ارزیابی کمی و کیفی سلول‌ها در چند محصول تجاری پروبیوتیک و بررسی تاثیر شرایط انبارمانی بر زنده‌مانی و قابلیت کشت مخمر پروبیوتیک

محورهای موضوعی : آلودگی میکروبی مواد غذائی

فاطمه حکیمی پور ¹ , رسول شفیعی ² , محمد ربانی ³

1 - گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران
2 - گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان،اصفهان، ایران
3 - گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران

تاریخ دریافت : 1398/02/25 تاریخ پذیرش : 1398/05/25 تاریخ انتشار : 1399/07/01

کلید واژه: پروبیوتیک, زنده‌مانی, فلوسایتومتری, ساکارومایسس بولاردی,

چکیده مقاله :

یکی از معیارهای مهم برای تعیین کیفیت محصولات حاوی پروبیوتیک ها، حضور تعداد مشخصی از سلول های زنده در هر گرم از محصول است. برای انتقال تعداد کافی از سلول های زنده به دستگاه گوارش، باید جمعیت میکروارگانیسم های پروبیوتیک طی دوره انبارمانی، حفظ شود. در مطالعه حاضر، در ابتدا جداسازی و شمارش سلول های زنده در چند محصول پروبیوتیک با استفاده از روش های شمارش در پلیت و فلوسیتومتری انجام شد. سپس جدایه ها با روش های بیوشیمیایی و مولکولی شناسایی شدند. همچنین تاثیر دماهای مختلف نگهداری طی 30 روز بر زنده مانی مخمرهای پروبیوتیک با روش های مذکور، ارزیابی شد. نتایج نشان داد که تعداد و نوع سویه جدا شده از یک نوع پروبیوتیک تجاری، ساشه پروتکسین ریستور، با تعداد و نوع سویه درج شده بر روی محصول مطابقت داشت، اما تعداد سلول های قابل کشت کپسول پروتکسین بالانس و محصول دیلیست با میزان جمعیت ادعا شده بر روی محصول مطابقت نداشت. در زمینه نتایج شمارش مخمرها نکته قابل توجه این بود که تنها 37 درصد سلول ها قابلیت کشت بر روی محیط کشت YPG آگار داشتند، در حالیکه بررسی زنده مانی سلول ها بر اساس انسجام غشای سیتوپلاسمی، حاکی از زنده مانی بیش از 87 درصد سلول ها بود. سلول های مخمری دیلیست، پایداری مطلوبی در محدوده دمایی 35-و 4 درجه سلسیوس نشان دادند. براین اساس می توان نتیجه گرفت که استفاده از روش های مختلف کشت و همچنین استفاده از شرایط فیزیکوشیمیایی متفاوت می تواند بر نتایج جداسازی و شمارش میکروارگانیسم ها تاثیر بسیار زیادی داشته باشد، در نتیجه استفاده از روش های مختلف جهت حصول به نتایج صحیح الزامی است.

چکیده انگلیسی:

One of the essential criteria for determining the quality of products containing probiotics is the presence of a certain number of viable cells per gram of product. To transmit enough viable cells to the gastrointestinal tract, the population of probiotic microorganisms should be preserved during storage. In the present study, culturable cells of some commercial products were isolated and enumerated by the plate count and flow cytometric methods. The isolates were then identified by biochemical and molecular methods. The viability of yeast cells was then assessed at different temperatures during 30 days by the methods above. The results showed that Protexin restore® contained the same types and number of bacteria that were claimed by the manufacturer. In contrast, protexin balance® and Dailyeast® contained a lower number of bacterial cells and yeast cells, respectively. It is noteworthy that only 33% of yeast cells were culturable on YPG agar, while flow cytometric analysis showed that 87% of cells were viable and exhibited cell membrane integrity. Also, yeast cells in Dailyeast® product were stable at 4-35°C. In conclusion, using different culture media and physicochemical conditions for the enumeration of viable and culturable cells may lead to different results. Thus, a combination of different methods should be used to get good results.

متن کامل:



ارزیابی کمي و کيفي سلول­ها  در چند محصول تجاری پروبیوتیک و  بررسي تاثير شرایط انبارماني بر زنده­ماني و قابليت کشت مخمر پروبیوتیک

