میزان شیوع و مقاومت آنتی‌بیوتیکی اشریشیا کلی O157:H7 در شیر خام گوسفند در مناطق مختلف استان خوزستان در سال 1401
محورهای موضوعی : بهداشت مواد غذایی
شکوفه ملک نژاد اهرمی
1
,
علی فضل ارا
2
,
مهدی زارعی
3
1 - دانش‌آموخته کارشناسی ارشد بهداشت و کنترل کیفی مواد غذایی، گروه بهداشت مواد غذایی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران
2 - استاد گروه بهداشت مواد غذایی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران
3 - استاد گروه بهداشت مواد غذایی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران
کلید واژه: اشریشیا کلی O157:H7, واکنش زنجیره پلی مراز, مقاومت آنتی‌بیوتیکی, شیر خام گوسفند,
چکیده مقاله :
اشریشیا کلی O157:H7، یکی از مهم‌ترین پاتوژن‌های منتقله از مواد غذایی است. این باکتری عامل عفونت‌های گاستروانتریت با دوز عفونی کم است و بهعنوان یک سویه انتروهموراژیک سبب ایجاد اسهال خونی می‌شود. شیر خام یکی از منابع آلودگی به این باکتری بوده و میتواند انسان را در معرض ابتلا به عفونت‌های شدیدی قرار دهد. هدف از مطالعه‌ی حاضر بررسی پتانسیل شیر خام گوسفند بهعنوان شاخصی در انتقال این پاتوژن و در معرض خطر قرار دادن سلامت عمومی جامعه بود. طی ماه‌های فروردین، اردیبهشت، خرداد و تیر 1401 تعداد ١١٤ نمونه شیر خام گوسفند عرضه‌شده در خوزستان تهیه و به آزمایشگاه منتقل شد. پس از انجام آزمون‌های تشخیصی بیوشیمیایی، تشخیص قطعی با استفاده از پرایمرهای اختصاصی مربوط به ژن‌های O157 (rfb)، H7(flic)، stx1 و stx2، PCR انجام گرفت. در این تحقیق جداسازی اشریشیا کلی O157:H7از ٣ نمونه (٦٣/٢ درصد) تأیید شد. بر روی جدایه‌های تأییدشده به‌منظور ارزیابی حساسیت آنتی‌بیوتیکی، آزمون آنتی‌بیوگرام انجام گرفت. نتایج نشان داد که صد در صد جدایه‌ها به آنتی‌بیوتیک‌های ایمیپنم، سفتازیدیم و سفتازیدیم کلاوونیک اسید حساس هستند. سپس به ترتیب نسبت به سیپروفلوکساسین، تریمتوپریم سولفامتوکسازول و جنتامایسین (٦٦/٦٦ درصد)، نیتروفورانتین و نالیدیکسیک اسید (٣٣/٣٣ درصد) حساسیت مشاهده شد. در هیچکدام از جدایه‌ها حساسیت به آمپی‌سیلین و کلیندامایسین مشاهده نشد که نشان‌دهنده‌ی بیشترین مقاومت جدایه‌های اشریشیا کلی O157:H7به این آنتی‌بیوتیک‌ها است. آلودگی شیر خام گوسفند به باکتری اشریشیا کلی O157:H7 در منطقه خوزستان نشان داد که مصرف شیر خام گوسفند میتواند احتمالاً با ریسک ابتلا به بیماری‌های ناشی از این باکتری ارتباط داشته باشد.
Escherichia coli O157:H7 is a significant foodborne pathogen responsible for gastroenteritis, with low infectious doses, and as an enterohemorrhagic strain, it can cause hemorrhagic dysentery. Raw milk, including sheep milk, is a known source of contamination with this pathogen, posing a potential risk for severe human infections. This study aimed to evaluate the potential of raw sheep milk as a vector for the transmission of E. coli O157:H7 and its associated health risks. A total of 114 raw sheep milk samples were collected in Khuzestan province over four months (April–July 2022). After biochemical assays, the isolates were identified by using specific primers targeting the O157 (rfb), H7 (flic), stx1, and stx2 genes for identification. The study confirmed the isolation of E. coli O157:H7 from 3 samples (2.63%). Antibiogram was then conducted on the confirmed isolates. The results revealed that all isolates were 100% susceptible to imipenem, ceftazidime, and ceftazidime-clavulanic acid. Sixty-six percent of the isolates were susceptible to ciprofloxacin, gentamicin, trimethoprim-sulfamethoxazole, while 33% showed susceptibility to nalidixic acid and nitrofurantoin. None of the isolates were susceptible to ampicillin or clindamycin, indicating significant resistance to these antibiotics. The contamination of raw sheep milk with E. coli O157:H7 in the Khuzestan region suggests that consuming raw sheep milk may be associated with an increased risk of infections caused by this pathogen.
بهداشت مواد غذایی دوره 14، شماره 3، پیاپی 55، پاییز 1403، صفحات:
«مقاله پژوهشی» DOI: 10.71876/jfh.2024.4011438
میزان شیوع و مقاومت آنتی‌بیوتیکی اشریشیا کلی O157:H7 در شیر خام گوسفند در مناطق مختلف استان خوزستان در سال 1401
شیوع و مقاومت آنتی‌بیوتیکی اشریشیا کلی O157:H7 در شیر گوسفند
شکوفه ملک‌نژاد اهرمی1، علی فضل‌آرا2*، مهدی زارعی2
1- دانش‌آموخته کارشناسی ارشد بهداشت و کنترل کیفی مواد غذایی، گروه بهداشت مواد غذایی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران
2- استاد گروه بهداشت مواد غذایی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران
*نویسنده مسئول مکاتبات: a.fazlara@scu.ac.ir
(دریافت مقاله: 10/11/1402 پذیرش نهایی: 11/4/1403)
چکیده
اشریشیا کلی O157:H7، یکی از مهم‌ترین پاتوژن‌های منتقله از مواد غذایی است. این باکتری عامل عفونت‌های گاستروانتریت با دوز عفونی کم است و بهعنوان یک سویه انتروهموراژیک سبب ایجاد اسهال خونی می‌شود. شیر خام یکی از منابع آلودگی به این باکتری بوده و میتواند انسان را در معرض ابتلا به عفونت‌های شدیدی قرار دهد. هدف از مطالعه‌ی حاضر بررسی پتانسیل شیر خام گوسفند بهعنوان شاخصی در انتقال این پاتوژن و در معرض خطر قرار دادن سلامت عمومی جامعه بود. طی ماه‌های فروردین، اردیبهشت، خرداد و تیر 1401 تعداد ١١٤ نمونه شیر خام گوسفند عرضه‌شده در خوزستان تهیه و به آزمایشگاه منتقل شد. پس از انجام آزمون‌های تشخیصی بیوشیمیایی، تشخیص قطعی با استفاده از پرایمرهای اختصاصی مربوط به ژن‌های O157 (rfb)، H7(flic)، stx1 و stx2، PCR انجام گرفت. در این تحقیق جداسازی اشریشیا کلی O157:H7از ٣ نمونه (٦٣/٢ درصد) تأیید شد. بر روی جدایه‌های تأییدشده به‌منظور ارزیابی حساسیت آنتی‌بیوتیکی، آزمون آنتی‌بیوگرام انجام گرفت. نتایج نشان داد که صد در صد جدایه‌ها به آنتی‌بیوتیک‌های ایمیپنم، سفتازیدیم و سفتازیدیم کلاوونیک اسید حساس هستند. سپس به ترتیب نسبت به سیپروفلوکساسین، تریمتوپریم سولفامتوکسازول و جنتامایسین (٦٦/٦٦ درصد)، نیتروفورانتین و نالیدیکسیک اسید (٣٣/٣٣ درصد) حساسیت مشاهده شد. در هیچکدام از جدایه‌ها حساسیت به آمپی‌سیلین و کلیندامایسین مشاهده نشد که نشان‌دهنده‌ی بیشترین مقاومت جدایه‌های اشریشیا کلی O157:H7به این آنتی‌بیوتیک‌ها است. آلودگی شیر خام گوسفند به باکتری اشریشیا کلی O157:H7 در منطقه خوزستان نشان داد که مصرف شیر خام گوسفند میتواند احتمالاً با ریسک ابتلا به بیماری‌های ناشی از این باکتری ارتباط داشته باشد.
