Comparison of pathogenicity of Botrytis cinerea isolates collected from vegetable and summer hosts in Varamin region and their resistance to common fungicides
Subject Areas : Plant PathologyHaniyeh zafar 1 , وحید زرین نیا 2
1 -
2 - هیات علمی گروه گیاه پزشکی دانشگاه آزاد واحد علوم و تحقیقات تهران
Keywords: Gray mold, morphology, resistance to chemicals,
Abstract :
The gray mold disease of Botrytis cinerea (tel: Botryotinia fuckeliana), in the end part of the tail of the soft and watery fruit, turns green and shriveled. The disease agent maintains its survival in the form of sclerotia in the soil, mycelium in contaminated plant residues, and also in the form of asexual spores in the air. This polyphagous fungus causes disease in vegetable and summer greenhouse products such as tomatoes, peppers, cucumbers and eggplants under cool and humid conditions. In this research, sampling was done during 2013-2014 from the greenhouses of Varamin region and identification of Botrytis cinerea fungus was done in BSM special culture medium. In order to study the morphology of the fungus, the structure of the progeny, the shape of the conidia, the type of filaments, and the spores and sclerotia were studied. The distribution pattern of this fungus on the surface of the colonies in the culture medium and the effects of resistance to the three fungicides benomyl, carbendazim and fenhexamid were investigated by creating different groups of B. cinerea. The correlation of the obtained data was evaluated in SPSS software. The results of the data analysis showed that this pathogen has a considerable morphological diversity and resistance in Varamin city, which is useful in the production of vegetable and summer cultivars resistant to gray rot disease, as well as evaluating the diversity in fungus morphology and disease-causing characteristics of this pathogen in Varamin areas, and similar areas to the geography of Varamin region will be used.
امینی، ر. و ابرین¬بنا، م. 1395. مقاومت برخی جدایه¬های Botrytis cinerea نسبت به قارچ¬کش¬های بنومیل، ایپرودیون و فن¬هگزامید در استان آذربایجان غربی. پژوهش¬های کاربردی در گیاه¬پزشکی 5(1): 195-207.
الهي نيا، ع. ١٣٨٤. بيماري¬هاى سبزى و صيفي و روش¬هاى مبارزه با آنها. چاپ اول، انتشارات دانشگاه گيلان، رشت.
Abbey, J.A., Alzohairy, S.A., Neugenauer, K.A., Hatlen, R.J. and Miles, T.D. 2024. Fungicide resistance in Botrytis cinerea and identification of Botrytis species associated with blueberry in Michigan. Frontiers in Microbiology 15: 1425392. https://doi.org/10.3389/fmicb.2024.1425392.
Amini, M.M., Mirzaei, S. and Heidari, A. 2023. A growing threats threat: investigating the high incidence of benzimidazole fungicides resistance in Iranian Botrytis cinerea isolates. PLos One 18(11): e0294530.
Beever, R.E. and Weeds, P.L. 2004 Taxonomy and Genetic Variation of Botrytis and Botryotinia. Pp: 29-52. In: Elad, Y., Williamson, B., Tudzynski, P. and Delan, N. (Eds.). Botrytis: Biology, Pathology and Control, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht,
Cheung, N., Tian, L., Liu, X. and Li, X. 2020. The destructive fungal pathogen Botrytis cinerera-insights from genes studied with mutant analysis. Pathogens 9(11): 923.
Chilvers, M.I. and du Toit, L.J. 2006. Detection and identification of Botrytis species associated with neck rot, scape blight, and umbel blight of onion. Online. Plant Health Progress; https://doi.org/10.1094/PHP-2006-1127-01-DG .
Delc´an, J. and Melgarejo, P. 2002. Mating behaviour and vegetative compatibility in Spanish populations of Botrytotinia fuckeliana. European Journal of Plant Pathology 108: 391-400.
Ebrahimzadeh, F. and Abrinbana, M. 2019. Activity of fungicide mixtures against Botrytis cinerea isolates resistant to benzimidazoles, strobilurins and dicarboximides. Annals of Applied Biology 174(3): 301-312.
Edwards, S.G. and Seddon, B. 2001.Selective media for the specific isolation of Botrytis cinerea. Letters in Applied Microbiology 32: 63-66.
Elad, Y. Williamson, B. Tudzynski, P. and Delen, N. 2007. Botrytis spp. and diseases they cause in agricultural systems: an introduction. In: Elade, Y., Williamson, P., Tudzinski, P. and Delen. N. Botrytis: Biology, Pathology and control. Springer Publishers. http://dx.doi.org/10.1007/978-1-4020-2626-3_1.
Fournier, E., Giraud, T., Loiseau, A., Vautrin, D., Estoup, A., Solignac, M., Cornuet, J.M. and Brygoo, Y. 2002. Characterization of nine polymorphic microsatellite loci in the fungus Botrytis cinerea (Ascomycota). Molecular Ecology Notes 2(3): 253-255.
Giraud, T., Fortini, D., Levis, C., Leroux, P. and Brygoo, Y. 1997. RFLP markers show genetic recombination in Botryotinia fuckeliana (Botrytis cinerea) and transposable elements reveal two sympatric species. Molecular Biology Evolution 14:1177-1185.
He, L., Cui, K., Li, T., Song, Y., Liu, N., Mu, W. and Liu, F. 2020. Evolution of the resistance of Botrytis cinerea to carbendazim and the current efficacy of carbendazim against gray mold after long-term discontinuation. Plant Disease 104(6): 1647-1653.
Hyde, K.D., Balrdin, P., Chen, Y., Thilini Chethana, K.W., De Hoog, S., Doilom, M., de Farias, A.R.G., Gonçalves, M.F., Gonkhom, D., Gui, H. and Hilário, S. 2024. Current trends, limitations and future research in the fungi? Fungal Diversity 125: 1-71.
Isaza, L., Zuluaga, Y.P. and Marulanda, M.L. 2019. Morphological, pathogenic and genetic diversity of Botrytis cinerea Pers. In blackberry cultivations in Colombia. Revista Brasileira de Fruticultura 41(6). https://doi.org/10.1590/0100-29452019490.
Korolev, N., Elad, Y. and Katan, T. 2008. Vegetative compatibility grouping in Botrytis cinerea using sulphate non- utilizing mutant. European Journal of Plant Pathology 122: 369-383.
Martinez, F., Dubos, B. and Fermaud, M. 2005. The role of saprotrophy and virulence in the population dynamics of Botrytis cinerea in vineyards. Phytopathology 95: 692-700.
Meng, L., Mestdagh, H., Ameye, M., Audenaert, K., Hofte, M. and van Labeke, M.C. 2020. Phenotypic variation of Botrytis cinerea isolates is influenced by spectral light quality. Frontiers in Plant Science 11: 1233.
