بررسی ویژگی های فیلم خوراکی بر پایه نانو سلولز باکتریایی اکسید شده با روش TEMPO حاوی پروتئین هیدرولیز شده حاصل از میوه درخت کاج
نجم الدین پیرویسی
1
(
دانشگاه آزاد واحد آیت ا...آملی
)
پیمان آریایی
2
(
گروه صنایع غذایی، دانشکده صنایع غذایی، آیت الله آملی، آمل، ایران
)
مهرو اسماعیلی
3
(
هئیت علمی دانشگاه آزاد واحد آیت ا...آملی
)
محمد احمدی
4
(
گروه علوم و صنایع غذایی، دانشکه کشاورزی و صنایع غذایی، واحد آیه الله آملی، دانشگاه آزاد اسلامی، آمل، ایران
)
کلید واژه: رادیکال آزاد, پپتید زیست فعال, نانو سلولز باکتریایی, استافیلوکوکوس اروئوس, اشیرشیاکلی,
چکیده مقاله :
در این مطالعه فیلم هوشمند و فعال بر اساس سلولز باکتریایی اکسید شده با روش TEMPO حاوی پروتئین هیدرولیز شده دانه کاج تولید شد. بدین منظور ابتدا پروتئین هیدرولیز شده میوه دانه کاج با استفاده از آنزیم تجاری آلکالاز هیدرولیز و سپس غلظتهای مختلف آن (0، 5/0، 1 و 5/1درصد) به فیلم نانو سلولز باکتریایی افزوده و ویژگیهای فیزیکی، مکانیکی، آنتیاکسیدانی و ضد میکروبی فیلمها بررسی شد. با توجه به نتایج پروتئین هیدرولیز شده دارای مقادیر بالای پروتئین (21/90درصد) و اسید آمینه بود که بالاترین مقادیر اسید آمینه مربوط به آرژنین 88/21درصد، گلوتامیک اسید 33/17درصد (اسیدهای آمینه غیر ضروری) و لوسین 75/6درصد (اسیدهای آمینه ضروری) بوده است. بر اساس نتایج فیلمها، افزایش غلظت پروتئین، سبب کاهش مقاومت کششی و افزایش کشش تا قبل از نقطه پارگی فیلم، نفوذ پذیری بخار آب و کدورت شد (05/0>P) اما تاثیر معنیداری بر رطوبت و حلالیت نداشت (05/0<P). فیلم ها دارای فعالیت آنتیاکسیدانی بالایی بودند و فعالیت مهار رادیکال آزاد DPPH با افزایش غلظت افزایش یافت (05/0>P)، و همچنین این فیلمها خاصیت ضد میکروبی بالایی علیه باکتریهای پاتوژن داشت و خاصیت ضد میکروبی علیه باکتری استافیلوکوکوس اروئوس بالاتر از اشیرشیاکلی بود. فیلم نانو سلولز حاوی پروتئین هیدرولیز شده با غلظت 5/1درصد دارای بالاترین فعالیت آنتی اکسیدانی و ضد میکروبی بود (05/0>p). بنابراین به نظر میرسد، فیلم نانو سلولز حاوی پروتئین هیدرولیز شده میوه کاج به علت دارا بودن خاصیت آنتی اکسیدانی و ضد میکروبی می‌تواند در بسته بندی هوشمند محصولات غذایی مورد استفاده قرار گیرد.
چکیده انگلیسی :
چکیده
در این مطالعه فیلم هوشمند و فعال بر اساس سلولز باکتریایی اکسید شده با روش TEMPO حاوی پروتئین هیدرولیز شده دانه کاج تولید شد. بدین منظور ابتدا پروتئین میوه دانه کاج با استفاده از آنزیم تجاری آلکالاز هیدرولیز و سپس غلظتهای مختلف آن (0، 5/0، 1 و 5/1درصد) به فیلم نانو سلولز باکتریایی افزوده و ویژگیهای فیزیکی، مکانیکی، آنتیاکسیدانی و ضد میکروبی فیلمها بررسی شد. با توجه به نتایج پروتئین هیدرولیز شده دارای مقادیر بالای پروتئین (21/90درصد) و اسید آمینه بود که بالاترین مقادیر اسید آمینه مربوط به آرژنین 88/21درصد، گلوتامیک اسید 33/17درصد (اسیدهای آمینه غیر ضروری) و لوسین 75/6درصد (اسیدهای آمینه ضروری) بوده است. بر اساس نتایج فیلمها، افزایش غلظت پروتئین، سبب کاهش مقاومت کششی و افزایش کشش تا قبل از نقطه پارگی فیلم، نفوذ پذیری بخار آب و کدورت شد (05/0>P) اما تاثیر معنیداری بر رطوبت و حلالیت نداشت (05/0<P). فیلم ها دارای فعالیت آنتیاکسیدانی بالایی بودند و فعالیت آننتی اکسیدانی با افزایش غلظت افزایش یافت (05/0>P)، و همچنین این فیلمها خاصیت ضد میکروبی بالایی علیه باکتریهای پاتوژن داشت و خاصیت ضد میکروبی علیه باکتری استافیلوکوکوس اروئوس بالاتر از اشیرشیاکلی بود. فیلم نانو سلولز حاوی پروتئین هیدرولیز شده با غلظت 5/1درصد دارای بالاترین فعالیت آنتی اکسیدانی و ضد میکروبی بود (05/0>p). بنابراین به نظر میرسد، فیلم نانو سلولز حاوی پروتئین هیدرولیز شده میوه کاج به علت دارا بودن خاصیت آنتی اکسیدانی و ضد میکروبی می‌تواند در بسته بندي هوشمند محصولات غذایی مورد استفاده قرار گیرد.
کلمات کلیدی: پپتید زیست فعال، آلکالاز، نانو سلولز باکتریایی، رادیکال آزاد، استافیلوکوکوس اروئوس، اشیرشیاکلی
1- مقدمه
فیلمهای خوراکی ساخته شده از بیوپلیمرهای طبیعی (پروتئینها و پلی ساکاریدها) در سالهای اخیر به دلیل تجزیه پذیری زیستی و پتانسیلهای آنها برای کاهش مشکلات جدی زیست محیطی مرتبط با مواد پلاستیکی غیر قابل تجزیه زیستی، توجه زیادی را به خود جلب کردهاند (3). سلولز باکتریایی یک شکل بسیار خالص از مواد سلولز تولید شده توسط باکتری استوباکترزایلینیوم1 است که دارای سطح ویژه بالا، خاصیت مکانیکی عالی و سازگاری زیستی خوب است. این ماده در برخی از خواص مانند خلوص زیاد، بلورینگى و درجه پلیمریزاسیون با سلولز گیاهی تفاوت دارد (39). در سالهای اخیر، الیاف سلولز در الیاف نانو اندازهای جدا شدهاند که به آنها نانوالیاف سلولزی میگویند. نانوالیاف سلولزی را میتوان با روشهای شیمیایی و مکانیکی از منابع سلولز جدا کرد. در روشهای جداسازی شیمیایی از مواد شیمیایی استفاده میشود (14، 38، 40). اکسیداسیون سلولز باکتریایی TEMPO2 روشی موثر برای شکستن پیوندهای هیدروژنی و تفکیک آنها به نانوالیاف نازک با حفظ مزایای اولیه و گسترش کاربردهای آن است. سلولز باکتریایی اکسید شده TEMPO(3TOBC) برای کاربردهایی نظیر جدا کننده باتری لیتیوم، ابرخازنها، مراقبت از پوست، پانسمان زخم و... مورد مطالعه قرار گرفته است (15، 16، 18، 28). همچنین استفاده از فیلم TOBC به همراه آنتوسیانین استخراج شده از سیب زمینی بنفش به منظور افزایش ماندگاری میگو نیز مورد بررسی قرار گرفته است (40). به منظور تولید بستهبندی فعال جدید برای افزایش کیفیت و ماندگاری محصولات غذایی طی دوره نگهداری، افزودن پروتئین هیدرولیز شده به عنوان یک عامل ضد باکتری طبیعی امری مفید و ضروری میباشد.