واژه‌های کلیدی: اشریشیا کلی O157:H7، واکنش زنجیره پلی مراز، مقاومت آنتی‌بیوتیکی، شیر خام گوسفند
مقدمه
باکتری اشریشیا کلی سروتیپ O157:H7، یکی از معروف‌ترین پاتوژن‌های منتقله از مواد غذایی و عامل عفونت‌های گاستروانتریت با دوز عفونی کم است (Zhong and Zhao, 2018 ). این باکتری به علت شدت بالای بیماری‌زایی و دوز عفونی کم (کمتر از ١٠ سلول) یکی از جدی‌ترین عوامل بیماری‌زای شناخته‌شده در مواد غذایی است (Kiranmayi et al., 2010) روده‌ی حیوانات، به‌ویژه گاو و سایر نشخوارکنندگان مخزن باکتری اشریشیا کلی سروتیپ O157:H7 است. از دیگر حیوانات مخزن این باکتری می‌توان به گوسفند، بز، غیر نشخوارکنندگانی مانند سگ، گربه، خوک، اسب و پرندگان اشاره کرد (Smith et al., 2015 ؛ Van den Brom et al., 2020). مطالعات اپیدمیولوژیک در مورد حیوانات مخزن باکتری اشریشیا کلی O157:H7 روی گاو متمرکز است، بااین‌حال سایر حیوانات میزبان نیز شناسایی شده‌اند. در ایالت متحده، هلند و استرالیا شیوع اشریشیا کلی O157:H7 در گوسفندان بالاتر از ٣١ درصد بود که نشان می‌دهد گوسفندان نیز ممکن است نقش مهمی بهعنوان مخزن باکتری اشریشیا کلی O157:H7 داشته باشند (Bach et al., 2002). در مطالعه‌ای که بین ٢٤ مزرعه‌ی گوسفند شیری در هلند صورت گرفت، باکتری اشریشیا کلی تولیدکننده‌ی شیگاتوکسین در همه‌ی این مزارع گزارش شد (Opsteegh et al., 2018). هفت سروتیپ، O26، O45، O103، O111، O121، O145 و O157 مسئول اکثر عفونت‌های STEC انسانی هستند (Capps et al., 2021 ؛ Khandaghi et al., 2011). محصولات غذایی مختلف ازجمله گوشت یا شیر خام یا نیم‌پخته، میوه، سبزی‌ها و آب آشامیدنی آلوده بهعنوان منبع عفونت در انسان عمل می‌کنند Alegbeleye et al., 2018)). اشریشیا کلی O157:H7 بهعنوان یک سویه انتروهموراژیک قادر به تولید شیگاتوکسین بوده و سبب ایجاد اسهال خونی یا کولیت خونریزی‌دهنده (Hemorrhagic Colitis) می‌شود. همچنین این باکتری می‌توانند منجر به بیماری سندروم اورمی همولیتیک (Hemolytic Uremic Syndrome) و پورپورای ترومبوتیک ترومبوسیتوپنیک (Thrombotic Thrombocytopenic Purpura) در کودکان، سالمندان و بیماران در معرض خطر شود ( Khandaghi et al., 2010؛ Kakagianni and Koutsoumanis, 2019). مرکز کنترل و پیشگیری از بیماری‌ها تخمین زده است که بیمارهای ناشی از غذا توسط شیگاتوکسین اشریشیا کلی سروتیپ O157:H7، هرساله موجب ٢٦٥٠٠٠ مورد بیماری، ٠٠ ٣٦ مورد بستری و ٣٠ مورد مرگ در آمریکا می‌شود (Kakagianni and Koutsoumanis, 2019). این بیماری‌ها به‌طور مستقیم با فاکتورهای حدت مرتبط هستند. ازجمله شیگاتوکسین‌ها (Stx1 و Stx2)، اینتیمین (کد شده توسط eae) و انتروهمولیزین (hlyA) که با دوز عفونی کم، اثرات سمی و بیماری عمومی شدید ایجاد می‌کند. ضایعات اتصال و محو شدن (A/E) ناشی از بیان eae، اختلال در گلبول‌های قرمز توسط hlyA و سرکوب سنتز پروتئین از طریق اتصال به رسپتور گلوبوتری‌آسیل‌سرامید (Globotriaosylceramide) توسط شیگاتوکسین ویژگی‌های اصلی مرتبط با حدت اشریشیا کلی تولیدکننده شیگاتوکسین هستند (Thierry et al., 2020).
باکتری اشریشیا کلی O157:H7 مهم‌ترین سروتیپ اشریشیا کلی تولیدکننده شیگاتوکسین، از اوایل دهه 1980 بهعنوان یک پاتوژن حیاتی قابل‌انتقال از طریق آب و مواد غذایی مطرح‌شده است. این باکتری همچنین در شیر خام گزارش‌شده است (Van den Brom et al., 2020; Rani et al., 2021). آلودگی شیر خام به این باکتری از طریق آلودگی شیر با مدفوع در حین شیردوشی رخ می‌دهد. اگرچه ترشح مستقیم ارگانیسم از پستان آلوده نیز گزارش‌شده است (Sancak et al., 2015). استراتژی‌های مدیریتی مختلفی را می‌توان برای کنترل گسترش بیماری‌های ناشی از این باکتری به کار برد. تشخیص سریع و کارآمد این پاتوژن به‌منظور کاهش عوارض و مرگ‌ومیر بسیار مهم است. فناوری‌های نوظهور مانند روش‌های حسگرهای زیستی، طیف‌سنجی و روش‌های دیجیتال مبتنی بر گوشی هوشمند بهعنوان رویکردهای جدید در زمینه تشخیص باکتری اشریشیا کلی O157:H7 شناخته‌شده است (Rani et al., 2021). حسگر رنگ سنجی مبتنی بر گوشی هوشمند بهعنوان ابزاری کارآمد جهت تشخیص باکتری اشریشیا کلی O157:H7 در شیر گزارش‌شده است (Yang et al., 2021 ).