Mirzaei, S., Mohammadi Goltapeh, E., Shams-Bakhsh, M., Safaie, N. and Chaichi, M. 2009. Genetic and phenotypic diversity among Botrytis cinerea isolates in Iran. Journal of Phytopathology 157(7-8): 474-482.
Naranjo-Ortiz, M.A. and Gabaldon, T. 2020. Fungal evolution: cellular, genomic and metabolic complexity. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society 95(5): 1198-1232.
Notte, A.M., Plaza, V., Marambio-Alvarado, B., Olivares-Urbina, L., Poblete-Morales, M., Silva-Moreno, E. and Castillo, L. 2021. Molecular identification and characterization of Botrytis cinerea associated to the endemic flora and semi-desert climate in Chile. Current Research in Microbial Sciences 2: 100049
O'Neill, T.M., Shtienberg, D. and Elad, Y. 1997. Effect of some host and microclimate factors on infection of tomato stems by Botrytis cinerea. Plant Disease 81(1): 36-40.
Pesic, B., Hrustic, J., Mihajlovic, M., Grahovac, M. and Delibasic, G. 2014. Botrytis cinerea in raspberry in Serbia: morphological and molecular characterization. Pesticidi I Fitomedicina 29: 237-247.
Porquier, A., Tisserant, C., Salinas, F., Glassi, C., Wange, L., Enard, W., Hauser, A., Hahn, M. and Weiberg, A. 2021. Retrotransposons as pathogenicity factors of the plant pathogenic fungus Botrytis cinerea, Genome Biology 22: 225. https://doi.org/10.1186/s13059-021-02446-4.
Rupp, S., Weber, R.W.S., Rieger, D., Detzel, P. and Hahn, M. 2017. Spread of Botrytis cinerea strains with multiple fungicide resistance in German horticulture. Frontiers in Microbiology 7: 2075. http://dx.doi.org/10.3389/fmicb.2016.02075.
Sautua, F.J., Baron, C., Perez-Hernandez, O.P. and Carmona, M.A. 2019. First report of resistance to carbendazim and procymidone in Botrytis cinerea from strawberry, blueberry and tomato in Argentina. Crop Protection 125. https://doi.org/10.1016/j.cropro.2019.104879.
Staats, M., van Baarlen, P. and van Kan, J.A.L. 2005. Molecular phylogeny of the plant pathogenic genus Botrytis and the evolution of host specificity. Molecular Biology and Evolution 22(2): 333-346.
Stall, R.E. 1991. Gray Mold. Pp. 16-17. In: Jones, J.B., Jones, J.P., Stall, R.E. and Zitter, T.A. (eds.). Compendium of Tomato Diseases. American Phytopathological Society Press, st. Paul, M.N.
Steentjes, M.B.F., Scholten, O.E. and van Kan, J.A.L. 2021. Peeling the onion: towards a better understanding of Botrytis disease of onion. Phytopathology 111(3): 464-473.
Tanovic, B. and Ivanovic, M. 2010. First report of occurrence of benomyl resistance in Botrytis cinerea isolates on raspberry in Serbia. 94(4): 486. https://doi.org/10.1094/pdis-94-4-0486c.
Wessels, B.A. 2012. Genetic characterization and fungicide resistance profiles of Botrytis cinerea in rooibos nurseries and pear orchards in the Western Cape of South Africa. Master’s thesis, Stellenbosch University, South Africa.
Williamson, B. Tudzynski, B. Tudzynski, P. and Van Kan, J.A.L. 2007. Botrytis cinerea: the cause of grey mould disease. Molecular Plant Pathology 8: 561-580.
گیاهپزشکی کاربردی، جلد 12، شماره 2، سال 1402
مقایسه شدت بيماريزايي جدايههاي Botrytis cinerea جمعآوري شده از ميزبانهاي سبزي و صيفي در منطقه ورامين و مقاومت آنها به قارچکشهای متداول
Comparison of pathogenicity of Botrytis cinerea isolates collected from vegetable and summer hosts in Varamin region and their resistance to common fungicides
هانيه ظفر1 و وحيد زرين نيا2*
دریافت: 14/10/1402 پذیرش: 15/12/1402
چکیده
بيمارى كپك خاكسـترى با عامل قارچی Botrytis cinerea (tel: Botryotinia fuckeliana)، در قسـمت انتهايي دم ميوه (دمگاه) گیاهان سبزی و صیفی رشـد ميكند. عامل بيمارى به صـورت (اسـكلروت) در خاك، ميسـليوم در بقاياى آلوده گياهي و همچنين بهصـورت اسـپورهاى غير جنسـي در هوا بقاء خود را حفظ ميكند. اين قارچ پليفاژ در محصـولات سـبزى و صـيفي گلخانه ای مانند گوجهفرنگي، فلفل، خيار و بادمجان تحت شـرايط هواى خنك و مرطوب بيمارى ايجاد ميكند. در اين پژوهش، نمونهبردارى طی سالهاى 94-١٣٩3 از گلخانههاى منطقه ورامين انجام و شناسايي قارچ Botrytis cinerea در محيط كشت اختصاصي BSM صـورت گرفت. به منظور بررسي مورفولوژى قارچ، سـاختار پرگنه، شـكل كنيدى، تيپ ريسـه‌ها و اسـپور و اسـكلروت مطالعه شد. تنوع پراكندگي اين قارچ در سـطح كلنيها در محيط كشـت و اثرات مقاومت به سه سـم بنومیل، كاربندازيم و فنهگزاميد با ايجاد گروه‌هاى مختلف قارچ B. cinerea بررسی گردید. همبستگی داده‌هاى بهدسـت آمده در نرم افزار SPSS مورد ارزيابي قرار گرفت. نتايج آناليز داده‌ها نشــان داد كه اين قارچ داراى تنوع مورفولوژى و مقاومتي قابل ملاحظهای در شهرستان ورامین است كه در تولید ارقام سبزى و صيفي مقاوم نسـبت به بيمارى پوسـيدگي خاكسـترى و همچنين ارزيابي ميزان تنوع موجود در مورفولوژى قارچ و خصوصيات بيماريزايي اين قارچ در نواحي ورامين و مناطق مشابه با جغرافياي منطقه ورامين استفاده خواهد شد.
واژگان كليدى: كپك خاكسترى، مورفولوژى، مقاومت سموم
مقدمه
گياهان سبزى و صيفي نقش بسيار اساسي در زندگي بشر دارند و بسيارى از عناصر ضرورى و ويتامين هاى مورد نياز از اين گياهان تأمين ميشوند. بنابراين حفظ این گياهان از اهميت زيادى برخوردار بوده و سلامتي انسان و سایر جانوران به اين گياهان وابسته است (الهينيا، ١٣٨٤). متأسفانه اغلب توليدكنندگان سبزى و صيفي با پاتوژنها به دو صورت بيمارگرهاى زنده (مسرى) شامل بيمارىهای قارچي، ويروسی، باكتريايي و غيره و بیمارگرهای غيرزنده (غير مسرى) مانند كمبود مواد غذايي، سرمازدگي، آلودگي هوا، كمبود رطوبت، زيادى نور و غيره در گياهان آشنا نیستند و لذا به درستي نميتوانند بيمارىهاى گياهان را تشخيص دهند؛ در حالیکه مديريت بيمارىها در درجه اول نياز به تشخيص صحیح بيماريها و عوامل ايجادكننده آنها دارد (الهينيا، ١٣٨4).
