ارزیابی تاثیر آنزیم های میکروبی و وزن مولکولی بر خاصیت آنتی¬اکسیدانی و ضد میکروبی پروتئین هیدرولیز شده دانه جو
الموضوعات :نگار تاجیک 1 , پیمان آریایی 2 , لیلا نجفیان 3
1 - دانشجوی دکتری،گروه علوم و صنایع غذایی، واحد آیت ا... آملی، دانشگاه آزاد اسلامی،آمل، ایران
2 - دانشیار، گروه علوم و صنایع غذایی، واحد آیت ا... آملی، دانشگاه آزاد اسلامی،آمل، ایران.
3 - استادیار،گروه علوم و صنایع غذایی، واحد ساری، دانشگاه آزاد اسلامی، ساری، ایران.
الکلمات المفتاحية: پروتئین هیدرولیز شده, آنتی اکسیدان, دانه جو, وزن مولکولی, ضد میکروبی.,
ملخص المقالة :
یکی از منابع جدید آنتیاکسیدانهای طبیعی، پروتئینهای هیدرولیزشده از منابع گیاهی میباشد. جو با توجه به سازگاری بالا به شرایط اقلیمی مختلف و قابلیت رشد در زمینهای فقیر و نامساعد و همچنین به علت دارا بودن ویتامینهایA، E، B1، B2، B12 و مواد معدنی و درصد پروتئین نسبتا بالا مورد توجه خاص است. بنابر این هدف از این تحقیق بررسی آنتیاکسیدانی و ضد میکروبی پروتئین هیدرولیز شده دانه جو بوده است. بنابراین در این مطالعه پروتئین هیدرولیز شده دانه جو با استفاده با استفاده از آنزیمهای تجاری آلکالاز و فلاورزایم، هیدرولیز و پپتیدهای زیست فعال که با استفاده از روش اولترافیلتراسیون غشایی با سه فرکشن شامل کمتر از 3 کیلو دالتون، 3-10 کیلو دالتون و 10-30 کیلو دالتون جدا گردید. خواص آنتیاکسیدانی پروتئین هیدرولیز شده و ضد میکروبی مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که پروتئین هیدرولیز شده توسط آلکالاز از میزان پروتئین و درجه هیدرولیز بالاتری نسبت به پروتئین هیدرولیز شده توسط آنزیم فلاورزایم برخوردار بود (05/0>p). نتایج نشان داد که فعالیت مهار رادیکال آزاد DPPH و ABTS و قدرت احیاکنندگی آهن در پروتئین هیدرولیز شده دانه جو توسط آنزیم آلکالاز به طور معنیداری بیشتر از پروتئین هیدرولیز شده فلاورزایم بود (05/0>p)، همچنین این پروتئین خاصیت ضدمیکروبی بالاتری بر روی باکتریهای پاتوژن داشت و خاصیت ضدمیکروبی علیه باکتری استافیلوکوکوس اروئوس بالاتر از اشیرشیاکلی بود. پروتئین هیدرولیز شده دانه جو با وزن مولکولی کمتر از 3 کیلو دالتون دارای بالاترین فعالیت آنتیاکسیدانی و ضدمیکروبی را دارا بود (05/0>p). نتایج کلی نشان داد، پروتئین هیدرولیز شده دانه جو دارای فعالیت آنتیاکسیدانی و ضدمیکروبی بالقوه بوده و میتواند يك منبع ايمن خوراكي و غني از پروتئين جهت استفاده در صنایع غذایی، غذاهای فراسودمند و خوراک دام توصیه شود.
1. Ahmadi F, Kadivar M, Shahedi M. 2007. Antioxidant activity of Kelussia odoratissima Mozaff. in model and food systems. Food Chemistry. 2007 105 (1): 57-64.
2. Aondona M, Ikya J. K, Ukeyima M.T, Gborigo J. A, Aluko R. E, Girgih A.T. 2021. In vitro antioxidant and antihypertensive properties of sesame seed enzymatic protein hydrolysate and ultrafiltration peptide fractions. Journal of Food Biochemistry.2021: 45: 1056-1073.
3. Borrajo P, Pateiro M, Gagaoua M, Franco D, Zhang W, Lorenzo J. M. Evaluation of the Antioxidant and Antimicrobial Activities of Porcine Liver Protein Hydrolysates Obtained Using Alcalase, Bromelain, and Papain. Appl. Sci. 2020; 10: 22-33.
4. Bougatef A, Hajji M, Balti R, Lassoued I, Triki-Ellouz Y, Nasri M. Antioxidant & free radical-scavenging activities of smooth hound (Mustelus mustelus) muscle protein hydrolysates obtained by gastrointestinal proteases. Food Chemistry. 2009; 114: 1198-1205.
5. Chalamaiah M, Hemalatha R, Jyothirmayi T. Fish protein hydrolysates: Proximate composition, amino acid composition, antioxidant activities and applications: A review. Food Chemistry. 2012; 135(4): 3020–3038.
6. Cozzolino D, Roumeliotis S, Eglinton J. 2015. Relationships between fatty acid contents of barley grain, malt, and wort with malt quality measurements. Cereal Chemistry. 92: 93-97.
7. Da Rocha M, Alemán A, Romani V. P, López-Caballero M. E, Gómez-Guillén M. C, Montero P, Prentice C. Effects of agar films incorporated with fish protein hydrolysate or clove essential oil on flounder (Paralichthys orbignyanus) fillets shelf-life. Food Hydrocolloids. 2018; 81: 351–363.
8. Davidson, P. M., Taylor, T.M. and Schmidt, S .E. 2013. Chemical preservatives and natural antimicrobial compounds, in Food microbiology. American Society of Microbiology, 22: 765-801.
9. DECastro R. J. S, Cason V. G, Sato H. H. Binary mixture of proteases increases the antioxidant properties of white bean (Phaseolus vulgaris L.) protein-derived peptides obtained by enzymatic hydrolysis. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. 2017; 10: 291-297.
10. FAO/WHO, 1990. Energy and protein requirements. Report of joint FAO/ WHO/UNU Expert Consultation Technical Report. FAO/WHO and United Nations University, Geneva, Series No. 724.
11. Firmansyah M, Abduh M. Y. Production of protein hydrolysate containing antioxidant activity from Hermetia illucens. Heliyon. 2019; 5(6): 25-41.
12. Ghanbarinia S. H, Ariaii P, Safari R, Najafian L. The effect of hydrolyzed sesame meal protein on the quality and shelf life of hamburgers during
refrigerated storage. Animal science journal. 2022; 93: 11-29.
13. Ghelich S, Ariaii P, Ahmadi M. Evaluation of Functional Properties of Wheat Germ Protein Hydrolysates and Its Effect on Physicochemical Properties of Frozen Yogurt. Int J Pept Res Ther. 2022; 28: 69-81.
14. Grisi T. C, Lira K. G. Action of nisin and high ph on growth of Staphylococcus aureus and Salmonella sp. in pure culture and the meat of land crab (Ucides cordatus). Brazilian Journal of Microbiology. 2005; 36: 151-156.
15. Guo B, Luan H, Lin S, Lv C, Zhang X, Xu R. Comparative proteomic analysis of two barley cultivars (Hordeum vulgare L.) with contrasting grain protein content. Front Plant Sci. 2016; 7:1–11.
16. Hamzeh, A., Rezaei, M., Khodabandeh, S. 2019. Antiproliferative and antioxidative activities of cuttlefish (Sepia pharaonis) protein hydrolysates as affected by degree of hydrolysis. Food Measurement, 12: 721–727.
17. Houde M, Khodaei N, Benkerroum N, Karboune, S. Barley protein concentrates: Extraction, structural and functional properties. Food Chemistry. 2018; 254: 367–376.
18. Jaeger A, Emanuele Z, Aylin W, Sahin, Elke K. Arendt. Barley Protein Properties, Extraction and Applications, with a Focus on Brewers’ Spent Grain Protein. Foods, 2021; 10(6): 13-29.
19. Mirsadeghi Darabi D, Ariaii P, Safari R, Ahmadi M. Effect of clover sprouts protein hydrolysates as an egg substitute on physicochemical and sensory properties of mayonnaise. Food Science & Nutrition. 2022; 10: 253–263.
20. Mirzapour Z, Ariaii P, Safari R. Evaluation the Effect Hydrolyzed Canola Meal Protein with Composite Coating on Physicochemical and Sensory Properties of Chicken Nugget. Int J Pept Res Ther. 2022; 28: 71-90.