گزارش‌هایی از وجود آلودگی به اشریشیا کلی O157:H7 در شیر در ایران وجود دارد برای نمونه یک مورد اشریشیا کلی O157:H7 در مخازن شیر شرکت شیر پاستوریزه در ایران تشخیص داده‌شده است (Brenjchi et al., 2011). همچنین حضور باکتری اشریشیا کلی O157:H7 در شیر خام گاو استان خوزستان، به‌خصوص در فصول گرم تأییدشده است (Morseli and Shakerian, 2023).
با توجه به دوز پایین عفونت‌زایی و ظهور سویه‌های اشریشیا کلی سروتیپ O157:H7 مقاوم در برابر آنتیبیوتیک، شناسایی منابع عفونی و چگونگی انتقال آن به انسان و همچنین ارزیابی مقاومت آنتی‌بیوتیکی جدایه‌ها ضرورت دارد. همچنین با توجه به اینکه مخزن اصلی باکتری اشریشیا کلی O157:H7 گاو است و عمده‌ی مطالعات بر روی گوشت، شیر و سایر فرآورده‌ها با منشأ گاو انجام‌شده است. هدف از مطالعه‌ی حاضر بررسی این است که شیر خام گوسفند تا چه اندازه میتواند بهعنوان شاخصی در انتقال این پاتوژن مطرح باشد و موجب در معرض خطر قرار دادن سلامت عمومی جامعه شود. لذا در این مطالعه امکان آلودگی شیر خام گوسفند به باکتری اشریشیا کلی سروتیپ O157:H7 با استفاده از روش‌های کشت به‌منظور تشخیص باکتری، وجود عامل بیماری‌زای O157:H7 با استفاده از آزمون واکنش زنجیره‌ایی پلیمراز (Polymerase Chain Reaction) و همچنین ارزیابی مقاومت آنتی‌بیوتیکی جدایه‌ها موردبررسی قرار گرفت.
مواد و روش‌ها
-جمع‌آوری نمونه‌ها
به‌منظور بررسی پتانسیل شیر خام گوسفند بهعنوان شاخصی در انتقال باکتری اشریشیا کلی O157:H7 و در معرض خطر قرار دادن سلامت عمومی جامعه، طی ماه‌های فروردین، اردیبهشت، خرداد و تیر 1401 تعداد ١١٤ نمونه شیر خام گوسفند با توجه به تعداد مراکز ثبت‌شده عرضه شیر گوسفند در شهرهای اهواز، امیدیه، ایذه، خرمشهر، باوی، شادگان، بهبهان، هفتکل، رامشیر، کارون، شوشتر، گتوند، دشت‌آزادگان، حمیدیه، هویزه، هندیجان، باغملک، شوش، مسجد سلیمان، دزفول، اندیمشک، لالی و رامهرمز از استان خوزستان به روش نمونه‌برداری تصادفی ساده به ترتیب تعداد 6، 4، 5، 6، 5، 3، 7، 3، 4، 4، 7، 5، 5، 5، 3، 2، 5، 7، 6، 7، 6، 3، 6 نمونه تهیه و سریعاً در شرایط سرما به آزمایشگاه بهداشت مواد غذایی دانشکده دامپزشکی دانشگاه شهید چمران اهواز منتقل و در همان روز مورد آزمایش قرار می‌گرفتند.
-جداسازی و شناسایی بیوشیمیایی اشریشیا کلی O157:H7
مقدار ٤٠ میلی‌لیتر از هر نمونه‌ی شیر سانتریفیوژ و از رسوب حاصل، مقدار یک میلی‌لیتر به لوله‌های حاوی ٩ میلی‌لیتر تریپتیک سوی براث (Tryptic Soy Broth) ((Merck, Germany غنی شده با نووبیوسین (20 میلی‌گرم بر لیتر) منتقل و در دمای ٣٧ درجه سلسیوس به مدت ٢٤ ساعت گرمخانه‌گذاری گردید. پس از سپری شدن این زمان، مجدداً سانتریفیوژ انجام شد. مایع رویی خارج و رسوب آن در یک میلی‌لیتر از محیط باقی‌مانده مخلوط و در محیط کشت اختصاصی سوربیتول مک کانکی آگار(Sorbitol MacConkey Agar) ((Merck, Germany، حاوی آنتیبیوتیک سفکسیم (٠٥/٠ میلی‌گرم بر لیتر) و محلول تلوریت پتاسیم (٥/٢ میلی‌گرم بر لیتر)، کشت داده شد و در دمای ٣٧ درجه سلسیوس به مدت ٢٤ ساعت گرمخانه‌گذاری شد. سپس تعداد ٣ تا ٥ عدد از کلنی‌های بی‌رنگ (سوربیتول منفی) یا کلنی‌های بی‌رنگ با هسته مرکزی دودی خاکستری از محیط کشت سوربیتول مک کانکی آگار حاوی آنتیبیوتیک سفکسیم انتخاب و در محیط کشت ائوزین متیلن بلو آگار (Eosin Methylene Blue Agar) (Conda, Spain)، بهصورت خطی کشت داده می‌شد. سپس از کلنی‌های با جلای سبز فلزی در محیط ائوزین متیلن بلو آگار، بر روی محیط کشت تریپتیک سوی آگار (Tryptic Soy Agar) ((Merck, Germany، نسبت به تهیه کشت خالص اقدام می‌شد. سپس ضمن نگهداری پلیت مذکور در یخچال، نسبت به انجام رنگ‌آمیزی گرم، آزمون‌های تشخیصی بیوشیمیایی شامل تست اکسیداز، تست IMVIC و همچنین تست TSI و LIA و PCR اقدام میگردید.
-شناسایی مولکولی اشریشیا کلی O157:H7
در ابتدا جهت جداسازی DNA از روش جوشانیدن استفاده شد. بدین نحو که مقداری کلنی را با لوپ استریل، در میکروتیوب‌های ٥/١ میلی‌لیتری حاوی یک سی‌سی آب مقطر استریل، حل و کاملاً هموژن شد. میکروتیوب‌ها شماره‌گذاری و در سانتریفیوژ با ١٢٠٠٠ دور در دقیقه و به مدت پنج دقیقه قرار داده شد. پس از سانتریفیوژ، مایع رویی خارج و به رسوب باقی‌مانده ١٠٠ میکرولیتر آب مقطر استریل افزوده گردید و به‌خوبی باهم مخلوط شدند. سپس میکروتیوب‌ها با قرار دادن بر روی آب جوش، به مدت ٦-٥ دقیقه حرارت داده شدند. پس‌ازآن مجدداً میکروتیوب‌ها سانتریفیوژ گشته و ٧٠ میکرولیتر از مایع رویی در یک میکروتیوب دیگر ریخته می‌شد و ضمن برچسب‌گذاری در فریزر٢٠- درجه سلسیوس نگهداری میگردید. در این مطالعه از پرایمرهای اختصاصی باکتری اشریشیا کلی O157:H7 که توسط شرکت زیست‌فناوری پیشگام سنتز شده است مطابق جدول (1) استفاده شد.
