ارزیابی تأثیر شرایط استخراج و نگهداری بر خواص آنتی میکروبی و میزان مهارکنندگی آنزیم‌های آلفا آمیلاز و آلفاگلوکوزیداز توسط عصاره آبی ترشک شبدری

الموضوعات :

مونا شریفی سلطانی ¹ , حسین میرسعیدقاضی ² , مصطفی سلطانی ³ , گیتی کریم ⁴

1 - دانشجو دکتری تخصصی، گروه علوم و مهندسی صنایع غذایی، دانشکده داروسازی، علوم پزشکی تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
2 - دانشیار، گروه فناوری صنایع غذایی، دانشکده فناوری کشاورزی، دانشکدگان کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران، پاکدشت، ایران
3 - استادیار، گروه علوم و مهندسی صنایع غذایی، دانشکده داروسازی، علوم پزشکی تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
4 - استاد، گروه بهداشت مواد غذایی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران

تاريخ الإرسال : 20 الأربعاء , ذو الحجة, 1445 تاريخ التأكيد : 26 الثلاثاء , ربيع الثاني, 1446 تاريخ الإصدار : 16 الثلاثاء , صفر, 1446

الکلمات المفتاحية: آلفاآمیلاز, آلفاگلوکوزیداز, حداقل غلظت مهارکنندگی, حداقل غلظت باکتری‌کشی, ترشک شبدری,

ملخص المقالة :

افزایش روزافزون بیماری‌های مزمن ازجمله دیابت و همچنین افزایش مقاومت باکتری‌ها به آنتی‌بیوتیک‌ها، الزام بررسی و یافتن منابع جدید حاوی ترکیبات ضدمیکروبی و ضددیابتی را ایجاب می‌کند. در این مطالعه، عصاره‌ی آبی گیاه ترشک شبدری به دو روش اولتراسوند و ماسراسیون تهیه گردید و تحت شرایط یخچالی و انجمادی، به دو شکل پوره و عصاره نگهداری شد. بررسی خواص مهارکنندگی از فعالیت آنزیم‌های آلفاآمیلاز و آلفاگلوکوزیداز نمونه‌های مختلف، و همچنین اثرات ضدمیکروبی عصاره‌ی آبی با دو روش میکرودایلوشن براث و انتشار در چاهک بر روی استافیلوکوکوس‌اورئوس و اشریشیاکلی، انجام گرفت. بیشترین خاصیت ممانعت کنندگی عصاره‌ی آبی ترشک شبدری در عصاره‌ی به‌دست‌آمده به روش اولتراسوند در روز صفر مشاهده گردید. تأثیر زمان نگهداری بر روی half-maximal inhibitory concentration (IC50) نمونه‌ها معنی‌دار شد و رابطه معکوس بین زمان نگهداری و مهارکنندگی آنزیم مشاهده گردید. نتایج این مطالعه نشان داد که قدرت مهارکنندگی از فعالیت آنزیم توسط عصاره ترشک شبدری رابطه مستقیم با حضور ترکیبات آنتی‌اکسیدانی در این گیاه دارد. همچنین عصاره‌ی آبی گیاه ترشک شبدری بر روی مهار رشد باکتری‌های گرم مثبت و منفی مورداستفاده در این مطالعه تأثیر مثبت داشت. بیشترین قطر هاله عدم رشد در استافیلوکوکوس‌اورئوس (20 میلی‌متر) مشاهده گردید. نتایج این مطالعه پتانسیل عصاره تازه استخراج شده‌ی گیاه ترشک شبدری به روش اولتراسوند را در ممانعت از رشد باکتری و مهار فعالیت آنزیم‌های آلفاآمیلاز و آلفاگلوکوزیداز نشان داد.

نص كامل:



بهداشت مواد غذایی                                                                                                                            دوره 14، شماره 2، پیاپی 54، تابستان 1403، صفحات: 20-1

 

 

«مقاله پژوهشی»                                                                              DOI: 10.71876/jfh.2024.3101424

 

ارزیابی تأثیر شرایط استخراج و نگهداری بر خواص آنتی میکروبی و میزان مهارکنندگی آنزیم‌های آلفا آمیلاز و آلفاگلوکوزیداز توسط عصاره آبی ترشک شبدری

 

فعالیت ضدمیکروبی و مهار فعالیت آنزیم ترشک شبدری

 

مونا شریفی‌سلطانی1و 2، حسین میرسعیدقاضی3*، مصطفی سلطانی4و2، گیتی کریم5

 

1- دانشجو دکتری تخصصی، گروه علوم و مهندسی صنایع غذایی، دانشکده داروسازی، علوم پزشکی تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

2- مرکز تحقیقات علوم تغذیه و صنایع غذایی، علوم پزشکی تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

3- دانشیار، گروه فناوری صنایع غذایی، دانشکده فناوری کشاورزی، دانشکدگان کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران، پاکدشت، ایران

4- استادیار، گروه علوم و مهندسی صنایع غذایی، دانشکده داروسازی، علوم پزشکی تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

5- استاد، گروه بهداشت مواد غذایی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران

*نویسنده مسئول مکاتبات: [e-mail]

(دریافت مقاله: 6/4/1403 پذیرش نهایی: 8/8/1403)

 

چکیده

افزایش روزافزون بیماری‌های مزمن ازجمله دیابت و همچنین افزایش مقاومت باکتری‌ها به آنتی‌بیوتیک‌ها، الزام بررسی و یافتن منابع جدید حاوی ترکیبات ضدمیکروبی و ضددیابتی را ایجاب می‌کند. در این مطالعه، عصاره‌ی آبی گیاه ترشک شبدری به دو روش اولتراسوند و ماسراسیون تهیه گردید و تحت شرایط یخچالی و انجمادی، به دو شکل پوره و عصاره نگهداری شد. بررسی خواص مهارکنندگی از فعالیت آنزیم‌های آلفاآمیلاز و آلفاگلوکوزیداز نمونه‌های مختلف، و همچنین اثرات ضدمیکروبی عصاره‌ی آبی با دو روش میکرودایلوشن براث و انتشار در چاهک بر روی استافیلوکوکوس‌اورئوس و اشریشیاکلی، انجام گرفت. بیشترین خاصیت ممانعت کنندگی عصاره‌ی آبی ترشک شبدری در عصاره‌ی به‌دست‌آمده به روش اولتراسوند در روز صفر مشاهده گردید. تأثیر زمان نگهداری بر روی half-maximal inhibitory concentration (IC50) نمونه‌ها معنی‌دار شد و رابطه معکوس بین زمان نگهداری و مهارکنندگی آنزیم مشاهده گردید. نتایج این مطالعه نشان داد که قدرت مهارکنندگی از فعالیت آنزیم توسط عصاره ترشک شبدری رابطه مستقیم با حضور ترکیبات آنتی‌اکسیدانی در این گیاه دارد. همچنین عصاره‌ی آبی گیاه ترشک شبدری بر روی مهار رشد باکتری‌های گرم مثبت و منفی مورداستفاده در این مطالعه تأثیر مثبت داشت. بیشترین قطر هاله عدم رشد در استافیلوکوکوس‌اورئوس (20 میلی‌متر) مشاهده گردید. نتایج این مطالعه پتانسیل عصاره تازه استخراج شده‌ی گیاه ترشک شبدری به روش اولتراسوند را در ممانعت از رشد باکتری و مهار فعالیت آنزیم‌های آلفاآمیلاز و آلفاگلوکوزیداز نشان داد.

 

واژه‌های کلیدی: آلفاآمیلاز، آلفاگلوکوزیداز، حداقل غلظت مهارکنندگی، حداقل غلظت باکتری‌کشی، ترشک شبدری

 

مقدمه

دیابت یک اختلال مزمن در متابولیسم پروتئین‌ها، چربی‌ها و کربوهیدرات‌ها است که باعث بالا رفتن بیش‌ازحد سطح قند خون افراد می‌شود (Durazzo et al., 2021). در سال‌های اخیر، شیوع دیابت تقریباً در همه‌ی مناطق دنیا افزایش یافته‌است، به گونه‌ای که در حال حاضر در سراسر جهان میلیون‌ها نفر با دیابت زندگی می‌کنند. روز‌به‌روز نگرانی‌ها در رابطه با این بیماری در حال افزایش است، چرا که علاوه بر اثرات عمیق بر کیفیت زندگی، باعث افزایش تقاضا برای خدمات بهداشتی و تحمیل هزینه‌های اقتصادی نیز می‌شود. از طرف دیگر، دیابت با مجموعه‌ای از بیماری‌ها از قبیل بیماری‌های قلبی-عروقی (عروق کرونر قلب)، سکته‌ی مغزی، بیماری کلیوی، رتینوپاتی و نوروپاتی، با احتمال قطع عضواندام تحتانی همراه هست، بنابراین کاهش سطح قند خون به یکی از مباحث قابل‌توجه در سراسر جهان تبدیل گشته است (Kooti et al., 2016; Durazzo et al., 2021).