بيمارى كپك خاكسترى توسط قارچ Botrytis cinerea Pers. با فرم جنسي Botryotinia fuckeliana ايجاد ميشود.
1- دانشجوی سابق کارشناسی ارشد بیماری شناسی گیاهی، گروه گیاهپزشکی، دانشکدۀ کشاورزی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد ورامین-پیشوا، ورامین، ایران
2- استادیار، گروه گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی و علوم صنایع غذایی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات تهران، تهران، ایران
نویسنده مسئول مکاتبات: Zarrinnia@gmail.com
قارچ Botrytis cinerea يك عامل بيمارگر غيراختصاصي گياهي بوده و قادر است علائم سوختگي يا پوسيدگي را در بسيارى از گياهان ایجاد نماید. این قارچ ميتواند مشكلی جدى در محصولات سبزى و صيفي گلخانهای مانند گوجهفرنگي، فلفل، خيار و بادمجان تحت شرايط هواى خنك و مرطوب ايجاد كند (O'Neill et al., 1997). اين قارچ در اوايل بهار و اواخر پائيز گوجهفرنگي و ساير محصولات گلخانهای آسيبهاى جدى وارد ميكند (Stall, 1991). اين قارچ داراى دامنه ميزباني وسيعي بوده و به محصولات جاليزى نیز خسارات اواني وارد ميكند. مناسبترين درجه حرارت براى رشد قارچ B. cinerea دماى ٢٠ درجه سلسیوس است؛ آلودگي در انبارهايي كه بهطور طبيعي سرد هستند و يا روى محصولات بعد از برداشت و در زمان حمل و نقل و حتي در صفر درجه سلسیوس نیز توسعه مييابد (الهينيا، ١٣٨٤).
اين قارچ با گسترش جهاني، ميزبانهاى فوقالعاده زيادى دارد؛ لذا موانع زیادی در مسیر تلاش برای مدیریت این بیمارگر بر روی طيف گستردهاى از ميزبانها، با توجه به تنوع مورفولوژيكي و ژنتيكي قارچ وجود دارد (Fournier et al., 2002؛ Williamson et al., 2007). این قارچ ميتواند به شكل كنيديوم و ساپروفيت و يا به شكل ميسليوم بر روى بافت هاى رو به زوال گياه زنده بماند و براى مدت طولاني تر، اندام‌هاى مقاومترى بنام اسكلروت توليد ميكند که در بقاياى مرده گياه زنده میمانند (Staats et al., 2005؛ Williamson et al., 2007).
در این مطالعه، به دليل تنوع مورفولوژى بالاى قارچ B. cinerea از نظر تيپ ريسه‌ها و اسپورها و اسكلروتها، تنوع پراكندگي اين گونه در سطح كلنيها در محيط كشـت بررسی گردید و اثرات مقاومت به سه سم متداول شامل بنومیل، كاربندازيم و فنهگزامید با ايجاد گروه‌هاى مختلف قارچ B. cinerea مطالعه شد. محتمل است یافته های حاصل از این مطالعه براى ايجاد ارقام سبزى و صيفي مقاوم به بيمارى پوسيدگي خاكسترى و همچنين جهت ارزيابي ميزان تنوع موجود در مرفولوژى قارچ و خصـوصيات بيماريزايي اين قارچ در نواحي ورامين و مناطق مشابه با جغرافياي منطقه ورامين استفاده گردد.
مواد و روشها
الف) نمونهبردارى، جداسازى و شناسايي
اين پژوهش در آزمايشگاه گياهپزشكي دانشكده كشاورزى دانشگاه آزاد اسلامي واحد ورامين ـ پيشوا در سالهای 94-١٣٩3 انجام شد. قارچهاى بيماريزا از گلخانههاى منطقه ورامين در سه ایستگاه جوادآباد، فلات، پيشوا و قلعهسين نمونه برداری شدند. به این ترتیب که در هر مزرعه و يا خطوط كشت در گلخانه، تكتك بوته‌ها بررسي و از ناحيه ساقه و برگ و ميوه‌هاى آلوده نمونهبردارى شد. در هر گلخانه با توجه به نوع كشت از گل و ميوه‌هاى رسيده و بوته‌هاى هرس شده كه معمولاً آلودگي در آنها بيشتر ديده مي شد؛ نمونهبردارى صورت گرفت. قارچ B. cinerea جدا شده از هر بوته آلوده بهعنوان يك جدايه در نظر گرفته شد. نمونه‌ها در پاكتهاى مخصوص جهت نگهدارى وكشت دادن به آزمايشگاه انتقال داده شد. روى پاكتها نام محصول و گلخانه و ساير مشخصات نمونه‌ها ثبت شد. به منظور جداسازى و تأييد شناسايي قارچ B. cinerea از محيط كشت اختصاصي Botrytis cinerea selective medium=BSM استفاده شد (Edwards and Seddon, 2001). مواد تشكيلدهنده اين محيط كشت شامل گلوكز، NaNO3، K2HPO2، 7H2O، MgSO4، KCl،pentachloronitrobenzene ،chloramphenicol ، سم مانب، رزبنگال، تانيك اسيد، آگار و مـاده سود ميباشد (Edwards and Seddon, 2001). كليد شناسايي قارچ بر اساس قارچهاى ناقص و با پيروى از منابع معتبر صورت گرفت (Chilvers and du Toit, 2006).
آزمون اثبات بيماريزايي
به منظور اثبات بيمارىزايي قارچ B. cinerea ابتدا جدايه خالصي از قارچ تهيه شد و از گياه لوبيا بهعنوان میزبان محك استفاده گردید. در اين آزمايش، ابتدا لوبياى حساس رقم پاك چند روز در آب خيسانده و در گلدان و در شرايط گلخانهاى كشت داده شد؛ بعد از 3-2 هفته، چند برگ از لوبيا انتخاب و در محـيط PDA در تشتكهاى پترى ٨ سانتيمترى حاوى كلرامفنيكل قرار داده شد و سپس سوسپانسيون خالص محيط حاوى (Dextros Broth Potato) PDB از قارچ به مقدار 106 اسپور تهيه گردید؛ از سوسپانسیون اسپور خالص قارچ به مقدار يك ميكروليتر بر روى هر برگ گياه لوبيا بهصورت قطرهاى ريخته و علايم در روزهاى سوم و پنجم و هفتم ثبت گرديد (2008 Korolev et al.,).