21. Nasir S. N. A. M, Sarbon N. M. Angiotensin converting enzyme (ACE), antioxidant activity and functional properties of shortfin scad (Decapterus macrosoma) muscle protein hydrolysate at different molecular weight variations. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. 2019; 20: 101-124.
22. Nemati M, Javadian S. R, Ovissipour M. Keshavarz M. A study on the properties of alosa (Alosa caspia) by-products protein hydrolysates using commercial enzymes. World Applied Sciences Journal. 2012; 18 (7): 950-956.
23. Ovissipour M, Rasco B, Shiroodi S.G, Modanlow M, Gholami S, Nemati M. Antioxidant activity of protein hydrolysates from whole anchovy sprat (Clupeonella engrauliformis) prepared using endogenous enzymes and commercial proteases. Journal of Food Science and Agriculture. 2013; 93: 1718–1726.
24. Rabiei S, Rezae M, Asgharzade D, Nikoo M, Rafieian-Kopaei M. Antioxidant and cytotoxic properties of protein hydrolysates obtained from enzymatic hydrolysis of Klunzinger’s mullet (Liza klunzingeri) muscle. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 2019; 55:1-10.
25. Ryu B, Shin K. H, Kim S. K. Muscle Protein Hydrolysates and Amino Acid Composition in Fish. Mar Drugs Jun. 2021; 29: 11-29.
26. Saad A. M, Sitohy M. Z, Ahmed A. I, Rabie N. A, Amin S. A, Aboelenin S. M, Soliman M. M, El-Saadony M. T. Biochemical and Functional Characterization of Kidney Bean Protein Alcalase - Hydrolysates and Their Preservative Action on Stored Chicken Meat. Molecules. 2021; 26: 46-59.
27. Shahi Z, Sayyed-Alangi S. Z, Najafian L. Effects of enzyme type and process time on hydrolysis degree, electrophoresis bands and antioxidant properties of hydrolyzed proteins derived from defatted Bunium persicum Bioss. press cake. Heliyon. 2020; 6(2): 55-72.
28. Shahnazi S, Khalili Sigaroudi F, Ajni Y, Yazdani D, Ahvazi M, taghizad F. Investigation of chemical composiotion and antimicrobial properties Thymus trautvetteri essential oil. Journal of Medicinal plants. 2007; 23:80–88.
29. Shahosseini S. R, Javadian S. R, Safari R. Evaluation of antibacterial and antioxidant activities of Liza abu viscera protein hydrolysate. Journal of Innovation in Food Science and Technology. 2021; 30 (2): 123-146.
30. Shahosseini S. R, Javadian S. R, Safari R. Effects of Molecular Weights -Assisted Enzymatic Hydrolysis on Antioxidant and Anticancer Activities of Liza abu Muscle Protein Hydrolysates. International Journal for Peptide Research & Therapeutics. 2022; 28: 1-11.
31. Taha S. ¬F, Mohamed S.¬ S, Wagdy M.¬S., Mohamed, F.¬G. 2013. Antioxidant and antimicrobial activities of enzymatic hydrolysis products from sunflower protein isolate. World Applied Sciences Journal, 21: 651-658.
32. Taheri A, Bakhshizadeh A. Antioxidant and ACE Inhibitory Activities of Kawakawa (Euthynnus affinis) Protein Hydrolysate Produced by Skipjack Tuna Pepsin, Journal of Aquatic Food Product Technology. 2020; 29 (2): 148-166.
33. Tkaczewska J, Borawska-Dziadkiewicz J, Kulawik P, Duda I, Morawska M, Mickowska B. The effects of hydrolysis condition on the antioxidant activity of protein hydrolysate from Cyprinus carpio skin gelatin. LWT Food Science and Technology. 2020;117: 108-126.
34. Varedesara M. S, Ariaii P, Hesari J. The effect of grape seed protein hydrolysate on the properties of stirred yogurt and viability of Lactobacillus casei in it. Food Sci Nutr. 2021; 9: 2180–2190.
35. Yaghoubzadeh Z, Peyravii Ghadikolaii F, Kaboosi H, Safari R. Fattahi E. Antioxidant Activity and Anticancer Effect of Bioactive Peptides from Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss) Skin Hydrolysate, International Journal of Peptide Research and Therapeutics. 2020; 26: 625–632.
چکیده
یکی از منابع جدید آنتیاکسیدانهای طبیعی، پروتئینهای هیدرولیزشده از منابع گیاهی میباشد. جو با توجه به سازگاری بالا به شرایط اقلیمی مختلف و قابلیت رشد در زمینهای فقیر و نامساعد و همچنین به علت دارا بودن ویتامینهایA، E، B1، B2، B12 و مواد معدنی و درصد پروتئین نسبتا بالا مورد توجه خاص است. بنابر این هدف از این تحقیق بررسی آنتیاکسیدانی و ضد میکروبی پروتئین هیدرولیز شده دانه جو بوده است. بنابراین در این مطالعه پروتئین هیدرولیز شده دانه جو با استفاده با استفاده از آنزیمهای تجاری آلکالاز و فلاورزایم، هیدرولیز و پپتیدهای زیست فعال که با استفاده از روش اولترافیلتراسیون غشایی با سه فرکشن شامل کمتر از 3 کیلو دالتون، 3-10 کیلو دالتون و 10-30 کیلو دالتون جدا گردید. خواص آنتیاکسیدانی پروتئین هیدرولیز شده و ضد میکروبی مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که پروتئین هیدرولیز شده توسط آلکالاز از میزان پروتئین و درجه هیدرولیز بالاتری نسبت به پروتئین هیدرولیز شده توسط آنزیم فلاورزایم برخوردار بود (05/0>p). نتایج نشان داد که فعالیت مهار رادیکال آزاد DPPH و ABTS و قدرت قدرت احیاکنندگی آهن در پروتئین هیدرولیز شده دانه جو توسط آنزیم آلکالاز به طور معنیداری بیشتر از پروتئین هیدرولیز شده فلاورزایم بود (05/0>p)، همچنین این پروتئین خاصیت ضدمیکروبی بالاتری بر روی باکتریهای پاتوژن داشت و خاصیت ضدمیکروبی علیه باکتری استافیلوکوکوس اروئوس بالاتر از اشیرشیاکلی بود. پروتئین هیدرولیز شده دانه جو با وزن مولکولی کمتر از 3 کیلو دالتون دارای بالاترین فعالیت آنتیاکسیدانی و ضدمیکروبی را دارا بود (05/0>p). نتایج کلی نشان داد، پروتئین هیدرولیز شده دانه جو دارای فعالیت آنتیاکسیدانی و ضدمیکروبی بالقوه بوده و میتواند يك منبع ايمن خوراكي و غني از پروتئين جهت استفاده در صنایع غذایی، غذاهای فراسودمند و خوراک دام توصیه شود.
کلمات کلیدی: پروتئین هیدرولیز شده، آنتی اکسیدان، دانه جو، وزن مولکولی، ضد میکروبی
1- مقدمه
هر روز اثرات زیان آور نگهدارندههاي شیمیایی از جمله عوارض سرطانزایی و خواص تراتوژنیک و نیز باقیماندههاي سمی بر سلامت انسان به اثبات میرسد و تقاضا براي مصرف مواد غذایی که عمر ماندگاري آنها به صورت طبیعی افزایش یافته، بیشتر میشود (8). لذا محققین مواد غذایی درصدد جایگزینی آنها با نمونههاي طبیعی شدهاند. یکی از منابع جدید آنتیاکسیدانهای طبیعی، پروتئینهای هیدرولیزشده از منابع گیاهی و جانوری میباشد. پروتئینهای هیدرولیز شده، ترکیباتی با وزن مولکولی پایین هستند که تحت عنوان پپتیدهای زیست فعال شناخته میشوند (28).