جدول (1)_ پرایمرهای پیشرو و معکوس مربوط به ژن‌های O157، H7، stx1، stx2 در باکتری اشریشیا کلی O157:H7
منبع | اندازه پرایمر | توالی پرایمر | پرایمر |
Paton et al., 1998
| 259 bp
| CGGACATCCATGTGATATGG TTGCCTATGTACAGCTAATCC | O157F O157R |
625 bp | GCGCTGTCGAGTTCTATCGAGC CAACGGTGACTTTATCGCCATTCC | H7 F H7 R | |
Kudva et al., 1996؛ Olowe et al., 2014
|
614 bp
|
ACACTGGATGATCTCAGTGG CTGAATCCCCCTCCATTATG
|
stx1 F stx1 R
|
779 bp | CCATGACAACGGACAGCAGTT CCTGTCAACTGAGCAGCACTTTG | stx2 F stx2R |
سپس طی دو مرحله نسبت به انجام PCR اقدام گردید. در مرحله نخست، مواد موردنیاز که شامل پنج میکرولیتر از DNA استخراج‌شده، ٢٠ میکرولیتر مستر میکس (Ampliqon, Denmark) حاوی یک میکرولیتر از هرکدام از پرایمرهای پیشرو و معکوس (Cinnagen, Iran) (درمجموع چهار میکرولیتر)، ٥/١٢میکرولیتر از مسترمیکس پایه و ٥/٣ میکرولیتر آب مقطر استریل، در یک میکروتیوب ٢/٠ میلی‌لیتری باهم مخلوط شده و حجم نهایی به ٢٥ میکرولیتر رسید. نمونه‌ها در دستگاه ترمال سایکلر (Bioer, China) قرارگرفته و دستگاه در دمای ٩٤ درجه سلسیوس تنظیم گردید. برای هر بار انجام واکنش PCR لازم است یک نمونه کنترل مثبت کنترل مثبت که از آرشیو میکروارگانیسم‌های گروه بهداشت مواد غذایی دانشگاه شهید چمران اهواز تهیه‌شده و یک نمونه کنترل منفی به همراه نمونه‌های مشکوک گذاشته شود. در آزمون PCR، از DNA مربوط به باکتری اشریشیا کلی O157:H7 (سویهیATCC 43895) بهعنوان کنترل مثبت و از آب مقطر بهعنوان کنترل منفی استفاده شد. در PCR مرحله نخست، با مشاهده هر دو باند O157 و H7 در یک واکنش PCR، سویه مربوطه ازنظر اشریشیا کلی O157:H7 مثبت گزارش‌شده و سپس نسبت به انجام PCR مرحله دوم اقدام میگردید تا بدینوسیله نسبت به ارزیابی و تشخیص توکسین‌زا بودن سویه‌های باکتریایی تأییدشده در مرحله نخست، ازنظر دارا بودن ژن‌های stx1 و stx2اقدام گردد. برنامه حرارتی PCR شامل سه بخش بود: بخش اول دناتوره کردن اولیه در دمای ٩٤ درجه سلسیوس و به مدت ٣ دقیقه (برای باز شدن دو رشته‌ی DNA) انجام شد. بخش دوم خود شامل ٣٥ سیکل و هر سیکل شامل سه مرحله می‌شد: ابتدا دناتوره شدن در ٩٤ درجه سلسیوس به مدت ٤٥ ثانیه، سپس اتصال پرایمرها در دمای ٦٢ درجه به مدت ٤٥ ثانیه و در ادامه، سنتز در دمای ٧٢ درجه سلسیوس و به مدت یک دقیقه انجام شد که آنزیم Taq (Cinnagen, Iran) در این مرحله با اضافه کردن نوکلئوتیدها به انتهای آغازگرها، با توجه به ردیف نوکلئوتیدی DNA الگو، باعث تکثیر قطعه موردنظر شد. بخش سوم، سنتز نهایی در ٧٢ درجه سلسیوس و به مدت ٥ دقیقه انجام شد تا در طی آن قطعاتی که به‌طور کامل سنتز نشده‌اند، کامل گردند.
محصولات PCR با الکتروفورز در ژل آگارز بررسی شد. جهت بررسی و مشاهده محصول PCR از ژل آگارز ٥/١ درصد (Cinnagen, Iran) استفاده گردید. ژل را درون تانک الکتروفورز (Paya Pajouhesh, Iran) قرار داده و مخزن تانک با محلول بافر TAE 1X پر گردید. ١٠ میکرولیتر از محصول PCR از هر نمونه درون چاهک ژل تزریق شد. چاهک وسط به تزریق نردبان ژنی bp٥٠ (٣ میکرولیتر) (Cinnagen, Iran)، اختصاص داده شد. الکتروفورز ژل درون بافر TAE 1X با استفاده از جریان برق ١٠٠ ولت به مدت ٤۰ دقیقه انجام گردید. پس از پایان الکتروفورز، باندهای تفکیک‌شده ژل در دستگاه ترانس لومیناتور Kiagen, Iran)) قرار داده‌شده و با تابش نورUV، باندهای ژل ازنظر صحت طول قطعه، با مارکر مولکولی و کنترل مثبت مورد مقایسه قرار گرفتند.
-آنتی بیوگرام
جهت سنجش حساسیت آنتی‌بیوتیکی جدایه‌ها از روش دیسک دیفیوژن آگار منطبق با استانداردهای موسسه استاندارد آزمایشگاهی و کلینیکی (Clinical Laboratory Standards Institute) اقدام شد (CLSI, 2019). در ابتدا نسبت به تهیه ٥/٠ مک‌فارلند اقدام (Padtan Teb, Iran) شد. سپس از کشت خالص ٢٤ ساعته هر یک از جدایه‌های اشریشیا کلی O157:H7، در سرم فیزیولوژی تلقیح شده و با مقایسه سوسپانسیون باکتریایی حاصل با کدورت لوله ٥/٠ مک‌فارلند، مقدار کدورت موردنیاز تشخیص داده می‌شد. سپس سواب استریل به سوسپانسیون حاصل آغشته شده و به‌طور کامل تمام سطح محیط مولر هینتون آگار(Mueller-Hinton agar) ((Merck, Germany، در داخل پلیت کشت داده شد. پس از جذب رطوبت سطح محیط کشت، دیسک‌های آنتی‌بیوتیکی (Padtan Teb, Iran)، با فاصله ٥/١ سانتی‌متر از دیواره‌ی پلیت و ٥/٢ سانتی‌متر از یکدیگر در سطح محیط کشت گذاشته شد. در این تحقیق برای هر جدایه مجموعاً از ده نوع دیسک آنتیبیوتیک مختلف شامل آمپی‌سیلین (10 میکروگرم)، ایمیپنم (10 میکروگرم)، نالیدیکسیک اسید (30 میکروگرم)، سفتازیدیم (30 میکروگرم)، تریمتوپریم سولفامتاکسازول (5 میکروگرم)، جنتامایسین (10 میکروگرم)، سفتازیدیم کالوونیک اسید (10 میکروگرم)، کلیندامایسین (2 میکروگرم)، نیتروفورانتین (300 میکروگرم) و سیپروفلوکساسین (5 میکروگرم) (Padtan Teb, Iran) در دو پلیت ده سانتی‌متری استفاده شد (شکل 1) بعد از قرار دادن دیسک‌های آنتی‌بیوتیکی پلیت‌ها در دمای ٣٧ درجه سلسیوس گرمخانه‌گذاری شده و پس از ٢٤ ساعت نتایج موردبررسی قرار گرفت. سپس با استفاده از خط‌کش قطر هاله‌ی عدم رشد در اطراف هر یک از دیسک‌ها اندازه‌گیری و بر اساس میلی‌متر ثبت‌شده و با جدول استاندارد تهیه‌شده از شرکت فراهم‌کننده‌ی دیسک‌های آنتی‌بیوتیکی و جدول CLSI (CLSI, 2021) مقایسه می‌شد. درنتیجه میزان حساسیت یا مقاومت ایزوله‌ها به هرکدام از آنتی‌بیوتیک‌ها تعیین میگردید.
