بررسی میزان شیوع استافیلوکوکوس اورئوس حاوی انتروتوکسین¬های A و B در لبنیات سنتی، سالاد و ناگت¬های عرضه‌شده در شهرستان شهرکرد و مقاومت آنتی¬بیوتیکی جدایه¬ها

الموضوعات :

نجمه واحد دهکردی ¹ , ابراهیم رحیمی ² , نوشا ضیاء ³

1 - دانشجوی دکترای تخصصی بهداشت مواد غذایی، گروه بهداشت مواد غذایی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران
2 - استاد، گروه بهداشت مواد غذایی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران
3 - گروه میکروبیولوژی دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد، شهرکرد، ایران

تاريخ الإرسال : 03 السبت , صفر, 1445 تاريخ التأكيد : 17 الثلاثاء , شعبان, 1445 تاريخ الإصدار : 24 الثلاثاء , شعبان, 1445

الکلمات المفتاحية: استافیلوکوکوس اورئوس, انتروتوکسین, مقاومت آنتی¬بیوتیکی, مواد غذایی, شهرکرد,

ملخص المقالة :

استافیلوکوکوس اروئوس از باکتری¬های گرم مثبت مقاوم به خشکی و تولیدکننده انتروتوکسین بوده که رایج¬ترین عامل مسمومیت¬زا در مواد غذایی می¬باشد که مقاومت زیادی به آنتی¬بیوتیک¬ها داشته و به دنبال حضور ژن¬های انتروتوکسین¬زای آن، گاستروانتریت و استفراغ رخ می¬دهد. در همین راستا هدف از مطالعه حاضر بررسی میزان شیوع استافیلوکوکوس اورئوس حاوی انتروتوکسین A و B در لبنیات سنتی، سالاد و ناگت¬های عرضه‌شده در شهرستان شهرکرد و مقاومت آنتی¬بیوتیکی جدایه¬ها می¬باشد. در این مطالعه تعداد 300 نمونه غذایی در بهار 1402 از بازار شهرکرد به‌صورت تصادفی ساده نمونه¬گیری و در شرایط سترون جهت جلوگیری از آلودگی ثانویه به آزمایشگاه بهداشت مواد غذایی انتقال داده شد. نتایج نشان داد که 63 درصد از سالادها، 5 درصد ناگت¬ها و 43/28 درصد از لبنیات سنتی نمونه¬گیری شده به استافیلوکوکوس اورئوس آلوده بودند که از بین آن¬ها 1 نمونه ژن A در سالاد فصل (33/0 درصد) و 1 نمونه ژن B در سالاد عرضه‌شده در ساندویچی¬ها (33/0 درصد) وجود داشت. نتایج تست آنتی¬بیوگرام نشان داد که بیشترین مقاومت آنتی¬بیوتیک شامل آمپی¬سیلین (18/86 درصد) و جنتامایسین (8/88 درصد) و همچنین کمترین میزان مقاومت مربوط به امی¬پنم (6/38 درصد) و تتراسایکلین (2/39 درصد) بود. با توجه به عوارض بالای ناشی از مصرف بی¬رویه آنتی¬بیوتیک¬ها و همچنین عدم نظارت دقیق بر روی مواد غذایی عرضه‌شده در فست¬فود¬ها، لذا قوانین دقیق، منسجم و سخت‌گیرانه جهت بهبود وضعیت بهداشتی و همچنین کاهش سطح آلودگی به میکروارگانیسم‌های مسمومیت¬زا، بیش‌ازپیش لازم است.

نص كامل:



بهداشت مواد غذایی                                                                                                                                  دوره 13، شماره 4، پیاپی 52، زمستان 1402، صفحات: 12-1

 

 

«مقاله پژوهشی: 1416»                                         

 

بررسی میزان شیوع استافیلوکوکوس اورئوس حاوی انتروتوکسین­های A و B در لبنیات سنتی، سالاد و ناگت­های عرضه‌شده در شهرستان شهرکرد و مقاومت آنتی­بیوتیکی جدایه­ها

شیوع استافیلوکوکوس در مواد غذایی

 

نجمه واحددهکردی1، ابراهیم رحیمی2*، نوشا ضیا جهرمی3 

 

1- دانشجوی دکترای تخصصی بهداشت مواد غذایی، گروه بهداشت مواد غذایی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران

2- استاد، گروه بهداشت مواد غذایی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران

3- استادیار، گروه زیست شناسی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران

نویسنده مسئول: [e-mail]

(دریافت مقاله: 28/5/1402 پذیرش نهایی: 17/9/1402)

 

 

چکیده

استافیلوکوکوس اروئوس از باکتری­های گرم مثبت مقاوم به خشکی و تولیدکننده انتروتوکسین بوده که رایج­ترین عامل مسمومیت­زا در مواد غذایی می­باشد که مقاومت زیادی به آنتی­بیوتیک­ها داشته و به دنبال حضور ژن­های انتروتوکسین­زای آن، گاستروانتریت و استفراغ رخ می­دهد. در همین راستا هدف از مطالعه حاضر بررسی میزان شیوع استافیلوکوکوس اورئوس حاوی انتروتوکسین A و B در لبنیات سنتی، سالاد و ناگت­های عرضه‌شده در شهرستان شهرکرد و مقاومت آنتی­بیوتیکی جدایه­ها می­باشد. در این مطالعه تعداد 300 نمونه غذایی در بهار 1402 از بازار شهرکرد به‌صورت تصادفی ساده نمونه­گیری و در شرایط سترون جهت جلوگیری از آلودگی ثانویه به آزمایشگاه بهداشت مواد غذایی انتقال داده شد. نتایج نشان داد که 63 درصد از سالادها، 5 درصد ناگت­ها و 43/28 درصد از لبنیات سنتی نمونه­گیری شده به استافیلوکوکوس اورئوس آلوده بودند که از بین آن­ها 1 نمونه ژن A در سالاد فصل (33/0 درصد) و 1 نمونه ژن B در سالاد عرضه‌شده در ساندویچی­ها (33/0 درصد) وجود داشت. نتایج تست آنتی­بیوگرام نشان داد که بیشترین مقاومت آنتی­بیوتیک شامل آمپی­سیلین (18/86 درصد) و جنتامایسین (8/88 درصد) و همچنین کمترین میزان مقاومت مربوط به امی­پنم (6/38 درصد) و تتراسایکلین (2/39 درصد) بود. با توجه به عوارض بالای ناشی از مصرف  بی­رویه آنتی­بیوتیک­ها و همچنین عدم نظارت دقیق بر روی مواد غذایی عرضه‌شده در فست­فود­ها، لذا قوانین دقیق، منسجم و سخت‌گیرانه جهت بهبود وضعیت بهداشتی و همچنین کاهش سطح آلودگی به میکروارگانیسم‌های مسمومیت­زا، بیش‌ازپیش لازم است.