پپتیدهای زیست فعال به عنوان اجزاء پروتئینی شناخته میشوند که در ساختمان پروتئین غیر فعال بوده و پس از آزاد شدن از طریق هیدرولیز، تخمیر، هضم شدن توسط آنزیمهای گوارشی و...اثرات متعددی بروز میدهند. پپتیدهای زیست فعال حاوی 20-2 اسید آمینه و وزن مولکولی کمتر از ۶۰۰۰ دالتون هستند که اثرات مثبتی بر سلامت مصرف کننده دارند. امروزه پپتیدهای زیست فعال به علت قابلیت استفاده در تهیه مواد غذایی فراسودمند مورد علاقه و توجه هستند. این پپتیدها به عنوان ترکیبات ضد اکسایش، ضد‌میکروب، ضد سرطان، ضد فشار خون، ضد ترمبوز و... به شمار میروند و علاوه بر خواص سلامت بخشی، واجد ویژگیهای عملکردی مانند امولسیون کنندگی و کف کنندگی، جذب آب و جذب روغن و ژلسازی میباشند (32).
این پپتیدها به سه روش سنتز شیمیایی، تخمیر میکروبی و هیدرولیز آنزیمی تولید میشوند، در این میان هیدرولیز آنزیمی از روشهاي جدید در بیوتکنولوژي غذایی میباشد که فرآیندي قابل کنترل و ملایم است و منجر به نابودي آمینواسیدهاي آزاد نمیشود (22، 28). پروتئینهای هیدرولیز شده گیاهی همانند هسته انگور، دانه جو، شبدر، جوانه گندم کنجاله کنجد و کلزا و ... به دلیل قیمت مناسب و آلرژي‌زایی کم، در مطالعات مختلف مورد استفاده قرار گرفته است (12، 13، 19، 20، 31).
گیاه جو به تیرهی گندمیان و جنس Hordeum تعلق دارد این جنس حدود 25 گونه زراعی و وحشی دارد. جو از نظر میزان تولید رتبهی پنجم را در میان غلات در دنیا دارد. ولی از نظر اهمیت، پس از گندم، ذرت و برنج چهارمین غله مهم دنیا به شمار میرود. از نظر علوفهای به عنوان دومین گیاه در نظر گرفته میشود (6). جو با توجه به سازگاری بالا به شرایط اقلیمی مختلف و قابلیت رشد در زمینهای فقیر و نامساعد، نیاز کم به رطوبت و مصارف مختلفی که دارد، مورد توجه خاص است. دانهی جو علاوه بر مصرف تغذیهای انسان در کشورهای فقیر مانند کشورهای شمال آفریقا، در صنعت داروسازی و کارخانجات نشاستهسازی مورد استفاده قرار میگیرد. دانهی این گیاه به عنوان منبع اصلی انرژی، پروتئین و فیبر برای نشخوار کنندگان و تقویت تولید تخم در مرغان تخم گذار بهکار میرود. همچنین به علت دارا بودن ویتامینهایA، E، B1، B2، B12 و مواد معدنی مانند کلسیم، فسفر، سدیم، منگنز، منیزیم، آهن و روی، و درصد پروتئین نسبتا بالا (8 تا 30 درصد) به اهمیت آن افزوده شده است. جو نسبت به سایر غلات برای دامنهی وسیعی از شرایط محیطی سازگار میباشد، بنابراین در مناطقی که شرایط محیطی برای تولید سایر غلات عامل محدود کنندهای است، جو میتواند محصول قابل قبولی تولید کند (6، 18).
با توجه به مطالب بیان شده و اهمیت پروتئین هیدرولیز شده و در ارتباط با پروتئین هیدرولیز شده دانه جو تا بحال مطالعهای در ایران انجام نشده است، هدف از مطالعه حاضر تولید پپتیدهای تخلیص شده از هیدرولیز آنزیمی دانه جو توسط آنزیمهای آلكالاز و فلاورزایم و بررسی خواص آنتیاکسیدانی و ضد میکروبی این پپتیدها میباشد.
2-مواد و روش ها
2-1-مواد اولیه
جدول 1: آنزیم های مورد استفاده در آزمایش
نام تجاری | منبع | دامنه pH | دامنه دما | میزان فعالیت (واحد آنسون) |
آلکالاز | Bacillus licheniformis | 10- 6 | 70- 55 | 4/2 |
فلاورزایم | Aspergillus oryzae | 7 – 5 | 70- 50 | 5/1 |
2-2-تولید پروتئین هیدرولیز شده
2-2-1-آماده سازی ایزوله پروتئین از دانه جو
2-2-2- هیدرولیز ایزوله پروتئینی حاصل از دانه جو
50 گرم نمونه، درون ارلن مایر 250 میلی لیتری ریخته و سپس میزان 100 میلیلیتر آب مقطر به نسبت (2:1) به ارلن مایر اضافه گردید و با همزن دیجیتالی به مدت 2 دقیقه هموژنیزه شد. سپس با اضافه کردن هیدروکسید سدیم 2/0 نرمال به pH بهینه فعالیت آنزیمها (آلکلاز 5/8، فلاورزایم 7)، رسانده شد. نمونهها در حمام آبی متحرک (Comecta، اسپانیا) در دمای 50 درجهسانتیگراد برای تولید پروتئین هیدرولیز شده با دور ثابت 200 دور در دقیقه قرار داده شد، سپس آنزیم (1 درصد میزان پروتئین نمونه اولیه) به آن اضافه و پس از هر بار نمونهگیری (زمان 10 و 20 دقیقه) و در پایان آزمایش (زمان 30 دقیقه) به منظور قطع واکنش آنزیمی در حمام آبی به مدت 15 دقیقه در دمای 95 درجهسانتیگراد قرار داده شدند. پروتئینهای هیدرولیز شده پس از خنک شدن با استفاده از سانتریفیوژ با دور ثابت 6700 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد، مایع شناور جمعآوری گردید و پروتئین هیدرولیز شده در فریزر نگهداری شد، سپس با استفاده از دستگاه خشک کن انجمادی (مدل Operon FDB-550 ، ساخت کشورکره( بصورت پودر در آمد (31).
2-3 اندازهگیری میزان پروتیئن دانه جو
مخخقادیر پروتئین ابتدایی دانه جو، ایزوله پروتئنی و پروتئین هیدورلیز شده بر اساس روش کلدال نمونهها هضم و سپس با تیتراسیون مقدار (6.25×N ) مقدار کل پروتئین رسوبی در فاز آبی محاسبه شد (22).
2-4- درجه هیدرولیز
ميزان هيدروليز به كمك تري كلرواستيك اسيد (TCA) اندازهگيري شد. مبناي اين روش اندازهگيري درصد نسبت پروتئينهاي محلول در تري كلرواستيك اسيد 10 درصد به كل پروتئينهاي موجود در نمونه ميباشد. براي اين منظور 5 ميليليتر از نمونه با 5 ميليليتر تري كلرواستيك اسيد 20 درصد مخلوط گرديد و سپس با دور 6700 rpm و زمان 10دقيقه سانتريفیوژ شد. سپس مقدار پروتئين در فاز محلول اندازهگيري و ميزان هيدروليز از طريق فرمول 1 محاسبه گرديد (22):
فرمول 1:
( میزان پروتئین حل شده در محلول تری کلرو استیک اسید 10درصد / میزان پروتئین در نمونه)= درجه هیدرولیز
2-5- ترکیب اسید آمینه
پودر پروتئین هیدرولیز شده برای مدت 24 ساعت در دمای 110 درجهسانتیگراد با استفاده از هیدروکلریک 6 نرمال هیدرولیز کامل شد. سپس با استفاده از فنیل ایزو تیوسیانات (PITC)عمل مشتقسازی اسیدهای آمینه انجام شد. میزان اسیدهای آمینه کل با استفاده از دستگاه HPLC مدلSmart line (آلمان) با استفاده از ستون C18 با آشکارساز فلورسنت (RF-530) انجام شد (16).
2-6- جداسازی پپتیدها
جداسازی پپتیدها توسط اولترا فیلتراسیون با دو فیلتر آمیکون با وزن مولکولی مختلف (۳ تا ۳۰ کیلودالتون) انجام شد. سه فرکشن (کمتر از 3 کیلو دالتون، 3-10 کیلو دالتون و 10-30 کیلو دالتون) جدا گردید. ابتدا پروتئین هیدرولیز شده خام با استفاده از فیلتر آمیکون ۳۰ کیلودالتون، در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد، مدت زمان ۱۰ دقیقه و با سرعت ۷۵۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ (Sigma 2 - 16kl ، اسپانیا) شد. سپس پروتئین هیدرولیز شده کمتر از ۳۰ کیلودالتون مجددا با استفاده از فیلتر آمیکون ۳ کیلودالتون، در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد، مدت زمان ۲۰ دقیقه و با سرعت ۷۵۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. بدین ترتیب، پپتیدهای کمتر از ۳ کیلو دالتون ، بین ۳ و 10 کیلودالتون و 10 تا ۳۰ کیلودالتون جدا شدند (34).