عنوان کوتاه: ارزیابی زنده ماني سلول ها در چند محصول پروبیوتیک­ها

چکیده

یکی از معیارهای مهم براي تعيين کيفيت محصولات حاوي پروبيوتيک­ها، حضور تعداد مشخصي از سلول­هاي زنده در هر گرم از محصول است. برای انتقال تعداد کافی از سلول­های زنده به دستگاه گوارش، باید جمعیت ميکروارگانيسم­هاي پروبیوتیک طی دوره انبارماني، حفظ شود. در مطالعه حاضر، در ابتدا جداسازی و شمارش سلول­هاي زنده در چند محصول پروبیوتیک با استفاده از روش­هاي شمارش در پليت و فلوسيتومتري انجام شد.  سپس جدایه­ها با روش­هاي بيوشيميايي و مولکولي شناسايي شدند. همچنین تاثیر دماهاي مختلف نگهداري طي 30 روز بر زنده­ماني مخمرهاي پروبیوتیک با روش­های مذکور، ارزيابي شد. نتایج نشان داد که تعداد و نوع سویه جدا شده از يک نوع پروبيوتيک تجاري، ساشه پروتکسین ریستور، با تعداد و نوع سویه درج شده بر روی محصول مطابقت داشت، اما تعداد سلول­هاي قابل کشت کپسول پروتکسین بالانس و محصول دیلیست با میزان جمعیت ادعا شده بر روی محصول مطابقت نداشت. در زمينه نتايج  شمارش مخمرها نکته قابل توجه اين بود که تنها 37 درصد سلول­ها قابليت کشت بر روي محيط کشت YPG آگار داشتند، در حالیکه بررسي زنده­ماني سلول­ها بر اساس انسجام غشاي سيتوپلاسمي، حاکی از زنده­مانی بيش از 87 درصد سلول­ها بود. سلول­های مخمری ديليست، پايداري مطلوبي در محدوده دمايي 35-و 4 درجه سلسیوس نشان دادند. براين اساس مي­توان نتيجه گرفت که استفاده از روش­هاي­ مختلف کشت و همچنین استفاده از شرايط فيزيکوشيميايي متفاوت مي­تواند بر نتايج جداسازي و شمارش ميکروارگانيسم­ها تاثير بسيار زيادي داشته باشد، در نتيجه استفاده از روش­هاي مختلف جهت حصول به نتايج صحيح الزامي است.

واژگان کلیدی:  ساکارومایسس بولاردی، لاکتوباسيلوس، زنده­مانی، فلوسایتومتری، پروبیوتیک

 

 

 

 

 

 

 

 

مقدمه

پروبیوتیک­ها به عنوان محصولاتي تعریف می­شوند که حاوی میکروارگانیسم­های غیربیماری‌زای زنده هستند و پس از ورود به دستگاه گوارش، از طريق تداخل با میکروب­های بیماری­زا موجب حفظ تمامیت مخاط، کاهش میزان اسهال، جلوگیری از عفونت و التهاب، کاهش کلسترول و فشارخون، تعدیل نشانه­های بیماری­هايي نظير عدم تحمل لاکتوز، کلونیزاسیون، تحریک و تعدیل سامانه ایمنی، فعالیت­های ضدسرطانی و ضدجهش­زایی و ... مي­شوند [10]. میکروارگانیسم­های پروبیوتیک به سه گروه باکتری‌ها، قارچ‌ها و مخمرها تقسیم می‌شوند. برای طبقه‌بندی و انتخاب باکتری‌های پروبیوتیک از معیارهای خاصی نظیر نوع سویه و ویژگی‌های فیزیولوژیکی آن استفاده می‌شود. برای تعیین جنس جدايه­ها،  معمولا ازمطالعه‌ ژنوتیپی شامل تجزیه‌ و تحلیل ژن­هاي RNA ریبوزومی (زیر واحدهای S۱۶ و S۲۳) با استفاده از واکنش زنجیره­ای پلیمراز¹ (PCR) و الکتروفورز² انجام می‌شود [8]. اغلب میکروارگانیسم­هایي که به‌ عنوان پروبیوتیک استفاده می‌شوند شامل سویه‌هایی از جنس‌ لاکتوباسیلوس، بیفیدیوباکتریوم، باسیلوس، استرپتوکوکوس و کپک آسپرژیلوس³ و مخمرساکارومایسس⁴ هستند [11].

بر اساس استانداردهای بین­المللی، جمعیت میکروارگانیسم­های پروبیوتیک در يک محصول تجاري، يکي از معيار­هاي اساسی برای دستیابی به آثار مفید آن است؛ بنابراین در کنترل کیفیت محصول تهیه شده با عنوان پروبیوتیک، بررسی جمعیت میکروارگانیسم­ها از اصول اولیه به شمار می­رود. محصول پروبیوتیک باید حداقل حاوی یک میلیون میکروارگانیسم در هر واحد (گرم يا ميلي­ليتر) باشد؛ به طوری که پس از مصرف، جمعیت کافی از آن­ها به صورت زنده، فعال و به تعداد کافی به روده بزرگ برسند. این تعداد میکروارگانیسم باید از زمان تولید تا تاریخ انقضای محصول و در کل دوره نگهداری حفظ شود [22]. بنابراین رعایت استانداردهای تولید محصول پروبیوتیک و افزودن تعداد توصیه شده میکروارگانیسم پروبیوتیک اثربخشی لازم محصول، حائز اهمیت است [22]. 

