Mycelial Compatibility Groups and Genetic Diversity in Populations of Sclerotinia sclerotiorum, the Causal Agent of Sclerotinia Stem Rot of Rapeseed in Mazandaran Province

Subject Areas : Plant Pathology

Sara Mohseni-chamazkoti ¹ , Saeed Rezaee ^{2 *} , علیرضا دلیلی ³ , Majid Aldaghi ⁴

1 - PhD. Student, Department of Plant Protection, SR.C., Islamic Azad University, Tehran, Iran
2 - Assistant Professor, respectively, Department of Plant Protection, SR.C., Islamic Azad University, Tehran, Iran
3 - Assistant Professor, Plant Protection Research Department, Agricultural and Natural Resources Research Centre of Mazandaran Province, Agricultural Research, Education and Extension Organization, Mazandaran, Sari, Iran
4 - Assistant Professor, Plant Protection Research Department, Agricultural and Natural Resources Research Centre of Mazandaran Province, Agricultural Research, Education and Extension Organization, Mazandaran, Sari, Iran

Received: 2024-10-22 Accepted : 2025-01-11 Published : 2025-03-18

Keywords: Genetic diversity, Mycelial compatibility, Microsatellite markers, Oilseed rape, Sclerotinia stem rot,

Abstract :

Sclerotinia stem rot, caused by the fungus Sclerotinia sclerotiorum, is one of the most important diseases of rapeseed in Iran. To assess the genetic diversity of S. sclerotiorum isolates, sampling was conducted from rapeseed fields in different regions of Mazandaran Province. A total of 56 isolates were selected based on their geographical distribution. Then, mycelial compatibility groups (MCGs) and simple sequence repeat (SSR) markers were used to analyze the genetic structure of these distinct isolates. In total, 32 MCGs were identified, of which 59.4% contained only a single isolate, while the remaining groups consisted of 2 to 7 isolates. Molecular analysis was performed using 10 pairs of microsatellite primers. In total, 31 microsatellite haplotypes were identified across all populations, with a few haplotypes found at high frequencies. Gene diversity among the seven populations ranged from 0.4120 to 0.5111. The highest and lowest levels of genetic diversity among the populations were observed in the Behshahr and Sari counties, respectively. No significant association was found between microsatellite haplotypes and mycelial compatibility groups (V = 0.75, p = 0.36). The findings of this study will be beneficial for breeding resistant cultivars and developing disease management strategies for Sclerotinia stem rot.

References:

یوسف دوست، و. و قوستا، ی. 1394. گروه¬هاي سازگار میسلیومی و بیماریزایی جدایه¬هاي قارچ عامل پوسیدگی سر کلم در ارومیه. مجله علمی کشاورزی 38(1): 78-67.
Ajiboye, T.O. Visser, H.G., Erasmus, E. and Schutte-Smith, M. 2025. Recent strategies for controlling the white mould fungal pathogen (Sclerotinia sclerotiorum) using gene silencing, botanical fungicides and nanomaterials. Sustainable Food Technology 3: 612-636.
Aldrich-Wolfe, L., Travers, S. and Nelson, B.D. 2015. Genetic variation of Sclerotinia sclerotiorum from multiple crops in the north central United States. PLoS One 10(9): e0139188. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139188.
Barari, H., Dalili, S.A. and Hassani, H.M. 2017. Genetic diversity among different isolates of Sclerotinia sclerotiorum in north of Iran. Journal of Bacteriology and Mycology 5(5): 387‒389.
Barari, H., Alavi, V. and Badalyan, S.M. 2012. Genetic and morphological differences among populations of Sclerotinina sclerotiorum by microsatellite markers, mycelial compatibility groups (MCGs) and aggressiveness in North Iran. Romanian Agricultural Research 29: 323-331.
Barari, H., Dalili, S.A. and Badalyan, S.M. 2014. Mycelial compatibility grouping and aggressiveness of Sclerotinia sclerotiorum on different hosts in North of Iran. Jordan Journal of Agricultural Sciences 10(1): 45-57. http://dx.doi.org/10.12816/0029873.
Bolton, M.D., Thomma, B.P.H.J. and Nelson, B.D. 2006. Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary: Biology and Molecular Traits of a Cosmopolitan Pathogen. Molecular Plant Pathology 7: 1-16.
Carbone, I., Anderson, J.B. and Kohn, L.M. 1999. Patterns of descent in clonal lineages and their multilocus fingerprints are resolved with combined gene genealogies. Evolution 53: 11-21.
Clarkson, J.P., Conventry, E., Kitchen. J., Carter, H.E. and Whipps, J.M. 2013. Population structure of Sclerotinia sclerotiorum in crop and wild hosts in the UK. Plant Pathology 62(2): 309-324.
Irani, H., Heydari, A., Javan-Nikkhah, M. and Ibrahimov, A.S. 2011. Pathogenicity variation and mycelial compatibility groups in Sclerotinia sclerotiorum. Journal of Plant Protection Research 51(4) 329-336.
Faraghati, M., Abrinbana, M. and Ghosta, Y. 2022. Genetic structure of Sclerotinia sclerotiorum populations from sunflower and cabbage in West Azarbaijan province of Iran. Scientific Reports 12: 9263. https://doi.org/10.1038/s41598-022-13350-7.
Hemmati, R., Javan-Nikkhah, M. and Linde, C.C. 2009. Population genetic structure of Sclerotinia sclerotiorum on canola in Iran. European Journal of Plant Pathology 125: 617-628.
Karimi, E., Safaie, N. and Shams-Bakhsh, M. 2012. Mycelial compatibility groupings and pathogenic diversity of Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary populations on canola in Golestan Province of Iran. Journal of Agricultural Science and Technology 14: 421-434.
Khan, M.A., Cowling, W.A., Banga, S.S., Barbetti, M.J., Cantila, A.Y., Amas, J.C., Thomas, W.J., You, M.P., Tyagi, V., Bharti, B. and Edwards, D. 2023. Genetic and molecular analysis of stem rot (Sclerotinia sclerotiorum) resistance in Brassica napus (canola type). Helyon 9: 1-12. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2023.e19237.
Kohli, Y., Brunner, L.J., Yoell, H, Milgroom, M.G., Anderson, J.B., Morrall, R.A. and Kohn, L.M. 1995. Clonal dispersal and spatially mixing in populations of the plant pathogenic fungus, Sclerotinia sclerotiorum. Molecular Ecology 4(1): 69-77.
Kohn, L.M. 1995. The clonal dynamic in wild and agricultural plant pathogen populations. Canadian Journal of Botany 73(S1): 1231–1240. http://dx.doi.org/10.1139/b95-383.
Lehner, M.S., Paula Júnior, T.J., Hora Júnior, B.T., Teixeira, H., Vieira, R.F., Carneiro, J.E.S. and Mizubuti, E.S.G. 2015. Low genetic variability in Sclerotinia sclerotiorum populations from common bean fields in Minas Gerais State, Brazil, at regional, local and micro-scales. Plant Pathology 64: 921-931.
Litholdo Júnior, C.G., Gomes, E.V., Lobo Júnior, M., Nasser, L.C.B. and Petrofeza, S. 2011. Genetic diversity and mycelial compatibility groups of the plant-pathogenic fungus Sclerotinia sclerotiorum in Brazil. Genetics and Molecular Research 10(2): 868-877.
Liu, J., Meng, Q., Zhang, Y., Xiang, H., Li, Y., Shi, F., Ma, L., Liu, C., Liu, Y., Su, B. and Li, Z. 2018. Mycelial compatibility group and genetic variation of sunflower Sclerotinia sclerotiorum in Northeast China. Physiological and Molecular Plant Pathology 102: 185-192. https://doi.org/10.1016/j.pmpp. 2018.03.006.
Liu, K. and Muse, S.V. 2005. PowerMarker: An integrated analysis environment for genetic marker analysis. Bioinformatics 21(9): 2128–2129. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bti282.
McDonald, B.A. and Linde, C. 2002. Pathogen population genetics, evolutionary potential, and durable resistance. Annual Review of Phytopathology 40: 349-379. https://doi.org/10.1146/annurev.phyto.40.120501. 101443.
Nei, M. 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 70: 3321-3323.
Pakdaman, B.S. and Goltapeh, E.M. 2007. In vitro studies on the integrated control of rapeseed white stem rot disease through the application of herbicides and Trichoderma species. Pakistan Journal of Biological Sciences 10(1): 7-12.
Peakall, R. and Smouse, P.E. 2012. GenAlEx 6.5: Genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research-An update. Bioinformatics 28(19): 2537-2539.
Pethybridge, S.J., Murphy, S., Lund, M. and Kikkert, J.R. 2024. Survival of Sclerotinia sclerotiorum sclerotia in central New York. Plant Disease 108(5): 1165-1172.
Reich, J., McLaren, D.L., Kim, Y.M., Wally, O., Yevtushenko, D., Hamelin, R. and Chatterton, S. 2024. Predicting airborne ascospores of Sclerotinia sclerotiorum through machine learning and statistical methods. Plant Pathology 73(6): 1586-1601.
Rohlf, F.J. 2009. NTSYSpc: Numerical taxonomy system (Version 2.2). Exeter Software, Setauket, NY, USA.
Saharan, G.S. and Mehta, N. 2008. Sclerotinia Diseases of Crop Plants: Biology, Ecology and Disease Management. Springer Science + Business Media B.V., Amsterdam.
Sambrook, J. and Russel, D.W. 2001. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Schafer, M.R. and Kohn, L.M. 2006. An optimized method for mycelial compatibility testing in Sclerotinia sclerotiorum. Mycologia 98(4): 593-597. https://doi.org/10.3852/mycologia.98.4.593.
Sexton, A.C. and Howlett, B.J. 2004. Microsatellite markers reveal genetic differentiation among populations of Sclerotinia sclerotiorum from Australian canola fields. Current Genetics 46(6):357-65.
Silva, R.A., Ferro, C.G., Lehner, M., Jr, T.J.P. and Mizubuti, E.S.G. 2021. The population of Sclerotinia sclerotiorum in Brazil is structured by mycelial compatibility groups. Plant Disease 105: 3376-3384.
Sirjusingh, C. and Kohn, L.M. 2001. Characterization of microsatellites in the fungal plant pathogen, Sclerotinia sclerotiorum. Molecular Ecology Notes 1(4): 267–269. https://doi.org/10.1046/j.1471-8278.2001.00102.x.
Tóthová, M., Máčajová, P. and Tóth, P. 2021. Mycelial incompatibility of Sclerotinia sclerotiorum isolates from a single rapeseed field in Slovakia. Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences 11(2). https://doi.org/10.15414/jmbfs.3369.
Tok, F.M., Derviş, S. and Arslan, M. 2016. Analysis of genetic diversity of Sclerotinia sclerotiorum from eggplant by mycelial compatibility, random amplification of polymorphic DNA (RAPD) and simple sequence repeat (SSR) analyses. Biotechnology and Biotechnological Equipment 30(5): 921_928.
Xu, D.F., Li, X.L., Pan, Y.M., Dai, Y.L., Li, P., Chen, F.X., Zhang, H.J., Guo, M. and Gao, Z.M. 2014. Genetic diversity and pathogenicity differentiation of Sclerotinia sclerotiorum on rapeseed (Brassica napus L.) in Anhui Province, China. Genetics and Molecular Research 13(4): 10704-10713. https://doi.org/10.4238/2014.december.18.12.
Yu, Y., Cai, J., Ma, L., Huang, Z., Wang, Y., Fang, A., Yang, Y., Qing, L. and Bi, C. 2020. Population structure and agressiveness of Sclerotinia sclerotiorum from rapeseed (Brassica napus) in Chongqing City. Plant Disease 104: 1201-1206.