در سال‌های اخیر، مطالعات متعددی بر روی گیاهان مختلف با قابلیت کاهش سطح قند خون انجام‌شده است. آلفاآمیلاز و آلفاگلوکوزیداز دو آنزیم مهم در مجاری گوارشی انسان هستند که با هیدرولیز پلی‌ساکاریدهای موجود در غذا آن‌ها را تبدیل به قندهای ساده قابل‌جذب توسط بدن می‌کنند (Falah Hosseini et al., 2013). بنابراین مهار این آنزیم‌ها می‌توانند تأثیر بسزایی در کاهش جذب قند در مجاری گوارشی داشته باشند. مهارکننده‌های آلفاآمیلاز به‌دست‌آمده از گیاهان قادر هستند میزان افزایش قند خون بعد از غذا (Hyperglycemia) را کاهش دهند. بااین‌وجود تخمین زده می‌شود که از 250000 گیاه، تنها 2500 مورد برای اثربخشی دارویی در برابر دیابت موردمطالعه قرارگرفته‌اند(Abu-Odeh and Talib, 2021). 

گیاه ترشک شبدری یک گیاه یک‌ساله از خانواده‌ی اکسالیداسه (Oxalidaceae) است، که گیاهی علفی و کوچک با ساقه‌ی خزنده و پوشیده از کرک خاکستری است. این گیاه بیشتر در مناطق مرطوب مانند شمال ایران می‌روید (Hosseini et al., 2009).  برگ‌های ترشک شبدری حاوی آب، پروتئین، چربی، کربوهیدرات، ویتامین C، نیاسین، بتاکاروتن، کلسیم، فیتواسترول، فلاونوئید، موسیلاژ و ترکیبات فنولیک است (Hosseini et al., 2009 Handali et al., 2011; Salehi Sardoei, 2021;). همچنین این گیاه به علت دارا بودن اسیدهای فنولیک، فلاوونوئیدها، گلوتاتیون و ویتامین‌های E و C دارای  خاصیت آنتی‌اکسیدانی است (Sirkanth et al., 2012). کلیه‌ی قسمت‌های این گیاه استفاده‌ی غذایی و داروئی دارد، به‌گونه‌ای که تاکنون مطالعات مختلف در داخل و خارج از کشور، اثربخشی این گیاه را در رفع اسهال، کم‌خونی و درمان التهاب دستگاه گوارش در دامپزشکی اثبات کرده‌اند.  همچنین اثرات ضد فشارخون، ضد روان‌پریشی، تنظیم‌کننده سرعت ضربان قلب توسط گیاه ترشک شبدری طی مطالعات مختلف به اثبات رسیده است (Salehi Sardoei, 2021). نکته‌ی قابل‌توجه در مورد این گیاه اثربخشی آن بر کاهش سطح قند خون است. در حال حاضر داروهایی مانند آکاربوز، گلیبوز و میگلیتول جهت کاهش سطح قندخون استفاده می‌شوند، که مکانیسم عمل این داروها مهار آنزیم‌های آلفاآمیلاز و آلفاگلوکوزیداز است. این دو آنزیم از طریق هیدرولیز پلی‌ساکاریدهای مواد‌غذایی در مجاری گوارشی و تبدیل آن‌ها به قندهای ساده قابل جذب باعث افزایش سطح  قندخون بعد از وعده‌های غذایی می‌شوند. بنابراین مهار فعالیت این دو آنزیم مخصوصا در بیماران دیابتی می‌تواند راه مناسبی برای پیشگیری از افزایش سطح گلوکز خون از طریق کنترل جذب گلوکز از دستگاه گوارش باشد (Falah Hosseini et al., 2013). این مطالعه با هدف تعیین اثر روش استخراج، شکل، طریقه و زمان نگهداری عصاره‌های مختلف ترشک شبدری بر میزان اثربخشی آن روی مهار فعالیت آنزیم‌های آلفاآمیلاز و آلفاگلوکوزیداز و همچنین تعیین اثر ضدباکتریایی این عصاره انجام گرفت.

 

مواد و روش‌ها

-مواد شیمیایی

آکاربوز، آنزیم آلفاآمیلاز، آلفاگلوکوزیداز پانکراس خوکی، نشاسته ذرت و 4-نیتروفنیل آلفا-D-گلوکوپیرانوزید از شرکت سیگما (Sigma-Aldrich, USA) تهیه شدند. سدیم کربنات، فسفات سدیم، محیط کشت مولر هینتون آگار و اسید‌3و5 ‌دی نیتروسالیسیلیک از شرکت مرک (Merck, Germany) خریداری شدند.

- باکتری‌ها

باکتری‌های مورد استفاده در این مطالعه از سازمان پژوهش علمی تهیه گردید. اشریشیاکلی دارای شناسه PTCC 1330 و استافیلوکوکوس‌اورئوس دارای شناسه PTCC 1764 بود.

-روش‌کار

-فرآیند عصاره‌گیری

ابتدا گیاه ترشک شبدری به‌منظور حذف خاک و هرگونه آلودگی احتمالی، با آب شسته شد. سپس توسط چرخ‌گوشت خانگی، خرد شده (پوره) (Moulinex, France) و به دو گروه تقسیم گردید. گروه اول به مدت شش ماه در فریزر نگهداری شد، اما گروه دوم بلافاصله عصاره‌گیری شد. عصاره‌گیری به دو روش اولتراسوند و ماسراسیون به کمک آب به عنوان حلال انجام گرفت. عصاره‌های به‌دست آمده از گروه دوم نیز خود به دو گروه تقسیم‌بندی شدند، یک گروه در یخچال و گروه دیگر در فریزر (18-) نگهداری شدند. پوره‌ی نگهداری شده در فریزر نیز در ماه سه و ماه شش از فریزر خارج و عصاره‌گیری(به دو روش اولتراسوند و ماسراسیون)  انجام گرفت.

برای این منظور، گیاه ترشک شبدری با آب به‌عنوان حلال به نسبت 1:1 مخلوط شد و درون دستگاه حمام اولتراسوند (Ultrasonic Cleaner, PARSONIC 7500 S, 28 kHz, 100 W) به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق ( 25 درجه سلسیوس) قرار گرفت. در روش ماسراسیون نیز مخلوط آب (حلال) و گیاه به مدت 15 دقیقه در دمای محیط قرار گرفت. در مرحله بعد عصاره‌های استخراج شده توسط کاغذ صافی واتمن شماره 5 صاف شدند و به کمک خشک­کن انجمادی (EHRSA, Germany) خشک گردید.

-اندازه‌گیری میزان مهارکنندگی آنزیم  آلفاآمیلاز

میزان مهارکنندگی فعالیت آنزیم آلفاآمیلاز و آلفاگلوکوزیداز در روز صفر، ماه سه و ماه شش سنجیده شد. به‌منظور اندازه‌گیری میزان مهارکنندگی آنزیم آلفاآمیلاز مخلوط واکنش حاوی 200 میکرولیتر بافر فسفات سدیم 02/0 مولار، 20 میکرولیتر آنزیم آلفاآمیلاز پانکراس خوکی  (Pig Pancreas Alpha amylase) و غلظت های مختلفی از نمونه (10، 20، 40، 60، و 80 میکروگرم بر میلی‌گرم) به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق (25 درجه سلسیوس) گرما گذاری شد و سپس 200 میکرولیتر نشاسته 1 درصد به لوله‌های آزمایش اضافه گردید. واکنش بوسیله افزودن 400 میکرولیتر معرف رنگی اسید3و5دی نیتروسالیسیلیک (Dinitrosalicylic acid-3,5) و قراردهی بر روی حمام آب جوش به مدت 5 دقیقه، خاتمه یافت. پس از سرد‌شدن مخلوط تا دمای اتاق، با 15 میلی‌لیتر آب مقطر رقیق شد و جذب آن در طول‌موج 540 نانومتر به‌وسیله اسپکتروفتومتر (Shimadzu, UV-2450, Japan) اندازه گیری شد.