شکل (1)_سنجش آنتی‌بیوتیکی جدایه‌های اشریشاکلی O157:H7
یافته‌ها
از تعداد ١١٤ نمونه کشت داده شده در محیط سوربیتول مک‌کانکی آگار حاوی سفکسیم و تلوریت پتاسیم، تعدادی کلنی سوربیتول منفی بهعنوان کلنی‌های مشکوک (Garbaj et al., 2016) مشاهده و جهت تشخیص تفریقی کلنی‌ها در محیط EMB کشت داده شدند. کلنی‌های اشریشیا کلی بر روی محیط کشت EMB جلای سبز فلزی داشتند. سپس بر روی آنها رنگ آمیزی گرم، تست اکسیداز، تست IMVIC و همچنین تست TSI و LIA انجام شد. در مجموع کلنی‌های مربوط به تعداد ٢١ نمونه شیر (42/18 درصد)، بهصورت اکسیداز منفی، اندول مثبت، MR مثبت، VP منفی و سیترات منفی مشاهده گردید. کلنی‌های مشکوک همچنین در لوله‌های TSI بهصورت اسید/اسید بوده و همچنین در LIA بهصورت قلیایی/قلیایی مشاهده شدند.
برای شناسایی باکتری اشریشیا کلی سروتیپ O157:H7 در مواد غذایی، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بهعنوان روش استاندارد در نظر گرفته می‌شود. کلنی‌های مشکوک برای تشخیص قطعی و حضور ژن‌های O157، H7، stx1و stx2 بهوسیله‌ی PCR مورد بررسی قرار گرفتند. طی بررسی‌ها در مورد حضور ژن‌های O157 و H7 باندهای تشکیل شده بر روی ژل آگارز نشان داد که از تعداد 21 نمونه مثبت مرحله‌ی قبل، ٣ نمونه (٦٣/٢درصد) دارای ژن‌های O157 و H7 بودند. طی مرحله بعد جدایه‌ها از نظر وجود ژن‌های stx1 و stx2 مورد بررسی قرار گرفتند که صرفاً یک نمونه (٨٧/٠درصد) بر روی آگارز باندهای حاوی هر دو ژن stx1 و stx2 را تشکیل داد. این نمونه مربوط به شهر اندیمشک بود. در دو نمونه (٧٥/١درصد) دیگر (مربوط به شهرهای شوشتر و گتوند) فقط ژن‌های O157 و H7 حضور داشت و آثاری از حضور ژن‌های بیماری‌زای stx1 و stx2 مشاهده نشد (شکل 2).
شکل (2)_ موارد مثبت باکتری اشریشیا کلی O157:H7 به همراه کنترل مثبت و منفی مربوط به ژن‌های O157، H7، stx1 و stx2 در PCR
ستون شماره ١: اشریشیا کلی O157:H7 ، ستون شماره ٢: اشریشیا کلی O157:H7 ، ستون شماره ٣: نردبان ژنی bp٥٠ ، ستون شماره ٤: کنترل مثبت باکتری دارای ژن‌های stx1 (bp٦١٤) و stx2(bp٧٧٩(، ستون شماره ٥: نردبان ژنی bp٥٠، ستون شماره ٦: کنترل مثبت باکتری دارای ژن‌های O157(bp٢٥٩) و H7(bp٦٢٥)، ستون شماره ٧: اشریشیا کلی O157:H7 ، ستون شماره ٨: ژن‌های stx1 و stx2در نمونه مثبت اشریشیا کلی O157:H7، ستون شماره ٩: کنترل منفی.
در نهایت نتایج آزمون سنجش حساسیت آنتی‌بیوتیکی نشان داد که صد در صد جدایه‌ها به آنتی‌بیوتیک‌های ایمیپنم، سفتازیدیم و سفتازیدیم کلاوونیک اسید حساس هستند. سپس بهترتیب نسبت به سیپروفلوکساسین، تریمتوپریم سولفامتوکسازول و جنتامایسین (٦٦/٦٦ درصد)، نیتروفورانتین و نالیدیکسیک اسید (٣٣/٣٣ درصد) حساسیت مشاهده شد. همچنین در هیچکدام از جدایه‌ها حساسیت به آمپی‌سیلین و کلیندامایسین مشاهده نشد که نشان دهنده‌ی بیشترین مقاومت جدایه‌های اشریشیا کلی O157:H7به این آنتی‌بیوتیک‌ها است (نمودار 1).
نمودار (1)_ نتایج آزمون سنجش حساسیت آنتی‌بیوتیکی جدایه‌های اشریشیا کلی O157:H7 نسبت به ١0 آنتیبیوتیک مختلف
بحث و نتیجه‌گیری
اشریشیا کلی O157:H7 بهعنوان یک نگرانی بهداشت عمومی در بسیاری از کشورهای جهان مطرح است. عفونت‌های ایجاد شده توسط باکتری اشریشیا کلی تولید کننده شیگاتوکسین سروتیپ O157:H7، چهارمین بیماری پرهزینه در کانادا و ایالت متحده است. اشریشیا کلی O157:H7 به علت شدت بالای بیماری‌زایی و دوز عفونی کم (کمتر از ١٠ سلول) یکی از جدی‌ترین عوامل بیماری‌زای شناخته شده در مواد غذایی است. این باکتری عمدتا برای انسان بیماری‌زا است اما در گاو و سایر حیوانات هیچ‌گونه علائم بالینی و بیماری به‌جز اسهال ایجاد نمی‌کند. بنابراین این حیوانات به عنوان ناقل عمل می‌کنند (Kiranmayi et al., 2010).
در مطالعه حاضر تعداد ١١٤ نمونه شیر خام گوسفند به منظور جداسازی و شناسایی باکتری اشریشیا کلی O157:H7 مورد بررسی قرار گرفت. از روش کشت در محیط‌های مغذی و انتخابی برای جداسازی استفاده شد و سپس ایزوله‌ها با روش PCR از نظر حضور ژن‌های شیگاتوکسین stx1 و stx2 و همچنین تایید سروتایپ (O157 و H7) مورد ارزیابی قرار گرفت. در نهایت یک جدایه اشریشیا کلی O157:H7 دارای ژن‌های stx1 و stx2 ( ٨٧/٠ درصد) و ٢ جدایه اشریشیا کلی O157:H7 فاقد ژن‌های stx1 و stx2 (٧٥/١ درصد) تشخیص داده شد. سنجش آنتی‌بیوتیکی جدایه‌ها بیشترین حساسیت را به آنتی‌بیوتیک‌های ایمیپنم، سفتازیدیم کلاوونیک اسید و سفتازیدیم (١٠٠درصد) نشان داد. همچنین بیشترین مقاومت نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های آمپی‌سیلین و کلیندامایسین (١٠٠درصد) مشاهده شد.