Full-Text:



گیاه­پزشکی کاربردی، جلد 13، شماره 2، سال 1403

گروه‌های سـازگار مـیسلیومی و تنوع ژنتیـکی در جمعیـت‌های قارچ Sclerotinia sclerotiorum عامل پوسیدگی اسکلروتینیایی ساقه کلزا در استان مازندران

Mycelial Compatibility Groups and Genetic Diversity in Populations of Sclerotinia sclerotiorum, the Causal Agent of Sclerotinia Stem Rot of Rapeseed in Mazandaran Province

 

سارا محسنی چمازکتی1، سعید رضایی2*، سید علیرضا دلیلی3 و مجید الداغی3

 

دریافت: 1/8/1403  پذیرش: 22/10/1403

 

چکیده

بیماری پوسیدگی اسکلروتینیایی ساقه، ناشی از قارچ Sclerotinia sclerotiorum، یکی از مهم‌ترین بیماري‌هاي کلزا در ایران می‌باشد. به منظور ارزیابی تنوع ژنتیکی جدایه‌های S. sclerotiorum، نمونه‌برداری از مزارع کلزا در مناطق مختلف استان مازندران انجام گرفت. تعداد 56 جدایه، بر­اساس پراکنش جغرافیایی انتخاب گردید، سپس، جهت بررسی ساختار ژنتیکی جدایه ها، از گروه‌هـای سازگاری میسلیـومی (MCGs) و نشانگر­های ریزمـاهـواره (SSRs) استفاده شد. در مجـموع، 32 گروه سازگاری میسلیومی شناسایی شد که 4/59 درصد از آنها فقط شامل یک جدایه بودند، درحالی‌که سایر گروه‌ها، 7-2 جدایه داشتند. آزمون مولکولی با استفاده از 10 جفت آغازگر ریزماهواره انجام گردید. در نهایت، 31 هاپلو‌تیپ ریزماهواره در همه جمعیت‌ها شناسایی و چند هاپلو‌تیپ با فراوانی بالا یافت شدند. تنوع ژنی در هفت جمعیت در محدوده 4120/0 تا 5111/0 متغیر بود. بیشترین و کمترین تنوع ژنتیکی درون جمعیت‌ به ترتیب مربوط به جمعیت شهرستان­های بهشهر و ساری بود. بین هاپلوتیپ­های ریزماهواره‌ و گروه‌های سازگاری میسلیومی ارتباط معنی­داری مشاهده نشد (75/0V=، 36/0P=). نتایج حاصل از این مطالعه براي اصلاح ارقام مقاوم و توسعه راهبرد­های مدیریت بیماري پوسیدگی اسکلروتینیایی ساقه مفید خواهد بود.

واژگان کلیدی: تنوع ژنتیکی، سازگاری میسلیومی، نشانگرهای ریزماهواره، کلزا، پوسیدگی اسکلروتینیایی ساقه

 

مقدمه

بیماری پوسیدگی اسکلروتینیایی ساقه، ناشی از قارچ Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary می­باشد که یکی از مهم‌ترین و مخرب‌ترین عوامل بیماری‌زای گیاهی با دامنه میزبانی و پراکنش جغرافیایی گسترده است. این بیمارگر توانایی آلوده‌سازی بیش از 400 گونه گیاهی، از جمله محصولات زراعی مهمی نظیر سویا، آفتابگردان، کلزا، کاهو، هویج، سیب‌زمینی، لوبیا و نخود را دارد (Bolton et al., 2006). در کلـزا، این بیـماری از عوامـل اصـلی کاهـش عملـکرد مـحـسوب می­شـود و در شـرایط آب و هـوایی مسـاعد، به‌ویـژه در جلـگه‌هـای شـمالی دریای خـزر، به­سـرعـت گستـرش مـی‌یابد (Pakdaman and Goltapeh., 2007). بسته به شدت آلودگی و شرایـط مـحـیطی، خـسـارت‌ بیـماری متغیـر بوده 

1 و 2- به ترتیب دانشجوی دکتری بیماری­شناسی گیاهی و استادیار، گروه گیاه‌پزشکی، دانشکده کشاورزی، آب، غذا و فراسودمندها، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات، تهران، ایران

3- استادیار، بخش تحقیقات گیاه‌پزشکی، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی استان مازندران، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، مازندران، ساری، ایران

نویسنده مسئول مکاتبات: [e-mail]

و در موارد طغیانی و شـیوع شـدید بیـماری مـی­تواند تا 100 درصـد کاهـش عمـلـکـرد مـحـصـول را بـه هـمـراه داشـته باشد (Saharan and Mehta, 2008).

مدیریت S. sclerotiorum به دلیل دامنه میزبانی وسیع، توانایی بقای طولانی‌مدت سختینه­ها در خاک و تنوع ژنتیکی بالا با چالش­های جدی مواجه است. این بیمارگر از دو مسیر متفاوت برای آلودگی استفاده می­کند: (1) آلودگی بخش پایینی ساقه از طریق میسلیوم‌های خاکزاد حاصل از جوانه‌زنی میسلیوژنیک سختینه‌ها و (2) آلودگی اندام‌های هوایی گیاه از طریق آسکوسپور­هایی که در نتیجه جوانه‌زنی کارپوژنیک تولید می‌شوند (Ajiboye et al., 2025). راهبرد­های کنترل بیماری شامل مجموعه‌ای از اقدامات زراعی، شیمیایی و استفاده از ارقام مقاوم است. روش‌های زراعی عمدتاً پیشگیرانه بوده و به دلیل بقای چند ساله سختینه‌ها و دامنه وسیع میزبانی قارچ، اثر­بخشی محدودی دارند. قارچ‌کش‌ها نیز اگرچه کاربرد گسترده‌ای دارند، اما به­علت هزینه بالا و وابستگی شدید کارایی به زمان‌بندی مناسب، نتایج متغیری ارائه می‌کنند. از این­رو، ترکیب مقاومت ژنتیکی با مدیریت زراعی و کنترل شیمیایی بهینه، به‌عنوان رویکردی کلیدی برای مهار بیماری توصیه می‌شود (Khan et al., 2023). موفقیت این رویکرد­ها، به‌ویژه توسعه ارقام مقاوم، وابسته به شناخت دقیق تنوع ژنتیکی و ساختار جمعیت S. sclerotiorum است (McDonald and Linde, 2002).