روش­هاي مختلفي براي انتقال و رساندن پروبيوتيک­ها به جايگاه­هاي خاص از دستگاه گوارش ارائه شده است. با اين حال، در ایران و جهان، استفاده از پروبيوتيک­ها در فرمولاسیون مواد غذایی و مکمل­ها، معمول است. فرمولاسیون دارویی پروبیوتیک­ها شامل قرص، کپسول و شربت است. محصولات دارویی متعارف به دلیل قابل­کنترل بودن تعداد ميکروارگانيسم زنده و نيز نگهداري تحت شرايط خاص، دارای اثربخشی بیشتری است. در مورد غذايي پروبيوتيک، ميکروارگانيسمهاي پروبيوتيک اغلب در فورمولاسيون مواد غذايي شامل فرآورده­های لبنی مانند پنیر، ماست، دوغ کفیر و سایر فرآورده­های غذایی از جمله غلات، آبمیوه و شکلات وارد مي­شوند. میزان زنده­مانی پروبیوتیک­ها در محصولات تجاری مبتنی بر غذا طی مسیر تولید تا مصرف بستگی زیادی به نوع سویه و روش فرمولاسیون دارد [7,23] . در سال­های اخیر مطالعاتی در مورد کیفیت محصولات پروبیوتیکی در ایران و جهان انجام شده است؛ نتایج برخی از این مطالعات نشان داده­ است که تعداد باکتری­های پروبیوتیک محصولات تجاری با میزان ادعا شده در برچسب تغذیه­ای مغایرت داشته و کمتر از میزان ادعا شده بوده است[4,3,6,15,1,21]. بر اساس آنچه توضيح داده شد،  مطالعه حاضر با هدف شناسایی، شمارش، تعیین خصوصیات و بررسی زنده­مانی سلول­های پروبیوتیک در چند محصول تجاری و بررسی تاثیر شرایط نگهداري مختلف بر نیمه عمر محصول پروبیوتیک صورت گرفته است.

مواد و روش­ کار

نمونه­ها

در این پژوهش از کپسول بالانس پروتکسین⁵ و ساشه ریستور پروتکسین⁶ حاوی سویه­های  لاکتوباسیلوس کازئی، لاکتوباسیلوس رامنوسوس، استرپتوکوکوس ترموفیلوس، بیفیدوباکتریوم بروی، لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس، بیفیدوباکتریوم لانگوم و لاکتوباسیلوس بولگاریکوس ساخت کشور انگلستان و  همچنين کپسول دیلیست⁷ حاوی سویه ساکارومایسس بولاردی⁸ ساخت شرکت زیست تخمیر توليد شده در ايران جهت شمارش و تعيين نوع ميکروارگانيسم­ها استفاده شد.  از هر نمونه تجاري سه بسته با سري ساخت يا تاريخ توليد مشابه تهيه شد و در طي آزمايش­ها از هر سه بسته مذکور استفاده شد.

محیط کشت و شرایط کشت

از محیط­های کشت MRS آگار و M17 آگار (ساخت شرکت Biolife®) برای کشت، شمارش و جداسازی باکتری­های پروبیوتیک موجود در محصولات تجاری ذکر شده و همچنین از محیط کشت YPG آگار (g/L 10 عصاره مخمر، g/L 20 پپتون و g/L 20 گلوکز) برای کشت، شمارش و جداسازی مخمر پروبیوتیک استفاده شد. شرایط کشت برای باکتری­ها، دماي 37 درجه سلسیوس به مدت 48 الی 72 ساعت تحت شرایط هوازی و بی­هوازی و برای مخمر پروبیوتیک، دماي30 درجه سلسیوس به مدت 48 الی 72 ساعت تحت شرایط هوازی بود [20].

تهیه رقت و شمارش سلول­های زنده

جهت شمارش باکتری‌های پروبیوتیک موجود در محصولات تجاری پروبیوتیک ذکر شده توسط روش پلیت کانت، یک گرم از محصول تحت شرایط استریل به‌ تدریج به لوله اول حاوی نه میلی‌لیتر محیط MRS براث افزوده شد. بعد از گذشت پنج دقیقه، لوله به مدت 30 ثانیه با دور rpm 2500 روی ورتکس قرار داده شد تا سوسپانسیون یکنواختی از باکتری‌ها به دست آید. سپس میزان یک میلی­لیتر از لوله اول تحت شرایط استریل به لوله دوم حاوی نه میلی‌لیتر محیط MRS براث انتقال داده شد و لوله مجددا ورتکس شد و تا لوله ششم تکرار شد. سپس میزان 100 میکرولیتر از لوله چهارم تا ششم با سه تکرار تحت شرایط استریل به محیط MRS آگار و M17 آگار انتقال داده شد و کشت گسترده⁹ با استفاده از ميله شيشه­اي استريل صورت گرفت. پليت­ها در دماي 37 درجه سلسیوس گرمخانه‌گذاری شدند و بعد از گرمخانه­گذاری شمارش کلنی صورت گرفت[20]. 

برای شمارش مخمر پروبیوتیک از کپسول دیلیست نیز همین روش با شرایط مذکور استفاده شد با اين تفاوت که از محيط کشت   YPG آگار و دماي 30 درجه سلسیوس استفاده شد.

جداسازی میکروارگانیسم­های پروبیوتیک

برای جداسازی و افتراق ميکروارگانيسم­هاي موجود در محصولات مورد آزمایش، پس از پایان زمان گرمخانه‌گذاری پليت­ها (مرحله قبل)، کلني­هاي جدا با ظاهر متفاوت از نظر رنگ، قطر، برآمدگی (صاف، محدب و مقعر) و شکل (کروی، بیضوی وچین‌خورده) روی محیط‌ کشت‌های جديد منتقل شدند و نهايتا خالص­سازی شدند.