-نمونه شاهد مثبت 

آکاربوز به‌عنوان شاهد در گستره غلظتی بین 10 تا 100 میکروگرم مورد استفاده قرار گرفت. آکاربوز یک داروی ضددیابتی مورد استفاده برای درمان دیابت نوع 2 است. این ترکیب یک ممانعت‌کننده فعالیت آنزیم آلفاگلوکوزیداز (یک آنزیم روده ای عامل آزاد شدن گلوکز از کربوهیدرات های بزرگ تر) است (Jyothi et al., 2011).

-اندازه‌گیری میزان مهارکنندگی آنزیم آلفا-گلوکوزیداز توسط عصاره

غلظت 5/0 میلی‌مولار از محلول 4-نیتروفنیل آلفا-D-گلوکوپیرانوزید  (pNPG) در بافر فسفات 1/0 مولار (9/6 = pH) آماده شد. همچنین غلظت‌های 50، 100 و 200 میکروگرم بر میلی‌لیتر از عصاره‌ها و نمونه استاندارد (آکاربوز) در بافر فسفات (9/6=  pH) آماده گردید. 1/0 (واحد در میلی‌لیتر) از محلول آلفا-گلوکوزیداز در 01/0 مولار بافر فسفات (0/6 pH =) آماده شد. در مرحله‌ی بعد 5 میلی لیتر بافر فسفات (1/0 مولار)، 5/2 میلی لیتر pNPG، 1 میلی لیتر نمونه تحت آزمون و 5/2 میلی‌لیتر محلول آلفاگلوکوزیداز با هم مخلوط شدند. مخلوط واکنش برای 20 دقیقه در دمای 37 درجه سلسیوس گرما گذاری شد. واکنش به‌وسیله افزودن 10 میلی لیتر محلول سدیم کربنات (1/0 مولار) خاتمه یافت. مقادیر جذب در  طول‌موج 405 نانومتر اندازه‌گیری شد. نمونه شاهد به‌صورت نمونه‌ای که در آن عصاره به‌وسیله متانول جایگزین شده است در‌نظر گرفته شد.

-نمونه شاهد مثبت 

آکاربوز به‌عنوان شاهد در گستره غلظتی بین 50 تا 200 میکروگرم مورد استفاده قرار گرفت.(Das and Himaja, 2015).

- حداقل غلظت مهارکنندگی( MIC) و حداقل غلظت کشندگی ( MBC)

حداقل غلظت مهارکنندگی رشد و حداقل غلظت کشندگی عصاره‌های استحصالی، به روش میکرودایلوشن براث ارائه شده توسط مطالعات پیشین (Shahabi et al., 2016) با اندکی تغییرات انجام گرفت. باکتری(اشرشیاکلی : PTCC 1330 و استافیلوکوکوس‌اورئوس : PTCC 1764) 24 ساعت قبل از انجام تست در محیط کشت مولر هینتون آگار کشت داده شد و در 37 درجه‌ی سلسیوس گرما‌گذاری شد. عصاره‌ی ترشک شبدری در غلظت 470 میلی‌گرم در لیتر تهیه گردید. در ابتدای کار، در هر چاهک (میکروپلیت 96 خانه‌ای پلی استایرن استریل) 100 میکرولیتر از مولر هینتون آگار (Merck, Germany) اضافه شد. سپس 100 میکرولیتر از عصاره به چاهک اول اضافه و مخلوط گردید. در مرحله‌ی بعد 100 میکرولیتر از چاهک اول برداشته شد و به چاهک دوم اضافه گردید، و درنهایت از چاهک دهم 100 میکرولیتر برداشته و دور ریخته شد. به این ترتیب ساخت رقت‌های دو برابر رقیق شده در چاهک‌های دیگر ادامه یافت، در‌نتیجه از چاهک دوم غلظت‌ها نصف چاهک قبلی بود. در مرحله‌ی بعد، 10 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری ( cfu/ml108 × 5/1، نیم مک فارلند) به چاهک‌ها افزوده گردید. درنهایت سطح پلیت‌ها پوشیده شد و به مدت 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه‌ی سلسیوس گرمخانه‌گذاری شد. برای تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی رشد و حداقل غلظت کشندگی از روش چشمی، رنگ آمیزی با رزازورین 1/0 درصد و کشت و شمارش استفاده شد (Shahabi et al., 2016).

بعد از قرائت نتیجه MIC به منظور تعیین مقدار MBC از گوده‌ای که تغییر رنگ بینابینی داشت (گوده‌ی مابین گوده‌ی قرمز و گوده‌ای که تغییر رنگ نداده بود) به کمک آنس نمونه برداشته و در سطح محیط کشت BHI آگار به‌صورت نقطه‌ای کشت داده شد. بعد از 24 ساعت انکوباسیون، رشد باکتری بررسی گردید و رقتی که رشد باکتری منفی بود به عنوان MBC اعلام گردید.

-روش انتشار در آگار با استفاده از چاهک

در این روش بعد از تهیه‌ی محیط کشت (مولر هینتون آگار)، 100 میکرولیتر از کشت باکتریایی (cfu/ml 108 × 5/1، نیم مک فارلند، اشرشیاکلی : PTCC 1330 و استافیلوکوکوس‌اورئوس : PTCC 1764) به کمک پخش کننده، در تمام نقاط محیط کشت پخش گردید. سپس در سطح محیط کشت به کمک انتهای پیپت استریل 7 چاهک به قطر 6 میلی‌متر ایجاد شد. به کمک سمپلر در هر یک از چاهک‌ها 25 میکرولیتر از غلظت‌های مختلف عصاره ریخته شد و پلیت‌ها برای مدت 24 ساعت در 37 درجه سلسیوس گرما‌گذاری شدند. در نهایت قطر هاله‌های عدم رشد توسط کولیس اندازه‌گیری شد و نتایج میانگین‌ها به‌صورت میلی‌متر گزارش شد (Farahmandfar and Kordjazi, 2018).

-تجزیه و تحلیل آماری

کلیه‌ی آزمون‌های انجام گرفته در این مطالعه در سه تکرار انجام شد. داده‌های به‌دست آمده با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) و تفاوت معنی‌دار بین میانگین‌ها در سطح احتمال 95 درصد توسط آزمون چند دامنه‌ای دانکن مشخص گردید. نتایج به‌دست آمده بااستفاده از نرم‌افزار SPSS19 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

 

یافته‌ها

-مهارکنندگی آنزیم آلفاآمیلاز 

IC50 آکاربوز و نمونه‌های عصاره‌ی ترشک شبدری، با رسم نمودار درصد بازدارندگی در برابر غلظت عصاره به‌دست آمد. مقدار IC50 آکاربوز برای آنزیم آلفاآمیلاز برابر 41/0 ± 21/60 میکروگرم‌ در میلی‌لیتر بود. این مقدار بیانگر مقدار غلظتی است که آکاربوز موجب مهار 50 درصد از فعالیت آنزیم آلفاآمیلاز می‌شود.

نتایج تجزیه­ی واریانس آنزیم آلفاآمیلاز نشان داد که اثرات ساده زمان، دما و روش عصاره‌گیری در سطح یک درصد معنی­دار شد (01/0p<)، همچنین اثر متقابل دوگانه زمان در دما نیز در سطح 5 درصد معنی­دار شد (05/0p<). درحالیکه سایر اثرات متقابل دوگانه و همچنین اثر متقابل سه گانه تیمارهای مورد بررسی از نظر آماری معنی‌دار نبود (05/0p>). مقایسه میانگین اثر متقابل زمان در دما نشان داد که بیشترین مقدار IC50 در تیمار متقابل شرایط نگهداری یخچال در زمان 6 ماه با مقدار 4/89 میکروگرم‌ در میلی‌لیتر مشاهده شد و کمترین مقدار نیز مربوط به تیمار ماه صفر با مقدار 1/69 میکروگرم‌ در میلی‌لیتر بود (شکل 1). مقایسه میانگین اثر روش عصاره‌گیری نیز نشان داد که کمترین مقدار  IC50در روش عصاره‌گیری اولتراسوند مشاهده شد (شکل 2).