تنوع ژنتیکی در پاتوژن‌های قارچی عمدتاً ناشی از جهش‌ها و نوترکیبی است (Liu et al., 2018). شناسایی گروه‌های سازگاری میسلیومی (MCGs) یکی از روش‌های رایج برای توصیف دودمان‌های همسانه‌ای و ارزیابی تنوع ژنتیکی قارچ‌ها از جمله S. sclerotiorum، به­شمار می‌آید (Carbone et al., 1999). با این حال، MCGها شاخصی غیر­مستقیم از تنوع ژنتیکی ارائه داده و قادر به تعیین دقیق روابط فیلوژنتیکی درون یا بین گروه‌ها نیستند (Litholdo Júnior et al., 2011). طی سال‌های اخیر، MCGهای متعددی در جمعیت‌های S. sclerotiorum جدا شده از میزبان‌ها و مناطق جغرافیایی مختلف شناسایی و گزارش شده است (Aldrich-Wolfe et al., 2015؛ Barari et al., 2014؛ Irani et al., 2011؛ Karimi et al., 2012؛ Litholdo Júnior et al., 2011؛ Liu et al., 2018؛ Tok et al., 2016؛ Silva et al., 2021؛ Yu et al., 2020).

برای بررسی دقیق‌تر ساختار ژنتیکی و روابـط بین جـدایه‌ها، از روش‌های مـولـکـولی متنوعـی مانند RAPD (Litholdo Júnior et al., 2011؛ Tok et al., 2016)، ISSR (Faraghati et al., 2022؛ Xu et al., 2014) و SSR (Aldrich-Wolfe et al., 2015؛ Barari et al., 2017؛ Clarkson et al., 2013؛ Hemmati et al., 2009؛ Liu et al., 2018؛ Tok et al., 2016؛ Silva et al., 2021؛ Yu et al., 2020) استفاده شده است. در میان این روش­ها، نشانگر‌­های ریزماهواره (SSRs) به دلیل چند­شکلی بالا، اختصاصی بودن در جایگاه ژنی، چند­آللی بودن و قابلیت تکثیر آسان توسط واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)، ابزار ارزشمندی در مطالعات ژنتیک جمعیت، تکامل و برنامه‌های به‌نژادی محسوب می‌شوند (Liu et al., 2018).

بررسی‌های پیشین نشان می‌دهند که S. sclerotiorum دارای تنوع ژنتیکی قابل‌توجهی است و هر دو نوع تولید­مثل جنسی و غیرجنسی در آن رخ می‌دهد (Litholdo Júnior et al., 2011). کلونالیتی در  S. sclerotiorum ناشی از تولید­مثل جنسی از طریق خودباروری است که منجر به تولید میلیون‌ها آسکوسپور می‌شود و همچنین از طریق تولید مثل غیرجنسی با تشکیل سختینه‌ها رخ می‌دهد (Kohn, 1995). با این حال، شواهدی از وقوع دگر­لقاحی نیز در برخی مناطق، از جمله ایران، گزارش شده است (Hemmati et al., 2009).

در ایران، مطالعات مختلف با استفاده از SSR و MCG نشان‌دهنده تنوع ژنتیکی بالا، تعداد متنوعی از گروه‌های سازگاری میسلیومی و ساختار جمعیتی ناهمگن در جمعیت‌های S. sclerotiorum بوده‌اند (Barari et al., 2012, 2014, 2017؛ Hemmati et al., 2009؛ Faraghati et al., 2022؛ Karimi et al., 2012). این شواهد اهمیت پایش مستمر تنوع ژنتیکی و ساختار جمعیتی این بیمارگر را در طراحی برنامه‌های مدیریتی مؤثر نشان می‌دهد.

در استان مازندران، قارچ S. sclerotiorum یکی از عوامل اصلی پوسیدگی ساقه کلزا به­شمار می‌رود و طی دهه‌های اخیر موجب کاهش قابل توجه عملکرد محصول شده است. بر این اساس، هدف مطالعه حاضر، بررسی ساختار ژنتیکی جدایه‌های S. sclerotiorum، عامل پوسیدگی ساقه کلزا، با استفاده از آزمون گروه‌های سازگاری میسلیومی (MCG) و روش تعیین ژنوتیپ (genotyping) مبتنی بر نشانگر­های SSR، در این استان بوده است.

 

مواد و روش­ها

جمع‌آوری، کشت و جداسازی نمونه‌ها

نمونه­برداری از مزارع کلزا در استان مازندران، از شهرستان­های گلوگاه، بهشهر، نکا، میاندرود، ساری، جویبار و بابل انجام گرفت (شکل 1). بدین ترتیب، نمونه­ها از گیاهان دارای علایم بیماری پوسیدگی اسکلروتینیایی ساقه در فصل زراعی سال 1400 جمع­آوری گردید. نمونه‌ها پس از خشک شدن در هوای آزاد، در پاکت‌های کاغذی جداگانه قرار گرفته و به آزمایشگاه مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی ساری منتقل شدند. سختینه‌های قارچ پس از جداسازی از ساقه و طوقه، ابتدا به مدت 10 ثانیه در محلول هیپوکلریت سدیم %1 و سپس به مدت 3-2 دقیقه در اتانول %70، ضدعفونی سطحی شدند. پس از آن، سختینه‌ها با آب مقطر سترون شستشو داده شده و روی کاغذ خشک‌کن سترون خشک شدند؛ سـپس به تـشتک‌های حاوي محیـط کشت PDA منتقل گردیدند. تشتک‌ها در تاریـکی و در دمـای اتـاق (°C22-24) نگهداری شدند. پرگنه قارچ پس از 5-3 روز ظاهر شد. جدایه‌ها پس از خالص‌سازی به روش نوک هیف، به تشتک­های جدید حاوی PDA منتقل شده و در یخچال تحت دمای °C4 نگهداری شدند.

 

 

شکل 1- نقشه پراکنش جغرافیایی جدایه­های Sclerotinia sclerotiorum از مزارع کلزا در استان مازندران. این نقشه با استفاده از نرم‌افزار QGIS Desktop (نسخه 8. 40. 3) تهیه شده است. 

Fig. 1. Geographic distribution map of Sclerotinia sclerotiorum isolates from rapeseed fields in Mazandaran Province. The map was generated using QGIS Desktop (version 3.40.8)

 

تعیین گروه‌های سازگار میسلیومی (MCGs)

جهت تعیین سازگاری یا ناسازگاری بین جدایه‌های مختلف قارچ، آزمون سازگاری میسلیومی بر اساس روش شافر و کوهن (Schafer and Kohn, 2006) انجام شد. جدایه‌ها ابتدا روی محیط کشت PDA کشت داده شدند. سپس، قرص­های میسلیومی به قطر پنج میلی‌متر از حاشیه کشت‌های در حال رشد سه تا چهار روزه برداشته و در تشتک‌های ۹ سانتی‌متری حاوی محیطPDA، که به آن ۷۵ میکرو­لیتر بر لیتر رنگ خوراکی قرمز مک‌کورمیک (McCormick’s red food coloring) به‌منـظور افزایـش وضـوح خطوط واکنـش ناسازگار افزوده شده بود، قرار داده شـدند. قرص‌های میـسلیومی با فاصله تقریبی 5/3 سانتی‌متر از یکدیگر جفت‌ شدند. تشتک‌ها در دمای °C22-24 و تاریکی نگهداری و پس از گذشت چهار تا هفت روز مورد ارزیابی قرار گرفتند. هر جدایه با تمام جدایه‌های دیگر به‌صورت دوتایی و در تمامی ترکیبات ممکن جفت‌ شد و هر ترکیب در سه تکرار انجام گردید. جدایه‌ها در صورتی سازگار در نظر گرفته شدند که ریسه‌های دو جدایه در محل تماس بدون تشکیل مرز مشخص با هم ادغام شده و یک کلنی واحد را تشکیل دهند. در مقابل، ناسازگاری با تشکیل خط به­عنوان واکنشی در ناحیه تماس و حد فاصل دو جدایه تعیین گردید، خط مذکور شامل میسلیوم هوایی یا یک نوار قرمز عاری از میسلیوم بود (شکل 2).

 

 

شکل 2- واکنش­های سـازگار و ناسـازگار بین جدایه­های مختلف S. sclerotiorum روی مـحیط کشت PDA بعد از چهار روز: (a) سازگاری، با ادغام سه کلنی نشان داده شده است؛ (b-c) ناسازگاری، که به­صورت ناحیه واکنش نشان داده شده است: (b) یک ناحیه عاری از میسلیوم همراه با یک خط قرمز مشخص؛ (c) نواری از میسلیوم‌های هوایی یکنواخت.