 

واژه­های کلیدی: استافیلوکوکوس اورئوس، انتروتوکسین، مقاومت آنتی­بیوتیکی، مواد غذایی، شهرکرد

 

 

مقدمه

بیماری و مرگ‌ومیر ناشی از بیماری­های غذازاد، یک تهدید دائمی برای سلامت عمومی و مانع مهمی برای توسعه اجتماعی و اقتصادی در سراسر جهان است. سازمان بهداشت جهانی بیماری‌های با منشأ مواد غذایی (Food borne disases) را­، بیماری با ماهیت عفونی یا سمی ناشی از مصرف غذا یا آب تعریف می‌کند (Cheung et al., 2021). تخمین زده می­شود که سالانه 76 میلیون بیماری، 325000 مورد بستری در بیمارستان و 5000 مرگ ناشی از بیماری­های منتقله از طریق غذا در ایالات متحده اتفاق می­افتد. در میان این موارد، 31 پاتوژن شناخته‌شده باعث 4/9 میلیون بیماری، 56000 بستری شدن در بیمارستان و 1300 مرگ می­شود (Guo et al., 2020). با این حال بیماری­های ناشی از غذا متعدد هستند و آن­ها شامل ویروس­ها و باکتری‌ها، انگل­ها، مواد شیمیایی، سموم و آلرژن­ها هستند که باعث ایجاد طیف گسترده­ای از بیماری­ها می­گردد. ایمنی مواد غذایی از بخش­های مهم سلامت هر جامعه­ای می­باشد که امروزه حاکمیت­ها، به خاطر افزایش مشکلات ناشی از آن و به‌منظور ارتقای سطح اطلاعات مصرف‌کنندگان در تلاش برای آگاهی بخشی آن­ها در این حوزه هستند. (Heidarzadi, 2021). استافیلوکوکوس اورئوس کواگولاز مثبت یکی از علل مهم بیماری­های با منشاء مواد غذایی است که سالانه باعث 241000 بیماری در ایالات متحده می‌شود. با این حال، بروز واقعی بیماری استافیلوکوکوس اورئوس می‌تواند بسیار بیشتر باشد زیرا بیماری پراکنده منتقله از غذا توسط استافیلوکوکوس اورئوس در ایالات متحده قابل گزارش نیست. استافیلوکوکوس اورئوس یک پاتوژن خطرناک است که می‌تواند باعث بسیاری از بیماری­های مختلف شود. اغلب باعث عفونت­های پوستی و عفونت­های مجاری تنفسی می­شود. عفونت­های پوستی معمولاً اکتسابی جامعه هستند (یعنی از فردی به فرد دیگر منتقل می­شوند)، درحالی‌که عفونت‌های ریه در بین عفونت­های بیمارستانی استافیلوکوکوس اورئوس غالب است. در بین پاتوژن­های بیمارستانی، استافیلوکوکوس اورئوس شایع­ترین بوده و با عوارض و مرگ‌ومیر بالا همراه است. این باکتری می­تواند در طیف وسیعی از دماها (7 تا 5/48 درجه سلسیوس؛ بهینه 30 تا 37 درجه سلسیوس)، pH (2/4 تا 3/9؛ بهینه 7 تا 5/7) و غلظت کلرید سدیم تا 15 درصد NaCl رشد کند، درنتیجه یک میکروارگانیسم مقاوم به خشکی با توانایی زنده ماندن در محیط­های بالقوه خشک و استرس­زا مانند بینی انسان و روی پوست و سطوح بی­جان مانند لباس و سطوح است. (Idrees et al., 2021)، 

استافیلوکوکوس اورئوس سموم متفاوتی را تولید می­کند. انتروتوکسین­های استافیلوکوکی یک خانواده از نه نوع اصلی سرولوژیکی انتروتوکسین­های پایدار در برابر حرارت (A، B، C، D، E، G، H، I، و J) هستند که به خانواده بزرگ سوپرآنتی ژن­های سمی تب­زا تعلق دارند. سموم پیروژنیک باعث فعالیت سوپرآنتی ژنی مانند سرکوب سیستم ایمنی و تکثیر سلول­های T غیراختصاصی می­شوند. انتروتوکسین­های تولیدشده توسط برخی از سویه­های استافیلوکوکوس اورئوس عوامل ایجادکننده بیماری هستند و انتروتوکسین A شایع­ترین سم دخیل در چنین بیماری­هایی است. انتروتوکسین A در برابر آنزیم‌های پروتئولیتیک بسیار مقاوم است و گزارش‌شده که انتروتوکسین‌های A، D وB  به ترتیب در 8/77، 5/37 و 10 درصد از اپیدمی‌های مربوط به مسمومیت­های ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس را به خود اختصاص داده است (Kadariya et al., 2014). 