 

 

 

 

شکل (1)- اثر زمان و دمای نگهداری بر مقدار IC50  آلفاآمیلاز در نمونه های اولتراسوند

*میانگین­های دارای حروف متفاوت دارای تفاوت معنی­دار در سطح یک درصد بر اساس آزمون دانکن هستند

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل (2)- مقایسه میانگین اثر روش عصاره گیری بر مهار عملکرد آلفاآمیلاز

*میانگین­های دارای حروف متفاوت دارای تفاوت معنی­دار در سطح یک درصد بر اساس آزمون دانکن هستند

 

نتایج تجزیه واریانس مقایسه‌ی کلیه‌ی نمونه‌ها با آکاربوز نشان داد که بین تیمارهای مختلف مورد بررسی از نظر آماری اختلاف معنی‌دار وجود دارد به‌طوریکه این اختلاف در سطح یک درصد معنی‌دار شد (01/0p<). مقدار IC50 کلیه نمونه‌ها نسبت به آکاربوز بیشتر بود. بیشترین و کمترین مقدار IC50 به‌ترتیب از تیمارهای 6 ماه در یخچال به روش ماسراسیون با میانگین 4/89 میکروگرم‌ در میلی‌لیتر و آکاربوز با میانگین 2/60 میکروگرم‌ در میلی‌لیتر به‌دست آمد (شکل 3).

 

 

شکل (3)- مقایسه میانگین اثر تیمارهای مختلف بر مقدار IC50 آنزیم آلفاآمیلاز

*میانگین­های دارای حروف متفاوت دارای تفاوت معنی­دار در سطح یک درصد بر اساس آزمون دانکن هستند.

 (T: زمان (ماه)، R: نگهداری یخچالی،F : نگهداری در فریزر،M : عصاره­گیری به روش ماسراسیون،U : عصاره گیری به روش اولتراسوند)

 

نتایج جدول تجزیه­ی واریانس نمونه‌های پوره شده‌ی ترشک شبدری نشان داد که اثرات ساده زمان و روش عصاره‌گیری در سطح یک درصد معنی­دار شد (01/0p<)، درحالیکه اثر متقابل دوگانه زمان در روش عصاره­گیری معنی­دار نشد (05/0p>). مقایسه میانگین اثر ساده زمان نشان داد که بیشترین مقدار IC50 برای آنزیم آلفاآمیلاز در زمان 6 ماه با میانگین 1/82 میکروگرم‌ در میلی‌لیتر و کمترین آن در زمان 3 ماه با میانگین 3/74 میکروگرم‌ در میلی‌لیتر مشاهده شد (شکل 4)، که حاکی از افزایش IC50 با گذشت زمان نگهداری پوره در فریزر است. مقایسه میانگین اثر ساده روش عصاره‌گیری نیز نشان داد که بیشترین مقدار IC50 با میانگین 5/82 میکروگرم‌ در میلی‌لیتر از روش ماسراسیون و کمترین مقدار با میانگین 9/73 میکروگرم‌ در میلی‌لیتر از روش اولتراسوند به‌دست آمد (شکل 5).

 

 

شکل (4)- مقایسه میانگین اثر ساده زمان بر مقدار IC50 آنزیم آلفاآمیلاز در نمونه‌های پوره

*میانگین­های دارای حروف متفاوت دارای تفاوت معنی­دار در سطح یک درصد بر اساس آزمون دانکن هستند

 

 

 

 

 

شکل 5(5)- مقایسه میانگین اثر ساده روش عصاره‌گیری بر مقدار IC50 آنزیم آلفاآمیلاز در نمونه‌های پوره

*میانگین­های دارای حروف متفاوت دارای تفاوت معنی­دار در سطح یک درصد بر اساس آزمون دانکن هستند

 

 

نتایج تجزیه واریانس IC50 آلفاآمیلاز نمونه‌های پوره با آکاربوز نشان داد که بین تیمارهای مختلف مورد بررسی از نظر آماری اختلاف معنی‌دار وجود دارد به‌طوریکه این اختلاف در سطح یک درصد معنی‌دار شد (01/0p<). کلیه نمونه‌های پوره مقدار IC50 بیشتری نسبت به آکاربوز نشان دادند (شکل 6).

 

  

شکل (6)- مقایسه میانگین اثر نمونه‌های پوره و آکاربوز بر مقدار IC50 آنزیم آلفاآمیلاز

*میانگین­های دارای حروف متفاوت دارای تفاوت معنی­دار در سطح یک درصد بر اساس آزمون دانکن هستند

(T: زمان (ماه)، R: نگهداری یخچالی،F : نگهداری در فریزر،M : عصاره­گیری به روش ماسراسیون،U : عصاره گیری به روش اولتراسوند)

 

-مهارکنندگی آنزیم آلفاگلوکوزیداز

مقدار IC50 آکاربوز برای آنزیم آلفاگلوکوزیداز برابر با 51/0 ± 40/144 میکروگرم‌ در میلی‌لیتر بود. این مقدار بیانگر مقدار غلظتی است که آکاربوز موجب مهار 50 درصد از فعالیت آنزیم آلفاگلوکوزیداز می‌شود. در بررسی سطح IC50 آنزیم آلفاگلوکوزیداز نمونه‌ها، نتایج مشابه آنزیم آلفاآمیلاز مشاهده گردید. نتایج جدول تجزیه­ی واریانس آنزیم آلفاگلوکوزیداز نشان داد که اثرات ساده زمان، دما و روش عصاره‌گیری در سطح یک درصد معنی­دار شد (01/0p<) ، همچنین تمامی اثرات متقابل دوگانه و همچنین اثر متقابل سه گانه در سطح  یک درصد معنی­دار شد (01/0p<). مقایسه میانگین اثر متقابل سه‌گانه زمان در دما در روش عصاره‌گیری نشان داد که تیمار متقابل 6 ماه زمان در یخچال به روش عصاره‌گیری ماسراسیون با میانگین 6/205 میکروگرم‌ در میلی‌لیتر بیشترین مقدار IC50 را داشت. و تیمار متقابل زمان صفر در یخچال به روش اولتراسوند با میانگین 6/161  میکروگرم‌ در میلی‌لیتر کمترین مقدار IC50 را داشت (شکل 7).

 

 

 

شکل (7)- مقایسه میانگین اثر متقابل زمان، دما و روش عصاره‌گیری بر مقدار IC50 آنزیم آلفاگلوکوزیداز

*میانگین­های دارای حروف متفاوت دارای تفاوت معنی­دار در سطح یک درصد بر اساس آزمون دانکن هستند

(T: زمان (ماه)، R: نگهداری یخچالی،F : نگهداری در فریزر،M : عصاره­گیری به روش ماسراسیون،U : عصاره گیری به روش اولتراسوند)

 

 

مقدار IC50 برای آنزیم آلفاگلوکوزیداز در کلیه‌ی نمونه‌های عصاره‌ی ترشک شبدری به‌دست آمده، از آکاربوز بیشتر بود. نتایج تجزیه واریانس آنزیم آلفاگلوکوزیداز نشان داد که بین تیمارهای مختلف مورد بررسی و آکاربوز از نظر آماری اختلاف معنی‌دار وجود دارد به‌طوریکه این اختلاف در سطح یک درصد معنی‌دار شد (01/0p<). بیشترین و کمترین مقدار IC50 به ترتیب از تیمارهای 6 ماه در یخچال به روش ماسراسیون با میانگین 6/205 میکروگرم‌ در میلی‌لیتر و آکاربوز با میانگین 4/144 میکروگرم‌ در میلی‌لیتر به‌دست آمد  (شکل 8).