2-7- اندازهگیری فعالیت آنتیاکسیدانی پروتئین هیدرولیز شده
2-7-1- بررسی مهار رادیکال آزاد (DPPH)
این آزمایش بر اساس مهار DPPH که با اضافه کردن گونههای رادیکالی یا آنتی اکسیدان باعث بی رنگ شدن محلول DPPH می شوند، میباشد. DPPH ترکیبی است بنفش رنگ که به دلیل حضور گروههای فنیل در ساختارش به راحتی به صورت رادیکال در آمده و در واقع منبع رادیکال آزاد میباشد . این ترکیب با گرفتن یک الکترون از ترکیب آنتی اکسیدان، از رنگ بنفش به زرد تغییر رنگ میدهد. رادیکالهای آزاد موجود در DPPH در ۵۱۲ نانومتر جذب دارند که از قانون بیر لامبرت پیروی میکنند و کاهش جذب آن با میزان ماده آنتی اکسیدان رابطه خطی دارد هر چه بر مقدار ماده آنتی اکسیدان افزوده شود DPPH بیشتری مصرف شده و رنگ بنفش بیشتر به سمت زرد میل می کند. بدین منظور 1 میلیلیتر از تیمارهای مختلف پروتئین هیدرولیز شده بهطور جداگانه با 1 میلیلیتر محلول 1/0 میلی مولار DPPH اضافه و مخلوط حاصل به‌خوبی تكان داده شد و به مدت 15 دقيقه در اتاق تاريك قرار داده و سپس جذب نوری نمونهها در طول‌موج nm 517 در مقابل شاهد خوانده شد (4).
فرمول 2:
100× (جذب شاهد / جذب شاهد-جذب نمونه) = درصد مهار رادیکال آزاد DPPH
2-7-2- اندازهگیری قدرت احیاکنندگی آهن (FRAP)
این آزمون مطابق روش Bougatef و همکاران (2009) انجام شد. در این روش آنتیاکسیدانها نقش احیاءکنندگی دارند و باعث احیا آهن فریک به آهن فرو میشود. بسته به قدرت احیاءکنندگی عصاره، رنگ زرد محلول آزمایش به رنگ سبز یا آبی تغییر مییابد (4).
2-7-3- بررسی مهار رادیکال آزاد (ABTS)
محلول رادیکال ABTS با مخلوط کردن 5 میلی لیتر از ABTS، 7 میلی مولار و 88 میکرو مولار پتاسیم پروسولفات 140 میلی مولار مهیا شد و 16 ساعت در دمای محیط درتاریکی نگهداری شد، 5/0 میلی لیتر از محلول موجود با40 میلی لیتر (بافر فسفات 5 میلی مولار، pH 4/7، حاوی Nacl 2/0 مولار) تا جذب محلول رادیکال ABTS بتواند در734 نانومتر عدد 02/0 ± 70/0 بدست آمد، ترکیب می شود. 65 میکرو مولار نمونه محلول با 65 میکرو مولار بافر فسفات ترکیب شد 67/66 میکرو مولار از این مخلوط با 910 میکرو مولار محلول ABTS ترکیب شد و 67/66 میکرو مولار بافر فسفات به عنوان شاهد با 910 میکرو مولار محلول ABTS ترکیب شد و پس از 10 دقیقه در دمای محیط در تاریکی قرار گرفت و جذب در 734 نانومتر قرائت شد (24).
تعیین فعالیت پاک کنندگی رادیکال آزاد ABTS با استفاده از فرمول 3 زیر محاسبه شد:
فرمول 3:
100× (جذب شاهد / جذب شاهد-جذب نمونه) = درصد مهار رادیکال آزاد ABTS
2-8- خصوصیات ضد میکروبی پروتئین هیدرولیز شده
میکروارگانیسمهای مورد استفاده در این تحقیق عبارتند از: اشریشیاکلی 1399: PTCCو استافیلوکوکوس اورئوس 1112 PTCC: که از مرکز تحقیقات و پژوهش علمی صنعتی ایران تهیه شد.
سويه استاندارد و ليوفيليزه باکتریها از سازمان پژوهشهاي علمي و صنعتي ايران تهيه و تا زمان انجام آزمایشات در فریزر 20- درجهسانتیگراد نگهداری شد. ابتدا طبق دستورالعمل و تحت شرایط استریل سر ویالها شکسته و محتوي داخل محیط مایع مغذی محیط براث1 تخلیه و سپس در لوله ها با پنبه پوشانده شد و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجهسانتیگراد گرمخانه گذاري شدند تا باکتريها رشد کرده و کدورت ایجاد کنند. پس از گذشت مدت زمان مورد نظر با کمک آنس استریل از محیط مایع برداشت کرده و روي محیط جامد مغذي نوترینت آگار کشت داده شد. پلیتها به صورت وارونه به مدت 24 ساعت دیگر در دمای 37 درجهسانتیگراد قرار گرفت تا کلنیهای لازم ایجاد شدند. از این کلنی برای تهیه سوسپانسیونهای استاندارد استفاده گردید. برای تهیه سوسپانسیون میکروبی استاندرد از کلنیهای رشد یافته 24 ساعت بر روی محیط نوترینت آگار استفاده شد. سوسپانسیون حاصل برای مطابقت با نیم مک فارلند توسط اسپکتوفتومتر در طول 625 نانومتر سنجیده شد. بدین ترتیب در هر بار انجام آزمایش (تعیین لگاریتم درصد احتمال رشد)، با مشخص شدن جذب نوری که معادل تقریبا CFU/g 108 باکتری در هر میلی لیتر بود، لوله کووت حاوی تقریبا CFU/g 108 باکتری در میلی لیتر مشخص گردید (14).
2-8-2- حداقل غلظت مهارکنندگی و حداقل غلظت کشندگی پپتید
باكتريهاي مورد مطالعه غلظت تقريبي CFU/g 108 به ميزان 2/0 ميلي ليتر به هر يك از لولههای آزمایش افزوده شد. در مرحله بعد محلولهاي پپتید با استفاده از آب مقطر به نحوي تهيه شد كه با ريختن مقدار 2/0 ميلي ليتر از هركدام از محلولها درون لوله آزمایشهاي حاوي محيط كشت BHI آگار باكتريهاي مورد آزمايش (اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس اورئوس) ساخته شد. سپس لولههای آزمایش در انكوباتور در دماي 37 درجهسانتيگراد براي باكتريها گرمخانهگذاري و پس از 24 ساعت پائينترين غلظتي كه در آن هيچ كدورتي مشاهده نگرديد به عنوانMIC در نظرگرفته شد. پس از تعيين MIC جهت تعيين MBCدر شرايط كاملا استريل از محتويات ارلنهايي كه پس از 24 ساعت گرمخانهگذاري هنوز شفاف بودند و كدورتي در آنها مشاهده نشده باشد به ميزان 1/0 ميلي ليتر در پتري ديشهاي حاوي محيط كشت مناسب هر گونه باكتري كشت سطحي داده شد. پس از 24 ساعت گرمخانهگذاري در دماي مناسب رشد و عدم رشد باكتريها بررسي و اولين غلظتي كه در آن رشد مشاهده نگرديد به عنوان MBC در نظر گرفته شد (30).
2-9-تجزیه و تحلیل آماری
کلیه آزمایشها در طرح آزمایشی کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام شد و نتیجه بهصورت میانگین با انحراف معیار گزارش گردید آنالیز آماری تیمارها توسط جدول آنالیز واریانس (ANOVA) با استفاده از نرم افزار (SPSS version 18) صورت گرفت. برای بیان اختلاف معنیداری میانگینها از آزمون دانکن در سطح 05/0 استفاده شد و نمودارها با نرم‌افزار Microsoft Excel ترسیم شد.