سالاد سبزیجات سرشار از ویتامین­ها و مواد معدنی هستند و بدون هیچ‌گونه عملیات حرارتی، گاهی بدون شستن و پوست کندن مصرف می­شوند و به همین دلیل احتمال آلودگی به میکروارگانیسم­های پاتوژن در آن وجود دارد. مصرف ناگت­ها به‌عنوان غذاهای آماده (Ready to eat) که دارای محتوای پروتئینی می­باشند افزایش‌یافته و امروزه استفاده از غذاهای نیمه آماده و آماده به علت عدم وقت کافی جهت پخت غذا، در دسترس نبودن منابع غذایی و درنهایت گرایش مردم نسبت به غذاهای بازاری آماده و نیمه آماده را می­توان از دلایل استفاده از آن‌ها دانست (Madahi et al., 2015).

افزایش تعداد مسمومیت­های ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس نسبت به آنتی­بیوتیک­­های اگزاسیلین و متی­سیلین سبب برتری آنتی­بیوتیک­های گلیکولیپیدی، ماکرولیپدی و لینکوزامیدی شده است. مقاومت استافیلوکوکوس اورئوس به اریترومایسین معمولاً با مقاومت سایر ماکرولیدها همراه است. اریترومایسین یک ماکرولید است که به‌طور گسترده در مسمومیت­های استافیلوکوکی استفاده می­شود که مطابق پژوهش­های صورت گرفته، مشخص‌شده است که سوش­های استافیلوکوکوس اورئوس غذازاد دارای مقاومت بالا نسبت به اکثر آنتی‌بیوتیک‌ها هستند که قابل‌توجه است (Azizpour, 2022). با توجه به مقاومت استافیلوکوکوس اورئوس به آنتی­بیوتیک­ها و شیوع نسبتاً بالای این باکتری در مواد غذایی، هدف از مطالعه حاضر بررسی میزان شیوع استافیلوکوکوس اروئوس حاوی ژن­های A و B در لبنیات سنتی، سالاد و ناگت­های عرضه‌شده در شهرستان شهرکرد و مقاومت آنتی­بیوتیکی جدایه­ها می­باشد.

 

مواد و روش­ها

-نمونه­گیری

در گام نخست، تعداد 300 نمونه مواد غذایی ازجمله 100 نمونه سالاد، شامل 50 نمونه سالاد فصل (ترکیبی از خیار، کاهو، کلم، فلفل دلمه­ای، هویج و گوجه)، و 50 نمونه سالاد عرضه‌شده در ساندویچی­ها (ترکیبی از خیار، کاهو و گوجه)، 100 نمونه لبنیات سنتی، شامل 20 نمونه خامه، 30 نمونه کره، 30 نمونه شیر خام و 20 نمونه ماست  و 100 نمونه ناگت (RTE) شامل 50 نمونه ناگت مرغ 50 گرمی (با 70 درصد گوشت مرغ) و 50 نمونه ناگت گوشت 50 گرمی (با 70 درصد گوشت) که به‌صورت باز در یخچال نگهداری می­شدند را از مراکز عرضه این محصولات در شهرستان شهرکرد به‌صورت تصادفی جداسازی و به آزمایشگاه بهداشت و کنترل کیفی مواد غذایی دانشگاه آزاد اسلامی شهرکرد انتقال داده شد.

-جداسازی استافیلوکوکوس اورئوس

براي جداسـازي اسـتافيلوكوكوس اورئـوس 5 گرم از نمونه­های مورد آزمایش بـه درون ظرف توزين استريل منتقل و سپس ميزان 45 میلی­لیتر محلول رينگر به‌عنوان حلال به آن افزوده شد تا رقت 1-­10 به دست آيد. پس از حل كـردن، مخلوط کردن و یکدست شدن و ايجـاد يك محلول همگن، ميزان 5/0میلی­لیتر از آن به‌وسیله سمپلر روي محيط برد پاركر آگـار  (Bird-Parker Agar) (Miemedia, Iran) به روش كشت سـطحي كشت داده شد. پليت­هاي كشت داده‌شده بـه مـدت 24 ساعت در دماي 37 درجه سلسیوس گرم­خانه­گذاری شدند. بعـد از پايـــان انكوباســـيون در صـــورت رشـــد، باكتري­هاي با كلني­هاي گرد و سياه رنگ، جهت انجـام كشت تأييدي، از كلوني­هاي مشـكوك به‌وسیله لـوپ استريل روي محيط مـانيتول سـالت آگـار(-نام شرکت سازنده درج شود؟Manitol Salt Agar) كشت داده و محیط­ها مجدداً به مدت 24 ساعت در انكوباتور در دمای 37 درجه سلسیوس قرارگرفته و بعـد از گذشـت 2ساعت بر روي كلني­هاي مانيتول مثبـت (كلـوني­هـاي زردرنگ داراي هاله زردرنگ) تست DNase جهت تأييد اســتافيلوكوكوس اروئــوس انجــام گرفت. هــمچنــين باكتري­هاي موردنظر با تست كواگولاز ارزيـابي و نتیجه اين تست در مورد استافيلوكوكوس اورئوس مشخص شدند (Pishadast et al., 2021).

-آزمایش کوآگولاز مثبت

از محیط برد پارکر، با استفاده از یـک حلقـه کشـت، چنـد پرگنه انتخاب‌شده را برداشته و به لولـه حـاوي محـیط کشـت آبگوشت مغز و قلب انتقـال داده شـد و در گرمخانه 37 درجه سلسیوس قرار گرفت. بعد از 24 سـاعت، 5/0 میلی­لیتر از این کشت مایع استافیلوکوکی در لوله‌آزمایش ریخته شد و 5/0 میلی­لیتر از پلاسـماي سـیتراته خرگـوش کـه چهار بار رقیق‌شده، به آن اضافه گردید و کاملاً باهم مخلـوط و به هم زده شد. در لوله دیگر، به‌عنوان شاهد منفی بـراي هر سري 5/0 میلی­لیتر پلاسمای سـیتراته، بـه 5/0 میلی­لیتر آبگوشت غذایی فاقد باکتري اضافه گردید. لوله­هـا در گرمخانـه 37 درجه سلسیوس قرارگرفته و در فواصــل معــین تــا 6 ســاعت ازنظر تشکیل لخته موردبررسی قرار گرفتند. در هر لوله که پلاسما منعقدشده و واکـنش مثبـت بـود به‌عنوان کواگـولاز مثبـت گزارش شد (Salehi et al., 2014).