در سالهاي اخیر، پروتئینهاي هیدرولیز شده با خواص آنتیاکسیدانی و سلامتی بخش از منابع حیوانی و گیاهی بسیاري تولید شدهاند. در بین منابع گیاهی و حیوانی مناسب براي تولید پروتئین هیدرولیز شده، منابع گیاهی به دلیل قیمت مناسبتر و آلرژي‌زایی کمتر، بیشتر مورد توجه قرار گرفتهاند (9، 23).
گونهی کاج تدا (Pinus faeda) نوعی درخت از دسته مخروطیان است، درختی است بزرگ با میوه مخروطی شکل که ارتفاع درخت به ۲۰ تا ۳۰ متر میرسد. میوه آن۱۰ تا ۱۹ سانتیمتر طول و 3 تا 4 سانتیمتر پهنا دارد. در ابتدا سبز رنگ بوده، ولی موقع رسیدن قهوهای میشود، فلسهای بارور نازک و لوزی تا تخم مرغی شکل و نوک آنها بریده یا دندانهدار است و دانهها بین فلسهای بازش قرار گرفته اند (41). بیشترین دانههای مورد مطالعه مغز بادام، فندق، گردو، پسته و بادام هندی است، با این حال، تنها تعداد کمی از محققان ویژگیهای دانه کاج را بررسی کردهاند. دانههای کاج حاوی محتوای بالای پروتئین، اسیدهای چرب اشباع نشده و فیبر غذایی، کربوهیدراتهای کم مولکولی، ویتامینها، اسید فولیک، نیاسین، آلفا-توکوفرول، مواد معدنی، فیتواسترولها و پلی فنولها میباشند (30، 35).
دانه کاج همچنین غنی از اسیدهای آمینه به ویژه اسیدهای آمینه ضروری که در بسیاری از موارد کمیاب هستند، مانند لایزین، متیونین و ترئونین میباشد، به همین دلیل، یکی از منابع مهم و با ارزش پروتئینهای گیاهی به شمار میرود. با توجه به اینکه دانه کاج با داشتن ترکیبات با ارزش تغذیهای بالا، اثرات مفیدی روی سلامتی انسان داشته و در عین حال منبع پروتئینی ارزان قیمتی است که سالانه به مقدار زیادی در سراسر جهان، به صورت ضایعات از دست میرود، میتوان به منظور مصارف انسانی، استخراج و یا هیدرولیز کرده و در فرمولاسیون مواد غذایی بهکار برد (21، 41).
هدف از انجام اين تحقيق، بررسي امكان توليد فيلم خوراكي برپايه نانو سلولز باکتریایی حاوی پروتئین هیدرولیز شده میوه دانه کاج بوه است و سپس خصوصيات فيزيكي و مکانیکی مانند نفوذپذيري نسبت به بخار آب، حلاليت فيلم، شفافي، ضخامت و مقاومت کششی فيلم خوراكي مورد بررسي قرار گرفت.
2-مواد و روش ها
2-1-مواد اولیه
بيست عدد مخروط گونهي كاج تدا در منطقه آستارا (ايران) از پنج اصله درخت تقريباً هم سن از يك منطقه جنگل كاري شده تهيه و به آزمایشگاه پژوهشکده اکولوژی خزر منتقل گردید. آنزیم آلکالاز (استخراج شده ازBacillus licheniformis) از شرکت نووازیم (دانمارک) تهیه و تا زمان مصرف در درجه حرارت 4 درجهسانتیگراد نگهداری شد. تمامی مواد شیمیایی مورد استفاده در آزمایش که از شرکت مرک آلمان تهیه شده بود، از درجه آزمایشگاهی برخوردار بودند.
2-2-تولید پروتئین هیدرولیز شده
دانه کاج توسط آسیاب کاملا خرد شده و بصورت آرد (با اندازه ذرات مش 40) در آمد و تا زمان استخراج پروتئین در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد. به منظور استخراج پروتئین خام، آرد دانه کاج با بافر 1/0 مولار تریس-HCL در pH 9 به نسبت 1:20 (w:v) با هم مخلوط شدند و این مخلوط در حمام آبی متحرک در دمای 35 درجه سانتیگراد به مدت 60 دقیقه با دور ثابت 150 دور در دقیقه نگهداری شد. سپس نمونهها با استفاده از سانتریفیوژ با دور ثابت 5000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند. مایع رویی تا زمان آنالیز در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد. غلظت پروتئین با استفاده از سرم آلبومین گاوی (BSA4) به عنوان استاندارد اندازهگیری شد (5).
سپس به منظور تولید پروتئین هیدرولیز شده، پیش تیمار حرارتی با حرارت دادن پروتئین خام در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 60 دقیقه تولید شد. سپس با اضافه کردن هیدروکسید سدیم 2/0 نرمال به pH بهینه فعالیت آنزیم آلکلاز (5/8)، رسانده شد. نمونهها در حمام آبی متحرک در دمای 80 درجهسانتیگراد برای تولید پروتئین هیدرولیز شده با دور ثابت 200 دور در دقیقه قرار داده شد، در ادامه آنزیم (1 درصد میزان پروتئین نمونه اولیه) به آن اضافه و پس از هر بار نمونهگیری (زمان های 30، 60، 90، 120، 150 دقیقه) و در پایان آزمایش (زمان 180 دقیقه) به منظور قطع واکنش آنزیمی در حمام آبی به مدت 15 دقیقه در دمای 95 درجهسانتیگراد قرار داده شدند. پروتئینهای هیدرولیز شده پس از خنک شدن با استفاده از سانتریفیوژ با دور ثابت 6700 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد، مایع شناور جمع آوری گردید و پروتئین هیدرولیز شده در فریزر نگهداری شد، پس از این مرحله با استفاده از دستگاه خشک کن انجمادی (مدل Operon FDB-550 ، ساخت کشورکره( بصورت پودر درآمد (24، 25).
ميزان هيدروليز به كمك تري كلرواستيك اسيد (TCA5) اندازهگيري شد. مبناي اين روش اندازهگيري درصد نسبت پروتئينهاي محلول در تري كلرواستيك اسيد 10 درصد به كل پروتئينهاي موجود در نمونه ميباشد. براي اين منظور 5 ميليليتر از نمونه با 5 ميليليتر تري كلرواستيك اسيد 20 درصد مخلوط گرديد و سپس با دور rpm 6700 و زمان 10دقيقه سانتريفیوژ شد. سپس مقدار پروتئين در فاز محلول اندازهگيري و ميزان هيدروليز از طريق فرمول 1 محاسبه گرديد (24):
فرمول 1:
( میزان پروتئین حل شده در محلول تری کلرو استیک اسید 10درصد / میزان پروتئین در نمونه)= درجه هیدرولیز
2-4- ترکیب اسید آمینه
پودر پروتئین هیدرولیز شده برای مدت 24 ساعت در دمای 110 درجهسانتیگراد با استفاده از هیدروکلریک 6 نرمال هیدرولیز کامل شد. سپس با استفاده از فنیل ایزو تیوسیانات (PITC)عمل مشتقسازی اسیدهای آمینه انجام شد. میزان اسیدهای آمینه کل با استفاده از دستگاه HPLC مدلSmart line (آلمان) با استفاده از ستون C18 با آشکارساز فلورسنت (RF-530) انجام شد (25).