3-1- بررسی مقادیر پروتئین
میزان پروتئین اولیه دانه جو برابر با 49/0±71/12 درصد و میزان پروتئین اولیه ایزوله دانه جو برابر با 93/0±24/45 بوده است. همچنین مقادیر پروتئین هیدرولیز شده در تیمارهای مختلف مابین 43/60- 35/93 درصد بوده است. بنابراین ایزوله و پروتئین هیدرولیز شده به علت دارا بودن مقادیر بالایی از پروتئین، دارای ارزش افزوده بوده و میتواند در فرمولاسیون غذای دام و همچنین در صنعت غذایی و دارویی استفاده شود (1). همچنین مقادیر بالاتر پروتئین، در پروتئین هیدرولیز شده در مقایسه با ایزوله دانه جو، به علت تجزیه پروتئین در حین فرآیند هیدرولیز میباشد و همچنین انجام سانتریفیوژ در حین فرآیند هیدرولیز، سبب جداسازی قسمتهای غیر پروتئین نمونه میشود (12). Guo و همکاران (2016) مقادیر پروتئین اولیه دو رقم مختلف جو را مابین 6/11-3/13درصد اعلام نمودند که نتایج آنها با نتایج مطالعه حاضر هم خوانی داشت (15). Houde و همکاران (2018) به اندازهگیری مقادیر پروتئین کنسانتره آرد جو بدون چربی با استفاده از روشهای قلیایی و آنزیمی پرداختند. آنها اعلام نمودند تیمار آنزیمی کنسانتره پروتئین با بالاترین محتوای پروتئین (0/49درصد) تولید نمودند (17). Jaeger و همکاران (2021) مقادیر پروتئین جو را 56/9درصد اعلام نمودند (18).
جدول 2: مقادیر پروتئین، پروتئینهاي هیدرولیز شده با استفاده از آنزیمهاي مختلف
فلاورزایم | آلکالاز | آنزیم
زمان هیدرولیز (دقیقه) |
Bc55/0±43/60 | Ac53/0±56/75 | 10 |
Bb56/0±43/70 | Ab46/0±67/83 | 20 |
Ba53/0±08/83 | Aa85/0±35/93 | 30 |
1) همه اعداد بر حسب درصد بیان شده است (میانگین ± انحراف از معیار)
2) اعداد در یک ردیف با حروف متفاوت اختلاف معنی دار دارند.(A, B)
3) اعداد در یک ستون با حروف متفاوت اختلاف معنی دار دارند.(a, b, c,..)
3-2- بررسی مقادیردرجه هیدرولیز
نتایج مربوط به درجه هیدرولیز نشان داد که نوع آنزیم و زمان فرآیند تاثیر مستقیمی بر روند افزایشی درجه هیدرولیز داشت (05/0>p). به طوریکه مقادیر درجه هیدرولیز توسط هر دو آنزیم بهطور پیوسته افزایش یافت، درجه هیدرولیز به طور قابل توجهی تحت تأثیر زمان فرآیند بود و طول زنجیره پپتیدی با درجه هیدرولیز نسبت عکس دارد بنابراین افزایش درجه هیدرولیز باعث کوتاهتر شدن طول زنجیره پپتیدی و کاهش توزیع وزن مولکولی میشود و در نتیجه باعث شکسته شدن نوارهای پپتیدی و افزایش اسیدهای آمینه آزاد میشود (2، 27). در بین دو آنزیم، پروتئین هیدرولیز شده توسط آنزیم آلکالاز درجه هیدرولیز بالاتری را در تمامی زمانهای هیدرولیز نشان داد (05/0>p). علت این امر ممکن است عملکرد دو آنزیم را در قابلیت آلکالاز در شکست پپتیدها به پپتیدهای کوچکتر و حتی تولید اسیدهای آمینه آزاد بیان کرد (22، 29).
جدول 3: مقادیر درجه هیدرولیز پروتئینهاي هیدرولیز شده با استفاده از آنزیمهاي مختلف
فلاورزایم |
آلکالاز | آنزیم
زمان هیدرولیز (دقیقه) |
Bc43/0±75/10 | Ac44/0±10/14 | 10 |
Bb17/0±19/16 | Ab80/0±24/20 | 20 |
Ba55/0±40/20 | Aa86/0±94/28 | 30 |
1) همه اعداد بر حسب درصد بیان شده است (میانگین ± انحراف از معیار)
2) اعداد در یک ردیف با حروف متفاوت اختلاف معنی دار دارند.(A, B)
3) اعداد در یک ستون با حروف متفاوت اختلاف معنی دار دارند.(a, b, c,..)
آنزیمهای پروتئولیتیک پروتئینها را به پپتیدهای کوچک متشکل از 2-20 اسید آمینه تجزیه میکند. وزن مولکولی، طول و توالی پپتیدها و ترکیب اسید آمینه آنها بر خواص پپتیدهای زیست فعال تأثیر میگذارد. هیدرولیزهای پروتئینی شامل آمینو اسیدهای آزاد و پپتیدهای با زنجیره کوتاه هستند که دارای ارزش غذایی و خواص زیستی مفیدی دارد (25). عملکرد پروتئینهای هیدرولیز شده به ترکیب اسید آمینه آن بستگی دارد. نتایج مربوط به مطالعه حاضر نشان داد، که میزان اسیدهای آمینه آبگریز آزاد (HAA) تحت تأثیر نوع پروتئاز قرار دارد. به طوریکه مقادیر HAA در پروتئین هیدرولیز شده توسط آنزیم آلکالاز برابر با 94/41درصد و برای آنزیم فلاورزایم برابر با 52/39درصد بوده است. در مجموع اسیدهای آمینهای که دارای خواص آبگریز هستند، نقش مهمی در روند بازدارندگی رادیکالهای آزاد دارند. این امر به دلیل توانایی اسیدهای آمینه آبگریز در افزایش دسترسی به رادیکالهای آزاد و در نتیجه کاهش دسترسی رادیکالهای آزاد در سلولهای هدف رخ میدهد (11). Jaeger و همکاران (2021) مقادیر HAA پروتئین جو را 86/37درصد اعلام نمودند که به نظر میرسد پس از هیدرولیز پروتئین مقادیر HAA افزایش میباید (18).
بالاترین مقادیر اسید آمینه ضروری در ارتباط با هر دو آنزیم، لوسین (آنزیم آلکالاز 99/6درصد و آنزیم فلاورزایم 15/6درصد) و بالاترین مقادیر اسید آمینه غیر ضروری گلوتامیک اسید (آنزیم آلکالاز 25/19درصد و آنزیم فلاورزایم 75/18درصد) بود. Jaeger و همکاران (2021) مقادیر لوسین و گلوتامیک اسید، پروتئین جو را به ترتیب 13/3 و 89/8درصد اعلام نمودند (18).
بر اساس توصیه های FAO/WHO (1990) در مورد پروتئینهای هیدورلیز شده تنها اسیدهای آمینه لایزین و فنیل آلانین دارای محدودیت نسبت به پروتئین های حیوانی بود (10)، بنابراین پروتئین هیدرولیز شده کنجاله کنجد از کیفیت غذایی مناسبی برخوردار باشد و میتواند به عنوان یک منبع پروتئین در صنایع غذایی مورد استفاده قرار گیرند (20).