در مطالعه‌ایی در ایران که تحت عنوان شناسایی مستقیم باکتری اشریشیا کلی O157:H7 و ژن‌های فاکتور حدت در مدفوع حیوانات کشتاری در زمان کشتار انجام شد، باکتری اشریشیا کلی O157:H7 در 2/4 درصد گاوها و 1/2 درصد گوسفندان مشاهده شد (Jalil et al., 2011). همچنین پژوهشی دیگر در منطقه آذربایجان شرقی تحت عنوان فراوانی باکتري اشریشیا کلی وروتوکسیکوژنیک در مدفوع گاوها و گوساله‌های کشتاری در کشتارگاه انجام شد که نتایج نشان‌دهنده وجود مقادیر نسبتاً بالاي باکتري اشریشیا کلی وروتوکسیکوژنیک در مدفوع گاوها و گوساله‌هاي کشتاري در کشتارگاه تبریز بود (Khakpour et al., 2012).
در مطالعه‌ای دیگر وجود باکتری اشریشیا کلی سروتیپ O157:H7 در غذاهای مختلف با منشا دامی در شمال غربی یونان مورد بررسی قرار گرفت. نمونه‌ها جهت تشخیص سروگروپ O157:H7 با استفاده از روش‌های استاندارد کشت و جداسازی ایمونومغناطیسی بررسی شدند. نتایج در مورد شیر گوسفند، پاتوژن را یک مورد از ١٠٠ نمونه (١درصد) گزارش داد. سویهی جدا شده سوربیتول منفی و تولید کننده وروتوکسین بوده و هر دو ژن stx1 و stx2 را حمل می‌کرد. همچنین از نظر حساسیت ضد میکروبی، نسبت به ٨ آنتیبیوتیک (نالیدیکسیک اسید، آمپی‌سیلین، کلرامفنیکل، کانامایسین، نورفلوکساسین، استرپتومایسین، تری‌متوپریم‌سولفامتوکسازول و تتراسایکلین) حساس بود ( Dontorou et al., 2003). نتایج تحقیق حاضر با نتایج این مطالعه مطابقت دارد. از این جهت که با روش کشت و PCR بر روی ایزوله‌ها، در هر دو مطالعه تنها یک مورد O157:H7 حامل ژن‌های stx1و stx2 در شیر خام گوسفند تشخیص داده شد. با این تفاوت که در مطالعه ایشان تعداد ١٠٠ نمونه شیر خام گوسفند مورد بررسی قرار گرفته شد و فراوانی باکتری اشریشیا کلی O157:H7 حامل ژن‌های شیگاتوکسین یک درصد بود اما در تحقیق حاضر از تعداد ١١٤ نمونه شیر گوسفند مورد بررسی، فراوانی باکتری اشریشیا کلی حامل ژن‌های شیگاتوکسین، ٨٧/٠ درصد گزارش شد. در هر دو مطالعه، جدایه‌های اشریشیا کلی O157:H7 حاوی ژن‌های شیگاتوکسین، نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های نالیدیکسیک اسید و تریمتوپریم-سولفامتوکسازول حساس بودند. البته در مورد آنتیبیوتیک آمپی‌سیلین در نتایج تفاوت وجود داشت به این صورت که جدایه‌ها در مطالعه‌ی حاضر، نسبت به آنتی بیوتیک آمپی‌سیلین مقاوم بودند. اختلاف در نتایج مقاومت آنتی‌بیوتیکی جدایه‌های اشریشیا کلی O157:H7 در مطالعات مختلف نشان می‌دهد که الگوی مقاومت آنتی‌بیوتیکی میتواند تحت تأثیر منطقه جغرافیایی، نوع و نحوه فرآوري و مصرف مواد غذایی، بيماري هاي باكتريايي شايع و فرهنگ مصرف داروها و بهويژه آنتيبيوتيك‌ها قرار گیرد. علاوه بر این، احتمالا مقاومت سویه‌هاي مختلف اشریشیا کلی O157:H7 با يكديگر متفاوت بوده و اين امر منجر به تاثير متفاوت یک آنتیبیوتیک خاص بر روی سویه‌های مختلف می‌گردد (Dontorou et al., 2003).
تحقیقی در اسپانیا، مشابه مطالعه‌ی حاضر وجود باکتری اشریشیا کلی O157:H7 را در نمونه‌های شیر غیرپاستوریزه میش مورد بررسی قرار داد. در بررسی وجود ژن‌های O157 (rfb) و(flic) H7 ، از بین تمام نمونه‌های شیر میش، ٣ مورد (٥/٣ درصد) از نظر اشریشیا کلی O157:H7 مثبت بودند. سپس با استفاده از مولتی‌پلکس PCR برای حضور ژن‌های حدت ehxA، eaeA، stx1 و stx2 تجزیه و تحلیل شدند. تمام جدایه‌های O157:H7 دارای سم شیگاتوکسین بوده و واجد ژن‌های حدتehxA وeaeA بودند ( Caro et al., 2006). این نتایج نشان داد که شیر خام میش مورد استفاده در تولید پنیر، با سویه‌های بالقوه بیماری‌زا آلوده است. درصد آلودگی شیر میش به اشریشیا کلی O157:H7 در تحقیق ایشان نسبت به مطالعه حاضر بالاتر گزارش شده است. در توضیح این عدم تشابه در نتایج مطالعات مختلف، دلایل متعددی از جمله عدم رعایت اقدامات بهداشتی در حین شیردوشی، پراکندگی جغرافیایی، فصول متفاوت، روش‌های نمونه‌برداری و روش‌های جداسازی مختلف باکتری اشریشیا کلی O157:H7 میتواند مطرح باشد. در یک مطالعه فراتحلیل، عوامل بیمای‌زای موجود در شیر خام و پنیر گوسفند و بز مورد بررسی قرار گرفت.
در مطالعه‌ای دیگر، مجموع 13 سویه اشریشیا کلی تولید کننده شیگاتوکسین جدا شده از شیر خام و پنیر گوسفندی مورد بررسی قرار گرفت و صفات بیوشیمیایی و همچنین مقاومت آنتی‌بیوتیکی آنها تعیین شد. تمام سویه‌های اشریشیا کلی تولید کننده شیگاتوکسین نسبت به باسیتراسین، کلوکساسیلین، پنی‌سیلین و تایلوزین مقاومت نشان دادند. این مطالعه، انواع مختلف بیوتایپ و الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی در سویه‌های اشریشیا کلی تولید کننده شیگاتوکسین جدا شده از لبنیات گوسفند را نشان داد (Caro et al., 2007). داده‌های تجزیه و تحلیل که از ٣٧ مطالعه انجام شده از کشورهای مختلف استخراج شده بود، نشان داد که فرکانس تشخیص عوامل بیماری‌زا در شیر خام گوسفند و بز مشابه و در مورد باکتری اشریشیا کلی تولید کننده شیگاتوکسین (٨/٤-٣/٤ درصد) است. میزان آلودگی به اشریشیا کلی تولید کننده شیگاتوکسین در پنیرهای شیر خام (١٠ درصد) نسبت به شیر پاستوریزه (٧/٤ درصد) بالاتر بود ( Gonzales-Barron et al., 2017). بنابراین آلودگی شیر و پنیر خام گوسفند و بز در این مطالعه، لزوم اقدامات پیشگیرانه مانند نظارت دقیق بر بهداشت در دامداری‌ها را نشان داد. در مطالعه‌ایی دیگر شیوع سروتیپ‌ها و ژن‌های حدت اشریشیا کلی تولید کننده شیگاتوکسین جدا شده از شیر گوسفند و بز و دیگر محصولات لبنی در اسپانیا بررسی شد. در مجموع ٥٠٢ محصول لبنی مورد بررسی قرار گرفت. سویه‌های اشریشیا کلی تولید کننده شیگاتوکسین در ٣٩ (٨/١٠درصد) مخزن شیر فله شناسایی شدند. درحالیکه سروتیپ O157:H7 از یک (٣/٠ درصد) مخزن فله جدا شد. در کل 8 سویه سروتیپ غیر O157 و یک سویه سروتیپ O157:H7 شناسایی شد. این مطالعه نشان داد که فرآورده‌های لبنی مخزن مهم پاتوژن اشریشیا کلی تولید کننده شیگاتوکسین برای انسان است (Rey et al., 2006).