2-5- تهیه فیلم نانوالیاف سلولز (TOBC)
نانو الیاف سلولز باکتریایی اکسید شده با روش اکسیداسیون با واسطه TEMPO در دمای اتاق مطابق روش گزارش شده توسط ایگوساکی6 و همکاران، (17) تولید شد. سلولز باکتریایی در محلول 1/0 مولار NaOH در دمای 98 درجهسانتیگراد جوشانده و با آب یونیزه (DI) شستشو داده شد تا اینکه pH خنثی و محیط باقیمانده و سلولهای چسبیده حذف شوند. سپس در دمای 40 درجهسانتیگراد به مدت 24 ساعت در خشککن انجمادی قرار داده شد. 5/0 گرم از سلولز باکتریایی خشک شده به قطعات کوچک بریده و توسط یک هموژنایزر با سرعت بالا (4000 دور در دقیقه) به مدت 20 دقیقه در سوسپانسیون نانوالیاف خرد شدند. سوسپانسیون نانوالیاف باکتری سلولز با افزودن mg/ml25/1 آب دیونیزه رقیق و سپس 1/0 گرم NaBrو 01/0 گرمTEMPO سوسپانسیون اضافه، و واکنش با ریختن 40 میلی لیتر NaClO14% تحت هم زدن مداوم آغاز شد. مقدار pH با افزودن محلول NaOH 5/0 مولار در محدوده 10-5/10 ثابت شد واکنش با افزودن 10 میلی لیتر اتانول پایان یافت و الیاف با محلول 1/0 مولار HCL اسیدی و سپس TOBC 3 بار با آب دیونیزه شسته شد. در نهایت، آب دیونیزه بهTOBC افزوده شد تا غلظت 1درصد به دست آید و در یخچال با دمای 4درجهسانتیگراد نگهداری شد.
برای تهیه فیلم های نانو الیاف سلولز حاوی پروتئین هیدرولیز شده، 100 گرم سوسپانسیون 1/0 درصد TOBC، غلظتهای مختلف پروتئین هیدرولیز شده (5/0، 1 و 5/1 درصد) در یک بشر ریخته و در دمای اتاق به مدت 48 ساعت با دور 600 بر روی دستگاه مغناطیسی هم زده شد. همزن مخلوط از طریق غشای استات سلولز (22/0 میکرومتر اندازه منافذ، قطر 47 میلی متر) با فیلتراسیون خلاء تحت فشار منفی در 1/0- مگاپاسکال فیلتر شد. پس از جدا کردن غشای فیلتر، فیلمهای به‌دست‌آمده به مدت 3 روز در دمای اتاق خشک و در دمای اتاق در تاریکی نگهداری شدند (40).
6-2- اندازهگیری خواص فیزیکی فیلمها
ضخامت نمونهها با یک میکرومتر دیجیتالی (001/0 میلی متر، Mitutoyoساخت ژاپن) اندازهگیري شد. اندازهگیري ها در پنج نقطه از هر نمونه تکرار شد. میانگین ضخامت محاسبه شده و در تعیین مقاومت کششی و نفوذ پذیري به بخار آب استفاده گردید (1).
2-6-2- اندازه گیري میزان رطوبت
قطعههای فیلم در ابعاد 3×3 میلیمتر بریده شد و هرکدام وزن گردید. مقدار اندازهگیری شده به عنوان وزن اولیه قرار داده شد. سپس قطعههای نمونه در آون 90 درجه سانتیگراد تا رسیدن به وزن خشک نهایی قرار داده شد، در ادامه نمونهها وزن و مقدار به عنوان وزن خشک در نظر گرفته شد (42).
2-6-3- ارزیابی حلالیت فیلم در آب
برای تعیین حلالیت، فیلمها در قطعات 2×3 سانتی متر بریده شد و سپس در دیسکاتور حاوی سیلکاژل به مدت 2 روز قرار داده شدند. پس از طی این مدت فیلمها با استفاده از ترازوی با دقت یک هزارم گرم توزین شده و در بشر حاوی 100 میلی لیتر آب مقطر قرار گرفتند (42). درصد حلالیت از رابطه زیر محاسبه گردید:
100×وزن خشک اولیه/ (وزن خشک نهایی-وزن خشک اولیه) = درصد حلالیت
2-6-4- اندازه گیري نرخ عبور بخار آب از درون فیلم ها (7WVP)
براي انجام این آزمایش از روش شماره 96 E مصوب ASTM استفاده گردید (1). براي انجام آزمایش درون سلول هاي اندازه گیري نفوذپذیري، آب ریخته شد. سپس سطح سلول بوسیله روکش با استفاده از پارافین مذاب پوشانده شد. سلول ها درون دسیکاتور حاوي سیلیکاژل قرار گرفتند. آب در دماي 25 درجه سانتیگراد، رطوبت 100 درصد ایجاد میکند. اختلاف رطوبت در دو سمت روکش در دماي 25 درجه سانتیگراد گرادینت فشار بخاري معادل103 × 337/2 پاسکال ایجاد میکند. تغییرات وزن سلول ها طی زمان با استفاده از یک ترازوي دیجیتال با دقت0001/0 گرم اندازه گیري شد. در تمام نمونه ها با رسم منحنی تغییرات وزن سلول نسبت به زمان، یک خط راست (99/0(R2> حاصل شد. نرخ انتقال بخار آب معادل با شیب خطوط حاصله تقسیم بر سطح سلول بود و از رابطه زیر حاصل شد. سطح سلول ها00287/0 متر مربع بود.
سطح سلول/ شیب خط = نرخ انتقال بخار آب
نمونه هاي فيلم به صورت چهار گوش بريده شدند و در سمت دروني سلول اسپكتروفوتومتر (طيف نورسنج) قرار گرفتند. طيف جذب (200-800 نانومتر) براي هر نمونه با بكار گيري اسپكتروفتومتر، ثبت شد و کدورت فیلم با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد (27):
ضخامت فیلم (میلی متر)/ جذب در طول موج 600 نانومتر= کدورت فیلم
2-7- اندازهگیري خواص مکانیکی فیلمها
آزمون های مکانیکی فیلم ها بر اساس روش اصلاح شده 02-ASTM D0882 صورت گرفت. فیلم ها در قطعات cm ۷۶۱ بریده و تحت شرایط رطوبت نسبی ۵۰درصد و دمای 25 درجه سانتیگراد مشروط شدند. ضخامت آنها در ۵ نقطه اندازهگیری و ضخامت متوسط آنها تعیین شد. ویژگی های مکانیکی فیلم (میزان کشش پذیری (درصد) و مقاومت به کشش (مگاپاسکال)) با استفاده از اینستران اندازه گیری شد. در دستگاه اینستران فاصله بین دو فک mm ۵۰، سرعت حرکت فک بالایی ۵۰ میلی متر بر دقیقه و فک پایینی ثابت بود (1).
2-8- اندازهگیری فعالیت آنتی اکسیدانی فیلمها
درصد به دام اندازي راديكال (2- 2-دي فنيل- 1 –پيكریل هیدرازیل) DPPH با استفاده از روش تغيير يافته سیریپاتوران و هارت8 (36) انجام گرفت. ۲۵ میلی گرم از فیلم در ۳ میلی لیتر آب مقطر به مدت ۵ دقیقه به آرامی هم زده شد. سپس 2/8 میلی لیتر از عصاره فیلم به لوله های آزمون حاوی 2/0 میلی لیتر محلول یک میلی مولار DPPH در متانول افزوده شد و به مدت ۳۰ دقیقه در اتاق نگهداری شد. میزان جذب لوله های آزمون و شاهد در طول موج ۵۱۷ نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه گیری شد. درجه بی رنگ شدن این ترکیب بیانگر قدرت به دام اندازی رادیکال آزاد توسط آنتی اکسیدان مربوطه می باشد. در نهایت با استفاده از فرمول زیر، درصد فعالیت به دام اندازی رادیکال های آزاد DPPH تعیین شد.