جدول 4: ترکیب اسید آمینه موجود در پروتئین هیدرولیز شده
FAO/ WHO, 1990 | فلاورزایم | آلکالاز | اسید آمینه (گرم در 100 گرم نمونه) |
| 55/2 | 99/2 | هیستدین1 |
80/2 | 25/3 | 58/3 | ایزو لوسین1 |
60/6 | 15/6 | 99/6 | لوسین1 |
80/5 | 58/4 | 99/4 | لایزین1 |
| 41/2 | 56/2 | متیونین1 |
30/6 | 55/5 | 99/5 | فنیل آلانین1 |
4/3 | 45/3 | 59/3 | تروئنین1 |
5/3 | 55/4 | والین1 | |
| 99/7 | 35/7 | آسپارتیک اسید |
| 79/4 | 59/4 | آرژنین |
| 11/10 | 97/10 | پرولین |
| 59/8 | 55/7 | سرین |
| 05/4 | 25/4 | آلانین |
| 55/3 | 29/2 | سیستئین |
| 75/18 | 25/19 | گلوتامیک اسید |
1/1 | 99/3 | 05/3 | تیروزین |
| 99/4 | 25/5 | گلایسین |
| 52/39 | 94/41 | HAA2 |
| 76/98 | 79/99 | میزان اسید آمینه کل |
1اسیدآمینه ضروری
2مجموع اسیدهای آمینه آبگریز (آلانین، والین، ایزولوسین، لوسین، تیروسین، فنیل آلانین، تریپتوفان، پرولین، متیونین و سیستئین)
3-4- خاصیت آنتی اکسیدانی
3-4-1- فعالیت رادیکال آزاد DPPH
تمامی پروتئینهای هیدرولیز شده دارای فعالیت آنتیاکسیدانی بودند اما فعالیت مهاری رادیکال DPPH ارتباط مستقیمی و معنیداری با وزن مولکولی و نوع آنزیم داشت(05/0>p). اگر رادیکالهای DPPH با یک سوبسترای پروتئینی مانند یک آنتیاکسیدان برخورد کنند، رادیکالها پاک میشوند و جذب کاهش مییابد. کاهش جذب به عنوان معیاری برای فعالیت مهار رادیکال آزاد، در نظر گرفته شده است. پروتئین هیدرولیز شده جو، حاوی دهندههای هیدروژن است که با واکنش با رادیکالهای آزاد تثبیت می شوند زیرا اسیدهای آمینه با باقیماندههای زنجیره جانبی آبگریز میتوانند سبب انتقال الکترون از پپتیدها به رادیکال DPPH شوند (21). همچنین فعالیت مهاری رادیکال DPPH، پروتئین جو تولیدی توسط آنزیم آلکالاز به طور معنیداری بالاتر از فلاورزایم بود (05/0>p). ممکن است به علت بالاتر بودن HAA در این پروتئین باشد، اسیدهای آمینه آبگریز بالاتر سبب افزایش دسترسی بیشتر به رادیکالهای آزاد و در نتیجه کاهش دسترسی رادیکالهای آزاد در سلولهای هدف رخ می دهد (11). پپتیدهای آنتیاکسیدانی در صنایع غذایی اهمیت ویژهای دارند، بهطوریکه که کیفیت محصول را با جلوگیری از اکسیداسیون پروتئینها، لیپیدها و اسیدهای نوکلئیک حفظ میکنند (26). این نتایج با نتایج Ovissipour و همکاران (2013) (پروتئین ماهی کیلکا) وVaredesara و همکاران (2021) (پروتئین هسته انگور) هم خوانی دارد (23 و 31)، آنها نیز اعلام کردند پروتئین هیدرولیز شده توسط آنزیم آلکالاز فعالیت آنتیاکسیدانی بالاتری نسبت به فلاورزایم دارا میباشد. با توجه به نتایج مربوط به فعالیت مهاری رادیکال DPPH، بالاترین مقادیر به ترتیب در وزن مولکولی کمتر از 3 کیلو دالتون، سپس کمتر از 10 کیلو دالتون و در انتهای مابین 10-30 کیلو دالتون مشاهده شد(05/0>p). وزن مولکولی کمتر از 10-30 کیلو دالتون فعالیت مهاری DPPH بسیار پایینی را نشان داد. پروتئین جو با وزن مولکولی کمتر از 3 کیلو دالتون، حاوی پپتیدها/ اسیدهای آمینه، بالاتری می باند که می توانند به عنوان دهندههای هیدروژن، رادیکالهای آزاد تثبیت را تثبت نمایند. نتایج مشابهی توسط Nasir and Sarbon (2019) نیز گزارش نمودند پروتئین هیدورلیز شده اسکلت ماهی (Decapterus macrosoma) با وزن مولکولی کمتر از 3 کیلو دالتون بیشترین مهار رادیکال آزاد DPPH را دارا بود (21). Taheriو Bakhshizadeh(2020) نیز اعلام نمودند پروتئین هیدرولیز شده skipjack tuna با اندازه مولکولی ۳ کیلو دالتون بالاترین مهار رادیکال آزاد DPPH را نشان داده است (33). بر اساس این گزارش ها، پپتیدهای کوچکتر به عنوان اهداکنندگان پروتون مناسب با هیدرولیز گسترده پروتئینها تولید می شوند.
شکل 1: مقادیر فعالیت رادیکال آزاد DPPH
3-4-2- قدرت احیاءکنندگی فریک
قدرت احیا کنندگی فریک پروتئینهای هیدرولیز شده (شکل 2) به طور معنی داری تحت تاثیر پارامترهای فرآیند (نوع آنزیم و وزن مولکولی) بوده است. بیشترین قدرت احیا کنندگی فریک، مربوط به پروتئین هیدرولیز شده توسط آنزیم آلکالاز با وزن مولکولی کمتر از 3 کیلو دالتون بود (43/0 میکرومول فروس/ گرم) (05/0>p). در حالیکه کمترین مقادیر مربوط به پروتئین هیدرولیز شده توسط آنزیم فلاورزایم با وزن مولکولی 10-30 کیلو دالتون بود (19/0 میکرومول فروس/ گرم). ترکیبات با قدرت کاهشی بالاتر توانایی بهتری برای اهدای الکترون یا هیدروژن دارند و پتانسیل قابل توجهی به عنوان یک آنتیاکسیدان طبیعی دارند (5). پروتئین هیدرولیز شده توسط آنزیم آلکالاز با وزن مولکولی کمتر از 3 کیلو دالتون احتمالاً حاوی بالاترین سطوح پپتیدها و اسیدهای آمینه آزاد است که قادر به اهدای الکترون به رادیکالهای آزاد و پایان دادن به واکنش زنجیره‌ای اکسیداسیون هستند (34). Aondona و همکارن، (2020) پروتئین هیدرولیز شده کنجاله کنجد بالاترین توانایی کاهندگی در کمترین وزن مولکولی مشاهده شد (1). Taheriو Bakhshizadeh(2020) نیز اعلام نمودند پروتئین هیدرولیز شده skipjack tuna با اندازه مولکولی ۳ کیلو دالتون بالاترین توانایی کاهندگی را نشان داده است (33). بنابر این بر اساس این دو مطالعه، قدرت کاهنده نیز مشابه مطالعه حاضر وابسته به وزن مولکولی بوده است.
شکل 2: مقادیر قدرت احیا کنندگی آهن
3-4-3- فعالیت رادیکال آزاد ABTS
ارزیابی مهار رادیکال محلول در آب ABTS یکی دیگر از شاخصهای تعیین قدرت ترکیبات آنتیاکسیدان و اثر فرآیند هیدرولیز آنزیمی بر این شاخص است. عملکرد هر آنزیم از نظر نوع رهایش اسیدهای آمینه خاص (لیپوفیل یا هیدروفیل) میتواند بر مهار رادیکالهای آزاد مؤثر باشد. این پپتیدها از طريق اهداء اتم هیدروژن به رادیکالهای آزاد موجب توقف با کاهش سرعت فرآیند اکسیداسیون میشوند. بیشترین مهار رادیکال محلول در آب ABTS (شکل 3)، مربوط به پروتئین هیدرولیز شده توسط آنزیم آلکالاز با وزن مولکولی کمتر از 3 کیلو دالتون بود (72/90درصد). در حالیکه کمترین مقادیر مربوط به پروتئین هیدرولیز شده توسط آنزیم فلاورزایم با وزن مولکولی 10-30 کیلو دالتون بود (36/58درصد). خاصیت آنتیاکسیدانی، توانایی مهار رادیکال کاتیونی و محلول در آبABTS ، مانند سایر شاخصها، به نوع آنزیم پروتئاز، درجه هیدرولیز و ترکیب اسید آمینه پپتیدها بستگی دارد و همچنین اندازه پپتیدها می تواند عامل کلیدی در توانایی حذف رادیکال ABTS باشد (27). Shahosseini و همکاران (2022) نیز نتایج مشابهی را در مورد پروتئین هیدرولیز شده ماهی بیاح گزارش نموده و بیان داشته اند نوع آنزیم مورد استفاده برای هیدرولیز و اندازه پپتیدها میتواند تاثیر بسزایی در توانایی حذف رادیکال ABTS بگذارد (29).
شکل 3: مقادیر فعالیت رادیکال آزاد ABTS
3-5- فعالیت ضد میکروبی
در سالهاي اخير مطالعات فراواني پيرامون استفاده از نگهدارندههاي طبيعي در صنايع غذايي صورت گرفته است از جمله اين تركيبات ضد ميكروبي، پروتئینهای هیدرولیز شده ميباشد (35).