عمليات تهيه سوسپانسيون اسپور قارچ عامل بيمارى
ابتدا قارچ عامل بيمارى مربوط به هر ايزوله در چهار پترى حاوى محيط PDA كشت داده شد. پس از مشاهده اسپورها بر روى محيط كشت و رشد كامل قارچ در پترىها، ٢ سيسي از آب مقطر استريل به محيط كشت اضافه شد و سپس با اسكالپل استريل بر روى محيط كشت حاوی عامل بيمارى تراشيده شد و به کمک تنظيف استريل، اسپورهاى خالص جداسازی شد. سپس اسپورها بر روى لام هموسيتومترى در سه تكرار شمارش شد تا غلظت اسپور به ميزان 106 برسد و پس از آن با سمپلر بهصورت يك قطره به برگ گياهان انتقال داده شد (شکل 1) (2008 Korolev et al.,). تجزيه و تحليل آمارى داده‌هاى مربوط به هر جدايه و مقايسه ميانگينها با استفاده از نرمافزار SPSS انجام شد.
شكل ١- تهيه سوسپانسيون اسپور قارچ Botrytis cinerea
Fig. 1. Preparation of Botrytis cinerea fungus spore suspension
ارزيابي خصوصيات مرفولوژيكي قارچ B.cinerea
در اين آزمون خصوصيات كلني و اسپور اسكلروت بهصورت كشت چند روز ايزولههاى قارچي بررسی شد. پس از گذشت چهار روز از رشد كلني ها، اندازهگيرى كلني و اسپورها و توليد اسكلروت طی بازه ٥ روز، ١٢روز، ٢٠روز و ٢٨ روز با توجه به مقياس هاى مورد نظر اندازه گيرى شد و در اعداد صفر (بدون كلني) تا ٤ نمره داده شدند؛ بهطور مثال، ١ = >٢٥% از مساحت كلني در نظر گرفته شد (.(Korolev et al., 2008
ارزيابي مقاومت به قارچكش ها
در ارزيابي مقاومت قارچ B. cinerea به قارچكشها، سموم در غلظت معين به محيط كشت غذايي اضافه شده و سپس قارچ B. cinerea در ظروف پترى كشت شد. قارچكشهاي مورد استفاده عبارت بودند از كاربندازيم، بنوميل و فنهگزاميد در غلظت ١ ميكروگرم در ميليليتر ماده فعال. به منظور انجام اين آزمايش يك قرص ٥ ميليمتری از حاشيه كلني قارچ B. cinerea برداشته و در مركز يك تشتك پترى ٩ سانتيمترى حاوى محيط كشت PDA به همراه هر يك از قارچكشهاى نامبرده در غلظتهاى مشخص كشت داده شد و سپس در دماى 22-٢٠ درجه سلسیوس در تاريكي نگهدارى شدند. سپس قطر هر كلني قارچي پس از ٤ روز اندازهگيرى شد (2008 ,.Korolev et al). در اين آزمايش نزديك به ٥٠ جدايه قارچ خالص شده از Botrytis cinerea از ميزبانهاى مختلف شامل فلفل دلمهای، گوجهفرنگي، خيار و بادمجان جداسازی شد. اين آزمايش در قالب طرح كاملاً تصادفي و به ازاى هر تيمار سه تكرار و هر تكرار شامل شاهد و سه ظرف پترى بود (2008 ,.Korolev et al).
نتایج
نتايج بر روى محيط كشت اختصاصي BSM همراه با نمونه شاهد از قارچ Alternaria spp. نشان داد كه تنها قارچ Botrytis cinerea در اين محيط رشد کرد و رنگ كلني آن به نارنجي و قهوه اى تغيير یافت و رنگ کلنی در گونه های ديگر بر روی اين محيط كشت متفاوت بود. احتمالاً سایر گونه های Botrytis بهعلت وجود مواد ساختارى محيط كشت، رشد خيلي كمي دارند (شکل 2). همانطور که در شکل 2 مشاهده مي شود، تنها قارچ Botrytis cinerea رشد کرده و این مشاهدات بر اختصاصي بودن اين محيط كشت دلالت دارد.
شکل 2- رشد قارچ Botrytis cinerea در مقابل قارچ Alternaria در محیط کشت اختصاصی BSM
Fig. 2. Growth of Botrytis cinerea versus Alternaria in BSM specific medium
مطالعه بيماريزايي
در تمام آزمایشات مربوط به بيماريزايي از گیاه لوبيا رقم پاك و از روش مايهزني (De tach) براى تمامي جدايه‌ها استفاده گردید. علايم ايجاد شده روى رقم مذكور تا حدى با سایر گیاهان میزبان متفاوت بود. اولين علايم طی 5-3 روز پس از مايهزني آشكار شدند. ارزيابي كلي در مورد قارچ بیمارگر 8-7 روز پس از اسپورپاشي انجام گرفت. علايم بهصورت نقاط ریز سرسنجاقي آشكار شد. در روزهاى بعد، اين نقاط به تدريج توسعه يافته و به رنگ قهوهاى تغییر رنگ داد و در برخي موارد سبب از بين رفتن و سوختگي يك برگ شد (شکل 3). در تمام آزمايشهاى فوق، قارچهاى تلقيح شده شناسايي شدند.
شکل 3- علائم حاصل از B. cinerea بر روی برگ سالم حاوی سوسپانسیون اسپور (A) و برگ آلوده شده (B)
Fig. 3. Symptoms of B. cinerea on a healthy leaf containing a spore suspension (A) and an infected leaf (B)
در این مطالعه 50 جدایه از میزبانهای آلوده به B. cinerea جمعآوری گردید. نتایج حاصل از آزمون آنالیز واریانس دادههای حاصل از بیماریزایی جدایهها نشاندهنده وجود اختلاف معنیدار بین جدایههای مورد بررسی از نظر شدت بیماریزایی بود (جدول 1). همچنین نتایج نشان داد که زمان بــر میـزان بـیمـاریزایی سویههای B. cinerea اثر معنیدار داشت؛ ولی اثر متقابل زمان و سویه در سـطح احتمال 5 درصـد معنیدار نبـود (احتمال= 738/0، سطح معنیداری= 884/0) (جدول 1).
جدول 1- تجزیه واریانس توان بیماریزایی جدایه های B. cinerea طی زمان با استفاده از روش ANOVA
Table 1. Variance analysis of pathogenicity of B. cinerea isolates over time using ANOVA method
S.O.V. منابع تغييرات | درجه آزادي Degree of Freedom | مجموع مربعات Sum of Squares | مربعات ميانگين Mean of Squares | F | سطح معناداري Significance | |
Isolate | جدایه | 25 | 282.026 | 11.281 | 7.832 | 0.00 |
Time | زمان | 3 | 471.80 | 157.060 | 109.042 | 0.00 |
Time×isolate | زمان × جدايه | 75 | 85.074 | 1.134 | 0.738 | 0.884 |
Error | خطا | 208 | 299.596 | 1.440 |
|
|
نتایج حاصل از آزمون دندوگرام نشان داد که جدایه BC-19 با اختلاف معنیدار نسبت به سایر سویهها بیشترین سطح بیماریزایی را از خود نشان داد (شکل 4).