100]×(میزان جذب کنترل / میزان جذب نمونه – میزان جذب کنترل)- 1 [ =درصد پاک کنندگی رادیکال آزاد DPPH
2-9- اندازهگیری فعالیت ضد میکروبی فیلمها
سوش میکروبهای استافیلوکوکوس اروئوس (PTCC 1189) و اشرشیاکلی (PTCC 1399) از کلکسیون میکروبی دانشگاه تهران تهیه گردید. ابتدا به کمک لوپ استریل، مقداری از هر باکتری را از داخل آمپول های استریل حاوی آن برداشته و به ۱۰ میلی لیتر محیط کشت BHI Broth اضافه شد. محیط کشت به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد، گرمخانه گذاری و پس از طی این مدت از لوله ها با استفاده از لوپ استریل روی محیط کشت Nutrient Agar کشت خطی داده شد. پلیت ها به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد، گرمخانه گذاری گردید. ۳ تا ۵ کلنی که به خوبی ایزوله شده بود و شکل یکسانی داشت، با استفاده از سواب استریل، به لوله های حاوی ۵ میلی لیتر سرم فیزیولوژی انتقال داده شد. به کمک اسپکتروفتومتر در طول موج ۶۲۵ کدورت سوسپانسیون ها مورد بررسی قرار گرفت. وقتی کدورت در حد نیم مک فارلند، که معادل جمعیتی در حدود CFU/g 108رسید، بعد از حدود ۱۵ دقیقه سوسپانسیون، آماده تلقيح شد. با استفاده از سواب استریل، از هر کدام از لوله های حاوی سوسپانسیون روی محیطهای اختصاصی خود کشت داده شد، به طوری که تمام سطح پلیت با سوسپانسیون آغشته گردید. برای این کار هر بار ۶۰ درجه پلیت چرخانده شده و در آخر دور پلیت نیز تلقیح شد تا تراکم مطلوب به دست آید (7).
برای انجام آزمون های تشخیص فعالیت ضدمیکروبی، فیلم ها به شکل دیسک های دایره ای به قطر ۶ میلی متر با استفاده از چاقوی دایره ای بریده شد. با استفاده از روش Agar diffusion فیلم های خوراکی بریده شده به قطر ۶ میلی متر را روی محیط های کشت تلقيح شده با سوسپانسیون در فاصله مناسب با هم جاگذاری شده و پلیت ها به مدت ۲۴ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد قرار گرفت. پس از طی مدت زمان مورد نظر، قطر هاله شفاف در اطراف فیلم بر اساس میلیمتر گزارش شد (7).
2-8- تجزیه و تحلیل آماری
کلیه آزمایشها در طرح آزمایشی کاملاً تصادفی در سه تکرار انجام شد و نتیجه بهصورت میانگین با انحراف معیار گزارش گردید آنالیز آماری تیمارها توسط جدول آنالیز واریانس (ANOVA) با استفاده از نرم افزار (SPSS version 18) صورت گرفت. برای بیان اختلاف معنیداری میانگینها از آزمون دانکن در سطح 05/0 استفاده شد و نمودارها با نرم‌افزار Microsoft Excel ترسیم شد.
1-3- بررسی مقادیر پروتئین و درجه هیدرولیز
مقادیر پروتئین ابتدایی دانه کاج 78/0±3/28درصد و مقادیر پروتئین در زمان 180 دقیقه برابر با 12/3±21/90درصد بوده است.
درجه هیدرولیز به عنوان یک پارامتر ناظر بر میزان هیدرولیز پروتئین مورد استفاده قرار می گیرد، این فاکتور بیشتر به عنوان یک شاخص جهت مقایسه میان پروتئین های هیدرولیز شدهی مختلف کاربرد دارد. روند هیدرولیز (جدول 1) در 90 دقیقه اول با سرعت بیشتری انجام شد و سپس سرعت هیدرولیز تا پایان آزمایش کند شد و با افزایش زمان هیدرولیز، در زمان 150 دقیقه بهبود قابل توجهی در درجه هیدرولیز مشاهده نشد. که نشان می دهد که حداکثر شکافتگی پپتیدها در طول 90 دقیقه هیدرولیز رخ داده است. اما در مجموع بالاترین مقادیر درجه هیدرولیز در زمان 150 دقیقه مشاهده شد و در این زمان اختلاف معنی داری با زمان 180 دقیقه نداشت. این نتایج با نتایج هیدرولیز گلوتن گندم (20) و هیدرولیز زرده تخم مرغ (2) مطابقت داشت.
جدول 1: مقادیر درجه هیدرولیز پروتئین هیدرولیز شده
درجه هیدرولیز | آزمون زمان هیدرولیز |
e94/0±75/24 | 30 |
d61/0±69/34 | 60 |
c78/0±25/42 | 90 |
b45/0±78/45 | 120 |
a75/0±99/46 | 150 |
a28/0±01/47 | 180 |
1) همه اعداد بر حسب درصد بیان شده است (میانگین ± انحراف از معیار)
2) اعداد در یک ستون با حروف متفاوت اختلاف معنی دار دارند.(a, b, c,..)
2-3- ترکیب اسیدآمینه
در مطالعه حاضر (جدول 2) 17 اسید آمینه شناسایی شد که از میان آنها 8 اسید آمینه ضروری و 9 اسید آمینه غیر ضروری بوده اند. بر اساس نتایج بدست آمده، بالاترین مقادیر اسید آمینه مربوط به آرژنین 88/21درصد و پس از آن گلوتامیک اسید 33/17درصد (اسیدهای آمینه غیر ضروری) و سپس لوسین 75/6درصد (اسیدهای آمینه ضروری) بوده است. در مجموع، پروتئینهای دانه کاج سرشار از آرژنین و گلوتامیک اسید گزارش شده اند که با نتایج تحقیق حاضر همخوانی دارد (21). Matthäus و همکاران، (21) به بررسی ترکیبات اسید آمینه 41 نمونه دانه کاج (با 22 گونه متفاوت) پرداختند، آنها نیز اعلام نمودند17 اسید آمینه در دانه کاج موجود می باشد که بالاترین اسید آمینه دانه کاج مربوط به آرژنین و پس از آن گلوتامیک اسید میباشد.
اسیدهای آمینه آبگریز (HAA9) (فنیل آلانین، پرولین، متیونین، آلانين، لوسین، ایزولوسین، تیروزین، والين) و اسیدهای آمینه آروماتیک (AAA10) (فنیل آلانین، هیستیدین، تریپتوفان، تیروزین)، مسئول اغلب خواص کاربردی و زیستی پروتئین های هیدرولیز شده همچون فعالیت آنتی اکسیدانی، ضد التهابی، ضد سرطان و کاهش قند و فشار خون می باشند (13، 43). مجموع اسیدهای آمینه آبگریز و آروماتیک در مطالعه حاضر به ترتیب برابر با 90/29 و 17/9 بوده است.با توجه با مقادیر بالای آنها هیدرولیز تولیدی می توان انتظار اثرات زیست فعال بودن آنان را در میزبان داشت. همچنین مقادیر ایزولوسین، لوسین، تروئنین، والین، هیستدین و تیروزین بالاتر از توصیه‌های FAO11/WHO12 (8) برای پروتئینهای حیوانی می باشد (به جز فنیل آلانین و لایزین) بنابر این به نظر می رسد پروتئین دانه کاج از کیفیت غذایی مناسبی برخوردار هستند و می تواند به عنوان منبع پروتئین در رژیم غذایی دام و طیور نیز مورد استفاده قرار گیرد.