خاصیت ضد میکروبی پروتئینهای هیدرولیز شده به طور قابل توجهی در ارتباط با پارامترهای فرآیند (نوع آنزیم و وزن مولکولی) بوده است. بیشترین خاصیت ضد میکروبی در ارتباط با هر دو باکتری، مربوط به پروتئین هیدرولیز شده توسط آنزیم آلکالاز با وزن مولکولی کمتر از 3 کیلو دالتون، در حالی که کمترین مقادیر مربوط به مربوط به پروتئین هیدرولیز شده توسط آنزیم فلاورزایم با وزن مولکولی 10-30 کیلو دالتون بود. استفاده از آنزیمهای مختلف در تولید پپتیدهای ضد باکتری بسیار مهم است. فعالیت این پپتیدهای ضد میکروبی باعث اختلال انتخابی غشای سلولی میشود که منجر به نفوذپذیری غشا، دپلاریزاسیون، اتلاف گرادیانهای الکتروشیمیایی و در نهایت مرگ سلولی میشود (3). همچنین توالی اسید آمینه، ساختار ثانویه، طول و وزن مولکولی بر فعالیت ضد میکروبی پپتیدها تأثیر گذار می باشد (33).
با توجه به نتایج باکتری گرم مثبت استافیلوکوکوس اورئوس مقاومت پایینتری نسبت به باکتری اشیرشیاکلی داشت. علت این امر، حساسيت بالاي باكتريهاي گرم مثبت به دليل عدم وجود ديواره سلولي ليپوپلي ساكاريدي است كه اين ديواره در باكتريهاي گرم منفي ممكن است از ورود تركيبات فعال به غشاي سيتوپلاسمي جلوگيري به عمل آورد (7). عملکرد ضد باکتریایی پپتیدها به گونههای باکتریایی بستگی دارد. اول، پپتیدها ممکن است به صورت الکترواستاتیکی به غشاهای باکتری متصل شوند. بنابراین، ساختارها و فرآیندهای بین سلولی، مانند سنتز دیواره سلولی، DNA، RNA و سنتز پروتئین ممکن است تحت تأثیر قرار گیرند و غشای پلاسما ممکن است قطع شود (26).
جدول 5: مقادیر MIC پروتئینهاي هیدرولیز شده علیه باکتریهای مختلف
اشیرشیاکلی | استافیلوکوکوس اورئوس | باکتری تیمار |
Ab00/25±00/525 | Bb43/14±33/358 | آلکالاز (10-30 کیلو دالتون) |
Ac43/14±66/466 | Bc43/14±33/283 | آلکالاز (3-10 کیلو دالتون) |
Ae43/14±33/358 | Bd43/14±33/208 | آلکالاز (>3 کیلو دالتون) |
Aa00/25±00/625 | Ba43/14±33/408 | فلاورزایم (10-30 کیلو دالتون) |
Ab43/14±33/508 | Bb43/14±33/358 | فلاورزایم (3-10 کیلو دالتون) |
Ad43/14±33/433 | Bc43/14±33/308 | فلاورزایم (>3 کیلو دالتون) |
1) همه اعداد بر حسب ppm بیان شده است (میانگین ± انحراف از معیار)
2) اعداد در یک ردیف با حروف متفاوت اختلاف معنی دار دارند.(A, B)
3) اعداد در یک ستون با حروف متفاوت اختلاف معنی دار دارند.(a, b, c,..)
جدول 6: مقادیر MBC پروتئینهاي هیدرولیز شده علیه باکتریهای مختلف
اشیرشیاکلی | استافیلوکوکوس اورئوس | باکتری تیمار |
Ab43/14±33/608 | Bb43/14±66/416 | آلکالاز (10-30 کیلو دالتون) |
Ac43/14±33/533 | Bc43/14±33/358 | آلکالاز (3-10 کیلو دالتون) |
Ae43/14±33/433 | Bd43/14±66/266 | آلکالاز (>3 کیلو دالتون) |
Aa43/14±66/716 | Ba43/14±66/491 | فلاورزایم (10-30 کیلو دالتون) |
Ab00/25±00/625 | Bb43/14±66/441 | فلاورزایم (3-10 کیلو دالتون) |
Ad00/25±00/500 | Bc00/25±00/375 | فلاورزایم (>3 کیلو دالتون) |
1) همه اعداد بر حسب ppm بیان شده است (میانگین ± انحراف از معیار)
2) اعداد در یک ردیف با حروف متفاوت اختلاف معنی دار دارند.(A, B)
3) اعداد در یک ستون با حروف متفاوت اختلاف معنی دار دارند.(a, b, c,..)
4- نتیجه گیری نهایی
در این پژوهش خواص آنتیاکسیدانی و ضد میکروبی پپتیدهای تخلیص شده از هیدرولیز آنزیمی دانه جو بررسی شد. نتایج مربوط به ویژگیهای پروتئین هیدرولیز شده نشان داد که از میان آنزیم آلکالاز و فلاورزایم، آنزیم آلکالاز میتواند پروتئین هیدرولیزي با درجه هیدرولیز بالاتري تولید کند و همچنین افزایش زمان هیدرولیز تأثیر مثبتی بر روی ویژگیهای مذکور داشت همچنین پروتئین هیدرولیز شده توسط آنزیم آلکالاز، اسیدهای آمینه HAA بالاتر، فعالیت آنتی اکسیدانی و ضد میکروبی بالاتری داشت و بالاترین خاصیت ضد میکروبی و آنتی اکسیدانی در وزن مولکولی کمتر از 3 کیلو دالتون مشاهده شد. بنابراین پروتئین هیدرولیز شده دانه جو میتواند در فرمولاسیون غذای آبزیان، دام و طیور پیشنهاد شود و همچنین میتواند به عنوان آنتیاکسیدان و ضد میکروب طبیعی برای جلوگیری از فساد لیپیدها مورد استفاده قرار گیرد.
5- منابع:
1. Aondona, M.M., Ikya, J.K., Ukeyima, M.T., Gborigo, J.A., Aluko, R.E., Girgih, A.T. 2021. In vitro antioxidant and antihypertensive properties of sesame seed enzymatic protein hydrolysate and ultrafiltration peptide fractions. Journal of Food Biochemistry. 45: 1056-1073.
2. Ahmadi, F., Kadivar, M., Shahedi. M. 2007. Antioxidant activity of Kelussia odoratissima Mozaff. in model and food systems. Food Chem. 105 (1): 57-64.
3. Borrajo, P., Pateiro, M., Gagaoua, M., Franco, D., Zhang, W., Lorenzo, J.M. 2020. Evaluation of the Antioxidant and Antimicrobial Activities of Porcine Liver Protein Hydrolysates Obtained Using Alcalase, Bromelain, and Papain. Appl. Sci. 10: 2290.
4. Bougatef, A., Hajji, M., Balti, R., Lassoued, I., Triki-Ellouz, Y., Nasri, M. 2009. Antioxidant & free radical-scavenging activities of smooth hound (Mustelus mustelus) muscle protein hydrolysates obtained by gastrointestinal proteases. Food Chemistry. 114: 1198-1205.
5. Chalamaiah, M., Hemalatha, R., Jyothirmayi, T. 2012. Fish protein hydrolysates: Proximate composition, amino acid composition, antioxidant activities and applications: A review. Food Chemistry. 135(4): 3020–3038.
6. Cozzolino, D., Roumeliotis, S., Eglinton, J. 2015. Relationships between fatty acid contents of barley grain, malt, and wort with malt quality measurements. Cereal Chemistry. 92: 93-97.
7. Da Rocha, M., Alemán, A., Romani, V. P., López-Caballero, M. E., Gómez-Guillén, M. C., Montero, P., & Prentice, C. 2018. Effects of agar films incorporated with fish protein hydrolysate or clove essential oil on flounder (Paralichthys orbignyanus) fillets shelf-life. Food Hydrocolloids. 81: 351–363.
8. Davidson, P.M., Taylor, T.M. and Schmidt, S .E. 2013. Chemical preservatives and natural antimicrobial compounds, in Food microbiology. American Society of Microbiology. p. 765-801.
9. DE Castro, R. J. S., Cason, V. G. & Sato, H. H. (2017). Binary mixture of proteases increases the antioxidant properties of white bean (Phaseolus vulgaris L.) protein-derived peptides obtained by enzymatic hydrolysis. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 10, 291-297.
10. FAO/WHO, 1990. Energy and protein requirements. Report of joint FAO/ WHO/UNU Expert Consultation Technical Report. FAO/WHO and United Nations University, Geneva, Series No. 724.
11. Firmansyah, M., Abduh, M. Y. 2019. Production of protein hydrolysate containing antioxidant activity from Hermetia illucens. Heliyon. 5(6: e02005.