Fig. 2. Compatible and incompatible reactions among different isolates of S. sclerotiorum tested on PDA medium after four days: (a) Compatibility, indicated by fusion of the three colonies; (b–c) Incompatibility, shown as a barrage zone: (b) a region of no mycelia accompanied by a distinct red line; (c) a band of uniform aerial mycelia.

 

بررسی تنوع ژنتیکی جدایه‌ها

استخراج DNA و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)

برای تهیه توده میسلیوم مورد نیاز جهت استخراج DNA از حاشیه پرگنه در حال رشد هر جدایه، یک قرص میسلیومی پنج میلی‌متری به ارلن حاوی محیط کشت مایع سترون شده عصاره سیب زمینی- دکستروز (PDB) انتقال داده شدند. پس از رشد کافی، توده میسلیومی هر یک از جدایه‌ها با آب مقطر سترون آبکشی شد تا محیط کشت به­طور کامل از روی آن شسته شود. سپس توده میسلیوم روی کاغذ صافی سترون خشک گردید. برای استخراج DNA، حدود یک گرم از میسلیوم خشک شده با استفاده از ازت مایع و هاون سرد پودر و به ویال سترون منتقل گردید و تا زمان استفاده در دمای °C20- نگهداری شد. استخراج DNA با استفاده از روشCTAB  انجام شد (Sambrook and Russel, 2001).

برای بررسی تنوع ژنتیکی قارچ S. sclerotiorum، از 10 جفت آغازگر ریزماهواره طراحی شده توسط سیرجوسینگ و کوهن (Sirjusingh and Kohn, 2001)، که در مـطالـعـات پیـشین چـند شـکـلی بـالایی نـشان دادند، استفاده شد (Barari et al., 2012, 2017؛ Hemmati et al., 2009). براي نشان دادن تنوع در تمامی جدایه‌ها، تکثیر DNA با استفاده از واکـنش زنجـیره‌اي پلیمراز و آغازگر­ها (جدول 1) به­طور جداگانه انجام شد. مخلوط واکنش PCR در حجم نهایی 20 میکرو­لیتر شامل 10 میکرو­لیتر PCR Master Mix (Amplicon, Denmark)، یک میکرو­لیتر از هر آغازگر (یک میکرو­لیتر آغازگر مستقیم و یک میکرولیتر آغازگر معکوس) (غلظت نهایی 5/0 میکرو­مولار برای هر آغازگر)، 5/1 میکرو­لیتر DNA ژنومی (با غلظت 100 نانو­گرم بر میکرو­لیتر) و آب مقطر دیونیزه به‌منظور تکمیل حجم واکنش بود. پس از قرار دادن میکروتیـوب‌ها در دسـتگاه ترموسـایکلر (Eppendorf Mastercycler)، دمای اتصال آغازگر­ها در واکنش PCR به شرح جدول 1 تنظیم گردید.

چرخه‌های حرارتی شامل یک چرخه واسرشت سازی اولیه در °C95 به مدت چهار دقیقه، سپس 32 چرخه شامل واسرشت­سازی در °C94 به­مدت 40 ثانیه، اتصال و هیبرید شدن آغازگر­ها در دمای °C55-63 بسته به نوع آغازگر به­مدت 40 ثانیه، گسترش در °C72 به­مدت یک دقیقه و نهایتاً یک چرخه بسط نهایی در °C72 به­مدت پنج دقیقه بود. الکتروفورز محصولات PCRروی ژل آگارز سه درصد در بافر TAE 1x، در ولتاژ ۱۴۵ ولت به مدت دو تا سه ساعت انجام شد. وزن مولکولی باند­ها با استفاده از DNA ladder (100 bp DNA Ladder, CinaGen) در محدوده 100 تا ۱۵۰۰ جفت باز به‌عنوان مرجع اندازه در طی الکتروفورز تعیین گردید.

تجزیه و تحلیل داده­ها

تنوع هاپلوتیپ و فراوانی‌ مرتبط با آن با استفاده از نرم‌افزار PowerMarker 3.25 (Liu and Muse, 2005؛ North Carolina State University, Bioinformatics Research Center, Raleigh, NC, USA) به‌دست آمد. شاخص­های تنوع ژنتیکی شامل تعداد آلل‌های مشاهده ‌شده (Na)، تعداد آلل‌های مؤثر (Ne)، تنوع ژنی نئی (h)، شاخص تنوع شانون (I)، و فاصله ژنتیکی با بهره­گیری از نرم‌افزار GenAlEx 6.5 (Peakall and Smouse, 2012؛ Australian National University, Research School of Biology, Canberra, Australia) محاسبه شدند. دندروگرام روابط فیلوژنتیکی نیز با استفاده از نرم‌افزار NTSYSpc 2.2 (Rohlf, 2009; Exeter Software, Setauket, NY, USA) ترسیم گردید.

 

جدول 1- آغازگرهای ریزماهواره مورد استفاده برای تعیین ویژگی جدایه‌های S. sclerotiorum از کلزا در استان مازندران

Table 1. Microsatellite primers used to characterize isolates of S. sclerotiorum from rapeseed in Mazandaran province

دمای اتصال Tm (Â◦C)b	توالی موتیف Repeat motif	توالی آغازگر Primer sequence (5-3)	جایگاه ژنی Locusa
63	(GT)8	GTAACACCGAAATGACGGC GATCACATGTTTATCCCTGGC	5-2
63	(GA)14	TTTGCGTATTATGGTGGGC ATGGCGCAACTCTCAATAGG	7-2
60	CA12	CACTCGCTTCTCCATCTCC GCTTGATTAGTTGGTTGGCA	8-3
63	(CA)9(CT)9	GCCGATATGGACAATGTACACC TCTTCGCAGCTCGACAAGG	9-2
55	(CA)9	CGATAATTTCCCCTCACTTGC GGAAGTCCTGATATCGTTGAGG	12-2
60	TACA10	GTTTTCGGTTGTGTGCTGG GCTCGTTCAAGCTCAGCAAG	55-4
55	(CT)12	TCGCCTCAGAAGAATGTGC AGCGGGTTACAAGGAGATGG	92-4
55	(CATA)25	TGCATCTCGATGCTTGAATC CCTGCAGGGAGAAACATCAC	106-4
60	(TATG)9	ATCCCTAACATCCCTAACGC GGAGAATTGAAGAATTGAATGC	110-4
60	(AGAT)14(AAGC)4	GCTCCTGTATACCATGTCTTG GGACTTTCGGACATGATGAT	114-4

a (Sirjusingh and Kohn, 2001) اقتباس از سیرجوسینگ و کوهن

b Optimized annealing temperature

 

نتایج

در این مطالعه، تعداد ۵۶ جدایه از قارچ S. sclerotiorum جداسازی و مورد مطالعه قرار گرفتند. این جدایه‌ها از هفت شهرستـان اسـتان مازنـدران، از جـمله گـلوگاه (6 جدایه)، بهـشهر (9 جدایه)، نکا (11 جدایه)، میاندورود (6 جدایه)، ساری (10 جدایه)، جویبار (8 جدایه)، و بابل (6 جدایه) جمع‌آوری شدند (جدول 2 و شکل 1).

جدول 2- منطقه نمونه­برداری، گروه‌های سازگار میسلیومی (MCGs) و هاپلوتیپ SSR در ۵۶ جدایه S. sclerotiorum.

Table 2. Sampling region, mycelial compatibility groups (MCGs), and SSR haplotype of 56 S. sclerotiorum isolates.