-انجام تست PCR

برای استخراج­DNA، باکتری­های رشد کرده در طول یک‌شب در محیط آب پپتونه که در دمای 37 درجه سلسیوس گرم­خانه گذاری شده بودند، به‌وسیله‌ی کیت استخراج DNA شرکت سیناژن ایران و با توجه به دستورالعمل شرکت سازنده استخراج و تا زمان انجام PCR در فريزر منفی20 درجه سلسیوس نگه‌داری شدند. سپس برای انجام واکنش PCR از جفت پرایمرهای طراحی­شده بر اساس ردیف نوکلئوتیدی ژن 16s rRNA باکتری استافیلوکوکوس اورئوس، استفاده شد.

برای انجام آزمايش PCR برای تشخیص ژن16s rRNA ، از دستگاه Master cycler gradient (Mastersycler, Germany) استفاده شد. حجم کلی واکنش­PCR، 30 میکرولیتر و شامل 90 نانوگرم پرایمر، 2/0 میلی مول ­dNTP، 10 میلی مول تریس ­HCl، 5/1 میلی­مول MgCl 2، 50 میلی­مول KCl و 1 واحد آنزیمTaq DNA Polymerase  بود.  برنامه­ی حرارتي مورداستفاده شامل: یک سیکل 95 درجه سلسیوس 3 دقيقه، 35 سیکل دمایی به ترتیب 94 درجه سلسیوس 1 دقیقه، 53 درجه سلسیوس 1 دقیقه، 72 درجه سلسیوس 1 دقیقه و درنهایت یک سیکل 72 درجه سلسیوس 8 دقیقه بود. سپس تمام نمونه­هایی که ازنظر حضور ژن 16s rRNA مثبت بودند، با استفاده از روش واکنش زنجیره­ای پلی مراز چندتایی (­PCR Multiplex) برای ردیابی توکسین­های باکتری استافیلوکوکوس اورئوس ارزیابی شدند.

واکنش PCR چندتایی جهت ردیابی ژن­ها در حجم نهایی 50 میکرولیتر شامل 5  میکرولیتر بافر­X10 buffer PCR، 5/1 میلی مول MgCl2، 200 میکرومول­dNTP، 1 میکرومول از زوج پرایمرهای F و R، 5 میکرولیتر از هر نمونه DNA و 25/1 واحد آنزیم ­Polymerase Taq DNA، انجام شد. برنامه­ی حرارتي مورداستفاده شامل: یک سیکل 95 درجه سلسیوس 2 دقيقه، 35 سیکل دمایی به ترتیب 95 درجه سلسیوس 1 دقیقه، 60 درجه سلسیوس 1 دقیقه، 72 درجه سلسیوس 1 دقیقه و20 ثانیه و نهایتاً یک سیکل 72 درجه سلسیوس 10 دقیقه بود. به‌منظور ردیابی ژن­های موردمطالعه باکتری حجم نهايي واكنش 25­،MgCl2  میکرولیتر بود که شامل: 20 نانوگرم DNA الگو، 2 ميلي مول 25 پيکومول از هر پرايمر، 1 واحد آنزيم Taq DNA Polymerase و200 ميکرومولdNTP  بود. برنامه­ی حرارتي مورداستفاده شامل: یک سیکل 95 درجه سلسیوس 5 دقيقه، سپس 35 سیکل دمایی به ترتيب 94 درجه سلسیوس 1 دقيقه، 50 درجه سلسیوس 1 دقیقه، 72 درجه سلسیوس 1 دقيقه و يک سیکل نهایی 72 درجه سلسیوس 5 دقيقه بود. تأييد وجود قطعه­ی تكثير يافته از ژل آگارز 1 درصد استفاده می‌شود. براي اين منظور 1 گرم از پودر آگارز در 100 میلی‌لیتر بافر TBE حل و بعد از ذوب شدن مقدار 2 ميكروليتر اتيديوم برومايد به آن اضافه و در سيني مخصوص الکتروفورز ريخته شد. سپس 15 ميكروليتر از محصول PCR همراه با 1 میکرولیتر لودینگ بافر مخلوط و روي ژل 1 درصد آگارز در حضور ماركر 100 جفت بازي DNAFermentas  در ولتاژ ثابت 90 ولت الكتروفروز شد (de Andrade et al., 2019).

 

 

جدول (1)- توالی پرایمرهای مورداستفاده برای شناسایی ­ژن­های هدف در استافیلوکوکوس اورئوس در واکنش PCR 

منبع	اندازه محصول	توالی پرایمر	ژن هدف
(Tavakoli-Far et al., 2020)	791	CCTATAAGACTGGGATAACTTCGGG CTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCG	16srRNA
(de Andrade et al., 2019)	544	TTGGAAACGGTTAAAACGA GAACCTTCCCATCAAAAACA	A
	416	TCGCATCAAACTGACAAACG GCAGGTACTCTATAAGTGCC	B

 

 

-سنجش مقاومت آنتی­بیوتیکی

تست­آنتی­بیوگرام به روش­diffusion_Disk  انجام گرفت. بعد از تهیه سوسپانسیون میکروبی مطابق با محلول استاندارد 5/0 مک­فارلند، در محیط کشت مولر هینتون آگار کشت داده شد و پس‌ازآن دیسک­های آنتی‌بیوگرام، شامل آمپی­سیلین (AM)، پنی­سیلین (PEN)، جنتامایسین (GM)، سولفامتاکساوزل ­(SXT)، آموکسی‌کلاو(AMC)، تتراسیکلین (TE)، اریترومایسین (ER)، کانامایسین (KM)، سفوتاکسیم (CX)، امی­پنم (IM)، کارباپنم (CP)، کوتریموکسازول (CMZ) و ریفامپین (RP) روی محیط کشت قرار داده شد. پس از 24 ساعت انکوباسیون، با تعیین قطر هاله­های عدم رشد، میزان مقاومت جدایه­ها به آنتی­بیوتیک­ها مشخص گردید (Heidarzadi et al., 2021).