شناسایی باکتری­های پروبیوتیک موجود در محصولات تجاری

شناسایی جدایه‌ها به روش بیوشیمیایی

به منظور شناسایی خصوصيات بيوشيميايي جدایه‌هاي باکتريايي از کیت بیوشیمیایی  API 50 CHساخت شرکت بیومریوکس¹⁰ ، طبق دستورالعمل ارائه شده در کيت استفاده شد. به صورت خلاصه سوسپانسیونی با کدورت معادل دو مک‌فارلند معادل        cfu/ml 108 × 6 باکتری از جدایه‌های خالص شده بر روی محیط MRS در محیط CHL (محيط انتقالي موجود در کيت­ها)  تهیه شد. سپس تلقیح از محیط CHL به میکروتیوب‌های دهیدراته صورت گرفته و با روغن معدنی¹¹ پوشیده‌ شده و در دمای 30 درجه سلسیوس به مدت 48 الی 72 ساعت تحت شرایط ‌هوازی گرمخانه‌گذاری شدند. پس از اتمام زمان گرمخانه‌گذاری تغییر رنگ و کدورت در میکروتیوب‌ها بررسی شد. ايجاد کدورت و تغيير رنگ نشانه مثبت بودن آزمايش است.

شناسایی جدایه‌ها به روش مولکولی 

جهت شناسايي دقيق­تر جدايه­هاي باکتريايي از روش تعيين توالي PCR 16S rDNA استفاده شد. DNA ژنومی پنج جدایه از طریق کیت استخراج DNA  ژنومی شرکت سیناژن استخراج شده و واکنش PCR با آغازگرهای 16S rDNA عمومی (27F و 1492R) انجام گرفت. پس از مشاهده‌ی باند واضح و عدم وجود باند غیراختصاصی و اسمیر برای هر یک از جدایه‌ها، محصول PCR برای توالی‌یابی به شرکت ژن‌فناوران تهران ارسال شد. توالی حاصل از دو آغازگر رفت و برگشت به وسیله نرم‌افزار CLC Main Workbench ویرایش و به­ هم متصل شدند. سپس برای تشخیص جنس و گونه باکتری به سایت مرکز ملي اطلاعات بیوتکنولوژی¹² مراجعه و نتایج توالی‌یابی Blast شد.

رسم درخت فیلوژنتیک

 با استفاده از توالی جدایه­ها و نرم­افزار MEGA 6.06 درخت فیلوژنتیک برای جدایه­های شناسایی شده رسم شد.

بررسی خصوصیات بیوشیمیایی مخمرپروبیوتیک 

به منظور بررسی خصوصیات بیوشیمیایی مخمر ساکارومایسس بولاردی توسط کیت بیوشیمیاییAPI 20 C  ، سوسپانسیونی با کدورت دو مک‌­ فارلند (معادل  cfu/ml108 × 6) از جدایه‌ خالص شده بر روی محیط YPG آگار در محیط API C تهیه شد. سپس تلقیح از محیط API C به میکروتیوب‌های دهیدراته صورت گرفته و در دمای 30 درجه سلسیوس به مدت 48 الی 72 ساعت گرمخانه‌گذاری شدند. پس از اتمام زمان گرمخانه‌گذاری، ظهور کدورت در میکروتیوب‌ها بررسی شد. ايجاد کدورت نشانه مثبت بودن آزمايش است.

بررسی زنده­مانی جدايه مخمر با استفاده از فلوسایتومتری

آماده‌سازی سلول‌های مخمر جهت کالیبراسیون دستگاه فلوسایتومتر

کشت تازه از مخمر، با انتقال از محیط YPG­ آگار به محیط YPG براث و گرمخانه­گذاری در دمای 30 درجه سلسیوس با دور rpm 120 به مدت 20 ساعت صورت گرفت. بعد از رشد سلول‌ها سوسپانسیون سلولی به مدت پنج دقیقه با دور rpm 2500 سانتریفیوژ گردید و محلول رویی دور ریخته شد. برای شستشوی رسوب حاصل، پنج میلی­لیتر  محیط YPG براث اضافه گردید و به مدت 30 ثانیه با دور rpm 1500 توسط ورتکس به‌ خوبی مخلوط شد و سوسپانسیون سلولی حاصل دوباره سانتریفیوژ گردید و محلول رویی دور ریخته شد. به رسوب حاصل پنج میلی­لیتر محیط YPG براث اضافه گردید و جمعیت سلولی زنده به دست آمد. برای ایجاد جمعیت سلولی مرده،‌ سلول‌های زنده به مدت 15 دقیقه در معرض دمای 63 درجه سلسیوس در حمام آب قرار گرفتند[18,19,17].