 

جدایه Isolate	منطقه نمونه برداری (شهرستان) Sampling region (County)	گروه سازگاری میسلیومی MCG	هاپلوتیپ haplotype	جدایه Isolate	منطقه نمونه برداری (شهرستان) Sampling region (County)	گروه سازگاری میسلیومی MCG	هاپلوتیپ haplotype
GS1	Sangyabsar (G)         سنگی ابسر	1	10	MD2	Darabkola (M)دارابکلا	19	17
GG1	Ghalepayan (G) قلعه پایان	14	4	MA2	Asram (M)                      اسرام	11	2
GG3	Ghalepayan (G)          قلعه پایان	9	11	MJ1	Jafkhaneh (M) جف خانه	11	1
GL2	Lamrask (G)                 لمراسک	1	1	MT2	Dashtenaz (M) دشت ناز	3	18
GH1	Hasanabad (G) حسن آباد	13	12	ST1	شویلاشت-اروت  Shevilasht-Erout (S)	25	1
GM2	Mehdiraje (G)             مهدیراجه	1	1	SL2	شویلاشت-خاله خیل Shevilasht-Khalekheyl (S)	2	1
BH1	Hosseinabad (BE) حسین آباد	28	4	SN1	شویلاشت-نوکنده Shevilasht-Nokandeh1 (S)	2	19
BT1	Gharetape (BE)               غارتپه	1	1	SE	پنبه زرکوتی Panbehzarkoti-Esfandan (S)	15	20
BG2	Gorjimahale (BE)    گرجی محله	1	13	SJ1	فریم-جعفرکلا Farim- Jafarkola (S)	18	1
BV1	Rakavand (BE)               رکاوند	31	4	SB1	سمسکنده-اسبوکلا Semeskandeh- Esbukola (S)	10	1
BV2	Rakavand (BE)            رکاوند	32	14	SB2	سمسکنده-اسبوکلا Semeskandeh- Esbukola (S)	2	21
BP2	Pasand (BE)                    پسند	6	15	SR1	شویلاشت-کرسام Shevilasht- Karsam (S)	9	22
BZ1	Tazehabad (BE) تازه آباد	21	9	SR2	شویلاشت-کرسام Shevilasht- Karsam (S)	16	3
BL1	klack (BE)                       کلاک	22	9	SU1	فرح آباد سوته-شمال North Farahabad- Souteh (S)	16	23
BE1	Emamdeh (BE) امامده	1	1	JD	Duncha (J) دونچا	24	24
NU1	Umal (N)                          اومال	7	4	JM2	Mianmelk (J) میان ملک	8	3
NA2	Ablou (N)                           آبلو	29	2	JM3	Mianmelk (J) میان ملک	4	25
NA3	Ablou (N)                           آبلو	2	2	JR	Rangrizmahaleh (J) رنگریزمحله	26	26
NP1	Chalehpol (N)    چاله پل	4	8	JL	Aliabad (J)              علی آباد	27	3
NP2	Chalehpol (N)               چاله پل	7	7	JK1	Kordkola (J) کردکلا	4	27
NP3	Chalehpol (N)              چاله پل	7	7	JK2	Kordkola (J) کردکلا	8	3
NB	Berijan (N)                    بریجان	23	4	JO1	Golmahaleh (J) گل محله	6	2
NN1	Nozarabad (N)              نوذرآباد	1	16	BM1	Moalemkola (BA) معلم کلا	5	28
NZ1	Ziaratkola (N)               زیارتکلا	12	6	BM3	Moalemkola (BA) معلم کلا	20	1
NZ2	Ziaratkola (N)               زیارتکلا	12	2	BA2	Lalehabad (BA) لاله آباد	5	29
NS2	Samandareh (N)  سامان دره	4	8	BA3	Lalehabad (BA) لاله آباد	5	30
MS	Sourbon (M)                  سوربان	17	2	BF1	Afrakoti (BA) افراکوتی	30	31
MU1	Ussa (M)                           اوسا	3	6	BF3	Afrakoti (BA) افراکوتی	5	4

a G, Galugah; BE, Behshahr; N, Neka; M, Miandorod; S, Sari; J, Juybar; BA, Babol

 

 

 

سازگاری میسلیومی 

مطالعات مربوط به تعیین گروه‌هاي سازگار میسلیومی برای گروه‌بندی جدایه‌های S. sclerotiorum بر اساس سازگاری میسلیومی آنها انجام شد. از بین 56 جدایه بررسی شده، 32 گروه سازگار میسلیومی شناسایی شد که 5/62 درصد آنها تنها شامل یک جدایه بودند و در بقیه گروه‌ها، بیش از یک جدایه در هر گروه وجود داشت (جدول 2). گروه سازگاری میسلیومی MCG 1 با هفت جدایه، بیشترین تعداد جدایه‌ها را به خود اختصاص داد. این جدایه‌ها از شهرستان‌های گلوگاه، بهشهر و نکا جمع‌آوری شده بودند. سایر MCG­ها شامل 2 تا 4 جدایه بودند. نتایج به­دست آمده نشان داد که جدایه‌های یک منطقه نمونه‌برداری اغلب بهMCG ­های متفاوتی تعلق داشتند. به­عنوان مثال، دو جدایه SR1 و SR2 از مزارع کرسام در ساری به ترتیب در MCG 9 وMCG 16  قرار گرفتند، در حالی­که دو جدایه JK1 و JK2 از مزارع کردکلا در جویبار به MCG 4 و MCG 8 اختصاص یافتند. با این­حال، در برخی موارد، جدایه‌های یک منطقه در یک MCG مشترک قرار گرفتند. به­عنوان نمونه دو جدایه NZ1 و NZ2 که از مزارع زیارت کلا در نکا جمع‌آوری شدند، هر دو به MCG 12 تعلق داشتند (جدول 2).

تنوع ژنتیکی بر اساس نشانگر­های ریزماهواره

تنوع ژنتیکی ۵۶ جدایه S. sclerotiorum با استفاده از 10 جفت پرایمر ریزماهـواره که تنـوع آللی مناسبی را نشان داده­اند، مورد بررسی قرار گرفت. نتایج تکثیر ۱۰ جفت پرایمر در جدول 3 ارائه شده است. در مجموع 46 آلل شناسایی شد که تعداد آلل‌ها در هر لوکوس بین ۲ تا 14 عدد متغیر بود. میانگین تعداد آلل در کل جایگاه‌ها برابر با 6/4 بود. اندازه آلل‌ها بین ۱6۸ تا 600 جفت باز متغیر بود، به­طوری­که کوچک‌ترین باند مربوط به نشـانگر 2-7 و بزرگ‌ترین باند مربوط به نشانگر 4-106 شناسایی شد. دامنه تنوع ژنی نئی بین 2812/0 تا 8820/0 متغیر بود (جدول 3). بر اساس داده‌های ریزماهواره‌ای، در مجموع 31 هاپلوتیپ در میان ۵۶ جدایه از هفت جمعیت S. sclerotiorum شناسایی شد (جدول 2 و 4). تعـداد هاپلوتیـپ‌ها در هر جـمعیت بین 5 تا 7 متـغیر بود (جدول 4) و 9 هاپلـوتیپ بـین دو یا چنـد جدایه مشترک بودند (شکل 3).

 

جدول 3- تنوع ژنتیکی در ۱۰ جایگاه ریزماهواره مورد استفاده برای تحلیل S. sclerotiorum جمع‌آوری‌شده از استان مازندران

Table 3. Genetic variation at 10 microsatellite loci used to analysis S. sclerotiorum collected from Mazandaran province

تنوع ژنی Gene diversity	محدوده اندازه Size range (bp)	آلل های مشاهده شده Alleles observed	جایگاه ژنی Locus
0.4591	318-320	2	5-2
0.3367	168-172	2	7-2
0.5503	240-255	4	8-3
0.2812	356-370	3	9-2
0.4649	212-220	3	12-2
0.6109	178-220	5	55-4
0.4789	369-377	3	92-4
0.8820	498-600	14	106-4
0.6926	340-357	4	110-4
0.6664	350-388	6	114-4

  a تنوع ژنی محاسبه شده توسط روش نئی (نئی 1973)

 a Gene diversity calculated via Nei's method (Nei 1973)

 

متداول‌ترین هاپلوتیپ در 10 جدایه (GL2، GM2، BE1، BT1، MJ1، SL2، SB1، SJ1، ST1، BM3) مشاهده شد، که این جدایه‌ها از پنج شهرستان گلوگاه، بهشهر، میاندرود، ساری و بابل جمع‌آوری شده‌اند. دومین هاپلوتیپ رایج، که در سه لوکوس با هاپلوتیپ نخست تفاوت داشت، در مجموع در 6 جدایه (NA3، NZ2، NA2، MA2، MS، JO1) شناسایی شد. این جدایه‌ها از شهرستان‌های نکا، میاندرود و جویبار جمع‌آوری شده‌اند. تعداد 22 هاپلوتیپ باقی‌مانده (% 97/70) با فراوانی کم، تنها در یک جدایه مشاهده شدند. هاپلوتیپ‌های مشترک میان جمعیت‌ها نشان‌دهنده تبادل هاپلوتیپ‌ها بین جمعیت‌ها و یا نشان‌دهنده جمعیت­هایی با منشأ یکسان هستند (Hemmati et al., 2009).