-آنالیز آماری

در مطالعه حاضر برای بررسی داده‌ها، از نرم‌افزار آماری SPSS نسخه 23 استفاده شد. برای مقایسه میزان آلودگی نمونه­های مورد مطالعه به استافیلوکوکوس اورئوس از آزمون آماری مربع کای (خی دو) در سطح معنی‌داری (p<0/05) استفاده شد. 

 

یافته­ها

مطابق نتایج جدول (1)- از مجموع 300 نمونه مواد غذایی ازجمله 100 نمونه سالاد، شامل سالاد فصل و سالاد عرضه‌شده در ساندویچی­ها، 23 نمونه سالاد فصل (­46 درصد) و 40 نمونه سالاد عرضه‌شده در ساندویچی­ها (80 درصد)، از 100 نمونه لبنیات سنتی، 7 نمونه خامه (35 درصد)، 9 نمونه کره (30 درصد)، 11 نمونه شیر خام (6/36 درصد)، 2 نمونه ماست ( 10 درصد) و از 100 نمونه ناگت (RTE)، 4 نمونه ناگت مرغ (8 درصد) و 1 نمونه ناگت گوشت (2 درصد) به استافیلوکوکوس اورئوس آلوده بودند. نتایج نشان داد که آلودگی بین نمونه­های سالاد، تفاوت معنی­داری وجود دارد (p<0.01)؛ اما تفاوت معنی­داری بین نمونه­های لبنیات سنتی و ناگت­ها وجود ندارد. همچنین نتایج نشان داد که از بین 300 نمونه غذایی، 2 نمونه (66/0 درصد) آلوده به جدایه­های دارای ژن­های A (33/0 درصد) و ژن B (33/0 درصد) بود. 

 

 

جدول (1)- مقایسه آلودگی سالاد فصل و سالاد عرضه شده در ساندویچی­ها، لبنیات سنتی و ناگت گوشت و مرغ به استافیلوکوکوس اورئوس

مواد غذایی	آلوده تعداد (%)		غیر آلوده تعداد (%)	Aژن تعداد (%)	Bژن تعداد (%)
سالاد فصل	23 (46)		27 (54)	1 (33/0)	-
سالاد عرضه شده در ساندویچی­ها	40 (80)		10 (20)	-	1 (33/0)
سطح معنی‌داری	001/0			001/0
ناگت مرغ	4 (8)	46 (92)		-	-
ناگت گوشت	1 (2)	49 (98)		-	-
سطح معنی‌داری	169/0
کره	9 (30)	21 (70)		-	-
شیر	11 (6/36)	19 (4/63)		-	-
خامه	7 (35)	13 (65)		-	-
ماست	2 (10)	18 (90)		-	-
سطح معنی‌داری	087/0

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل (1)- ژل حاصل از الکتروفورز محصول PCR مربوط به ردیابی انتروتوکسین­های A (قطعه 544 جفت بازی) و B (قطعه 416 جفت بازی) در ایزوله­های استافیلوکوکوس اورئوس (ستون M= مارکر 100 جفت بازی DNA، ستون‌های 1 و 2= ایزوله­های مورد مطالعه)

 

 

طبق نتایج به‌دست‌آمده از جدول (2)- مشخص شد که بیشترین میزان مقاومت مربوط به جنتامایسین (8/88 درصد)، آمپی­سیلین (18/86 درصد) و کمترین مقاومت مربوط به امی­پنم (6/38 درصد) و تتراسایکلین (2/39 درصد) می­باشد.

 

 

جدول (2). میزان مقاومت استافیلوکوکوس اورئوس به آنتی­بیوتیک­های مختلف

شماره	نام آنتی­بیوتیک	درصد سویه­های مقاوم
1	آمپی­سیلین (AM)	18/86 درصد
2	پنی­سیلین (PEN)	4/71 درصد
3	جنتامایسین (GM)	8/88 درصد
4	سولفامتاکساوزل ­(SXT)	8/70 درصد
5	آموکسی­کلاو(AMC)	16/74 درصد
6	تتراسیکلین (TE)	2/39 درصد
7	اریترومایسین (ER)	6/60 درصد
8	کانامایسین (KM)	49/81 درصد
9	سفوتاکسیم (CX)	33/83 درصد
10	امی­پنم (IM)	6/38 درصد
11	کارباپنم (CP)	4/76 درصد
12	کوتریموکسازول (CMZ)	3/57 درصد
13	ریفامپین (RP)	7/41 درصد

 

 

بحث و نتیجه­گیری

در مطالعه حاضر میزان آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس در سالادهای عرضه شده در ساندویچی­ها 80 درصد و سالادهای رستورانی 46 درصد و درمجموع سالادهای مورد مطالعه 63 درصد بود (جدول 1).

مطالعه­­­ای بر روی آلودگی سالادهای عرضه شده در رستوران­های نظامی ترکیه نشان داد که از بین 512 نمونه، 48 نمونه (4/9 درصد) دارای استافیلوکوکوس اورئوس کواگولاز مثبت بودند (Aycicek et al., 2005)­، که پایین‌تر از نتایج به‌دست‌آمده از تحقیق حاضر است. در تحقیقی بر روی آلودگی سالادهای عرضه شده در پاکستان گزارش‌شده که از مجموع 100 نمونه آزمایش‌شده، 54 نمونه آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس بودند. از 54 ایزوله استافیلوکوکوس اورئوس، 32 (59 درصد) استافیلوکوکوس اورئوس کواگولاز مثبت بودند. با این حال، 22 (40 درصد) کواگولاز منفی بود (Saifullah et al., 2018)، که تا حدودی با نتایج تحقیق حاضر مطابقت دارد. در مطالعه دیگری گزارش‌شده که از 345 نمونه سالاد سبزیجات، 40 نمونه (6/11درصد) آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس بودند (Seo et al., 2010)، که با نتایج حاصل از تحقیق حاضر تفاوت دارد.