 

 

 

شکل (8)- مقایسه میانگین تیمارهای مختلف بر مقدار IC50 آنزیم آلفاگلوکوزیداز

*میانگین­های دارای حروف متفاوت دارای تفاوت معنی­دار در سطح یک درصد بر اساس آزمون دانکن هستند

(T: زمان (ماه)، R: نگهداری یخچالی،F : نگهداری در فریزر،M : عصاره­گیری به روش ماسراسیون،U : عصاره گیری به روش اولتراسوند)

 

 

نتایج جدول تجزیه­ی واریانس میزان بازدارندگی از فعالیت آنزیم آلفاگلوکوزیداز نمونه‌های پوره شده نشان داد که علاوه بر اثرات ساده زمان و روش عصاره‌گیری، همچنین اثر متقابل دوگانه زمان در روش عصاره­گیری نیز در سطح یک درصد معنی­دار شد (01/0p<). مقایسه میانگین اثر متقابل زمان در روش عصاره‌گیری نشان داد که بیشترین مقدار IC50 در تیمار متقابل روش ماسراسیون عصاره‌گیری در زمان 6 ماه با میانگین 6/201 میکروگرم‌ در میلی‌لیتر مشاهده شد و کمترین مقدار نیز مربوط به تیمار متقابل روش اولتراسوند در زمان 3 ماه با میانگین 7/167 میکروگرم‌ در میلی‌لیتر بود (شکل 9).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل(9)- مقایسه میانگین اثر متقابل زمان و روش عصاره‌گیری بر مقدار IC50 آنزیم آلفاگلوکوزیداز در نمونه‌های پوره

*میانگین­های دارای حروف متفاوت دارای تفاوت معنی­دار در سطح یک درصد بر اساس آزمون دانکن هستند

 

 

همچنین، نتایج تجزیه واریانس نشان داد که بین مقدار IC50 نمونه‌های پوره در مقایسه‌ی با آکاربوز از نظر آماری اختلاف معنی‌دار وجود دارد به‌طوریکه این اختلاف در سطح یک درصد معنی‌دار شد. کلیه‌ی نمونه‌ها سطح IC50 بالاتری در مقایسه با آکاربوز نشان دادند (شکل 10).

 

 

شکل (10)- مقایسه میانگین اثر تیمارهای مختلف بر مقدار IC50 آنزیم آلفاگلوکوزیداز در نمونه‌های پوره

*میانگین­های دارای حروف متفاوت دارای تفاوت معنی­دار در سطح یک درصد بر اساس آزمون دانکن هستند

(T: زمان (ماه)، R: نگهداری یخچالی،F : نگهداری در فریزر،M : عصاره­گیری به روش ماسراسیون،U : عصاره گیری به روش اولتراسوند)

 

-بررسی فعالیت ضدمیکروبی عصاره به روش انتشار در آگار (چاهک)

با استفاده از روش انتشار در آگار، اثر ضدباکتریایی عصاره‌ی ترشک شبدری به روش چاهک پلیت بر باکتری‌های اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس‌اورئوس انجام شد و نتایج حاصل در جدول 1 گزارش شده است. براساس نتایج مقایسه‌ی میانگین‌ها در روش چاهک، بیشترین میزان قطر هاله عدم رشد (00/0 ± 20 میلی‌متر) مربوط به باکتری استافیلوکوکوس‌اورئوس بود. اثر ضدمیکروبی عصاره‌ی ترشک شبدری به روش چاهک نشان داد که افزایش غلظت عصاره نسبت مستقیم با افزایش قطر هاله‌ی عدم رشد در باکتری‌های مورد مطالعه دارد. در مورد هر دو باکتری مورد آزمایش، در غلظت‌های 11 و 23 درصدی عصاره‌ی آبی ترشک شبدری بر روی استافیلوکوکوس‌اورئوس و اشریشیاکلی هاله‌ی عدم رشد مشاهده گردید. همچنین طبق نتایج به دست آمده مقاومت باکتری اشریشیاکلی نسبت به استافیلوکوکوس‌اورئوس در برابر عصاره‌ی آبی ترشک شبدری بیشتر بود. نتایج بیانگر اثر بازدارندگی عصاره‌ی ترشک شبدری بر رشد باکتری‌های مورد مطالعه بود که به صورت هاله‌ی عدم رشد نمایان شد.

کمترین غلظت عصاره، قطر هاله‌ای برابر با 00/0 ± 11 میلی‌متر برای هردو باکتری ایجاد نمود، اما بالاترین غلظت (47 درصد) قطر هاله‌ای برابر 02/0 ± 16  و 01/0 ± 20 میلی‌متر به ترتیب برای اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس‌اورئوس ایجاد نمود.

 

جدول (1)- خصوصیات ضدباکتریایی عصاره ی ترشک شبدری

فعالیت ضدباکتریایی			باکتری
قطر عدم هاله رشد (میلی‌متر) %11 % 23	حداقل غلظت کشندگی (میلی‌گرم در لیتر)	حداقل غلظت مهارکنندگی (میلی‌گرم در لیتر)
aA 00/0 ± 11     bB 02/0 ± 16	59	5/29	اشریشیاکلی
aA 00/0 ±   11           bC 01/0 ± 20	5/29	7/14	استافیلوکوکوس اورئوس

*حروف غیرمتشابه کوچک در هر ردیف و حروف غیرمتشابه بزرگ در هر ستون نشان‌دهنده‌ی اختلاف معنی‌دار (05/0p<) هستند

 

 

-بررسی میزان MIC و MBC عصاره

در این مطالعه حداقل غلظت ممانعت از رشد عصاره‌ی ترشک شبدری در برابر اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس‌اورئوس مورد بررسی قرار گرفت. به‌طور‌کلی، MIC یا حداقل میزان بازدارندگی بیانگر کمترین مقدار از عصاره است که می‌تواند بیشترین مهارکنندگی از رشد یک میکروارگانیسم را پس از گذشت یک دوره انکوباسیون مشخص ایجاد نماید (Kowalska-Krochmal and Dudek-Wicher., 2021). از آنجا که نمونه‌ی اولتراسوند روز صفر بیشترین میزان بازدارندگی از فعالیت آنزیم‌های آلفاآمیلاز و آلفاگلوکوزیداز را نشان داد، درنتیجه حداقل غلظت مهارکنندگی و حداقل غلظت کشندگی این نمونه در برابر باکتری‌های استافیلوکوکوس‌اورئوس و اشرشیاکلی سنجیده شد. عصاره‌ی آبی ترشک شبدری دارای اثر مهارکنندگی و کشندگی بر هردو باکتری استافیلوکوکوس‌اورئوس و اشریشیاکلی است. طبق نتایج ارائه شده در جدول 1 مقدار MIC و MBC برای استافیلوکوکوس اورئوس به ترتیب 7/14 و 5/29 قسمت در میلیون و برای اشریشیاکلی به‌ترتیب معادل 5/29 و 59 قسمت در میلیون بود.

 