 

جدول 4- تخمین تنوع ژنتیکی جمعیت‌های قارچ S. sclerotiorum بر اساس نشانگر SSR

Table 4. Estimation of genetic variability in S. sclerotiorum populations based on SSR marker

If	He	Ned	Nac	H(unique)	Hb	na	Population	جمعیت
0.8030	0.4888	2.2325	2.60	2	5	6	Galugah	گلوگاه
0.8751	0.5111	2.4545	2.90	4	7	9	Behshahr	بهدشت
0.8256	0.4909	2.3174	2.80	3	6	11	Neka	نکا
0.7780	0.4666	2.1454	2.60	2	5	6	Miandorod	میان دورود
0.7034	0.4120	1.8291	2.70	5	7	10	Sari	ساری
0.8123	0.5062	2.1951	2.60	4	6	8	Juybar	جویبار
0.7493	0.4444	2.1012	2.60	4	6	6	Babol	بابل

a اندازه جمعیت، b هاپلوتیپ، c تعداد آلل­های مشاهده شده، d تعداد آلل­های موثر، e تنوع ژنی نئی، f شاخص اطلاعات شانون

a Population size, b Haplotype, c Observed number of alleles, d Effective number of alleles,

e Nei gene diversity, f Shannon information index

 

دندروگرام (UPGMA) بر اساس فاصله ژنتیکی Nei رسم شد و نشان داد که هفت جمعیت مازندران به­طور کلی در دو گروه مجزا قرار گرفتند. یک گروه از آنها شش عضوی و گروه دیگر تک عضوی بود. گروه اول شامل جمعیت­های بهشهر، گلوگاه، نکا، ساری، میاندرود و جویبار بود و در گروه دوم جمعیت بابل قرار گرفت (شکل 4).

 

شکل 3- فراوانی هاپلوتیپ‌های ریزماهواره برای جمعیت‌های S. sclerotiorum از کلزا در مازندران برای 9 هاپلوتیپ شامل بیش از یک جدایه

Fig. 3. Microsatellite haplotype frequency for seven S. sclerotiorum populations from rapeseed in Mazandaran for 9 haplotypes comprising more than one isolate

 

بحث

در این تحقیق، تنوع ژنتیکی 56 جدایه قارچ S. sclerotiorum بر اساس گروه‌هاي سازگاري میسلیومی (MCGs) و نشانگرهای ریز ماهواره (SSR) مورد بررسی قرار گرفت. گروه‌های سازگاری میسلیومی نشان‌دهنده توانایی ادغام یا عدم ادغام میسلیوم بین جدایه‌ها هستند، در حالی­که نشانگرهای ریزماهواره‌ به­عنوان ابزاری حساس برای تحلیل ساختار ژنتیکی و ارزیابی تنوع جمعیتی شناخته می‌شوند.

نتایج این تحقیق نشان داد که ساختار جمعیتی S. sclerotiorum در مزارع کلزای استان مازندران، شامل ترکیبی ناهمگن از گروه‌های سازگاری میسلیومی است. شناسایی 32 گروه سازگاری از میان 56 جدایه مورد بررسی، بیانگر تنوع ژنتیکی بالای این قارچ در مناطق مطالعه شده می­باشد. چنین تنوعی می‌تواند حاصل نرخ بالاي مهاجرت، تبادل ژنتیکی یا نوترکیبی در جمعیت­های قارچی باشد (Kohli et al., 1995). از میان 32 گروه شناسایی شده، 20 گروه تنها شامل یک جدایه بودند. این امر می‌تواند ناشی از جهش‌های تصادفی یا ورود اخیر این گروه‌ها به منطقه باشد. مطالعات مشابه نیز در مناطق مختلف جهان از جمله شمال شرق چین (Liu et al., 2018)، ایالات متحده آمریکا (Aldrich-Wolf et al., 2015)، و ایران (Irani et al., 2011؛ Barari et al., 2012, 2014؛ یوسف­دوست و قوستا، 1394) گزارش شده­اند که همگی بر وجود تنوع بالا در MCG­های این قارچ در میزبان­هایی مانند آفتابگردان، کلزا، سویا، لوبیا، هویج و کلم تأکید دارند.

 

 

 

 شکل 4- دندروگرام (UPGMA)، نشان‌دهنده روابط ژنتیکی میان هفت جمعیت S. sclerotiorum بر اساس فاصله ژنتیکی نئی

Fig. 4. Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA) dendrogram showing the genetic relationships among the seven populations of S. sclerotiorum based on Nei’s genetic distance

 

در همین راستا، کریمی و همکاران (Karimi et al., 2012) تعداد 35 گروه سازگاری میسلیومی مجزا را از میان 57 جدایه جمع‌آوری‌شده از مزارع کلزا در استان گلستان شناسایی کردند که مؤید تنوع بالای جمعیت‌های این قارچ در ایران است. مطـالعات مشـابه از سـایر منـاطـق جغرافیایی نیز یافته‌های مـشابهی را گزارش کرده‌اند. به‌عنـوان مثال، یو و همکاران (Yu et al., 2020) در بررسی 90 جدایه از مزارع کلزای شهر چونگ‌چینگ در چین، 47 گروه سازگاری میسلیومی شناسایی کردند که 72 درصد از آنها شامل تنها یک جدایه بودند. همچنین، توتووا و همکاران (Tóthová et al., 2021) نیز در مطالعه‌ای روی ۴۰ جدایه از مزارع کلزا در اسلواکی، تنوع قابل‌توجهی در ساختار جمعیتی این قارچ گزارش کردند. به‌طور کلی، مطالعات انجام‌شده بر روی مجموعه‌های متنوعی از جدایه‌های S. sclerotiorum در مزارع کلزا از مناطق جغرافیایی مختلف، اطلاعات ارزشمندی را در خصوص شناخت بهتر تنوع ژنتیکی و ساختار جمعیتی این بیمارگر فراهم می‌آورند. 

نشانگرهای ریزماهواره، که به دلیل نرخ بالای جهش و ماهیت چند­آللی خود شناخته شده‌اند، به‌ویژه در تحلیل‌های فیلوژنتیکی دقیق از ارزش بالایی برخوردارند (Sirjusingh and Kohn, 2001). در این تحقیق، با استفاده از ۱۰ نشانگر ریزماهواره، تعداد 46 جایگاه پلی‌مورفیک (آلل) در ۵۶ جدایه جمع‌آوری‌شده از هفت شهرستان استان مازندران شناسایی شد. جایگاه 4-106 با 14 باند بیشترین آلل را در میان آلل­های تولیدی به خود اختصاص داد. همچنین، این جایگاه با مقدار تنوع ژنی نسبتاً بالا (8820/0) نشان می­دهد که دارای تنوع آللی بالایی در میان جدایه­هاست و می­تواند نشانگر مناسبی برای بررسی تمایز ژنتیکی باشد، زیرا تفکیک بهتری در بین جمعیت­ها و درون جمعیت­ها انجام می­دهد. تعداد کل هاپلوتیپ‌ها بر اساس ترکیب‌های آللی منحصر به فرد در جایگاه‌های ریزماهواره و شمارش هاپلوتیپ‌های متمایز موجود تعیین گردید. در مجموع، 31 هاپلوتیپ از ۵۶ جدایه (% 36/55) شناسایی شد و 22 جدایه تنها دارای یک هاپلوتیپ بودند. کلارکسون و همکاران (Clarkson et al., 2013) تعداد 228 هاپلوتیپ SSR را در 384 جدایه (%59) از بریتانیا شناسایی کردند، در حالی­که یو و همکاران (Yu et al., 2020) تعداد 52 هاپلوتیپ را در 90 جدایه (%58) از شهر چونگ‌کینگ چین گزارش کردند. به‌طور مشابه، لـهنر و همکاران (Lehner et al., 2015) نسبت مشـابهی از هاپـلوتیپ‌ها را در جـمعـیت‌های S. sclerotiorum در برزیل شناسایی کردند. براری و همکاران (Barari et al., 2017) نیز در بررسی 52 جدایه از مزارع کلزا در استان مازندران تعداد 27 هاپلوتیپ را گزارش کردند. همچنین، سکستون و هاولت (Sexton and Howlett, 2004) با استفاده از هشت نشانگر ریزماهواره بر روی 154 جدایه S. sclerotiorum جمع­آوری شده از مزارع کلزا در استرالیا، تعداد 82 هاپلوتیپ (25/53) مختلف را شناسایی کردند که بسیاری از آن‌ها در هر جمعیت منحصر­به­فرد بودند. این یافته‌های مشابه در مناطق جغرافیایی مختلف، نشان‌دهنده تنوع ژنتیکی بالای این قارچ بیماری‌زا است.