جدول 2: ترکیب اسید آمینه موجود در پروتئین هیدرولیز شده
FAO/ WHO, 1990 | آلکالاز | اسید آمینه (گرم در 100 گرم نمونه) |
9/1 | 66/2 | هیستدین1 |
80/2 | 85/2 | ایزو لوسین1 |
60/6 | 75/6 | لوسین1 |
80/5 | 59/2 | لایزین1 |
| 30/1 | متیونین1 |
30/6 | 78/3 | فنیل آلانین1 |
4/3 | 45/3 | تروئنین1 |
5/3 | والین1 | |
| 78/5 | آسپارتیک اسید |
| 88/21 | آرژنین |
| 57/5 | پرولین |
| 13/5 | سرین |
| 33/3 | آلانین |
| 47/3 | سیستئین |
| 33/17 | گلوتامیک اسید |
1/1 | 73/2 | تیروزین |
| 84/5 | گلایسین |
| 90/29 | HAA2 |
| 17/9 | AAA3 |
| 03/98 | میزان اسید آمینه کل |
2مجموع اسیدهای آمینه آبگریز (آلانین، والین، ایزولوسین، لوسین، تیروسین، فنیل آلانین، تریپتوفان، پرولین، متیونین و سیستئین)
3مجموع مقادیر اسیدهای آمینه آروماتیک ) فنیل آلانین، هیستیدین، تریپتوفان و تیروزین(
3-3- ویژگیهای فیزیکی فیلم
1-3-3-بررسی مقادیر رطوبت و حلالیت
مقادیر رطوبت (نمودار 1) در مطالعه حاضر مابین 25/11-99/10 درصد بوده است. افزودن پروتئین هیدرولیز شده دانه کاج تاثیر معنی داری بر مقادیر رطوبت نداشته است. این نتایج با نتایج سالگودا13 و همکاران (31) در ارتباط با فیلم مرکب دانه سویا و پروتئین آفتابگردان حاوی پروتئین هیدرولیز شده پلاسما همخوانی دارد. آنها نیز اعلام نمودند افزودن پروتئین هیدرولیز شده تاثیر بر مقادیر رطوبت فیلم نداشت. همچنین دیالیورا14 و همکاران (5) اعلام نمودند افزودن پروتئین هیدرولیز شده پنبه دانه به فیلم آلژینات تاثیر معنی داری بر مقادیر رطوبت فیلم ندارد. مقادیر رطوبت در مطالعه آنها مابین 22/12- 75/10 درصد بوده است.
نمودار 1: درصد رطوبت در فیلم ها
حلالیت و محتوى رطوبت دو فاکتور مهم فیلم هاى زیست تخریب پذیر مى باشند که بر مقاومت فیلم به آب به ویژه در محیط‌هاى مرطوب تاثیرگذار مىباشند. نتایج مربوط به حلالیت (نمودار 2) و رطوبت در مطالعه حاضر باهم، همخوانی داشت. اختلاف معنی داری در مقادیر حلالیت در فیلمهای مختلف مشاهده نشد و مقادیر حلالیت ما بین 84/19-88/18 بوده اشت. بنابراین حلالیت فیلم نانو سلولز با افزودن پروتئین هیدرولیز شده نیز تغییر معنی داری نکرده است (05/0<P). این نتایج با نتایج Giménez و همکاران (12) فیلم ژلاتین پوست گل ماهی مرکب15 (Dosidicus gigas) حاوی ژلاتین هیدرولیز شده ماهی مرکب همخوانی دارد. آنها نیز اعلام نمودند افزودن ژلاتین هیدرولیز شده در سطح 10-0 درصد تاثیری بر مقادیر حلالیت فیلم نداشت. همچنین این نتایح با نتایج دیالیورا و همکاران (5) پروتئین هیدرولیز شده پنبه دانه به فیلم آلژینات و نتایج با نتایج سالگودا و همکاران (32) در ارتباط با فیلم پروتئین آفتابگردان همخوانی دارد.
نمودار 2: درصد حلالیت در فیلم ها
ضخامت از فاکتورهاي مهم فیلم است که به طور مستقیم روي ویژگی هاي بیولوژیکی و ماندگاري محصول بسته بندي شده تأثیر میگذارد. همچنین یک عامل اساسی است که بر خواص مکانیکی، شفافیت و WVP فیلم ها نیز تأثیر میگذارد (6). نتایج مربوط به مقادیر ضخامت (نمودار 3) در مطالعه حاضر نشان داد با افزودن پروتئین هیدرولیز شده به فیلم میزان ضخامت افزایش یافت به طوری که کمترین مقادیر ضخامت در فیلم نانوسلولز بوده است (94/19 میکرومتر) و بیشترین مقادیر در فیلم نانو سلولز+ پروتئین هیدرولیز شده 5/1درصد مشاهده شد (45/27 میکرومتر) )05/0>P). علت این امر، احتمالاً به دلیل افزایش محتوای جامد پس از افزودن پروتئین هیدرولیز شده می باشد، که نتایج مشابهی توسط دیالیورا و همکاران (5) در ارتباط با پروتئین هیدرولیز شده پنبه دانه به فیلم آلژینات و قاسمی16 و همکاران (11) در ارتباط با فیلم کربوکسی متیل سلولز حاوی پروتئین هیدرولیز شده اسکلت کپور نقرهای ماهی مشاهده شد.
نمودار 3: ضخامت فیلم ها
3-3-3-بررسی نفوذ پذیری به بخار آبWVP
یکی از مهم ترین عوامل در تعیین مناسب بودن یک فیلم جهت بسته بندی مواد غذایی، نفوذپذیری بخار آب (WVP) میباشد، یکی از علل افت کیفیت ماده غذایی، مبادلات رطوبت بین ماده غذایی و محیط اطراف آن است و فیلم باید از انتقال رطوبت جلوگیری کند و یا آن را کاهش دهد (4). به طور کلی عوامل مختلفی مانند نوع ترکیبات و میزان برهمکنش بین آنها، ضخامت، حلالیت و نفوذپذیری مولکول های بخار آب در ماتریس فیلم بر میزان WVP تأثیر میگذارد (11). نتایج مربوط به مقادیر WVP (نمودار 4) در مطالعه حاضر نشان داد با افزودن پروتئین هیدرولیز شده به فیلم میزان WVP افزایش یافت به طوری که کمترین مقادیر WVP در فیلم نانوسلولز بوده است (×10-11 gs-1m-1Pa-12/5) و بیشترین مقادیر در فیلم نانو سلولز+ پروتئین هیدرولیز شده 5/1درصد مشاهده شد (×10-11 gs-1m-1Pa-05/6) )05/0>P). علت این امر، دارا بودن اثر پلاستی سایزری پروتئین هیدرولیز شده با وزن مولکولی کم می باشد. وجود پروتئین منجر به افزایش گروه های آبدوست در ساختار فیلم شده و متعاقباً وجود مولکول های آب بیشتر در آن منجر به افزایش WVP فیلم می شود همچنین افزایش ضخامت لایههای پروتئین هیدرولیز شده نیز بر مقادیر WVP تاثیر گذار می باشد (5، 11). نتایج مشابهی توسط دیالیورا و همکاران (5) در ارتباط با پروتئین هیدرولیز شده پنبه دانه به فیلم آلژینات و قاسمی و همکاران (11) در ارتباط با فیلم کربوکسی متیل سلولز حاوی پروتئین هیدرولیز شده اسکلت کپور نقرهای ماهی، مشاهده شد.