بحث و نتیجه‌گیری

در این پژوهش میزان قدرت مهارکنندگی آنزیم‌های آلفاآمیلاز و آلفاگلوکوزیداز توسط گیاه ترشک شبدری تحت پارامترهای متفاوت از جمله روش عصاره‌گیری (اولتراسوند و ماسراسیون)، مدت زمان نگهداری (صفر، 3 و 6 ماه)، شکل نگهداری (عصاره و پوره) و دمای نگهداری (یخچال و فریزر) بررسی شد. نتایج کلی به‌دست آمده حاکی از آن است که بهترین IC50 مربوط به تاثیر نمونه‌ی اولتراسوند روز صفر بر فعالیت آنزیم آلفاآمیلاز است. اگرچه تاثیر این نمونه نسبت به مابقی نمونه‌ها بهتر بود، اما اثر آن در مقایسه با آکاربوز ضعیف‌تر بود. نتایج مشابهی در رابطه با تاثیر عصاره‌های مورد استفاده در این مطالعه بر روی آنزیم آلفاگلوکوزیداز نیز به‌دست آمد. همانگونه که اشاره شد، زمان نگهداری اثر معنی‌داری بر مقدار  IC50 نمونه‌ها داشت. با گذشت زمان نگهداری، میزان قابلیت بازدارندگی از فعالیت آنزیم‌های آلفاآمیلاز و آلفاگلوکوزیداز نمونه‌ها کاهش یافت. از طرف دیگر، نگهداری در فریزر باعث حفظ بیشتر قابلیت بازدارندگی از فعالیت آنزیم توسط نمونه‌های ترشک شبدری گردید. به طور کلی  با توجه به نتایج به‌دست آمده می‌توان اظهار داشت که فرآیند اولتراسوند تاثیر قابل توجهی بر روی میزان اثر بازدارندگی نمونه‌ها داشت، به‌گونه‌ای که نمونه‌های اولتراسوند شده نسبت به عصاره‌های به‌دست آمده به روش ماسراسیون میزان IC50 پایین تری را نشان دادند. نتایج این پژوهش نشان داد که عصاره‌ی آبی اولتراسوند شده‌ی گیاه ترشک شبدری اثر مهارکنندگی قابل توجهی بر روی آنزیم‌های آلفاآمیلاز و آلفاگلوکوزیداز داشت. مطالعات پیشین اثر عصاره‌ی ترشک شبدری بر مهار آنزیم آلفاآمیلاز را اثبات کرده‌اند (Jyothi et al., 2014). محققان با تایید خاصیت ضددیابتی عصاره­ی ترشک شبدری، اعلام کردند که عصاره­ی آبی گیاه ترشک شبدری با مهار آنزیم آلفاآمیلاز قادر به ممانعت از افزایش قندخون تا دو ساعت پس از صرف غذا است (Kavitha, 2012 and Angila). یافته‌های مطالعه­ای دیگر نیز فعالیت ضدمیکروبی عصاره­ی آبی ترشک شبدری را به اثبات رسانده است (Sharangouda and Patil, 2007). مکانیسم عمل عصاره­ی ترشک شبدری در مهار آنزیم های آلفاآمیلاز و آلفاگلوکوزیداز هنوز مشخص نیست. اما فعالیت آنتی­اکسیدانی عصاره­ی ترشک شبدری توسط مطالعات پیشین به اثبات رسیده است (Sreejith, 2014). یافته‌های مطالعه­ای دیگر نیز مشخص نمود که ترکیبات دارای خاصیت آنتی­اکسیدانی، قادر به مهار فعالیت آنزیم آلفاگلوکوزیداز از طریق مهار رادیکال‌های آزاد اکسیژن هستند (Zhang et al., 2015). پتانسیل ضددیابتی ترکیبات فنولیک مخصوصا تانین­ها و فلاوونوئیدها نیز توسط مطالعات پیشین به اثبات رسیده است (Ali Asgar et al., 2013; Zhang et al., 2010). نتایج یک مطالعه نشان داد که گیاه ترشک شبدری دارای مقادیر قابل توجهی ویتامین C، فلاونوئیدها و ترکیبات فنولیک است (Sardoei., 2021). از طرفی، مطالعات متعددی خاصیت آنتی‌اکسیدانی و ضد دیابتی فلاوونوئیدها و اسید فنولیک‌ها را به اثبات رسانیده‌اند (Hoang et al., 2020; Proenca et al., 2022). گروه‌های مختلفی از فلاوونوئیدها قادر به مهار آنزیم‌های آلفاآمیلاز هستند زیرا این ترکیبات می‌توانند به صورت غیرکووالانس به جایگاه‌های فعال باقیمانده آنزیم متصل شوند (Williams et al., 2012). همچنین در متابولیسم کربوهیدرات‌ها، اسیدهای فنولیک بیشتر به دلیل توانایی‌شان در مهار فعالیت بیولوژیکی آنزیم‌های آلفاآمیلاز و آلفاگلوکوزیداز شناخته شده‌اند (Kashtoh and Baek., 2023).

در مطالعه‌ای که بر روی اثر مهارکنندگی عصاره بر روی فعالیت آنزیم انجام گرفت، مشخص گردید که متابولیت‌های ثانویه ازجمله لیگنین‌ها، فلاوونوئیدها، تریترپنوئیدها، تانین‌ها، استروئیدها، گلیکوزیدها، فنول‌ها، و ساپونین‌ها فنولیک‌اسیدها، و کومارین‌ها دارای پتانسیل مهارکنندگی از فعالیت آلفاآمیلاز و آلفاگلوکوزیداز هستند (Kifle et al., 2021). نتایج یک بررسی نشان داد که حضور گروه‌های هیدروکسیلی در موقعیت‌های ارتو و پارای ترکیبات فنلی، آن‌ها را به گزینه‌ی مناسبی برای پاکسازی رادیکال‌های آزاد تبدیل می‌کند. در مطالعه‌ی مذکور با اشاره بر ریشه‌ی بروز ناهنجاری‌هایی مانند دیابت (ناشی از ایجاد استرس اکسیداتیو) به علت حمله مشتقات فعال اکسیژن به ماکروملکول‌های حیاتی بدن (لیپیدها، کربوهیدرات‌ها، پروتئین‌ها، و DNA)، گزارش شده است که بین استرس اکسیداتیو و دیابت رابطه‌ی مستقیمی وجود دارد. درنتیجه با توجه به این اثر متقابل می‌توان اعلام نمود که عصاره‌های دارای فعالیت آنتی‌اکسیدانی و ضددیابتی امکان دارد که دارای اثرات ضددیابتی و آنتی‌اکسیدانی، به ترتیب، نیز باشند (Pirian et al., 2016).

یکی از راهبردها و روش‌های اتخاذ شده برای درمان دیابت، مهار آنزیم‌های هضم‌کننده کربوهیدرات‌ها مانند آلفاآمیلاز وآلفاگلوکزیداز در جذب گلوکز گوارشی است که در نتیجه سطح گلوکز پس از غذا را کاهش می‌دهد. به‌طورکلی می‌توان گفت که عملکرد اصلی مهارکننده‌های آنزیم، ایجاد تاخیر در تجزیه کربوهیدرات‌ها در روده‌ی کوچک است. درنتیجه میزان گلوکز خون پس از صرف غذا را در فردی که از دیابت رنج می‌برد کاهش می‌دهد. عصاره‌های گیاهی دارای پتانسیل مهارکنندگی فعالت آنزیم، دارای ترکیبات فعالی هستند که با سوبسترا برای اتصال به محل فعال آنزیم رقابت می‌کنند و در نتیجه از تجزیه الیگوساکاریدها به دی‌ساکاریدها جلوگیری می‌کنند (Kazeem et al., 2013). 

تاثیر اولتراسوند بر افزایش فعالیت آنزیم‌های آلفاآمیلاز و آلفاگلوکوزیداز را  می‌توان در درجه اول به تاثیر اولتراسوند بر ترکیبات فعال نسبت داد. مطالعات پیشین به این اصل اشاره کرده‌اند که اولتراسوند در مقایسه با روش‌های حرارتی متداول، به حفظ بهتر ترکیبات زیست فعال مانند فلاوونوئیدها کمک می‌کند. در وهله بعد می‌توان به پدیده حفره‌زایی (کاویتاسیون) اشاره نمود. در اثر تابش اولتراسوند حباب‌هایی ناپایدار تشکیل می‌شوند که سبب ایجاد کاویتاسیون موقت می‌گردند.این حباب‌های ناپایدار فروپاشیده و اتم‌های هیدرون و رادیکال‌های هیدروکسیل را تولید می‌کنند، که می‌توانند فعالیت آنتی‌اکسیدانی را ایجاد کنند. این پدیده در دقایق ابتدایی فرآیند رخ می‌دهد. سپس، با گذشت زمان، اولتراسوند انتشار سریع‌تر ترکیبات موردنظر (فنول، فلاوونوئیدها و غیره) را تسهیل می‌کند و منجر به افزایش آن‌ها می‌شود. بنابراین، افزایش فلاوونوئیدها در نمونه‌های اولتراسوند شده را می‌توان عمدتا به تخریب سلولی نسبت داد، زیرا غشاهای شکسته شده و آنزیم‌ها آزاد می‌شوند (ِDzah et al., 2022; Barani et al., 2021).

از طرف دیگر، در اثر این پدیده هیدروژن مورد نیاز برای کاتالیز کردن هیدرولیز پیوند (4-1) α-گلوکوزید توسط آنزیم آلفاگلوکوزیداز تامین می‌شود، ترکیبات فنولی با جدا کردن یون هیدروژن آزاد شده از جایگاه کاتالیزور آنزیم آلفاگلوکوزیداز باعث ممانعت از فعالیت آنزیم می‌شوند (Jalili Safaryan et al., 2022).