در این مطالعه، ۹ هاپلوتیپ بین دو یا چند جدایه مشترک بود و دو هاپلوتیپ با بیشترین فراوانی، در تمام شهرستان‌های بررسی شده مشاهده شدند. چنین الگو­هایی ممکن است ناشی از چند فرآیند هم‌زمان باشد، از جمله تکثیر کلونال ژنوتیپ(های) موفق از طریق تولیدمثل غیرجنسی و ماندگاری سختینه‌ها که امکان بقا و گسترش محلی را فراهم می‌کند. علاوه بر این، انتقال انسان‌محور (مثلاً از طریق خاک یا تجهیزات کشاورزی آلوده) می‌تواند جریان ژنی بین مزارع مجاور را تسریع کند. اگر­چه شواهد مستقیم برای S. sclerotiorum محدود است، اما ساختار جمعیتی غالباً کلونال این قارچ نشان می‌دهد که جابجایی محلی و انسان‌محور می‌تواند نقش داشته باشد. انتقال طبیعی نیز حائز اهمیت است؛ سختینه‌ها می‌توانند مدت طولانی در شرایط مزرعه‌ای باقی بمانند و توسط آب جابه­جا شوند، که بقای محیطی و پراکنش را تسهیل می‌کند (Pethybridge et al., 2024). آسکوسپور­های هوا­زاد نیز عامل مهمی در پراکنش درون‌مزرعه‌ای و بین‌مزارع هستند و نقش کلیدی در پراکنش ژنتیکی در فواصل دور دارند. این آسکوسپور­ها محصول آمیزش­های جنسی میان ژنوتیپ­های مشابه یا متفاوت­اند، که می­توانند منجر به تولید نسل­هایی با ساختار ژنتیکی مشابه شوند (Reich et al., 2024). ترکیب پراکنش هوا­برد آسکوسپور­ها با گسترش کلونال، می‌تواند منجر به توزیع گسترده ژنوتیپ‌های مشابه شود؛ ساز­و­کاری که با ساختار جمعیتی غالباً کلونال S. sclerotiorum سازگار است. گزارش‌هایی از وجود هاپلو‌تیپ‌های ریزماهواره مشترک در بین جمعیت‌های مناطق مختلف از جمله چین نیز وجود دارد (Yu et al., 2020). همچنین، بر اساس گزارش همتی و همکاران (Hemmati et al., 2009)، از میان 80 هاپلوتیپ شناسایی شده از استان­های مازندران، گلستان، گیلان و اردبیل، 19 هاپلوتیپ (% 7/23) در میان دست­کم دو جمعیت منطقه­ای مشترک بودند.

در تجزیه خوشه­ای جمعیت­ها بر اساس دندروگرام (UPGMA)، جمعیت‌های بهشهر و گلوگاه کمترین فاصله ژنتیکی (035/0) را نشان داده و در یک خوشه نزدیک به هم قرار گرفته‌اند. این می­تواند نشان­دهنده تبادل ژنی یا منشاء ژنتیکی مشترک آنها باشد. جمعیت نکا نیز در مرحله بعد به این خوشه افزوده شده و ارتباط نسبتاً نزدیکی با این دو جمعیت دارد. در گروه اول، جمعیت­های ساری و میاندرود از سایر جمعیت­ها متمایز شدند. در سمت دیگر، جمعیت‌ بابل در یک خوشه مجزا قرار گرفت و بیشترین فاصله ژنتیکی (248/0) را با جویبار نشان داد.

در ایـن پژوهـش، همـبسـتگی بـیـن هاپلوتیـپ‌هـای ریزماهـواره و گـروه‌هـای سـازگاری میـسلیـومـی مـعنی‌دار نـبود (75/0 = r، 36/0= p [Cramér’s V]. در واقـع، تطابق قابـل‌توجهی بیـن هاپلـوتیـپ‌های حاصل از نشانگر­های ریزماهواره‌ای (SSR) و گروه‌های سازگاری میسلیومی (MCGs) مشاهده نشد؛ به‌طوری­که هر گروه سازگاری میسلیومی شامل جدایه‌هایی با هاپلوتیپ‌های متفاوت بود و در مقابل، جدایه‌های متعلق به یک هاپلوتیپ نیز الزاماً در یک گروه سازگاری قرار نداشتند. این الگو با یافته‌های پژوهش‌های پیشین (Hemmati et al., 2009) هم‌راستا است که عدم ارتباط نزدیک بین MCG­ها و نشانگر­های SSR را گزارش کرده‌اند. یو و همکاران (Yu et al., 2020) نیز در جمعیت‌های S. sclerotiorum شهر چونگ‌چینگ چین، ارتباط معنا­داری بین هاپلوتیپ‌های SSR و گروه‌های MCG نیافتند و این امر را به احتمال وقوع نوترکیبی در جمعیت نسبت دادند.

یکی از دلایل احتمالی این عدم همبستگی می‌تواند وقوع نوترکیبی ژنتیکی (جنسی یا شبه‌جنسی) در جمعیت باشد، که منجر به باز­آرایی آلل‌ها در جایگاه‌های SSR می‌شود بدون آن‌که الگو­های سازگاری میسلیومی تغییر یابد. علاوه بر این، اپیستازی و اثرات برهم‌کنش ژنی نیز ممکن است سبب فرگشت مستقل ژن‌های دخیل در تعیین MCG از تنوع ژنومی در نشانگر­های SSR گردند. از سوی دیگر، SSR­ها اغلب نواحی غیر­کُد­کننده ژنوم را نشان می‌دهند، در حالی‌که گروه‌های سازگاری میسلیومی تحت کنترل مجموعه‌ای از ژن‌های خاص سازگاری هتروکاریونی قرار دارند؛ بنابراین تنوع در این دو سیستم الزاماً هم‌راستا نیست. احتمال وجود جریان ژنی بین جمعیت‌ها و جهش‌های نقطه‌ای در ژن‌های کنترل‌کننده سازگاری میسلیومی نیز می‌تواند به ایجاد چنین الگو­های ناهمخوانی منجر شود.

با این حال، یافته‌های متناقضی نیز در این زمینه گزارش شده‌اند. به­عنوان مثال، سیلوا و همکاران (Silva et al., 2021) وجود همبـسـتـگـی نزدیـکـی بـیـن MCGs و MLLs (multi-locus lineage) را گـزارش کـردنـد. همچنین لیو و همکاران (Liu et al., 2018) نشان دادند همبستگی قوی بین نتایج آزمون MCGs و نشانگر­های ریزماهواره وجود دارد. در مطالعه آلدریچ ولف و همکاران (Aldrich-Wolfe et al., 2015) جدایه‌های متعلق به یک گروه سازگاری میسلیومی معمولاً دارای هاپلوتیپ‌های یکسان یا بسیار مشابه بودند، به‌طوری‌که اختلاف آن‌ها تنها در یک یا دو جایگاه از مجموع ۱۲ جایگاه پلی‌مورفیک مشاهده شد. سکستون و هاولت (Sexton and Howlett, 2004) نیز نشان دادند که توالی‌ها یا هاپلو‌تیپ‌های مشابه یا نزدیک، معمولاً به گروه‌های MCG مشابه تعلق داشتند، یعنی نشانگر­های ریزماهواره با گروه‌بندی MCG همخوانی داشتند. این گزارش‌های متناقض حاکی از آن است که میزان همبستگی بینMCG ­ها وSSR ­ها ممکن است به جمعیت مورد بررسی، شرایط بوم‌شناختی، ساختار ژنتیکی منطقه‌ای و روش‌های تحلیلی مورد استفاده وابسته باشد. 

نتایج این تحقیق اطلاعات ارزشمندی درباره تنوع ژنتیکی و ساختار جمعیتی S. sclerotiorum در مزارع کلزای استان مازندران ارائه می‌دهد. یافته‌ها نشان می­دهد که این قارچ دارای توانایی بالایی در سازگاری با شرایط محیطی مختلف است و می‌تواند تحت تأثیر تغییرات اکوسیستمی دچار تحول ژنتیکی شود. شناخت دقیق تنوع ژنتیکی و ساختار جمعیت این پاتوژن می‌تواند نقش کلیدی در تدوین راهبرد­های مؤثر برای مدیریت بیماری ایفا کند. به­طور کلی، برنامه‌های اصلاحی باید بر اساس شناخت دقیق ساختار ژنتیکی پاتوژن در هر منطقه طراحی شوند تا بتوانند مقاومت پایدار و مؤثری در برابر بیماری پوسیدگی اسکلروتینیایی ساقه ایجاد کنند. نتایج این تحقیق بر اهمیت پرورش ارقام مقاوم کلزا متناسب با ساختار ژنتیکی جمعیت‌های پاتوژن در هر منطقه تأکید دارد. انتخاب و توسعه ارقامی که به‌طور ویژه برای مقابله با ساختار ژنتیکی پاتوژن‌های بومی طراحی شده‌اند، می‌تواند اثر­بخشی راهکار­های مدیریت بیماری را بهبود بخشیده و از خسارات اقتصادی ناشی از آن جلوگیری کند. 

 

منابع                                                                                                                                                        References

یوسف دوست، و. و قوستا، ی. 1394. گروه­هاي سازگار میسلیومی و بیماریزایی جدایه­هاي قارچ عامل پوسیدگی سر کلم در ارومیه. مجله علمی کشاورزی 38(1): 78-67.

Ajiboye, T.O. Visser, H.G., Erasmus, E. and Schutte-Smith, M. 2025. Recent strategies for controlling the white mould fungal pathogen (Sclerotinia sclerotiorum) using gene silencing, botanical fungicides and nanomaterials. Sustainable Food Technology 3: 612-636.