کالیبراسیون دستگاه فلوسایتومتری 

 براي تعيين زندماني مخمرها از روش شفيعي و همکاران با اندکي تغييرات استفاده شد [18,19,17]. به صورت خلاصه، براي کاليبره نمودن دستگاه فلوسايتومتر، از سه جمعيت مخمري (سلول­هاي زنده، سلول­هاي مرده و  مخلوط سلول­هاي زنده و مرده) به تعداد 107 سلول در ميلي­ليتر استفاده شد. هر دسته سلول با استفاده از دو فلوروکروم طبق روشي که توضيح داده مي­شود، رنگ­آميزي شدند. برای نشان‌دار کردن سلول‌های آسيب ديده يا غيرزنده در هر جمعيت سلولي، میزان 30 میکرولیتر محلول پروپیدیوم یدید¹³ 9/1 میلی‌مولار (معادل 3/1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) به 1200 میکرولیتر سوسپانسیون سلولی مرده اضافه شد و به مدت پنج دقیقه در تاریکی و دمای اتاق گرمخانه‌گذاری شد. پس از اين مدت، میزان 10 میکرولیتر محلول تیازول نارنجی¹⁴ 17 میکرومولار (معادل 1/8 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) به 1200 میکرولیتر سوسپانسیون سلولی اضافه گردید و به مدت 20 دقیقه در تاریکی و دمای اتاق گرمخانه‌گذاری گردید. سپس سوسپانسیون­ سلول­های زنده يا مرده از مخمر به تنهایی یا به صورت مخلوط (زنده و مرده) برای تعیین خصوصیات و بررسي پاسخ به دتکتورهای FLI(380V) و FL3(350V) منتقل شدند.

کليه ذرات موجود در محيط ارائه شده به دستگاه فلوسيتومتر (مدل Partec و مارک FlowMax) با استفاده از کانال FSC(180V) مقابل SSC(400V) بدست آمد. سپس بر اساس رنگ­آميزي با تيازول نارنجي، کل جمعيت سلول­ها (سلول مرده و زنده) در پلات‌های FSC مقابل  FL1 (380V)بدست آمد. از بين جمعيت رنگ­آميزي شده با تيازول نارنجي، افتراق زير جمعیت­های مرده و زنده بوسیله رنگ پروپيديوم يديد و در پلات‌ FL1  مقابل FL3 متمایز شدند. فایل‌های داده‌های حاصل از فلوسایتومتری با استفاده از نرم افزار Partec FLoMax  تجزیه و تحلیل شد[18,19,17].

بررسی ماندگاری محصول پروبیوتیک

به منظور بررسی سینتیک مرگ مخمر ساکارومایسس بولاردی از روش سینتیک مرگ تسریع شده¹⁵ استفاده شد. در اين روش، مقادیر یکسانی از نمونه توزین گردید و دردماهاي (يخچال)  4 درجه سلسیوس، دماهاي محيط (20 و 35 درجه سلسیوس) و دماي افزايش يافته محيطي( 50 درجه سلسیوس) به مدت 30 روز گرمخانه‌گذاری شد. انتخاب دماهاي مختلف  جهت بررسی زنده‌مانی سلول‌ها در روزهای اول، دهم، بیستم و سی‌ام روش پلیت کانت و فلوسایتومتری انجام شد.

نتایج

شمارش باکتری‌های پروبیوتیک

نتایج حاصل از شمارش باکتری‌های پروبیوتیک به روش پلیت کانت در جدول 1 ارائه شده است. با توجه به نتایج حاصل از شمارش در محيط­هاي کشت­ و شرايط مختلف (حضور يا عدم حضور اکسيژن و دماهاي مختلف)، مجموع بيشترين سلول­هاي ميله­اي شکل و نيز کوکسي شکل در هر دو نوع محيط کشت به عنوان معيار مقايسه با تعداد ادعا شده بر بسته بندي محصول قرار گرفت. بر اين اساس، تعداد کل جمعیت شمارش شده از کپسول پروتکسین بالانس (در مجموع 108×51/1 سلول در هر گرم از محصول)  با جمعیت درج شده بر روی محصول مطابقت نداشت، اما تعداد سلول شمارش شده از ساشه پروتکسین ریستور نسبت به جمعيت ادعا شده بر بسته بندي محصول بيشتر بود،  با اين حال از لحاظ آماري تفاوت معنا­داري (05/0 p<) با تعداد جمعیت درج شده بر روی محصول نداشت.

 

 

 

 

 

 

 

جدول 1. نتایج حاصل از شمارش ميکروارگانيسم­هاي قابل کشت در محصولات تجاری تحت شرايط مختلف

محیط کشت و شرایط کشت	تعداد ميکروارگانيسم­هاي قابل کشت برآورد شده در پلیت کانت محصولات تجاری (‌CFU/g)
	کپسول پروتکسین بالانس	ساشه پروتکسین ریستور
MRS آگار، هوازی، 37 درجه سلسیوس	107 × 3/7 (106×8/9±)	109  × 07/1 *(108×1/6±)
MRS آگار، بی هوازی، 37 درجه سلسیوس	107 × 5/4 (106×7/6±)	109 × 09/1 (108×2/7±)
M17 آگار، هوازی، 37 درجه سلسیوس	107 × 8/7 (106×7/1±)	109 × 29/1 (108×7/8±)
M17 آگار، بی هوازی، 37 درجه سلسیوس	107 × 3/3 (106×8/5±)	109 × 25/1 (108×5/9±)
مقدار ادعا شده در محصول تجاری	108 × 0/2	109 × 00/1
*مقادير ارايه شده ميانگين ± انحراف از معيار استاندارد مي باشد.