بنابراین تفاوت در مقدار پتانسیل مهارکنندگی آنزیم توسط نمونه‌های مختلف می‌تواند مربوط به تفاوت در مقدار ترکیبات فنولیک و فلاوونوئید آن‌ها باشد، که این تفاوت در ترکیبات فنلی نیز مربوط به تفاوت در روش استخراج و/یا نگهداری است (Nadeem et al., 2019). نتایج این مطالعه در راستای مطالعات پیشین بود. پژوهشگران پیشین در مطالعات ضددیابتی خود بر روی نمونه‌های مختلف عسل، فعالیت مهاری آلفاگلوکوزیداز را ارزیابی کردند و دریافتند که همه‌ی نمونه‌ها دارای تاثیر متناسب با غلظت بودند. این رفتار به منشا گیاهی عسل، به‌ویژه حضور فنول‌ها و فلاوونوئید‌ها نسبت داده شد (Ali et al., 2020). نتایج یک مطالعه‌ی دیگر نشان داد که ترکیبات فنلی می‌توانند اثرات بالقوه ضددیابتی داشته باشند، این مطالعه به‌طور خاص به تانن‌ها و فلاوونوئیدها اشاره کرد (Ali Asgar et al., 2013). برخی از اسیدهای فنلی، فلاوونوئیدها و رنگدانه‌های دیگر در تمشک توسط بررسی‌های انجام گرفته شناسایی، و اعلام شده که این ترکیبات فعالیت مهاری قوی برآنزیم‌ها دارند (Zhang et al., 2010). همچنین اولتراسوند به عنوان یک روش موثر برای تقویت ترکیبات زیست فعال مرتبط با مهار آنزیم آلفا گلوکوزیداز اثبات شده است. یک مطالعه تاثیر استخراج اولتراسونیک بر استخراج ترکیبات فعال از پوست میوه لانگان را ارزیابی کرد و اثرات مهاری این عصاره بر فعالیت آنزیم آلفاگلوکوزیداز را مورد بررسی قرار داد. نتایج این مطالعه مشخص نمود که میزان مهار آنزیم متناسب با مقدار عصاره است. آن‌ها همچنین ذکر کردند که این امر به دلیل آن است که فرآیند اولتراسوند به طور قابل توجهی استخراج را بهبود می‌بخشد؛ با افزایش این ترکیبات، قدرت مهارکنندگی نیز افزایش می‌یابد که به کاهش آزادسازی مونوساکاریدها پس از مصرف منجر می‌شود (Li et al., 2016).

برخی از مطالعات پیشین اثر مثبت فریز کردن بر خصوصیات عملکردی و کیفیت غذاهای گیاهی را اثبات کرده‌اند. از آنجا که فریزکردن باعث رهایش ترکیبات فعال زیستی مانند اسیدهای فنولیک و آنتوسیانین‌ها می‌شود، در نتیجه میزان فعالیت آنتی‌اکسیدانی افزایش می‌یابد (Neri et al., 2020). کاهش قدرت مهارکنندگی از فعالیت آنزیم در نمونه‌های ترشک شبدری پوره شده را می‌توان به اکسیداسیون نسبت داد. عمل پوره کردن باعث کاهش فعالیت آنتی­اکسیدانی ناشی از افزایش سطح اکسیداسیون می‌شود. با توجه به رابطه‌ی مستقیم بین فعالیت آنتی­اکسیدانی و میزان مهارکنندگی از فعالیت آنزیم، درنتیجه کاهش سطح IC50 در نمونه‌های پوره شده دور از انتظار نبود (Barmaverain et al., 2022).

نتایج بدست آمده حاصل از آزمون ضدمیکروبی در این پژوهش، در راستای مطالعات پیشین بود. نتایج یک مطالعه نشان داد که عصاره‌ی متانولی ترشک در مقایسه با استرپتومایسین استاندارد فعالیت ضدباکتریایی نسبتا قابل قبولی دارد، که به علت حضور ترکیبات فنولیک در این گیاه است (Raghavendra et al., 2006). نتایج مطالعه‌ای مشابه در این راستا، قطر هاله برابر 21 و 33/19 میلی‌متر برای غلظت 20 درصدی از عصاره‌ی ترشک شبدری را گزارش کردند (Hosseini et al., 2009). با توجه به نتایج به‌دست آمده از آزمون حداقل غلظت مهارکنندگی و حداقل غلظت بازدارندگی، می‌توان اذعان داشت که حداقل غلظت بازدارندگی عصاره آبی ترشک شبدری در باکتری‌های گرم منفی بیشتر از باکتری‌های گرم مثبت است. دلیل این امر را می‌توان به وجود لایه لیپوپروتئین-لیپوپلی ساکاریدی موجود در پپتیدوگلیکان دیواره‌ی سلولی باکتری‌های گرم منفی نسبت داد، که باعث افزایش مقاومت باکتری‌های گرم منفی در برابر ترکیبات ضدباکتریایی موجود در عصاره‌های گیاهی می‌شود (Burt, 2004).

با یک دید کلی به نتایج حاصل از مطالعه‌ی پیش رو می‌توان گزارش نمود که روش اولتراسوند نسبت به روش ماسراسیون در استخراج ترکیبات عملکردی بسیار کاربردی‌تر و موثرتر است. عصاره‌های به‌دست آمده از گیاه ترشک شبدری تازه، قابلیت بالاتری در مهار فعالیت آنزیم‌های آلفاآمیلاز و آلفاگلوکوزیداز را دارد. به عبارتی می‌توان ذکر نمود که نگهداری در یخچال یا فریزر باعث کاهش قدرت مهارکنندگی از فعالیت آنزیم توسط عصاره می‌شود. نگهداری گیاه ترشک شبدری به صورت عصاره در قیاس با شکل پوره شده، باعث حفظ بیشتر ترکیبات موثر در مهار فعالیت آنزیم می‌گردد. عصاره‌ی آبی ترشک شبدری که دارای اثر ضدمیکروبی قابل توجهی است اثر ضدمیکروبی بالاتری بر باکتری‌های گرم مثبت نسبت به باکتری‌های گرم منفی نشان داد. پیشنهاد می‌شود که با مطالعات بیشتر بر روی ترکیبات اصلی و موثر این گیاه از ترکیبات ضد‌دیابتی و ضدمیکروبی این گیاه در درمان دیابت و/یا عفونت با باکتری‌ها استفاده شود. از طرفی با توجه به تاثیر مثبت عصاره‌ی آبی ترشک شبدری بر روی مهار فعالیت آنزیم‌های موثر در افزایش قند‌خون، می‌توان از عصاره‌ی این گیاه در فرمولاسیون موادغذایی مختلف جهت تولید محصولات فراسومند برای بیماران دیابتی بهره برد.

 

تضاد منافع

نویسندگان هیچگونه تعارض منافعی ندارند.

 

 

 

منابع

·       Abu-Odeh, A.M. and Talib, W.H. (2021). Middle east medicinal plants in the treatment of diabetes: A review. Molecules, 26(3), 742-751.

·       Ali Asgar, M.D. (2013). The anti-diabetic potential of phenolic compounds: A review. International Journal of Food Properties, 16 (1), 91-103.

·       Ali, H., Abu Bakar, M.F., Majid, M., Muhammad, N. and Lim, S.Y. (2021). In vitro anti-diabetic activity of stingless bee honey from different botanical origins. Food Research, 4(11), 1421-1426.

·       Aliasgar, M.D. (2013). The anti-diabetic potential of phenolic compounds: A review. International Journal of Food Properties, 16(1), 91-103.

·       Angila, K.N. and Kavitha, N. (2012). Antidiabetic antihyperlipidemic and antioxidant activity of Oxalis corniculata in alloxan induced diabetic mice. Journal of natural sciences research, 2(7), 9-13

·       Barani, Y.H., Zhang, M. and Wang, B. (2021). Effect of thermal and ultrasonic pretreatment on enzyme inactivation, color, phenolics, and flavonoids contents of infrared freeze-dried rose flower. Journal of Food Measurement and Characterisation, 15(6), 995-1004.

·       Barmaverain, D., Hasler, S., Kalbermatten, C., Plath, M. and Kalbermatten, R. (2022). Oxidation during fresh plant processing: A race against time. Processes, 10(7), 1335-1342.

·       Burt, S.S. (2004). Essential oil: their antibacterial properties and potential application in food-a review. International Journal of Food Microbiology, 94(3), 223-253.

·       Das, P. and Himaja, M. (2015). Antioxidant, anti-arthritic, and hypoglycemic activity of oxalis corniculata linn. Leaf extracts. International Journal of PharmTech Research, 8(7), 51-57.