Aldrich-Wolfe, L., Travers, S. and Nelson, B.D. 2015. Genetic variation of Sclerotinia sclerotiorum from multiple crops in the north central United States. PLoS One 10(9): e0139188. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139188.

Barari, H., Dalili, S.A. and Hassani, H.M. 2017. Genetic diversity among different isolates of Sclerotinia sclerotiorum in north of Iran. Journal of Bacteriology and Mycology 5(5): 387‒389.

Barari, H., Alavi, V. and Badalyan, S.M. 2012. Genetic and morphological differences among populations of Sclerotinina sclerotiorum by microsatellite markers, mycelial compatibility groups (MCGs) and aggressiveness in North Iran. Romanian Agricultural Research 29: 323-331.

Barari, H., Dalili, S.A. and Badalyan, S.M. 2014. Mycelial compatibility grouping and aggressiveness of Sclerotinia sclerotiorum on different hosts in North of Iran. Jordan Journal of Agricultural Sciences 10(1): 45-57. http://dx.doi.org/10.12816/0029873.

Bolton, M.D., Thomma, B.P.H.J. and Nelson, B.D. 2006. Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary: Biology and Molecular Traits of a Cosmopolitan Pathogen. Molecular Plant Pathology 7: 1-16.

Carbone, I., Anderson, J.B. and Kohn, L.M. 1999. Patterns of descent in clonal lineages and their multilocus fingerprints are resolved with combined gene genealogies. Evolution 53: 11-21.

Clarkson, J.P., Conventry, E., Kitchen. J., Carter, H.E. and Whipps, J.M. 2013. Population structure of Sclerotinia sclerotiorum in crop and wild hosts in the UK. Plant Pathology 62(2): 309-324.

Irani, H., Heydari, A., Javan-Nikkhah, M. and Ibrahimov, A.S. 2011. Pathogenicity variation and mycelial compatibility groups in Sclerotinia sclerotiorum. Journal of Plant Protection Research 51(4) 329-336.

Faraghati, M., Abrinbana, M. and Ghosta, Y. 2022. Genetic structure of Sclerotinia sclerotiorum populations from sunflower and cabbage in West Azarbaijan province of Iran. Scientific Reports 12: 9263. https://doi.org/10.1038/s41598-022-13350-7.

Hemmati, R., Javan-Nikkhah, M. and Linde, C.C. 2009. Population genetic structure of Sclerotinia sclerotiorum on canola in Iran. European Journal of Plant Pathology 125: 617-628.

Karimi, E., Safaie, N. and Shams-Bakhsh, M. 2012. Mycelial compatibility groupings and pathogenic diversity of Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary populations on canola in Golestan Province of Iran. Journal of Agricultural Science and Technology 14: 421-434.

Khan, M.A., Cowling, W.A., Banga, S.S., Barbetti, M.J., Cantila, A.Y., Amas, J.C., Thomas, W.J., You, M.P., Tyagi, V., Bharti, B. and Edwards, D. 2023. Genetic and molecular analysis of stem rot (Sclerotinia sclerotiorum) resistance in Brassica napus (canola type). Helyon 9: 1-12. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2023.e19237.

Kohli, Y., Brunner, L.J., Yoell, H, Milgroom, M.G., Anderson, J.B., Morrall, R.A. and Kohn, L.M. 1995. Clonal dispersal and spatially mixing in populations of the plant pathogenic fungus, Sclerotinia sclerotiorum. Molecular Ecology 4(1): 69-77.

Kohn, L.M. 1995. The clonal dynamic in wild and agricultural plant pathogen populations. Canadian Journal of Botany 73(S1): 1231–1240. http://dx.doi.org/10.1139/b95-383.  

Lehner, M.S., Paula Júnior, T.J., Hora Júnior, B.T., Teixeira, H., Vieira, R.F., Carneiro, J.E.S. and Mizubuti, E.S.G. 2015. Low genetic variability in Sclerotinia sclerotiorum populations from common bean fields in Minas Gerais State, Brazil, at regional, local and micro-scales. Plant Pathology 64: 921-931.

Litholdo Júnior, C.G., Gomes, E.V., Lobo Júnior, M., Nasser, L.C.B. and Petrofeza, S. 2011. Genetic diversity and mycelial compatibility groups of the plant-pathogenic fungus Sclerotinia sclerotiorum in Brazil. Genetics and Molecular Research 10(2): 868-877.

Liu, J., Meng, Q., Zhang, Y., Xiang, H., Li, Y., Shi, F., Ma, L., Liu, C., Liu, Y., Su, B. and Li, Z. 2018. Mycelial compatibility group and genetic variation of sunflower Sclerotinia sclerotiorum in Northeast China. Physiological and Molecular Plant Pathology 102: 185-192. https://doi.org/10.1016/j.pmpp. 2018.03.006.

Liu, K. and Muse, S.V. 2005. PowerMarker: An integrated analysis environment for genetic marker analysis. Bioinformatics 21(9): 2128–2129. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bti282.

McDonald, B.A. and Linde, C. 2002. Pathogen population genetics, evolutionary potential, and durable resistance. Annual Review of Phytopathology 40: 349-379. https://doi.org/10.1146/annurev.phyto.40.120501. 101443.

Nei, M. 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 70: 3321-3323.

Pakdaman, B.S. and Goltapeh, E.M. 2007. In vitro studies on the integrated control of rapeseed white stem rot disease through the application of herbicides and Trichoderma species. Pakistan Journal of Biological Sciences 10(1): 7-12.

Peakall, R. and Smouse, P.E. 2012. GenAlEx 6.5: Genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research-An update. Bioinformatics 28(19): 2537-2539.

Pethybridge, S.J., Murphy, S., Lund, M. and Kikkert, J.R. 2024. Survival of Sclerotinia sclerotiorum sclerotia in central New York. Plant Disease 108(5): 1165-1172.

Reich, J., McLaren, D.L., Kim, Y.M., Wally, O., Yevtushenko, D., Hamelin, R. and Chatterton, S. 2024. Predicting airborne ascospores of Sclerotinia sclerotiorum through machine learning and statistical methods. Plant Pathology 73(6): 1586-1601.

Rohlf, F.J. 2009. NTSYSpc: Numerical taxonomy system (Version 2.2). Exeter Software, Setauket, NY, USA.

Saharan, G.S. and Mehta, N. 2008. Sclerotinia Diseases of Crop Plants: Biology, Ecology and Disease Management. Springer Science + Business Media B.V., Amsterdam.

Sambrook, J. and Russel, D.W. 2001. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Schafer, M.R. and Kohn, L.M. 2006. An optimized method for mycelial compatibility testing in Sclerotinia sclerotiorum. Mycologia 98(4): 593-597. https://doi.org/10.3852/mycologia.98.4.593.

Sexton, A.C. and Howlett, B.J. 2004. Microsatellite markers reveal genetic differentiation among populations of Sclerotinia sclerotiorum from Australian canola fields. Current Genetics 46(6):357-65.

Silva, R.A., Ferro, C.G., Lehner, M., Jr, T.J.P. and Mizubuti, E.S.G. 2021. The population of Sclerotinia sclerotiorum in Brazil is structured by mycelial compatibility groups. Plant Disease 105: 3376-3384.

Sirjusingh, C. and Kohn, L.M. 2001. Characterization of microsatellites in the fungal plant pathogen, Sclerotinia sclerotiorum. Molecular Ecology Notes 1(4): 267–269. https://doi.org/10.1046/j.1471-8278.2001.00102.x.

Tóthová, M., Máčajová, P. and Tóth, P. 2021. Mycelial incompatibility of Sclerotinia sclerotiorum isolates from a single rapeseed field in Slovakia. Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences 11(2). https://doi.org/10.15414/jmbfs.3369.

Tok, F.M., Derviş, S. and Arslan, M. 2016. Analysis of genetic diversity of Sclerotinia sclerotiorum from eggplant by mycelial compatibility, random amplification of polymorphic DNA (RAPD) and simple sequence repeat (SSR) analyses. Biotechnology and Biotechnological Equipment 30(5): 921_928.

Xu, D.F., Li, X.L., Pan, Y.M., Dai, Y.L., Li, P., Chen, F.X., Zhang, H.J., Guo, M. and Gao, Z.M. 2014. Genetic diversity and pathogenicity differentiation of Sclerotinia sclerotiorum on rapeseed (Brassica napus L.) in Anhui Province, China. Genetics and Molecular Research 13(4): 10704-10713. https://doi.org/10.4238/2014.december.18.12.

Yu, Y., Cai, J., Ma, L., Huang, Z., Wang, Y., Fang, A., Yang, Y., Qing, L. and Bi, C. 2020. Population structure and agressiveness of Sclerotinia sclerotiorum from rapeseed (Brassica napus) in Chongqing City. Plant Disease 104: 1201-1206.

75