در تحقیقی که بر روی آلودگی سالادهای خیابانی عرضه شده در هندوستان انجام گرفت، مشخص شد که از 150 نمونه، 90 (60 درصد) نمونه آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس بودند (Ghosh et al., 2007)، که بامطالعه حاضر همسو می­باشد. از مهم­ترین دلایل آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس عدم شستشوی مناسب مواد تشکیل‌دهنده سالاد، عدم رعایت بهداشت شخصی و در معرض گردوخاک قرار دادن آن­ها است. مطالعه­ای بر روی ارزیابی مقاومت به متی­سیلین در جدایه­های استافیلوکوکوس اورئوس در سبزیجات انجام گرفت که مشخص شد 45 مورد از 350 (85/12درصد) نمونه­ سبزی و سالاد برای استافیلوکوکوس اورئوس مثبت بود (Tavakoli-Far et al., 2020)، که میزان آلودگی از مطالعه حاضر کمتر است.

در مطالعه حاضر میزان آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس در کره 30 درصد، در شیر خام 6/6 درصد ، در خامه 25 درصد و در ماست 2 درصد و درمجموع لبنیات­ سنتی مورد مطالعه 9/27 درصد آلوده بودند (جدول 1).

در تحقیقی بر روی 255 نمونه از لبنیات سنتی عرضه شده در اتیوپی گزارش‌شده كه به استافیلوکوکوس اورئوس دریافتند که از  مجموع 255 نمونه محصولات لبنی 43 (6/24 درصد) نمونه شیر، 7 (5/17 درصد) نمونه ماست و 2 (5 درصد) نمونه پنیر به استافیلوکوکوس اورئوس آلوده بودند. همچنین نتايج اين تحقيق نشان داده که 49 نمونه (2/94 درصد) از جدایه­ها به آمپی­سیلین و 42 نمونه (8/80 درصد) به آموکسی سیلین مقاوم بودند. 20 نمونه (5/38 درصد) از جدایه­ها نیز به سفوکسیتین مقاوم بودند (Lemma et al., 2021)، که تا حدودی بامطالعه حاضر همسو است، در این تحقیق میزان آلودگی در لبنیات سنتی43/28 درصد، و بیشترین مقاومت مربوط به آمپی­سیلین و جنتامایسین بود.

نتایج مطالعه­ای که بر روی آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس در لبنیات سنتی عرضه شده انجام گرفت نشان داد که از مجموع 130 نمونه، 56 نمونه (43 درصد) به استافیلوکوکوس اورئوس آلوده هستند. همچنین آن­ها دریافتند که جدایه ها بیشترین مقاومت به اریترومایسین و پنی­سیلین داشتند (Výrostková et al., 2021)، که با نتایج تحقیق حاضر در خصوص درصد آلودگي مطابقت ندارد؛ چراکه در مطالعه حاضر میزان آلودگی به لبنیات سنتی43/28 درصد بود. در این مطالعه میزان مقاومت به پنی­سیلین و اریترومایسین به ترتیب 4/71 و 6/60 بود که با نتايج تحقيق حاضر مطابقت دارد. در تحقیقی که بر روی 330 نمونه شیر خام و محصولات لبنی فرآوری شده سنتی برای جداسازی اشريشیا کولای و استافیلوکوکوس اورئوس انجام گرفت گزارش شد که از مجموع نمونه‌ها، 125 نمونه (88/37 درصد) و 179 نمونه (54/24 درصد) به ترتیب به اشريشیا کولای و استافیلوکوکوس اورئوس آلوده بودند (Teresa Debela et al., 2019) که با نتایج حاصل از تحقیق حاضر در خصوص استافیلوکوکوس اورئوس مطابقت دارد. مطالعه­ای در سقز بر روی آلودگی شیر خام نشان داد که از تعداد 100 نمونه، 51 نمونه به استافیلوکوکوس اورئوس آلوده بودند که بالاتر از نتایج به‌دست‌آمده از تحقیق حاضر (43/28) است. از مجموع 51 جدایه، 19 جدایه (25/37 درصد) به 1 آنتی‌بیوتیک، 19 جدایه (25/37 درصد) به 2 آنتی‌بیوتیک، 3 جدایه (88/5 درصد) به 3 آنتی‌بیوتیک، 5 جدایه (80/9 درصد) به 4 آنتی‌بیوتیک، 3 جدایه (88/5درصد) به 5 آنتی‌بیوتیک، 1 جدایه (98/1 درصد) به 6 آنتی‌بیوتیک و 1 جدایه (98/1 درصد) به 8 آنتی‌بیوتیک به‌طور هم‌زمان مقاومت نشان دادند (Farajpour et al., 2015)، که در مطالعه حاضر از مجموع 13 آنتی­­بیوتیک، جدایه ها به 10 آنتی‌بیوتیک بیشتر از 50 درصد مقاومت نشان دادند.