شکل 4- دندروگرام حاصل شدت بيمارىزايي B. cinerea بر روى گیاه لوبيا رقم پاك. بيشترين شدت بيمارىزايي در جدايه ١٩BC- از شهرستان پیشوا با اختلاف معنیدار نسبت به سایر جدایهها مشاهده شد.
Fig. 4. Dendrogram of pathogenic intensity of B. cinerea on bean plant of Pak variety. The highest pathogenic intensity was observed in 19BC isolate from Pishva city with a significant difference compared to other isolates.
ارزيابي خصوصيات اسكلروتهاى قارچ Botrytis cinerea
بررسی میانگین تعداد اسکلروتها نشان داد که جدایههای مورد بررسی B. cinerea علیرغم شرايط يكسان رشدی از نظر تعداد اسكلروت برابر نبودند. بيشترين تعداد اسكلروت مربوط به جدايههای شماره 14، 15 و 45 و كمترين آن مربوط به جدايههاى ٣٨-٤٥-٣٧-٤٨-٢٨-٣٥-٢٠-٣٤-39 و 50 بود (شکل 5).
ارزیابی مقاومت به قارچکشها
بر اساس یافتههای حاصل از این تحقیق قارچكش فنهگزاميد در گونه B. cinerea از نظر مورفولوژيكي متمايز بود. جدایههای گونه B. cinerea نسبت به اين قارچكش از خود حالت حساس و نيمهحساس نشان دادند. در ارزيابي مقاومت قارچ B. cinerea به قارچكش فنهگزامید، در مقدارهاى معين در محيط كشت مشخص شد که جدایههای قارچ مورد بررسی نسبت به قارچکش فنهگزامید سطح متنوعی از مقاومت را با اختلاف معنیدار داشتند؛ همچنین نتایج نشان داد که قطر کلنی در سویه 37 تحت تأثیر این قارچکش با اختلاف معنیداری با سایر جدایهها کمترین میزان رشد و در جدایه شماره 7 بیشترین میزان رشد را داشت (شکل 6).
شکل 5- ميانگين تعداد اسكلروتهای حاصل از جدایه های B. cinerea
Fig. 5. The average number of sclerotia obtained from B. cinerea isolates
شکل 6- میانگین رشد قطر کلنی جدایهها تحت تأثیر فنهگزامید
Fig. 6. Average colony diameter growth of isolates under the influence of phenhexamide
بررسی میزان حساسیت جدایههای جمعآوری شده از منطقه ورامین به قارچکش بنومیل نشان داد که در جدایههای 37 و 42 کمترین میانگین قطر کلنی قارچ در محیط کشت ثبت گردید؛ سایر جدایهها با اختلاف معنیدار، قطر کلنی بیشتری داشتند؛ در تیمار با بنومیل، جدایه 7 بیشترین قطر کلنی را داشت. همچنین بررسی میزان حساسیت جدایهها نسبت به قارچکش کاربندازیم نشان داد که کمترین میانگین قطر کلنی در جدایه 37 و 42 بدون اختلاف معنیدار مشاهده شد. در مقابل بیشترین قطر کلنی قارچ در جدایه 7 ثبت گردید (شکل 7).
بحث
با توجه به اهميت موضوع، مطالعه طبقهبندى، زيست بومشناسي، زيستشناسي مولكولي و همچنين مطالعه در مورد روشهای پيشگيرى و كنترل بيمارىهاى ناشي از گونههای جنس Botrytis بر روى گياهان ميزبان مدنظر بسیاری از محققین قرار دارد. قارچ Botrytis cinerea ميتواند يك مشكل جـدى در مـحصـولات سـبـزى و صيفي گلخانهای مانند گوجهفرنـگي، فـلـفل، خـيـار و بـادمـجان تـحـت شـرايـط هـواى سـرد و خـنـك و مـرطـوب بيـمارى ايجـاد كند (1997 ,.B. cinerea .(O'Neill et al عامل كپك خاكسترى، يك قارچ نكروتروف و گونهاى مركب است كه باعث بوجود آمدن بيمارى قبل و بعد از برداشت در حداقل ٢٣٥ گونـه گـيـاهي مي شـود. ايـن قـارچ تـنـوع ژنوتيپي و فنوتيپي غيرمـعـمـولي را نـشـان مـي دهـد كـه بـاعـث سـازگـارى سـريـع آن بـه شـرايـط مـحيـطي و سموم شده است (1997 ,.Giraud et al).
شکل 7- میانگین رشد قطر کلنی جدایهها تحت تیمار با سم بنومیل (راست) و سم کاربنداریم (چپ)
Fig. 7. Average colony diameter growth of isolates treated with benomyl (right) and carbendazim (left)
از مهمترين دلايل تنــوع در جمـعيـتهـاى قـارچي مـيتـوان به فـراينـدهايـي هـمـچـون هـتروكاريوزيس، آنـيـوپلـوئـيـدى، تـرانـسـپـوزونها، جـهـشهـاى خـودبـهخـودى، توليدمثل جنسي و غيرجنسي اشاره نمود (Naranjo-Ortiz and Gabaldon, 2020؛ Wessels, 2012). مطالعه روى ميزان تنوع جمعيت در يك جامعه قارچي نقش مهمي در توسعه استراتژیهاى لازم براى توليد يك رقم با مقاومت پايدار خواهد داشت (2024 Hyde et al.,). در این تحقیق، بين توان بيمارىزايي جدايه‌ها و گروه‌هاى سازگاری رويشي رابطه معنيدار (در سطح احتمال ٥ درصد) و معكوس مشاهده شد، به اين معني كه جدايه‌هايي با قدرت بيمارىزايي بالاتر در گروه‌هاى سازگارى رويشي با فراواني كمتر حضور داشتند.