در پژوهشی که تحت عنوان جداسازی و بررسی خصوصیات باکتری انتروهموراژیک اشریشیا کلی سروتیپ‌های O157:H7 و O157:NM (Non-Motile) از شیر گاو، شتر، گاومیش، بز و گوسفند در ایران انجام شد. به‌طور کلی ١٧ مورد از ٧٣٤ نمونه شیر خام (٣/٢ درصد) آلوده به اشریشیا کلی O157 مشخص شد. بالاترین میزان شیوع در نمونه‌های شیر گاومیش (٥/٥ درصد) و به دنبال آن شیر گاو (٩/٣ درصد)، گوسفند (٤/١ درصد) و بز (1 درصد) مشاهده شد (Rahimi et al., 2012). مطالعات بسیاری شیوع اشریشیا کلی انتروهموراژیک سروتیپ O157:H7 را مخصوصا در گاو و گاهاً در گوسفند کشتارگاهی اندازه‌گیری کرده‌اند. در انگلستان، این باکتری در ٧/٤ درصد گاوها و ٧/١ درصد گوسفندان (Paiba et al., 2002)، ٧/١٥ درصد گاوها و ٢/٢ درصد گوسفندان (Chapman et al., 1994) و ٧/٤ درصد گاوها و ٧/٠ درصد گوسفندان گزارش شده است (Milnes et al., 2008). در مطالعه‌ای در ایتالیا، بیشتر گوسفندان بالغ مورد آزمایش در کشتارگاه، از نظر اشریشیا کلی انتروهموراژیک سروتیپ O157:H7 مثبت بودند (Franco et al., 2009).
آلودگی شیر خام گوسفند به باکتری اشریشیا کلی O157:H7 در منطقه خوزستان نشان داد که مصرف شیر خام گوسفند میتواند احتمالا با ریسک ابتلا به بیماری‌های ناشی از این باکتری ارتباط داشته باشد. با توجه جداسازی و شناسایی باکتری اشریشیا کلی O157:H7 در شیر و به اثبات رسیدن توکسین‌زایی آن، مصرف شیر خام گوسفند یک خطر بالقوه برای سلامت عمومی جامعه و مصرف کنندگان به‌حساب می‌آید. حضور اشریشیا کلی O157:H7 و سایر سروتیپ‌های اشریشیا کلی تولید کننده‌ی شیگاتوکسین در شیر، میتواند نشان دهنده‌ی آلودگی ثانویه در طی زنجیره‌ی تولید و انتقال شیر باشد ( Farrokh et al., 2013; Gomes et al., 2016;.(Smith et al., 2015 شیر خام باید تحت نظارت‌های معمول درمورد شاخص‌های آلودگی مدفوعی، از جمله اشریشیا کلی و باکتری‌های کلیفرم قرارگیرد. چنین رویکردهایی می‌توانند کیفیت بهداشتی بهبود یافته‌ایی را در عرضه شیر خام به دست آورد. اما از آنجایی که سطح کم یا فرکانس پایین آلودگی گاهی اجتناب ناپذیر است، این کار نمی‌تواند عدم وجود عوامل بیماری‌زا را در تهیه شیر خام تضمین کند. یکی از راه‌های موثر در حذف این باکتری از زنجیره غذایی حرارت دادن است. با کنترل دقیق پاستوریزاسیون شیر می‌باید این اطمینان حاصل شود که مصرف آن برای فرد ضرری نداشته باشد. حضور سویه‌های مقاوم به آنتیبیوتیک اين باكتري نیز میتواند احتمال بروز بیماری را افزایش دهد و درمان عفونت‌های ناشی از این باکتری با شکست روبه‌رو شود. از اینرو بررسی میزان شیوع آلودگي به اشریشیا کلی O157:H7 به منظور اطلاع از وضعيت اپيدميولوژيكي این باکتری و ایجاد روش‌های مناسب کنترلی و همچنین تعیین الگوی حساسیت آنتی‌بیوتیکی آنها برای جلوگیری از گسترش سویه‌های مقاوم به آنتیبیوتیک و انتقال آنها به زنجیره غذایی انسان ضروری است.
سپاسگزاری
هزینه‌های انجام مطالعه حاضر از طریق پژوهانه سال 1400 دانشگاه شهید چمران اهواز تامین شده است که بدینوسیله از حوزه معاونت پژوهشی دانشگاه سپاسگزاری می‌گردد.
تعارض منافع
نویسندگان تعارض منافعی برای اعلام ندارند.
منابع
• Alegbeleye, O.O., Singleton, I. and Sant’Ana, A.S. (2018). Sources and contamination routes of microbial pathogens to fresh produce during field cultivation: a review. Food Microbiology, 73: 177-208.
• Brenjchi, M., Jamshidi, A., Farzaneh, N. and Basami, M. (2011). Identification of shiga toxin producing Escherichia coli O157:H7 in raw cow milk sample from dairy farms in Mashhad multiplex PCR assay. Iranian Journal of Veterinary Research, Shiraz University, 12(2): 145-148.
• Capps, K. M., Ludwig, J. B., Shridhar, P. B., Shi, X., Roberts, E., DebRoy, C., ... & Nagaraja, T. G. (2021). Identification, Shiga toxin subtypes and prevalence of minor serogroups of Shiga toxin-producing Escherichia coli in feedlot cattle feces. Scientific Reports, 11(1): 8601.
• Caro, I., Fernandez-Barata, V.M., Alonso-Llamazares, A. and Garcia-Armesto, M.R. (2006). Detection, occurrence, and characterization of Escherichia coli O157: H7 from raw ewe's milk in Spain. Journal of Food Protection, 69(4): 920-924.
• Caro, I., Mateo, J. and García‐Armesto, M.R. (2007). Phenotypical characteristics of Shiga-like toxin Escherichia coli isolated from sheep dairy products. Letters in Applied Microbiology, 45(3): 295-300.
• Chapman, P.A., Wright, D.J. and Siddons, C.A. (1994). A comparison of immunomagnetic separation and direct culture for the isolation of verocytotoxin-producing Escherichia coli 0157 from bovine faeces. Journal of Medical Microbiology, 40(6): 424-427.