در پژوهش حاضر میزان آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس در ناگت­های گوشت 8 درصد و ناگت­های مرغ 2 درصد بود و درمجموع 5 درصد ناگت­های نمونه­گیری شده آلوده بودند (جدول 1). مطالعه­ای که در کشور غنا بر روی آلودگی غذاهای آماده به استافیلوکوکوس اورئوس انجام شد نشان داد 100 درصد  36 نمونه از غذاهای آماده آلوده بودند. همچنین بیشترین میزان مقاومت به اریترومایسین، آمپی‌سیلین، کوتریماکسازول و پنی­سیلین مشاهده شد (Ayamah et al., 2021) که با نتایج حاصل از این تحقیق در خصوص درصد آلودگی به استافیلوکوکوس همخوانی ندارد . در پژوهش حاضر آلودگی در 5 درصد نمونه­ها وجود داشت؛ اما مقاومت بالای جدایه‌های استافیلوکوکوس اورئوس به آمپی­سیلین، جنتامایسین، اریترومایسین و پنی­سیلین در مطالعه حاضر نیز مشاهده شد. در تحقیقی که بر روی آلودگی غذاهای آماده به استافیلوکوکوس اورئوس انجام شد، دریافتند که از تعداد 255 نمونه گوشت، 4/9 درصد به استافیلوکوکوس اورئوس آلوده بودند و در بین جدایه­ها بیشترین میزان مقاومت نسبت به سفوکسیستین بود (Okoli et al., 2018)، که با نتایج تحقیق حاضر تا حدودی مطابقت دارد. در تحقیقی بر روی غذاهای منجمد شهرستان­های اهواز و سنندج گزارش شد که از تعداد 250 نمونه 18 درصد آن­ها به استافیلوکوکوس اورئوس آلوده بودند (Kalantar et al., 2012)، که با این تحقیق مطابقتی ندارد. در مطالعه­ای که بر روی آلودگی مواد غذایی به استافیلوکوکوس اورئوس انجام گرفت، نشان داده شد از مجموع 30 ناگت، 19 نمونه معادل 3/63 درصد به استافیلوکوکوس اورئوس آلوده بودند (Shylaja et al., 2018)، که با این مطالعه مطابقتی ندارد. در گزارشی نشان داده شد که از مجموع 30 نمونه ناگت تهیه‌شده به‌صورت تصادفی، 30 درصد آن­ها آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس بودند (Ibrahim et al., 2018) درحالی‌که در این مطالعه 5 درصد ناگت‌ها به استافیلوکوکوس اورئوس آلوده بودند.

در تحقیقی برای جداسازی ژن­های آنتروتوكسين هاي  استافیلوکوکوس اورئوس از ناگت­ها عرضه شده در اصفهان و چهارمحال و بختیاری مشخص شد از مجموع 420 نمونه اخذشده 27 نمونه (42/6 درصد) آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس بودند. درمجموع 33/33 درصد از جدایه­ها قادر به تولید آنتروتوکسین A، 16/4 درصد از جدایه­ها قادر به تولید آنتروتوکسین B، 50/12 درصد از جدایه­ها قادر به تولید  آنتروتوکسین C، 33/8 درصد از جدایه­ها قادر به تولید آنتروتوکسین D، 50/12 درصد از جدایه­ها قادر به تولید آنتروتوکسین A + C و 50/12درصد از جدایه­ها قادر به تولید آنتروتوکسین A + D بودند. شایع­ترین ژن­ شناسایی‌شده ژن آنتروتوكسين  A(25 درصد) بود (Madahi et al., 2015)، که ازلحاظ فراوانی استافیلوکوکوس اورئوس تا حدودی بامطالعه حاضر مطابقت دارد. اما در مطالعه حاضر ژن آنتروتوكسين A و  Bهرکدام در 33/0 درصد جدایه­ها مشاهده شدند. در تحقیقی بر روی آلودگی شیر به استافیلوکوکوس اورئوس در منطقه 3 تهران نشان داده شد که از 30 نمونه شیر خام خریداری‌شده به‌طور تصادفی، هیچ­کدام از نمونه­ها به استافیلوکوکوس اورئوس  حاوي ژن A و B آلوده نبودند (Golafrouz et al., 2020). 

در تحقیق حاضر نشان داده شد که آلودگی استافیلوکوکوس اورئوس شیوع بالایی را داشته و همچنین مقاومت آنتی­بیوتیکی جدایه­ها به‌صورت قابل‌ملاحظه‌ای بالا می­باشد. ازآنجایی‌که غشای سلولی در استافیلوکوکوس اورئوس فسفولیپیدی است که به‌عنوان یک مانع نفوذپذیر انتخابی عمل می­کند و سلول باکتری را از ورود موادی مانند آنتی­بیوتیک­ها محافظت می­کند که این خود مقاومت باکتری را در برابر عوامل نامساعد محافظت می­کند. انتروتوکسین­های استافیلوکوکوس اورئوس به حرارت مقاومت بالایی دارند، بنابراین لبنیات سنتی، ناگت و سالادهای عرضه شده در رستوران­ها و فست­فودی­ها آلوده به این توکسین­ها می­تواند تهدیدی برای سلامت مصرف­کننده باشد. وجود استافیلوکوکوس اورئوس با عوامل ژنتیکی تولید انتروتوکسین باید به‌عنوان یک عامل خطر بالقوه برای ایمنی مواد غذایی در نظر گرفته شود. بنابراین باید با رعایت اصول بهداشتی در دامداری­ها، مراکز عرضه لبنیات سنتی، مواد غذایی آماده  و همچنین مراکز عرضه مواد غذایی خیابانی جهت پیشگیری از وقوع رخداد آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس و همچنین درمان محتاطانه این عارضه با آنتی­بیوتیک­ها نهایت دقت را به عمل آورد.

 

سپاسگزاری

بدین‌وسیله از كليـــه همكـــاران گروه بهداشت مواد غذایی دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد که نهايت همكاري را در انجام ايـن پـروژه را داشتند تشكر به عمل مي­آید.

 

تعارض منافع

نویسندگان تعارض منافعی برای اعلام ندارند.

 

منابع

·       Ayamah, A., Sylverken, A.A., Ofori, L.A. (2021). Microbial load and antibiotic resistance of escherichia coli and staphylococcus aureus isolated from ready-to-eat (RTE) khebab sold on a university campus and Its environs in ghana. Journal of Food Quality, (6)2: 1-9.

·       Aycicek, H., Cakiroglu, S., Stevenson, T.H. (2005). Incidence of Staphylococcus aureus in ready-to-eat meals from military cafeterias in Ankara, Turkey. Food Control, (4)16: 531-534.

·       Azizpour, A. (2022). A survey of prevalence and antibiotic resistance pattern of Staphylococcus aureus strains isolated from eggs in Ardabil area, Iran. Journal of Comparative Pathobiology, (16)19: 3831-3840.

·       Cheung, G.Y., Bae, J.S., Otto, M., (2021). Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence, (12)1: 547-569.