 

شمارش سلول­های زنده مخمر در محصول به روش پلیت کانت

نتایج حاصل از پلیت کانت مخمر‌های موجود در محصول دیلیست نشان داد که حداقل تعداد زنده بدست آمده در یک گرم از محصول پروبیوتیک معادل CFU/g 109 × 6/6 بود. تعداد ادعا شده در محصول مورد آزمایش CFU/g 1010 × 00/2 می‌باشد. بنابراین می‌توان گفت که درصد قابل کشت با استفاده از روش کشت و نوع محيط کشت مورد استفاده (محیط YPG آگار) در اين تحقيق برابر با 18/33 درصد ميزان ادعا شده می‌باشد.

بررسی سلول­های زنده مخمر در محصول به روش فلوسایتومتری

نتایج حاصل از بررسی زنده‌مانی سلول‌های مخمر به روش فلوسایتومتری در شکل1 نشان داده شده است. طبق پروتکل توضيح داده شده در بخش مواد و روش کار، کليه سلول­ها (مرده و زنده) رنگ تيازول نارنجي را مي پذيرند، لذا همانطور که در شکل 1 ب نشان داده شده است با انتخاب اين نوع سلول­ها احتمال خطای ناشي از شمارش ذرات غيربيولوژيک کاهش مي­يابد. همانطور که در هيستوگرام شکل 1 ج مشخص است، قسمت اعظم سلول­ها در ناحيه­ايي قرار گرفته­اند که ميزان جذب رنگ پروپيديوم يدید حداقل است. درصد سلول‌های زنده يعني ناحیه R3 (نشان‌دار شده با رنگ تیازول نارنجی و بدون رنگ پروپيديم يديد) در شکل 1د برابر با 37/87 درصد می‌باشد. 

 

شکل 1- تعيين سلول­هاي زنده و غير زنده مخمر ساکارومايسس بولاردي در محصول تجاري ديليست.  الف، ناحیه R1 نشان‌دهنده‌ی کلیه‌ی ذرات (شامل سلول­هاي زنده و مرده و ...) موجود در محیط بر اساس دو مشخصه‌ی FSC و SSC می‌باشد. ب، ناحیه R2 نشان‌دهنده‌ی کلیه سلول‌هایی است که با رنگ تیازول نارنجی رنگ‌آمیزی شده‌اند و بر روی کانال FL1 قابل تشخیص می‌باشند. ج، هیستوگرام سلول‌های رنگ شده با رنگ پروپیدیوم یدید را نشان می‌دهد که بر روی کانال FL3 قابل تشخیص می­باشند. د، نشان‌دهنده‌ی دو جمعیت مختلف از سلول‌هایی است که با دو رنگ تیازول نارنجی و پروپیدیوم یدید رنگ‌آمیزی شده‌اند و بر روی کانال‌های FL1 و FL3 قابل تشخیص می‌باشند. همان‌گونه که مشخص است قسمت اعظم سلول‌ها (R3) رنگ پروپیدیوم یدید را جذب نکرده‌اند و  لذا داراي جذب اندک بر کانال FL3 بوده و بنابراين زنده مي­باشند. 

شناسایی بیوشیمیایی ومولکولی جدایه‌ها

در کيت API، در اثر تخمیر قند مورد نظر توسط جدایه، اسید تولید شد که سبب تغییر رنگ شناساگر از بنفش به زرد شد و نتیجه تخمیر قند مورد نظر مثبت گزارش شد. قند‌هایی که باکتری‌ها توانایی تخمیر آن‌ها را نداشته به رنگ بنفش باقی ماندند و نتیجه تخمیر منفی گزارش شد. بر این اساس، نمونه­های CM8، AN1،  SM1 و SM2 میکروارگانیسم­هایی با خصوصیات جنس لاکتوباسیلوس­ها شناسايي شد (جدول 2).

نتایج حاصل از الکتروفورز با استفاده از آغازگرهای مورد استفاده، در شکل 2 نشان داده شده است. با توجه به این که اندازه‌ی محصول آغازگرهای مورد استفاده bp 1500 است، یک باند قوی در محدوده‌ی bp 1500 مشاهده شد. با تعیین توالی و BLAST مشخص شد که میکروارگانیسم­های جدا شده (نمونه­های AN1، SM1 و )SM2 ­لاکتوباسیلوس رامنوسوس و نمونه CM8  لاکتوباسیلوس پاراکازئی می­باشد. نتایج حاصل از شناسایی بیوشیمیایی و مولکولی در جدول 2 ارائه شده است.

 

شکل 2. الکتروفورز محصولات واکنش PCR جدایه‌های  CM8، SM1 و AN1 به همراه نمونه بدون  DNA (کنترل منفي) الگو به عنوان کنترل منفی و نمونه Ladder . همانطور که ديده مي­شود هر سه جدايه داراي باند مشخص (حدود 1500 جفت باز) مي باشند.