نمودار 4: نفوذپذیری فیلمها در برابر بخارآب
4-3-3- بررسی مقادیر کدورت
ویژگیهای نوری فیلمها، مانند رنگ، شفافیت و عبور نور، ویژگیهای مهمی هستند که بر ظاهر، پذیرش، تجاری‌سازی، بازارپسندی و مناسب بودن آنها برای کاربردهای مختلف تأثیر می‌گذارند. نتایج مربوط به مقادیر کدورت (نمودار 5) در مطالعه حاضر نشان داد با افزودن پروتئین هیدرولیز شده به فیلم میزان کدورت افزایش یافت به طوری که کمترین مقادیر کدورت در فیلم نانوسلولز بوده است (12/1) و بیشترین مقادیر در فیلم نانو سلولز+ پروتئین هیدرولیز شده 5/1درصد مشاهده شد (61/1) )05/0>P). افزودن پروتئین هیدرولیز شده سبب افزایش کدورت فیلم می شود، بنابراین شفافیت را کاهش و کدورت را افزایش میدهد (11). نتایج مشابهی توسط دیالیورا و همکاران (5) در ارتباط با پروتئین هیدرولیز شده پنبه دانه به فیلم آلژینات مشاهده شد، آنها اعلام نمودند افزایش پراکندگی نور (یعنی کاهش شفافیت) در ارتباط با افزایش تجمع پروتئین در فیلم آلژینات می باشد. تغییرات در شفافیت فیلم ممکن است سبب کاهش تقاضا مصرف کننده ها باشد، اما سرعت انتقال نور مرئی کم یک مزیت برای بسته بندی مواد غذایی است زیرا وجود نور می تواند باعث تغییرات رنگ و طعم، از دست دادن مواد مغذی و در نهایت فساد اکسیداتیو مواد غذایی شود.
نمودار 5: کدورت فیلمها
4-3- بررسی ویژگیهای مکانیکی فیلم
خواص مکانیکی بیانگر قدرت فیلم برای حفظ یکنواختی ماده غذایی بسته بندی شده است. خواص مکانیکی فیلمهای خوراکی تحت تأثیر نوع و غلظت فیلم، حلال و نرم کننده، روش تولید فیلم، رطوبت نسبی، دمای اندازهگیری و پوششدهی با سایر زیست پلیمرها قرار دارد. معمولا با افزودن مواد ضدمیکروبی خواص کششی فیلم های زیست تخریب پذیر تضعیف میگردد (19). مقادیر مقاومت کششی (نمودار 6) در فیلم نانو سلولز برابر با 62/102 مگاپاسکال و حداکثر کشش تا قبل از نقطه پارگی در فیلم نانو سلولز 62/3 در صدبوده است که نشاندهنده رفتار مکانیک مناسب فیلم نانو سلولز می باشد، این نتایج تقریبا با نتایج Wen و همکاران (40) در ارتباط با فیلم سلولز باکتریایی هم خوانی داشت آنها مقادیر مقاومت کششی را 30/113 مگا پاسکال و حداکثر کشش تا قبل از نقطه پارگی 31/2درصد اعلام نمودند. افزودن پروتئین هیدرولیز شده سبب کاهش مقاومت کششی و افزایش حداکثر کشش تا قبل از نقطه پارگی شد )05/0>P) به طوریکه کمترین میزان مقاومت کششی و بیشترین میزان حداکثر کشش تا قبل از نقطه پارگی (نمودار 7) در فیلم نانو سلولز+ پروتئین هیدرولیز شده 5/1درصد مشاهده شد (به ترتیب 42/91 مگاپاسکال و 14/4درصد). جیمنز17 و همکاران، (12) اعلام نمودند، پپتیدهای کوچک برهمکنش زنجیره به زنجیره ضعیف تری را با پیوند هیدروژنی ایجاد میکنند. خواص مکانیکی فیلمها ارتباط نزدیکی با توزیع و چگالی برهم‌کنش‌های درون و بین مولکولی بین زنجیره‌های پلیمری در شبکه‌های فیلم دارد. بنابراین، افزودن پروتئین هیدرولیز شده به فیلم نانوسلولز می‌تواند با کاهش نیروهای بین مولکولی و افزایش تحرک زنجیره‌های پروتئینی، بر خواص مکانیکی لایه‌ها تأثیر بگذارد (12).
نمودار 6: مقاومت کششی فیلمها
نمودار 7: حداکثر کشش تا قبل از نقطه پارگی فیلمها
5-3-اندازهگیری خاصیت آنتی اکسیدانی فیلمها
با توجه به نتایج کمترین مقادیر خاصیت آنتی اکسیدانی (نمودار 8) در فیلم نانوسلولز بوده است.با افزودن پروتئین هیدرولیز شده به فیلم مهار رادیکال آزاد DPPH18 فیلمها افزایش یافت و با افزایش غلظت پروتئین هیدرولیز شده خاصیت آنتی اکسیدانی بالاتری مشاهده شد. به طوری که بیشترین میزان مهار رادیکال آزاد DPPH فیلمها در فیلم نانو سلولز+ پروتئین هیدرولیز شده 5/1ردصد مشاهده شد (07/86 درصد) )05/0>P). علت این امر، خاصیت آنتی اکسیدانی پپتیدها میباشد. پپتیدها با شکستن زنجیره واکنش‌های رادیکال آزاد می توانند سرعت فرآیندهای اکسیداسیون آنزیمی و غیر آنزیمی را کاهش دهند. پپتیدهای آنتیاکسیدانی به طور کلی از 3 تا 16 اسید آمینه تشکیل شدهاند و اجزای اصلی آنها هیستیدین، متیونین، تیروزین، سیستئین و لایزین است که این اسیدهای آمینه قدرت ضد اکسایشی بالایی دارند (34، 37). دارا بودن خاصیت آنتی اکسیدانی در پروتئینهای هیدرولیز شده و پپتیدهای زیست فعال گیاهی، نظیر کلزا، هسته انگور، کنجاله کنجد و جوانه شبدر در شرایط آزمایشگاهی توسط سایر محققین نیز گزارش شده است (10، 22، 23، 39). دیالیورا و همکاران (5) نشان داد که افزایش غلظت پروتئین هیدرولیز شده پنبه دانه در فیلمهای آلژینات، سبب افزایش فعالیت آنتیاکسیدانی فیلمها (افزایش ظرفیت حذف رادیکالDPPH) می شود.
نمودار 8: خاصیت آنتی اکسیدانی فیلمها
6-3-اندازهگیری خاصیت ضد میکروبی فیلمها
مکانیسم اثر پپتید ضد میکروبی عمدتاً مبتنی بر تعامل الکترواستاتیکی پپتیدها با غشای سلولی میکروارگانیسمها است. پپتیدهای ضد میکروبی با عملکرد نفوذپذیری غشاء مشخص میشوند. آنها میتوانند وارد غشاء شوند و در نتیجه آن را مختل کنند. با توجه به نتایج (جدول 3) کمترین مقادیر خاصیت ضد میکروبی در فیلم نانوسلولز بوده است با افزودن پروتئین هیدرولیز شده به فیلم خاصیت ضد میکروبی فیلمها افزایش یافت به طوری که بیشترین میزان خاصیت ضد میکروبی فیلمها علیه هر دو باکتری (اشیرشیاکلی و استافیلوکوکوس اروئوس) در فیلم نانو سلولز+ پروتئین هیدرولیز شده 5/1درصد مشاهده شد. پتانسیل ضد میکروبی فیلم های حاوی پپتیدها ممکن است به دلیل زیست فعال بودن آنها باشد مکانیسم اثر ضد میکروبی پپتیدها عمدتاً مبتنی بر تعامل الکترواستاتیکی پپتیدها با غشای سلولی میکروارگانیسم ها است. پپتیدهای ضد میکروبی با عملکرد نفوذپذیری غشاء، میتوانند وارد غشاء شوند و در نتیجه آن را مختل کنند. این تغییرات باعث عدم تعادل در محتویات سلولی میشود که فرآیندهای همانندسازی، رونویسی و ترجمه توالی DNA را با اتصال به اهداف خاص درون سلولی، از نظم خارج میکند (5، 29، 37). همچنین خاصیت ضد میکروبی فیلمهای حاوی پروتئین هیدرولیز شده علیه باکتری گرم مثبت استافیلوکوکوس اورئوس بالاتر از باکتری گرم منفی اشیرشیاکلی بود. باکتری های گرم منفی دارای یک پوشش سلولی هستند که از نظر ساختاری و عملکردی پیچیدهتر از پوشش سلولی باکتری های گرم مثبت است. باکتری های گرم منفی دارای مولکول های لیپوپلی ساکارید در غشاهای خود هستند که با کاهش تشکیل ترکیبات آبگریز به عنوان یک مانع عمل می کنند (26، 33).