با توجه به اهميت بیماری کپک خاکستری و گسترش سريع B. cinerea در دماهاى معمولي سردخانهها و به دليل انتشار از ميوهها و ساير محصولات آلوده به محصولات سالم مجاور آنها در سردخانه، ميتواند موجب خسارت هنگفت شود. در سالهاى اخير ميزان فـروش مـحصـولات قارچكش بر عليه Botrytis spp.، ١٢-٢٥ ميليون دلار آمريكا بوده است (2007 ,.Elad et al). با توجه به خسارتي كه اين قارچ بر روى محصولات كشاورزى وارد ميكند، مديريت آن از اهميت ويژهای برخوردار است. در اين راستا شناخت قارچ كمك شاياني به اتخاذ روشهاى مديريتي مينمايد. تا كنون روشهاى مختلفي در تاكسونومي گونههاى اين جنس بهكار رفته است، اين روشها اغلب شامل روشهاى مورفولوژيكي، بيوشيميايي، سرولوژيكی، مولكولي و ارتباط ميزباني ميباشد (Cheung et al., 2020). اگرچه مطالعات بيوشيميايي فراواني روى جنس Botrytis صـورت پذيرفته است، اما تعداد كمي در تاكسونومي بهكار برده شدهاند. موفقيت روشهاى سرولوژيك نيز بيشتر در تشخيص و بـه مـيـزان كـمـترى در تعييـن سـطـح آلـودگي نـاشي از Botrytis بهكار رفته است (Dewey and Yohalem, 2004). بهطور كلي توصيف گونههاى قارچ Botrytis بيشتر براساس خصوصيات مورفولوژيك و محيطي صورت پذيرفته و گونهها براساس ارتباط ميزباني نامگذارى شدهاند. خصوصيات مورفولوژيك تحت شرايط محيطي قرار ميگيرند و بنابراين در مفيد بودن آنها ترديد وجود دارد. در شناسايي مبتني بر مورفولوژى نياز به كشت عامل بيمارى روى محيط آگار اين امر علاوه بر زمانبر بودن آن، معمولاً بعد از ظهور علائم صورت گرفته و قادر به تشخيص آلودگيهاى پنهان نيست. علاوه بر اين، خصوصيات مورفولوژيك هنوز هم كاربرد فراواني در تشخيص گونههاى جنس Botrytis داشته و تنها در سالهاى اخير تمايل به استفاده از روشهاى مولكولي در اين زمينه افزايش يافته است. در اين تحقيق نيز از روشهاى مورفولوژيك جهت شناسايي گونه در ٥٠ جدايه مختلف Botrytis كه از ميزبانهاى مختلف جداسازى شده بودند، استفاده شد.
بهطور كلي بهدليل طبيعت چند هستهاى كنيدى و سلولهاى هيف، جدايههاى Botrytis تمايل به تغيـير دائـمي در نسلهاى متوالي (در آزمـايـشـگاه و مـزرعه) داشـتـه و تغيـيرات ژنـوتيـپي و فـنوتيـپـي در B. cinerea معمول است (2007 ,.Elad et al). اين قارچ تنوع ژنوتيپي و فنوتيپي غيرمعمولي را نشان ميدهد كه باعث سازگارى سريع آن به شرايط محيطي و سموم شده است (Giraud et al., 1997). علت اصلي شهرت B. cinerea بهعنوان يك قارچ متنوع غيرمعمول، وجود تيپهاى رشدى مشخص از لحاظ موفولوژيك است. سه تيپ عمومي در اين قارچ عبارتند از: مسيليومي، اسپورزا و اسكلروتي (Steentjes et al., 2021). اين مورفوتيپها تا زماني كه تجديد كشت با استفاده از ريسه صورت بگيرد، پايدارند؛ اما تجديد كشت بهوسيله تك اسپور منجر به ايجاد كلونيهايي ميشود كه از والدين و ساير تك كلونها متمايزند (Beever and Weeds, 2004). برخي از دانشمندان دو تيپ اصلي ميسليومي و اسكلروتي را براى اين قارچ در نظر گرفته و تيپ اسپورزا زير مجموعه اين دو گروه تلقي ميشود (Meng et al., 2020).
يكي از عوامل ديگرى كه باعث ايجاد تغييرات ژنتيكي و فتوتيپي در قارچ B.cinerea ميگردد، وجود عناصر ترانسپوزوني (Transposable elements) در برخي از استرينهاى اين قارچ است. عنـاصـر ترانسپوزوني، در حقيقت تواليهايي كوتاه از بازهاى DNA هستند که پس از ورود به ساختـار ژن، ساختمان آن را بههم ميزنـند و مـوجـب جهـش ميشـوند. ترانـسپـوزنهاى قارچي ميتوانند برای گونههای فـاقد فرم جنسی، تنوع ژنتيكي گستردهای ایجاد كنند (Porquier et al., 2021؛ Martinez et al., 2005).
در این مطالعه طی بررسي بر روى رشد 50 جدایه از قارچ B. cinerea، مشاهده گردید که رشد کلنی از روز دوم بعد از کشت آغاز شده و طی 6-4 روز تا قطر 2-1 سانتیمتر در تمامی جدایهها رسید. بعد از روز ششم ضخامت قارچ بيشتر شده و همچنين در برخي از جدايه‌ها از روز چهارم اسپورزايي نيز انجام گرفت؛ از روز هفتم به بعد اسكلروتها شروع به رشد نمودند. ميرزايي و همكاران ٣٦٣ جدايه از جنس Botrytis را از سراسر ايران از روى گياهان مختلف جمعآورى نمودند (Mirzaei et al., 2009). به منظور شناسايي گونههاى اين جنس در درجه اول از خصوصيات مورفولوژيك، نظير طـول كنـيديـوفـور، انـدازه كنيدى و اسـكـلروت و در درجه بـعدى از ارتـباط مـيـزبـاني اسـتـفاده شـد و هـشـت گـونــه از قـــارچ Botrytis شـنـــاســايـي گـرديـد، کـه عـــبـارتــنـد از:B. porri ،B. pelargonii ،B. paeoniae B. gladiolorum،B. convoluta ،B. faba ،B. cinerea و B. aclada. بهعلاوه بررسي ساختار جمعيت قارچ B. cinerea در ايران در طي دوره‌هاى متناوب به منظور تعیین درصد پویایی جمعيت و ارزيابي امكان ظهور نژادهاى جديد بيمارىزا به منظور كاهش اثرات ناشي از بيمارى كپك پوسيدگي خاكسترى پيشنهاد ميگردد (Mirzaei et al., 2009). به جهت تنوع قابل ملاحظه در میزان رشد جدایهها و همچنین شدت بیماریزایی، دادههای این تحقیق با نتایج میرزایی و همکاران مطابقت دارد. در نتایج این تحقیق نیز اختلاف معنیدار از نظر شدت بیماریزایی بین جدایههای جمعآوری شده از شهرستان ورامین مشاهده گردید. یافتههای محققین نشاندهنده وجود تنوع قابل ملاحظه در فراوانی و ریختشناسی اسکلروت و میسلیومهای حاصل از جدایههای B. cinerea در سراسر دنیا است؛ در مطالعهای بر روی جدایههای این قارچ در صربستان، چهار تیپ میسلیوم و چهار تیپ اسکلروت در بین 130 جدایه B. cinerea مشاهده گردید؛ علاوه بر این درصد فراوانی تولید اسکلروت در جدایههای مختلف با یکدیگر اختلاف معنیدار نشان داد (Pesic et al., 2014). نتایج این تحقیق با یافتههای مطالعه از نظر تنوع در فراوانی تولید اسکلروت مطابقت دارد. در تحقیق حاضر جدایههای 14، 15 و 45 بیشترین درصد فراوانی تولید اسکلروت را به خود اختصاص دادند. نتایج مشابهی از 50 جدایه حاصل از باغات تمشک سیاه در کلمبیا بهدست آمد که با یافتههای تحقیق حاضر همراستاست (Isaza et al., 2019).