·       Durazzo, A., Lucarini, M. and Santini, A. (2021). Plants and Diabetes: Description, role, comprehension, and exploitation. International Journal of Molecular Sciences, 22(8), 3938-3943.

·       Dzah, C.S., Duan, Y., Zhang, H., Wen, C., Zhang, J., Chen, G. and Ma, H. (2020). The effect of ultrasound-assisted extraction on yield, antioxidant, anticancer and antimicrobial activity of polyphenol extracts: A review. Food Bioscience, 35 (12), 100547.

·       Falah Hosseini, H., Asgari, B., Asgarpanah, ZH., Babaizarch, A. and Eghbalizarch, T. (2013). Investigating the effect of polar and non-polar extracts of Aloe vera L. on the activity of alpha-amylase and alpha-glucosidase enzymes in vitro. Journal of Medicinal Plants, 48 (12), 160-169. [In Persian]

·       Farahmandfar, R. and Kordjazi, A. (2018). Antimicrobial effect of Cardin (Biarum bovei) extract against Escherichia coli and Staphylococcus aureus: Studies in vitro and hamburger. Journal of Food Science and Technology, 86 (16), 1-12. [In Persian]

·       Handali, S., Hosseini, H., Ameri, A. and Moghimipour, E. (2011). Formulation and evaluation of an antibacterial cream from Oxalis corniculata aqueous extract. Jundishapur Journal of Microbiology, 4(4), 255-260.

·       Hoang, A.L., Xuan, T.D., Dieu Thuy, N.T., Van Quan, N. and Trang, L.T. (2020). Antioxidant and α-amylase inhibitory activities and phytocompounds of Clausena indica fruits. Medicines, 7(10), 156-161.

·       Hosseini, H., Hendali, S., Parishani, MR., Ghezelbash, GR. and Ameri, A. (2009). Investigating the antibacterial effects of the aqueous extract of Oxalis conriculata and comparing its effect with common antibiotics in the treatment of infections caused by Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Journal of Medicinal Plants. 33 (9), 1-7. [In Persian]

·       Jalili Safaryan, M., Ahmadi Gavlighi, H., Barzegar, M., Tabarsa, M. and Udenigwe, Ch. (2022). Evaluation of inhibitory effect of alpha-amylase and alpha-glucosidase by interaction phenolic compounds, soluble fiber, and protein extracted from green lentils. Iranian Journal of Food Science and Technology. 19(1), 35-45. [In Persian]

·       Jyothi, K.S.N., Hemalatha, P. and Challa, S. (2011). Evaluation of α-amylase inhibitory potential of three medicinally important traditional wild food plants of India. International Journal of Green Pharmacy, 5 (2), 95-99.

·       Jyothi, K.S.N., Shailaja, M., Viveni, J. and Suresh, C. (2014). Identification of a proteinaceous alpha-amylase inhibitor from a medicinal herb Oxalis corniculata L. (Oxalidaceae). Journal of Homeopathy and Ayurvedic Medicine, 3 (4), 165-171.

·       Kashtoh, H. and Baek, K.H. (2023). New insights into the latest advancement in α-amylase inhibitors of plant origin with anti-diabetic effects. Plants, 12(3), 2944-2967.

·       Kazeem, M.I., Adamson, J.O. and Ogunwande, I.A. (2013). Modes of inhibition of α-Amylase and α-Glucosidase by aqueous extract of morinda lucida Benth leaf. BioMed Research International, 527570. 136(10), 137-143.

·       Kifle, D.Z., Debeb, G.S. and Belayneh, M.Y. (2021). In Vitro α-Amylase and α-Glucosidase inhibitory and antioxidant activity of the crude extract and solvent fractions of Hagenia abyssinica leaves. Biochemistry Research International, 6652777. 11(1), 241-312.

·       Kooti, W., Farokhipour, M., Asadzadeh, Z., Ashtary-Larky, D. and Asadi-Samani, M. (2016). The role of medicinal plants in the treatment of diabetes: a systematic review. Electronic Physician, 8(1), 1832-1842.

·       Li, P.H., Lin, Y.W., Lu, W.C., Hu, J.M. and Haung, D.W. (2016). In vitro hypoglycemic activity of the phenolic compounds in longan fruit (Dimocarpus Longan var. Fen ke) shell against α-glucosidase and ß-glucosidase. International Journal of Food Properties, 19(5), 1786-1797.

·       Nadeem, M., Mumtaz, M.W. and Danish, M. (2019). Ultrasonication-assisted extraction, antioxidant activity, and α-amylase inhibition potential of vitexnegundo leaves. Biology (Pakistan), 65 (2), 131-138.

·       Neri, L., Faieta, M., Di- Mattia, C., Sacchetti, G., Mastrocola, D. and Pittia, P. (2020). Antioxidant activity in frozen plant foods: effect of cryoprotectants, freezing process, and frozen storage. Foods, 9(12), 1886-1872.

·       Pelaez-Acero, A., Garrido-Islas, D.B., Campos-Montiel, F.G., Gonzalez-Montiel, L., Medina-Perez, G., Luna-Rodriguez, L., Gonzalez-Lemus, U. and Cenobio-Galindo, A.J. (2022). The application of ultrasound in honey: antioxidant activity, inhibitory effect on α-amylase and α-glucosidase, and in vitro digestibility assessment. Molecules, 27 (22), 5825.

·       Pirian, K., Moin, S., Sohrabipour, J., Rabiee, R. and Piri, K. (2016). Evaluation of antioxidant and α-amylase inhibitory activity of two species Sargassum angostifolium and Palisada perforate. Journal of Cell and Molecular Research, 31(2), 171-158[In Persian].

·       Proenca, C., Riberiro, D., Freitas, M. and Fernandes, E. (2022). Flavonoids as potential agents in the management of type 2 diabetes through the modulation of α-amylase and α-glucosidase activity: A review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 62(2), 3137-3207.

·       Raghavendra, MP., Satish, S. and Raveesha, KA. (2006). Phytochemical analysis and antibacterial activity of Oxalis corniculata; a known medicinal plant. Myscience, 1 (1), 72-78.

·       Salehi Sardoei, A. (2021). Introduction of Oxalis conriculata: Botany and Phytochemistry. Journal of Plant and Biotechnology, 15(4), 61-72. [In Persian]

·       Shahabi, N., Tajik, H., Moradi, M. and Forough, M. (2016). Antibacterial properties of Zataria multiflora Boiss. Essential oil nanoemulsion formed by emulsion phase inversion. Journal of Food Microbiology, 3(3), 45-56. [In Persian]

·       Sharangouda, K. and Patil, A.B. (2007). Anti-implantation and abortifacient activities of oxalis corniculata in albino rats. Nigerian Journal of Natural Products and Medicine, 11(2), 456-462.

·       Sreejith, G. (2014). Hepatoprotective activity of Oxalis corniculata L. Pthanolic extract against paracetamol induced hepatotoxicity in Wistar rats and its in vitro antioxidant effects. Journal of Natural Sciences Research, 4 (3), 104-111.

·       Srikanth, M., Swetha, T. and Veeresh, B. (2012). Phytochemical and pharmacology of Oxalis corniculata Linn: a review. International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 3(11), 4077-4083.

·       William, L.K., Li, C., Withers, S.G. and Brayer, G.D. (2012). Order and disorder: differential structural impacts myricetin and ethyl caffeate on human amylase, an antidiabetic target. Journal of Medicine and Chemistry, 55(13), 10177-10186.

·       Zhang, B., Deng, Z., Ramdath, D., Tang, Y., Chen, P. and Liu, P. (2015). Phenolic profiles of 20 Canadian lentil cultivar and their contribution to antioxidant activity and inhibitory effects on a-glucosidase and pancreatic lipase. Food Chemistry, 172(1), 862-872.

·       Zhang, L., Li, J., Hogan, S., Chung, H., Welbaum, G.E. and Zhou, k. (2010). Inhibitory effect of raspberries on starch digestive enzyme and their antioxidant properties and phenolic composition. Food Chemistry, 119(8), 592-599.

·       Zhang, L., Li, J., Hogan, S., Chung, H., Welbaum, GE. and Zhou, K. (2010). Inhibitory effect of raspberries on starch digestive enzyme and their antioxidant properties and phenolic composition. Food Chemistry, 119(2), 592-599.

 

1