جدول 3: فعالیت ضد میکروبی پروتئینهاي هیدرولیز شده
استافیلوکوکوس اروئوس | اشیرشیاکلی | باکتری نوع فیلم |
- | - | نانو سلولز |
++ | - | نانو سلولز+پروتئین 5/0درصد |
+++ | ++ | نانو سلولز+پروتئین 1درصد |
+++ | +++ | نانو سلولز+پروتئین 5/1درصد |
-<7mm، +=7-13 mm، ++=13-18 mm،+++>18 mm
4- نتیجه گیری نهایی
بر اساس نتایج مطالعه حاضر، پروتئین هیدرولیز شده دارای 17 اسید آمینه بود که از میان آنها 8 اسید آمینه ضروری و 9 اسید آمینه غیر ضروری بوده اند و بالاترین مقادیر اسید آمینه مربوط به آرژنین 88/21درصد و پس از آن گلوتامیک اسید 33/17درصد (اسیدهای آمینه غیر ضروری) و سپس لوسین 75/6درصد (اسیدهای آمینه ضروری) بوده است. همچنین نتایج مربوط به ویژگیهای فیلم نشان داد افزایش غلظت پروتئین سبب کاهش مقاومت کششی و افزایش کشش تا قبل از نقطه پارگی فیلم نانو سلولز شد و افزودن پروتئین هیدرولیز شده بر روی رطوبت و حلالیت تاثیر معنی داری نداشت، اما سبب افزایش نفوذ پذیری بخار آب و افزایش کدورت شد همچنین خاصیت آنتی اکسیدانی و ضد میکروبی با افزایش غلظت افزایش یافت. بنابراین کاربرد این فیلم ها به علت دارا بودن خاصیت آنتی اکسیدانی و ضد میکروبی می تواند در نگهداری مواد غذایی بسیار مفید باشند البته برای افزایش کارایی این نوع بسته بندیها در آینده تحقیقات بیشتری در زمینه زمان زیست تخریب پذیری و تأثیر این پلیمرها در ویژگیهای ماده غذایی لازم است.
5- منابع
1. ASTM. 1996. Standard test methods for tensile properties of thin plastic sheeting, D882-91. Annual book of ASTM. Philadelphia, PA: American society for Testing and Material.
2. Bao, Zj., Zhao, Y., Wang, Xy. et al. 2017. Effects of degree of hydrolysis (DH) on the functional properties of egg yolk hydrolysate with alcalase. J Food Sci Technol. 54: 669–678 (2017).
3. Cazon, P., Velazquez, G., Ramirez, J. A., & Vazquez, M. 2017. Polysaccharide-based films and coatings for food packaging: A review. Food Hydrocolloids. 68: 136–148.
4. Dashipour, A., Razavilar, V., Hosseini, H., Shojaee-Aliabadi, S., German, J. B., Ghanati, K., Khaksar, R. 2015. Antioxidant and antimicrobial carboxymethyl cellulose films containing Zataria multiflora essential oil. International Journal of Biological Macromolecules. 72: 606-613.
5. De Oliveira Filho, J. G. de, Rodrigues, J. M., Valadares, A. C. F., Almeida, A. B. de, Lima, T. M. de, Takeuchi, K. P., … Egea, M. B. 2019. Active food packaging: Alginate films with cottonseed protein hydrolysates. Food Hydrocolloids. 92: 267-275.
6. Ebrahimi, B., Mohammadi, R., Rouhi, M., Mortazavian, A. M., Shojaee-Aliabadi, S., & Koushki, M. R. 2018. Survival of probiotic bacteria in carboxymethyl cellulose-based edible film and assessment of quality parameters. LWT-Food Science and Technology. 87: 54- 60.
7. Emiroğlu, Z. K., Yemiş, G. P., Coşkun, B. K., Candoğan, K. 2010. Antimicrobial activity of soy edible films incorporated with thyme and oregano essential oils on fresh ground beef patties. Meat Sci. 86 (2): 283-8.
8. FAO/WHO 1991. Protein quality evaluation. Rome, Italy: Food and Agricultural Organization of the United Nations. 66.
9. Feyzi, S., Varidi, M., Zareb, F., Varidi, M.J. 2015. Extraction Optimization of Fenugreek Seed Protein, Science of food and agriculture. 15: 3165–3176.
10. Ghanbarinia, S. H., Ariaii, P., Safari, R., Najafian, L. 2022. The effect of hydrolyzed sesame meal protein on the quality and shelf life of hamburgers during refrigerated storage. Animal science journal. 93: 1, e13729.
11. Ghasemi, Zh., Alizadeh Khaled-Abad, M., Almasi, H., Nikoo, M. 2022. Carboxymethyl cellulose based bioactive edible films with Lactobacillus casei and fish protein hydrolysates. Iranian Food Science and Technology Research Journal. 17 (6): 85-102.
12. Giménez, B., Gómez-Estaca, J., Alemán, A., Gómez-Guillén, M. C., Montero, M. P. 2009. Improvement of the antioxidant properties of squid skin gelatin films by the addition of hydrolysates from squid gelatin. Food Hydrocolloids. 23: 1322–1327.
13. Guo, J., Swanepoel, A., Joao, R., Salze, G., Rhodes, M. and Davis, D.A., 2020. Hydrolysed salmon meal as a replacement for salmon meal in practical diets for Pacific white shrimp (Liptopenaeus vannamei). Aquaculture Nutrition. 26(2): 368-381.
14. Huang, C., Ji, H., Yang, Y., Guo, B., Luo, L., Meng, Z., et al. 2020a. TEMPO-oxidized bacterial cellulose nanofiber membranes as high-performance separators for lithium-ion batteries. Carbohydrate Polymers. 230, Article 115570.
15. Huang, X., Luo, X., Liu, L., Dong, K., Yang, R., Lin, C., et al. (2020b). Formation mechanism of egg white protein/κ-carrageenan composite film and its application to oil packaging. Food Hydrocolloids. 105.
16. Hubbe. M. A., Rojas, O.J., Lucia, L.A., & Sain, M. 2008. Cellulosic Nanocomposites: A Review. BioResources. 3: 929-980.
17. Isogai, A., Saito, T., Fukuzumi, H. 2010. TEMPO-oxidized cellulose nanofibers. Nanoscale. 3: 71–85.
18. Jun, S. H., Park, S. G., & Kang, N. G. 2019. One-pot method of synthesizing TEMPO-oxidized bacterial cellulose nanofibers using immobilized TEMPO for skincare applications. Polymers. 11(6): 1044.
19. Kechichian, V., Ditchfield, C., Veiga- Santos, P., & Tadini, C. C. 2010. Natural antimicrobial ingredients incorporated in biodegradable films based on cassava starch. LWT- Food Science and Technology. 43(7): 1088- 1094.
20. Kong, X., Zhou, H., Qian, H. 2007. Enzymatic hydrolysis of wheat gluten by proteases and properties of the resulting hydrolysates. Food Chem. 102: 759–763.
21. Matthäus, B., Li, P., Ma, F., Zhou, H., Jiang, J., Özcan, M.M., 2018. Is the Profile of Fatty Acids, Tocopherols, and Amino Acids Suitable to Differentiate Pinus armandii Suspicious to Be Responsible for the Pine Nut Syndrome from Other Pinus Species Chem. Biodivers. 15 (1): e1700323.