• Clinical and Laboratory Standards Institute. (2019). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. M100 standard, 29th ed. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA.
• Delaquis, P., Bach, S. and Dinu, L.D. (2007). Behavior of Escherichia coli O157: H7 in leafy vegetables. Journal of Food Protection, 70(8): 1966-1974.
• Dontorou, C., Papadopoulou, C., Filioussis, G., Economou, V., Apostolou, I., Zakkas, G. et al., (2003). Isolation of Escherichia coli O157: H7 from foods in Greece. International Journal of Food Microbiology, 82(3): 273-279.
• Farrokh, C., Jordan, K., Auvray, F., Glass, K., Oppegaard, H., Raynaud, S., et al. (2013). Review of Shiga-toxin-producing Escherichia coli (STEC) and their significance in dairy production. International Journal of Food Microbiology, 162(2): 190-212.
• Franco, A., Lovari, S., Cordaro, G., Di Matteo, P., Sorbara, L., Iurescia, M. et al., (2009). Prevalence and concentration of verotoxigenic Escherichia coli O157: H7 in adult sheep at slaughter from Italy. Zoonoses and Public Health, 56(5): 215-220.
• Gomes, F., Saavedra, M. J. and Henriques, M. (2016). Bovine mastitis disease/pathogenicity: evidence of the potential role of microbial biofilms. Pathogens and Disease, 74(3).
• Gonzales-Barron, U., Gonçalves-Tenório, A., Rodrigues, V. and Cadavez, V. (2017). Foodborne pathogens in raw milk and cheese of sheep and goat origin: a meta-analysis approach. Current Opinion in Food Science, 18(1): 7-13.
• Jalil, K., Vadood, R., and Abolfazl, B. (2011). Direct detection of Escherichia coli O157 and its major virulence factor genes in animal feces at slaughter using multiplex polymerase chain reaction (PCR). African Journal of Microbiology Research, 5(14): 1763-1767.
• Kakagianni, M. and Koutsoumanis, K.P. (2019). Assessment of Escherichia coli O157: H7 growth in ground beef in the Greek chill chain. Food Research International, 123: 590-600.
• Khandaghi, J., Razavilar, V., & Barzgari, A. (2010). Isolation of Escherichia coli O157: H7 from manure fertilized farms and raw vegetables grown on it, in Tabriz city in Iran. African Journal of Microbiology Research, 4(9): 891-895.
• Khakpour, M., Nazeri, F., Khandaghi, J., and Shayegh, J. (2012). Prevalence of verotoxigenic Escherichia coli (VTEC) on slaughtered cattle and calves in Tabriz abattoir.The Veterinary Journal of the Islamic Azad University, Tabriz, 5(4): 1379-1385.
• Kiranmayi, C., Krishnaiah, N. and Mallika, E.N. (2010). Escherichia coli O157: H7-An Emerging Pathogen in foods of Animal Origin. Veterinary World, 3(8): 382-391.
• Kudva, I.T., Hatfield, P.G. and Hovde, C. J. (1996). Escherichia coli O157: H7 in microbial flora of sheep. Journal of Clinical Microbiology, 34(2): 431-433.
• Milnes, A.S., Stewart, I., Clifton-Hadley, F.A., Davies, R.H., Newell, D.G., Sayers, A.R. et al., (2008). Intestinal carriage of verocytotoxigenic Escherichia coli O157, Salmonella, thermophilic Campylobacter and Yersinia enterocolitica, in cattle, sheep and pigs at slaughter in Great Britain during 2003. Epidemiology and Infection, 136(6): 739-751.
• Morsel, M. and Shakerian, A. (2023). Investigation the contamination of raw milk with Escherichia coli and Escherichia coli O157: H7 in Ramhormoz city, Khouzestan. Journal Zoonosis, 3(2): 57-69
• Olowe, O.A., Aboderin, B.W., Idris, O.O., Mabayoje, V.O., Opaleye, O.O., Adekunle, O.C. et al., (2014). Genotypes and phenotypes of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) in Abeokuta, Southwestern Nigeria. Infection and Drug Resistance, 7: 253-259.
• Opsteegh, M., van Roon, A., Wit, B., Hagen-Lenselink, B., van Duijkeren, E., Dierikx, C. et al., (2018). Surveillance zoönosen in de melkgeiten-en melkschapenhouderij in 2016 (Surveillance zoonoses in dairy goat and dairy sheep industry in 2016). The Dutch National Institute for Public Health and the Environment, 1-72.
• Paiba, G.A., Pascoe, S.J.S., Wilesmith, J.W., Kidd, S.A., Byrne, C., Ryan, J.B. M. et al., (2002). Fecal carriage of verocytotoxin‐producing Escherichia coli O157 in cattle and sheep at slaughter in Great Britain. Veterinary Record, 150(19): 593-598.
• Paton, A.W., and Paton, J.C. (1998). Detection and Characterization of Shiga Toxigenic Escherichia coli by Using Multiplex PCR Assays for stx 1, stx 2, eaeA, Enterohemorrhagic E. coli hlyA, rfb O111, and rfb O157. Journal of Clinical Microbiology, 36(2): 598-602.
• Rahimi, E., Khamesipour, F., Yazdi, F. and Momtaz, H. (2012). Isolation and characterization of enterohaemorragic Escherichia coli O157: H7 and EHEC O157: NM from raw bovine, camel, water buffalo, caprine and ovine milk in Iran. Kafkas Universitesi Veterinetr Fakultesi Dergisi, 18(4): 559-564. [In Persion]
• Rani, A., Ravindran, V. B., Surapaneni, A., Mantri, N., & Ball, A. S. (2021). Trends in point-of-care diagnosis for Escherichia coli O157: H7 in food and water. International Journal of Food Microbiology, 349: 109233.
• Rey, J., Sanchez, S., Blanco, J.E., De Mendoza, J.H., De Mendoza, M.H., Garcia, A. et al., (2006). Prevalence, serotypes and virulence genes of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolated from ovine and caprine milk and other dairy products in Spain. International Journal of Food Microbiology, 107(2): 212-217.
• Sancak, Y.C., Sancak, H. and Isleyici, O. (2015). Presence of Escherichia coli O157 and O157: H7 in raw milk and Van herby cheese. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy, 59(4): 511-514.
• Thierry, S.I.L., Gannon, J.E., Jaufeerally-Fakim, Y. and Santchurn, S.J. (2020). Shiga-toxigenic Escherichia coli from animal food sources in Mauritius: Prevalence, serogroup diversity and virulence profiles. International Journal of Food Microbiology, 324\, 108589.
• van den Brom, R., de Jong, A., van Engelen, E., Heuvelink, A. and Vellema, P. (2020). Zoonotic risks of pathogens from sheep and their milk-borne transmission. Small Ruminant Research, 189: 106123.
• Yang, T., Wang, Z., Song, Y., Yang, X., Chen, S., Fu, S., ... & Jiang, Y. (2021). A novel smartphone-based colorimetric aptasensor for on-site detection of Escherichia coli O157: H7 in milk. Journal of Dairy Science, 104(8): 8506-8516.
• Zhong, J. and Zhao, X. (2018). Detection of viable but non-culturable Escherichia coli O157: H7 by PCR in combination with propidium monoazide. Three Biotechnology, 8(1): 28-32.