جدول2: نتایج حاصل از شناسایی مولکولی جدایه‌ها

نام نمونه	منبع	سویه شناسایی شده	درصد اطمینان حاصل از شناسایی مولکولی
CM8	کپسول بالانس پروتکسین	لاکتوباسیلوس پاراکازئی	99
AN1		لاکتوباسیلوس رامنوسوس	99
SM1	ساشه ریستور پروتکسین	لاکتوباسیلوس رامنوسوس	99
SM2		لاکتوباسیلوس رامنوسوس	100

 

رسم درخت فیلوژنتیک

نتایج رسم درخت فیلوژنتیک جدایه­­ها در شکل 3 نشان‌دهنده‌ی احتمال قرار گرفتن دو یا چند باکتری در یک شاخه از جد مشترک می‌باشد. هم‌ردیفی توالی 16S rDNA نمونه­ها به همراه تعدادی از گونه­های جنس لاکتوباسیلوس در نرم‌افزار MEGA 6.06 به روش MUSCLE انجام گرفت و سپس ارتباط تبارشناسی سویه‌ها با روش الحاق همسایگی¹⁶ مشخص شد. ارزش بوت استرپ¹⁷ با بیان درصد از 1000 تکرار در بالای شاخه‌ها نشان داده شده است و شاخه­های بالای 50 درصد ارزش قابل استناد محسوب شد.

 

شکل 3. درخت فیلوژنتیک جدایه­ها رسم شده با استفاده از نرم افزار 06/6 MEGA 

نتایج جداسازی، شناسایی و رسم درخت فیلوژنتیکی جدایه‌ها نشان داد که باکتری­های جداسازی شده در این مطالعه متعلق به گونه­های لاکتوباسیلوس رامنوسوس، لاکتوباسیلوس پاراکازئی و استرپتوکوکوس ترموفیلوس بودند. بیشترین باکتری جدا شده در این مطالعه، لاکتوباسیلوس رامنوسوس بود. سویه­های لاکتوباسیلوس رامنوسوس از نمونه­‌ی ساشه و کپسول جداسازی شد که نوع سویه با ادعای تولیدکننده مطابقت داشت ولی سویه­ لاکتوباسیلوس پاراکازئی جداسازی شده از نمونه کپسول با ادعای تولیدکننده مطابقت نداشت.

شناسایی بیوشیمیایی مخمر ساکارومایسس بولاردی

پس از گذشت 48 ساعت گرمخانه‌گذاری، کدورت در بعضی از میکروتیوب‌ها مشاهده شد که نشان‌دهنده‌ی مثبت بودن تخمیر قند و مصرف کربوهیدرات به عنوان منبع کربنی توسط مخمر بود و عدم کدورت میکروتیوب­ها نشان‌دهنده‌ی عدم تخمیر قند مورد نظر بود. بنابراین نتایج حاصل از کیت نشان داد که مخمر جداسازي شده به جنس ساکارومایسس تعلق دارد و توانايي تخمیر قندهای گلوکز، گالاکتوز، مالتوز، ساکارز، تره‌هالوز، ملیزیتوز، رافینوز و گلیسرول را دارا می‌باشد.

بررسی زنده­ماني مخمرهای پروبیوتیک موجود در محصول پروبیوتیک ديليست  طي انبار­ماني

سینتیک مرگ سلول‌های مخمر در محصول تجاري ديليست، طي مدت 30 روز در دماهاي مختلف و  به دو روش پلیت‌ کانت و فلوسایتومتری بررسی شد. بر اساس نتايج بدست آمده و به صورت کلي، محصول ديليست پايداري مطلوبي در محدوده دمايي مورد آزمايش (50-4 درجه سلسیوس)‌ در طي يک دوره يک ماهه داشت. با اين حال با کاهش دماي نگهداري، روند کاهش تعداد
 سلول­هاي قابل کشت نيز کاهش يافت، به صورتيکه حتي پس از گذشت 20 روز نگهداري در دماي 35-و 4 درجه سلسیوس، تعداد سلول­ها نسبت به نمونه شاهد (زمان صفر) تغيير معني­داري نداشت (شکل 4). در دماي 4 درجه سلسیوس، حتي پس از 30 روز تعداد قابل کشت مخمر نسبت به نمونه شاهد تفاوتي نداشت.  با افزايش دما به 50 درجه سلسیوس، تعداد سلول­هاي قابل کشت پس از گذشت 10 روز کاهش معني­داري نسبت به نمونه شاهد نشان داد به صورتيکه  تنها حدود 50 درصد سلول­ها، قابليت کشت داشتند. بررسي زنده­ماني سلول­هاي مخمر بر اساس ارزيابي انسجام غشاي سلول¹⁸ با استفاده از روش فلوسيتومتري نيز نشان داد که زنده­ماني سلول­هاي مخمري دهيدراته در محصول تجاري ديليست، وابسته به دماي نگهداري است (شکل 5). با اين حال، همانطور که در شکل 5 ديده مي­شود، روند کاهش سلول­هاي زنده نسبت به روند کاهش سلول­هاي قابل کشت (شکل 4) آهسته­تر است به طوري که مثلا در دماي 4 درجه سلسیوس، تمام سلول­ها زنده­ماني (شکل 4) خود را طي 30 روز حفظ نمودند، اما قابليت کشت آن­ها پس از طي اين مدت کاهش يافت (شکل 5).  به عبارت ديگر، مي­توان چنين استباط نمود که سلول­ها ابتدا قابليت رشد و کشت خود را از دست مي­دهند و در نهايت زندماني آنها تحت تاثير قرار مي­گيرد. نکته مهم ديگري نيز رابطه با مخمرهاي مورد آزمايش ايجاد آسيب به غشاي سلول­ها در 25 درصد جمعيت سلول­ها بود همچنين مشخص شد که 75 درصد سلول­ها در روز اول به عنوان مخمرهاي زنده و غير قابل نفوذ نسبت به پروپيديوم يديد قابل مشاهده بودند.