·       de Andrade, A.P.C., de Figueiredo, E.A.T., de Fatima Borges, M., Arcuri, E.F. (2019). Diversity of staphylococcus coagulase-positive and negative strains of coalho cheese and detection of enterotoxin encoding genes. Boletim do Centro de Pesquisa de Processamento de Alimentos (36)1: 1032-1041.

·       Farajpour, M.T., Sadeghi zali, M.H., Ghiamirad, M., (2015). Prevalence and antibiotic susceptibility of Staphylococcus aureus in raw milks of Saqez. Journal of Food Hygiene, (5)3: 39-48.

·       Ghosh, M., Wahi, S., Kumar, M., Ganguli, A., (2007). Prevalence of enterotoxigenic Staphylococcus aureus and Shigella spp. in some raw street vended Indian foods. International Journal of Environmental Health Research, (17)2: 151-156.

·       Golafrouz, H., Ahari, H., Anvar, S.A., Shahbazzadeh, D., (2020). Detection of Staphylococcus aureus Enterotoxin A (SEA) Using dot-elisa in milk samples. Journal of Medical Microbiology and Infectious Diseases (8)4: 132-136.

·       Guo, Y., Song, G., Sun, M., Wang, J., Wang, Y., (2020). Prevalence and therapies of antibiotic-resistance in staphylococcus aureus. Frontiers In Cellular and Infection Microbiology (10)1:101-107.

·       Heidarzadi, M. A., (2021). A systematic review on the contamination of traditional Iranian fruit juices with Escherichia coli. New Findings In Veterinary Microbiology (4)1: 83-93. [In persian]

·       Heidarzadi, M., Rahnama, M., Alipoureskandani, M., Saadati, D., Afsharimoghadam, A., (2021). Salmonella and Escherichia coli contamination in samosas presented in Sistan and Baluchestan province and antibiotic resistance of isolates. Journal of Food Hygiene (11)2, 81-90. [In persian]

·       Ibrahim, H., Hassan, M., Amin, R., Shawky, N., Elkoly, R., (2018). The bacteriological quality of some chicken meat products. Benha Veterinary Medical Journal (35)2: 50-57.

·       Idrees, M., Sawant, S., Karodia, N., Rahman, A., (2021). Staphylococcus aureus biofilm: morphology, genetics, pathogenesis and treatment strategies. International Journal of Environmental Research and Public Health (18)3: 76-82.

·       Kadariya, J., Smith, T.C., Thapaliya, D., (2014). Staphylococcus aureus and staphylococcal food-borne disease: an ongoing challenge in public health. BioMed Research International (20)14: 1-9.

·       Kalantar, E., Amin, M., Bahmani, N., Tamimi, M., Hashemzadeh, M., Narenji, H., (2012). Antibiotic resistance pattern in bacterial isolates obtained from frozen food samples of animal origin in Sanandaj and Ahvaz. African Journal of Bacteriology Research (4)2: 38-41.

·       Lemma, F., Alemayehu, H., Stringer, A., Eguale, T., (2021). Prevalence and antimicrobial susceptibility profile of Staphylococcus aureus in milk and traditionally processed dairy products in Addis Ababa, Ethiopia. BioMed Research International (20)21: 20-35.

·       Madahi, H., Rahimi, E., Jalali, M., (2015). Detection of enterotoxin genes of staphylococcus aureus isolates from chicken nugget in Esfahan province by PCR technique. Biological Journal of Microorganism (4)1: 25-34.

·       Okoli, C.E., Njoga, E.O., Enem, S.I., Godwin, E.E., Nwanta, J.A., Chah, K.F., (2018). Prevalence, toxigenic potential and antimicrobial susceptibility profile of Staphylococcus isolated from ready-to-eat meats. Veterinary World (11)5: 12-18.

·       Pishadast, S., Rahnama, M., Alipour Eskandani, M., Saadati, D., Noori Jangi, A., Heidarzadi, M., (2021). Study of antimicrobial effect of nisin and alcoholic extract of garlic on the activity of staphylococcus aureus ATCC 1113 in Tilapia minced meat during storage at 4° C. Journal of Food Hygiene (11)3: 37-47. [In persian]

·       Saifullah, S., Abbas, F., Samad, A., Rizwan, M., Bugti, F.S., Saima, R., et al. (2018). 31. Staphylococcus aureus prevalence in the fresh salad and vegetables of the Quetta city. Pure and Applied Biology (PAB) (7)11: 255-262.

·       Salehi, A., Dehghanifard, E., Alimohammadi, M., (2014). Evaluation of Coagulase-Positive Staphylococcus aureus Contamination in Lighvan Cheese on Retail Stores. Journal of Environmental Health Enginering (4)1: 130-136.

·       Seo, Y.-H., Jang, J.-H., Moon, K.-D., (2010). Occurrence and characterization of enterotoxigenic Staphylococcus aureus isolated from minimally processed vegetables and sprouts in Korea. Food Science and Biotechnology (19)5: 313-319.

·       Shylaja, M., Goud, S.S.S., Samatha, K., Pradeep, C., (2018). Studies on the incidence of staphylococcus aureus and its enterotoxins in different meat and meat products. The Pharma Journal (7)11: 669-673.

·       Tavakoli-Far, B., Mousavi, B., Mashak, Z., Rezaei, M.A., Doregiraee, F., Kachoie, M.A., et al. (2020). Molecular Typing and Phenotypic and Genotypic Evaluation of Antibiotic Resistance and Virulence Factors of the Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus Bacteria Isolated From Vegetable and Salad Samples. Researcher Square (2)1: 1-19.

·       Teresa Debela, T., Hiko, A., Sibhat, B. (2019). Assessment of hygienic practice in dairy farm and isolation of escherichia coli and staphylococcus aureus in milk and dairy product in selected towns of central ethiopia. Food Control (3)2: 78-90. 

·       Výrostková, J., Regecová, I., Zigo, F., Semjon, B., Gregová, G.. (2021). Antimicrobial resistance of staphylococcus spp. isolated from cheeses. Animals (12)4: 25-36.

 

11