با توجه به اينكه ظهور هر نژاد جديد در طي فرايند گونهزايي بیمارگر صرف نظر از گرايش اين گونهزايي به سمت افزايش يا كاهش قدرت بيماريزايي در تعامل با تنوع ژنتيكي گياه ميزبان و همچنين اثرات غيرمستقيم بر ساير اكوسيستم مرتبط با ميزبان گياهي ذكر شده است.
از نظر میزان حساسیت نسبت به قارچکشهای متداول، تحقیقات متعددی در این زمینه بر روی قارچ B. cinerea انجام گرفته است و در اغلب موارد مقاومت چندگانه جدایههای مختلف این بیمارگر نسبت به قارچکشها گزارش شده است (Rupp et al., 2017). اولین گزارش از مقاومت جدایهای B. cinerea نسبت به قارچکش بنومیل از تمشکهای آلوده در صربستان اعلام گردید (Tanovic and Ivanovic, 2010)؛ در این تحقیق 130 جدایه از قارچ B. cinerea تحت تیمار با غلظت 1 و 10 میلیگرم در لیتر از بنومیل قرار گرفته و نه جدایه کاملاً مقاوم معرفی شدند؛ جدایههای مقاوم به بنومیل نسبت به تیوفانات متیل نیز مقاوم بودند؛ نتایج این تحقیق با یافتههای مطالعه حاضر به لحاظ وجود سطوحی از مقاومت در بین جدایههای B. cinerea مطابقت دارد. در مطالعه مشابهی در ایران، سطوح مختلفی از مقاومت جدایههای B. cinerea نسبت به قارچکش بنومیل در 103 جدایه جمعآوری شده از استان آذربایجان غربی مشاهده شد (امینی و ابرینبنا، 1395)؛ که با یافته های حاصل از تحقیق حاضر مطابقت دارد.
در مطالعات دیگری میزان حساسیت جدایههای مختلف B. cinerea نسبت به قارچکش کاربندازیم مورد بررسی قرار گرفت. نتایج در یکی از تحقیقات انجام شده نشان داد که بیش از 95 درصد جدایههای B cinerea نسبت به قارچکش کاربندازیم مقاوم هستند و بروز سه جدایه مختلف در سه جایگاه ژنی متفاوت مسئول ایجاد چنین مقاومتی شناخته شد (He et al., 2020). در مطالعه مشابه دیگری، استفاده از کاربندازیم برعلیه کپک خاکستری به دلیل مقاومت جدایههای قارچ بیمارگر بیاثر شناخته شد (Sautua et al., 2019). در ایران نیز مقاومت این قارچ نسبت به کاربندازیم مورد تأیید قرار گرفته است (Amini et al., 2023)؛ این محققین نشان دادند بهعلت مقاومت B. cinerea نسبت به تمام قارچکشهای گروه بنزیمیدازول، استفاده از قارچکشهای این گروه مانند بنزیمیدازول می بایست با احتیاط بسیار زیاد در برنامه های مدیریت تلفیقی آفت انجام گیرد. نتایج حاصل از تحقیق حاضر از نظر مقاومت جدایههای جمعآوری شده از منطقه ورامین نسبت به کاربندازیم با تحقیقات پیش از آن مطابقت دارد.
بهطور مشابه در تحقیقات بسیاری به مطالعه میزان مقاومت جدایههای B cinerea نسبت به قارچکش فنهگزامید پرداخته شده است. امینی و ابرینبنا (1395) میزان مقاومت جدایههای B. cinerea در آذربایجان غربی را نسبت به فنهگزامید بررسی و این قارچکش را برعلیه جدایههای موجود در استان اثربخش معرفی نمودند. در مطالعه مشابه دیگری نیز 89 درصد از جدایههای جمعآوری شده B. cinerea از باغات بلوبری در ایالت میشیگان، ایالات متحده آمریکا، نسبت بـه فنهـگزامـید حـسـاس تشخیص داده شدند (Abbey et al., 2024). در مـطالـعه دیـگری تنـها 22 درصـد از جـدایههای B. cinerea نسبت به فنهگزامید حساس معرفی شدند (Notte et al., 2021). در تحقیق حاضر سطوح متفاوتی از حساسیت نسبت به فنهگزامید در B. cinerea مشاهده گردید که از اینرو با نتایج تحقیقات مشابه مطابقت دارد. با توجه به مقاومت نسبی جدایههای مختلف B. cinerea نسبت به قارچکشهای متداول، بهتر آن است که از ترکیب یا تلفیق قارچکشها متعلق به گروههای شیمیایی مختلف برای مدیریت این بیمارگر استفاده گردد. نتایج حاصل از مطالعات مشابه نیز از کاربرد تلفیقی قارچکشها حمایت میکنند (Ebrahimzadeh and Abrinbana, 2019). در تحقیق مشابه دیگری نیز به دلیل شیوع مقاومت چندگانه جدایههای B. cinerea نسبت به قارچکشهای مختلف، کاربرد مخلوطی از قارچکشها برعلیه این بیمارگر توصیه گردید (Rupp et al., 2017) که از این نظر با نتایج حاصل از این تحقیق همراستاست.
منابع References
امینی، ر. و ابرینبنا، م. 1395. مقاومت برخی جدایههای Botrytis cinerea نسبت به قارچکشهای بنومیل، ایپرودیون و فنهگزامید در استان آذربایجان غربی. پژوهشهای کاربردی در گیاهپزشکی 5(1): 195-207.
الهي نيا، ع. ١٣٨٤. بيماريهاى سبزى و صيفي و روشهاى مبارزه با آنها. چاپ اول، انتشارات دانشگاه گيلان، رشت.
Abbey, J.A., Alzohairy, S.A., Neugenauer, K.A., Hatlen, R.J. and Miles, T.D. 2024. Fungicide resistance in Botrytis cinerea and identification of Botrytis species associated with blueberry in Michigan. Frontiers in Microbiology 15: 1425392. https://doi.org/10.3389/fmicb.2024.1425392.
Amini, M.M., Mirzaei, S. and Heidari, A. 2023. A growing threats threat: investigating the high incidence of benzimidazole fungicides resistance in Iranian Botrytis cinerea isolates. PLos One 18(11): e0294530.
Beever, R.E. and Weeds, P.L. 2004 Taxonomy and Genetic Variation of Botrytis and Botryotinia. Pp: 29-52. In: Elad, Y., Williamson, B., Tudzynski, P. and Delan, N. (Eds.). Botrytis: Biology, Pathology and Control, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht,
Cheung, N., Tian, L., Liu, X. and Li, X. 2020. The destructive fungal pathogen Botrytis cinerera-insights from genes studied with mutant analysis. Pathogens 9(11): 923.