22. Mirsadeghi Darabi, D., Ariaii, P., Safari, R., Ahmadi, M. 2022. Effect of clover sprouts protein hydrolysates as an egg substitute on physicochemical and sensory properties of mayonnaise. Food Science & Nutrition. 10: 253–263.
23. Mirzapour, Z., Ariaii, P., Safari, R. et al. 2022. Evaluation the Effect Hydrolyzed Canola Meal Protein with Composite Coating on Physicochemical and Sensory Properties of Chicken Nugget. Int J Pept Res Ther. 28: 97.
24. Nemati, M., Javadian, S. R., Ovissipour, M. and Keshavarz, M. 2012. A study on the properties of alosa (Alosa caspia) by-products protein hydrolysates using commercial enzymes. World Applied Sciences Journal. 18 (7): 950-956.
25. Otoni, C. G., de Moura, M. R., Aouada, F. A., Camilloto, G. P., Cruz, R. S., Lorevice, M. V., Mattoso, L. H. 2014. Antimicrobial and physical-mechanical properties of pectin/papaya puree/cinnamaldehyde nanoemulsion edible composite films. Food Hydrocolloids. 41: 188-194.
26. Ovissipour, M., Rasco, B., Shiroodi, S.G., Modanlow, M., Gholami, S. and Nemati, M. 2013. Antioxidant activity of protein hydrolysates from whole anchovy sprat (Clupeonella engrauliformis) prepared using endogenous enzymes and commercial proteases. Journal of Food Science and Agriculture. 93: 1718–1726.
27. Peng, Y., Li, Y. 2014. Food Hydrocolloids Combined effects of two kinds of essential oils on physical , mechanical and structural properties of chitosan films. Food Hydrocolloids. 36: 287–293.
28. Pourjavaher, S., Almasi, H., Meshkini, S., Pirsa, S., Parandi, E. 2017. Development of a colorimetric pH indicator based on bacterial cellulose nanofibers and red cabbage (Brassica oleraceae) extract. Carbohydrate Polymers. 156: 193–201.
29. Rai, M., Pandit, R., Gaikwad, S., K¨ovics, G. 2016. Antimicrobial peptides as natural bio-preservative to enhance the shelf-life of food. Journal of Food Science & Technology. 53 (9): 3381–3394.
30. Safari, S., Yousefi, M., Khawari, A., Sajjadi, M., Nazari, ML., Alipour, A., Salehi, MH., Mousavi, Y. 2017. Effect of Afghan Chehelghoza (Pinus gerardiana L.) on sperm parameters of male rats. J. Food Nutrition. Disorders. 6 (5): 1–2.
31. Salgado, P. R., Fernández, G. B., Drago, S. R., & Mauri, A. N. 2011. Addition of bovine plasma hydrolysates improves the antioxidant properties of soybean and sunflower protein-based films. Food Hydrocolloids. 25(6): 1433-1440.
32. Salgado, P. R., López-Caballero, M. E., Gómez-Guillén, M. C., Mauri, A. N., & Montero, M. P. 2012. Exploration of the antioxidant and antimicrobial capacity of two sunflower protein concentrate films with naturally present phenolic compounds. Food Hydrocolloids. 29(2): 374-381.
33. Shahosseini S.R. Javadian S.R., Safari R. 2021. Evaluation of antibacterial and antioxidant activities of Liza abu viscera protein hydrolysate. Journal of Innovation in Food Science and Technology. 30 (2): 123-146.
34. Shahosseini, S.R., Javadian, S.R. Safari, R. 2022. Effects of Molecular Weights -Assisted Enzymatic Hydrolysis on Antioxidant and Anticancer Activities of Liza abu Muscle Protein Hydrolysates. International Journal for Peptide Research & Therapeutics. 28: 72.
35. Singh, G., Kumar, D., Dash, A. K. 2021. Pinus gerardiana Wallichex. D. Don. -A review. Phytomedicine Plus. 1(2): 100024.
36. Siripatrawan, U., Harte, B. R. 2010. Food Hydrocolloids Physical properties and antioxidant activity of an active fi lm from chitosan incorporated with green tea extract. Food Hydrocolloids. 24(8): 770–775.
37. Tkaczewska. J. 2020. Peptides and protein hydrolysates as food preservatives and bioactive components of edible films and coatings - A review. Trends in Food Science & Technology. 106: 298–311.
38. Van Hai, L., Zhai, L., Kim, H. C., Kim, J. W., Choi, E. S., Kim, J. 2018. Cellulose nanofibers isolated by TEMPO-oxidation and aqueous counter collision methods. Carbohydrate Polymers. 191: 65–70.
39. Varedesara MS, Ariaii P, Hesari J. 2021. The effect of grape seed protein hydrolysate on the properties of stirred yogurt and viability of Lactobacillus casei in it. Food Science and Nutrition. 9: 2180–2190.
40. Wen, Y., Liu, J., Jiang, L., Zhu, Z., He, S., He, S., Shao, W. 2021. Development of intelligent/active food packaging film based on TEMPO-oxidized bacterial cellulose containing thymol and anthocyanin-rich purple potato extract for shelf life extension of shrimp. Food Packaging and Shelf Life. 29: 100709.
41. Yathisha, U.G., Bhat, I., Karunasagar, I. and Mamatha, B.S., 2018. Antihypertensive activity of fish protein hydrolysates and its peptides. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 59 (15): 2363-2374.
42. Zaki zadeh. 2011. Ornamental trees. Gillan University Publication. (Persian)
43. Zolfi, M., Khodaiyan, F., Mousavi, M. & Hashemi, M. 2014. The improvement of characteristics of biodegradable films made from kefiran–whey protein by nanoparticle incorporation. Carbohydratepolymers. 109: 118-125.
Investigating the properties of edible film based on bacterial nanocellulose oxidized by TEMPO method containing hydrolyzed protein obtained from pine tree fruit.
Abstract
In this study, intelligent and active film was produced based on oxidized bacterial cellulose by TEMPO method containing hydrolyzed pine seed protein. For this purpose, first, the protein of the pine seed fruit was hydrolyzed by the commercial alcalase hydrolysis enzyme, and then its different concentrations (0, 0.5, 1 and 1.5%) were added to the bacterial nanocellulose and physical characteristics, mechanical, antioxidant and antimicrobial properties of the films were investigated. According to the results, the hydrolyzed protein had high amounts of protein (90.21%) and amino acids, the highest amounts of amino acids corresponding to arginine 21.88%, glutamic acid 17.33% (non-essential amino acids) and then leucine 6.75% (essential amino acids). Based on the results of the films, by increase in protein concentration, tensile strength was decreased and elasticity before the point of film rupture, water vapor permeability and turbidity were increased (P< 0.05), but it did not have a significant effect on moisture and solubility (P>0.05). The films had high antioxidant activity and antioxidant activity increased with increasing concentration (P<0.05), and also these films had high antimicrobial properties against pathogenic bacteria and antimicrobial properties against Staphylococcus aureus was higher than Escherichia coli. Nano cellulose film containing hydrolyzed protein with a concentration of 1.5% had the highest antioxidant and antimicrobial activity (p<0.05). Therefore, it seems that nano cellulose film containing hydrolyzed protein of pine fruit can be used in intelligent packaging of food products due to its antioxidant and antimicrobial properties.
Keywords: bioactive peptide, alcalase, bacterial nanocellulose, free radical, Staphylococcus aureus, Escherichia coli
[1] Acetobacter xylinum
[2] 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl radical
[3] TEMPO-oxidized bacterial cellulose
[4] Bovine Serum Albumin
[5] Trichloro acetic acid
[6] Isogai
[7] Water vapor permeability
[8] Siripatrawan and Harte
[9] hydrophobic amino acids
[10] Aromatic amino acids
[11] Food and Agriculture Organization
[12] World Health Organization
[13] Salgado
[14] de Oliveira
[15] elaborated squid
[16] Ghasemi
[17] Giménez
[18] 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