12. Ghanbarinia, S. H., Ariaii, P., Safari, R., Najafian, L. 2022. The effect of hydrolyzed sesame meal protein on the quality and shelf life of hamburgers during refrigerated storage. Animal science journal. 93: 1, e13729.
13. Ghelich, S., Ariaii, P. & Ahmadi, M. Evaluation of Functional Properties of Wheat Germ Protein Hydrolysates and Its Effect on Physicochemical Properties of Frozen Yogurt. Int J Pept Res Ther. 28: 69.
14. Grisi,T. C., Lira, K. G. 2005. Action of nisin and high ph on growth of Staphylococcus aureus and Salmonella sp. in pure culture and the meat of land crab (Ucides cordatus). Brazilian Journal of Microbiology, 36: 151-156.
15. Guo, B., Luan, H., Lin, S., Lv, C., Zhang, X., Xu, R. 2016. Comparative proteomic analysis of two barley cultivars (Hordeum vulgare L.) with contrasting grain protein content. Front Plant Sci. 7, 1– 11.
16. Hamzeh, A., Rezaei, M., Khodabandeh, S. 2019. Antiproliferative and antioxidative activities of cuttlefish (Sepia pharaonis) protein hydrolysates as affected by degree of hydrolysis. Food Measurement. 12: 721–727.
17. Houde, M., Khodaei, N., Benkerroum, N., Karboune, S. 2018. Barley protein concentrates: Extraction, structural and functional properties. Food Chemistry. 254: 367–376.
18. Jaeger, A., Emanuele, Z., Aylin, W., Sahin, Elke K. Arendt. 2021. Barley Protein Properties, Extraction and Applications, with a Focus on Brewers’ Spent Grain Protein. Foods. 10, 6: 1389.
19. Mirsadeghi Darabi, D., Ariaii, P., Safari, R., Ahmadi, M. 2022. Effect of clover sprouts protein hydrolysates as an egg substitute on physicochemical and sensory properties of mayonnaise. Food Science & Nutrition. 10: 253–263.
20. Mirzapour, Z., Ariaii, P., Safari, R. 2022. Evaluation the Effect Hydrolyzed Canola Meal Protein with Composite Coating on Physicochemical and Sensory Properties of Chicken Nugget. Int J Pept Res Ther. 28: 97.
21. Nasir, S. N. A. M., Sarbon, N. M. 2019. Angiotensin converting enzyme (ACE), antioxidant activity and functional properties of shortfin scad (Decapterus macrosoma) muscle protein hydrolysate at different molecular weight variations. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. 20: 101254.
22. Nemati, M., Javadian, S. R., Ovissipour, M. and Keshavarz, M. 2012. A study on the properties of alosa (Alosa caspia) by-products protein hydrolysates using commercial enzymes. World Applied Sciences Journal. 18 (7): 950-956.
23. Ovissipour, M., Rasco, B., Shiroodi, S.G., Modanlow, M., Gholami, S. and Nemati, M. 2013. Antioxidant activity of protein hydrolysates from whole anchovy sprat (Clupeonella engrauliformis) prepared using endogenous enzymes and commercial proteases. Journal of Food Science and Agriculture. 93: 1718–1726.
24. Rabiei, S., Rezae. M., Asgharzade, D., Nikoo, M., Rafieian-Kopaei, M. 2019. Antioxidant and cytotoxic properties of protein hydrolysates obtained from enzymatic hydrolysis of Klunzinger’s mullet (Liza klunzingeri) muscle. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 55: e18304, 1-10.
25. Ryu B, Shin KH, Kim SK. Muscle Protein Hydrolysates and Amino Acid Composition in Fish. Mar Drugs. 2021 Jun 29; 19(7):377. doi: 10.3390/md19070377. PMID: 34210079; PMCID: PMC8304736.
26. Saad, A. M., Sitohy, M. Z., Ahmed, A. I., Rabie, N. A., Amin, S. A., Aboelenin, S. M., Soliman, M. M., El-Saadony, M. T. 2021. Biochemical and Functional Characterization of Kidney Bean Protein Alcalase-Hydrolysates and Their Preservative Action on Stored Chicken Meat. Molecules. 26: 4690.
27. Shahi, Z., Sayyed-Alangi, S. Z., Najafian, L. 2020. Effects of enzyme type and process time on hydrolysis degree, electrophoresis bands and antioxidant properties of hydrolyzed proteins derived from defatted Bunium persicum Bioss. press cake. Heliyon. 6(2): e03365.
28. Shahosseini, S.R., Javadian, S.R., Safari, R. 2021. Evaluation of antibacterial and antioxidant activities of Liza abu viscera protein hydrolysate. Journal of Innovation in Food Science and Technology, 30 (2): 123-146.
29. Shahosseini, S.R., Javadian, S.R., Safari, R. 2022. Effects of Molecular Weights -Assisted Enzymatic Hydrolysis on Antioxidant and Anticancer Activities of Liza abu Muscle Protein Hydrolysates. International Journal for Peptide Research & Therapeutics. 28: 72.
30. Shahnazi S., Khalili Sigaroudi F., Ajni Y., Yazdani D., Ahvazi, M. and taghizad, F. 2007. Investigation of chemical composiotion and antimicrobial properties Thymus trautvetteri essential oil. Journal of Medicinal plants. 23:80 – 88.
31. Varedesara, M.S., Ariaii, P., Hesari, J. 2021. The effect of grape seed protein hydrolysate on the properties of stirred yogurt and viability of Lactobacillus casei in it. Food Sci Nutr, 9:2180–2190.
32. Taha, S. F., Mohamed, S. S., Wagdy M. S., Mohamed, F. G. 2013. Antioxidant and antimicrobial activities of enzymatic hydrolysis products from sunflower protein isolate. World Applied Sciences Journal, 21: 651-658.
33. . 2020. Antioxidant and ACE Inhibitory Activities of Kawakawa (Euthynnus affinis) Protein Hydrolysate Produced by Skipjack Tuna Pepsin, Journal of Aquatic Food Product Technology, 29 (2): 148-166.
34. Tkaczewska, J., Borawska-Dziadkiewicz, J., Kulawik, P., Duda, I., Morawska, M., & Mickowska, B. 2020. The effects of hydrolysis condition on the antioxidant activity of protein hydrolysate from Cyprinus carpio skin gelatin. LWT Food Science and Technology. 117: 108616.
35. Yaghoubzadeh, Z., Peyravii Ghadikolaii, F., Kaboosi, H., Safari, R. and Fattahi, E. 2020. Antioxidant Activity and Anticancer Effect of Bioactive Peptides from Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss) Skin Hydrolysate, International Journal of Peptide Research and Therapeutics. 26: 625–632.
Evaluation of the effect of microbial enzymes and molecular weight on the antioxidant and antimicrobial properties of barley grain hydrolyzed protein
Abstract
One of the new sources of natural antioxidants is hydrolyzed proteins from plant sources. Barley is of particular interest due to its adaptability to different weather conditions and the ability to grow in poor and unfavorable lands, as well as due to the presence of vitamins A, E, B1, B2, B12 and minerals and a relatively high percentage of protein. Therefore, the aim of this research was to investigate the antioxidant and antimicrobial properties of hydrolyzed barley protein. In this study, barley grain protein was hydrolyze using commercial enzymes of alcalase and flavourzyme, and bioactive peptides was separated using membrane ultrafiltration with three fractions including less than 3 kDa, 3-10 kDa and 10 -30 kDa. The antioxidant properties of hydrolyzed and antimicrobial proteins were evaluated. The results showed that the protein hydrolyzed by alcalase had a higher protein content and degree of hydrolysis than the protein hydrolyzed by flavourzyme enzyme (p <0.05). The results showed that the free radical scavenging activity of DPPH and ABTS and the power of iron reduction in barley grain hydrolyzed protein by alcalase enzyme was significantly higher than flavourzyme (p <0.05), also this antimicrobial properties against pathogenic bacteria was higer, and its antimicrobial properties against Staphylococcus aureus were higher than Escherichia coli. Hydrolyzed barley grain protein with a molecular weight of less than 3 kDa had the highest antioxidant and antimicrobial activity (p <0.05). Therefore, it seems that hydrolyzed barley grain protein has potential antioxidant and antimicrobial activity and can be recommended as a safe and rich source of protein for use in food industry, health foods and animal feed.
Keywords: Hydrolyzed protein, antioxidant, barley seed, molecular weight, antimicrobial
[1] Brain Heart Infusion