Chilvers, M.I. and du Toit, L.J. 2006. Detection and identification of Botrytis species associated with neck rot, scape blight, and umbel blight of onion. Online. Plant Health Progress; https://doi.org/10.1094/PHP-2006-1127-01-DG .
Delc´an, J. and Melgarejo, P. 2002. Mating behaviour and vegetative compatibility in Spanish populations of Botrytotinia fuckeliana. European Journal of Plant Pathology 108: 391-400.
Ebrahimzadeh, F. and Abrinbana, M. 2019. Activity of fungicide mixtures against Botrytis cinerea isolates resistant to benzimidazoles, strobilurins and dicarboximides. Annals of Applied Biology 174(3): 301-312.
Edwards, S.G. and Seddon, B. 2001.Selective media for the specific isolation of Botrytis cinerea. Letters in Applied Microbiology 32: 63-66.
Elad, Y. Williamson, B. Tudzynski, P. and Delen, N. 2007. Botrytis spp. and diseases they cause in agricultural systems: an introduction. In: Elade, Y., Williamson, P., Tudzinski, P. and Delen. N. Botrytis: Biology, Pathology and control. Springer Publishers. http://dx.doi.org/10.1007/978-1-4020-2626-3_1.
Fournier, E., Giraud, T., Loiseau, A., Vautrin, D., Estoup, A., Solignac, M., Cornuet, J.M. and Brygoo, Y. 2002. Characterization of nine polymorphic microsatellite loci in the fungus Botrytis cinerea (Ascomycota). Molecular Ecology Notes 2(3): 253-255.
Giraud, T., Fortini, D., Levis, C., Leroux, P. and Brygoo, Y. 1997. RFLP markers show genetic recombination in Botryotinia fuckeliana (Botrytis cinerea) and transposable elements reveal two sympatric species. Molecular Biology Evolution 14:1177-1185.
He, L., Cui, K., Li, T., Song, Y., Liu, N., Mu, W. and Liu, F. 2020. Evolution of the resistance of Botrytis cinerea to carbendazim and the current efficacy of carbendazim against gray mold after long-term discontinuation. Plant Disease 104(6): 1647-1653.
Hyde, K.D., Balrdin, P., Chen, Y., Thilini Chethana, K.W., De Hoog, S., Doilom, M., de Farias, A.R.G., Gonçalves, M.F., Gonkhom, D., Gui, H. and Hilário, S. 2024. Current trends, limitations and future research in the fungi? Fungal Diversity 125: 1-71.
Isaza, L., Zuluaga, Y.P. and Marulanda, M.L. 2019. Morphological, pathogenic and genetic diversity of Botrytis cinerea Pers. In blackberry cultivations in Colombia. Revista Brasileira de Fruticultura 41(6). https://doi.org/10.1590/0100-29452019490.
Korolev, N., Elad, Y. and Katan, T. 2008. Vegetative compatibility grouping in Botrytis cinerea using sulphate non- utilizing mutant. European Journal of Plant Pathology 122: 369-383.
Martinez, F., Dubos, B. and Fermaud, M. 2005. The role of saprotrophy and virulence in the population dynamics of Botrytis cinerea in vineyards. Phytopathology 95: 692-700.
Meng, L., Mestdagh, H., Ameye, M., Audenaert, K., Hofte, M. and van Labeke, M.C. 2020. Phenotypic variation of Botrytis cinerea isolates is influenced by spectral light quality. Frontiers in Plant Science 11: 1233.
Mirzaei, S., Mohammadi Goltapeh, E., Shams-Bakhsh, M., Safaie, N. and Chaichi, M. 2009. Genetic and phenotypic diversity among Botrytis cinerea isolates in Iran. Journal of Phytopathology 157(7-8): 474-482.
Naranjo-Ortiz, M.A. and Gabaldon, T. 2020. Fungal evolution: cellular, genomic and metabolic complexity. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society 95(5): 1198-1232.
Notte, A.M., Plaza, V., Marambio-Alvarado, B., Olivares-Urbina, L., Poblete-Morales, M., Silva-Moreno, E. and Castillo, L. 2021. Molecular identification and characterization of Botrytis cinerea associated to the endemic flora and semi-desert climate in Chile. Current Research in Microbial Sciences 2: 100049
O'Neill, T.M., Shtienberg, D. and Elad, Y. 1997. Effect of some host and microclimate factors on infection of tomato stems by Botrytis cinerea. Plant Disease 81(1): 36-40.
Pesic, B., Hrustic, J., Mihajlovic, M., Grahovac, M. and Delibasic, G. 2014. Botrytis cinerea in raspberry in Serbia: morphological and molecular characterization. Pesticidi I Fitomedicina 29: 237-247.
Porquier, A., Tisserant, C., Salinas, F., Glassi, C., Wange, L., Enard, W., Hauser, A., Hahn, M. and Weiberg, A. 2021. Retrotransposons as pathogenicity factors of the plant pathogenic fungus Botrytis cinerea, Genome Biology 22: 225. https://doi.org/10.1186/s13059-021-02446-4.
Rupp, S., Weber, R.W.S., Rieger, D., Detzel, P. and Hahn, M. 2017. Spread of Botrytis cinerea strains with multiple fungicide resistance in German horticulture. Frontiers in Microbiology 7: 2075. http://dx.doi.org/10.3389/fmicb.2016.02075.
Sautua, F.J., Baron, C., Perez-Hernandez, O.P. and Carmona, M.A. 2019. First report of resistance to carbendazim and procymidone in Botrytis cinerea from strawberry, blueberry and tomato in Argentina. Crop Protection 125. https://doi.org/10.1016/j.cropro.2019.104879.
Staats, M., van Baarlen, P. and van Kan, J.A.L. 2005. Molecular phylogeny of the plant pathogenic genus Botrytis and the evolution of host specificity. Molecular Biology and Evolution 22(2): 333-346.
Stall, R.E. 1991. Gray Mold. Pp. 16-17. In: Jones, J.B., Jones, J.P., Stall, R.E. and Zitter, T.A. (eds.). Compendium of Tomato Diseases. American Phytopathological Society Press, st. Paul, M.N.
Steentjes, M.B.F., Scholten, O.E. and van Kan, J.A.L. 2021. Peeling the onion: towards a better understanding of Botrytis disease of onion. Phytopathology 111(3): 464-473.
Tanovic, B. and Ivanovic, M. 2010. First report of occurrence of benomyl resistance in Botrytis cinerea isolates on raspberry in Serbia. 94(4): 486. https://doi.org/10.1094/pdis-94-4-0486c.
Wessels, B.A. 2012. Genetic characterization and fungicide resistance profiles of Botrytis cinerea in rooibos nurseries and pear orchards in the Western Cape of South Africa. Master’s thesis, Stellenbosch University, South Africa.
Williamson, B. Tudzynski, B. Tudzynski, P. and Van Kan, J.A.L. 2007. Botrytis cinerea: the cause of grey mould disease. Molecular Plant Pathology 8: 561-580.