 

شکل 4. شمارش سلول­هاي زنده و قابل کشت مخمر نگهداري شده در دماي مختلف به روش پليت کانت. سلول‌های مخمر خشک شده (محصول ديليست) براي مدت 30 روز در ظرف در بسته، تاريک و در دماي مختلف نگهداري شدند. سپس تعداد سلو­ل­هاي قابل کشت به روش پليت کانت بررسي شد. آزمايش­ها حداقل در سه تکرار انجام شد و نتايج ارائه شده انحراف معيار ± ميانگين است. حروف متفاوت نشان داده شده، بیانگر تفاوت معنادار (05/0 p≤) بین هر آزمایش با زمان صفر (کنترل) می‌باشد.

 

شکل 5: بررسي زنده­ماني سلول­هاي مخمري محصول ديليست نگهداري شده در دماهاي مختلف به روش فلوسيتومتري. سلول‌های مخمر خشک شده براي مدت 30 روز در ظرف در بسته، تاريک و در دماهاي مختلف نگهداري شدند. سپس زنده­ماني سلو­ل­ها بر اساس ارزيابي تمامیت غشای سلولي مورد بررسي قرار گرفت. آزمايش­هاي فلوسايتومتري حداقل در سه تکرار انجام شد و نتايج ارائه شده انحراف معيار ± ميانگين است.

بحث

با توجه به اهميت زنده­ماني سلول­ها در محصولات پروبيوتيک، در این مطالعه تعداد سلول­های زنده موجود در چند محصول تجاری بررسی شد. همچنين تاثير دماي نگهداري بر روي سلول­هاي مخمر پروبيوتيک ساکارومايسس بولاردي مورد بررسي قرار گرفت.

 نتایج حاصل از شمارش باکتری‌های پروبیوتیک موجود در محصول تجاری کپسول بالانس پروتکسین به روش پلیت کانت نشان داد که مجموع جمعیت شمارش شده در محيط کشت­هاي مختلف (MRS آگار و M17 آگار) با مقدار درج شده بر روی محصول اختلاف معناداري دارد و جمعیت شمارش شده بر روی پلیت (5/24 درصد) کمتر از مقدار درج شده بر روی محصول بسته‌بندی شده است. نتایج حاصل از شمارش باکتری‌های پروبیوتیک موجود در محصول تجاری ساشه ریستور پروتکسین به روش پلیت کانت نشان داد که میزان جمعیت شمارش شده با میزان جمعیت درج شده بر روی محصول پروبیوتیک یکسان بوده و اختلاف معني­داري در جمعیت شمارش شده با تعداد ادعا شده وجود ندارد. بدست آوردن نتايج متفاوت نسبت به مقادير ادعا شده  بر محصولات تجاري و حتي تفاوت در نوع ميکروارگانيسم­هاي ادعا شده، در تحقيقات قبلي نيز ديده شده است. Elliot و همکاران (2004) پس از بررسی نه محصول پروبیوتیک گزارش کردند که شمارش و بررسی نوع باکتری تنها در سه محصول با برچسب آن مطابقت داشت و در سایر نمونه­ها تعداد و نوع سویه با ادعای تولیدکننده هم­خوانی نداشت. در مطالعه ديگري نيز نشان داده شد که نتایج شمارش ميکروارگانيسم­هاي پروبیوتیک‌ جدا شده از محصول تجاري پروبیوتیک، در برخی موارد با جمعیت ادعا شده بر روی محصول پروبیوتیک اختلاف دارد، همچنين تنها از 63 درصد نمونه­هاي محصول خشک شده، باکتري قابل جداسازي بود [21].  نتایج شناسایی و رسم درخت فیلوژنتیکی جدایه‌ها نشان داد که باکتری­های جداسازی شده در این مطالعه متعلق به گونه­های لاکتوباسیلوس رامنوسوس، لاکتوباسیلوس پاراکازئی بودند. بیشترین باکتری جدا شده در این مطالعه، لاکتوباسیلوس رامنوسوس بود. سویه­های لاکتوباسیلوس رامنوسوس از نمونه­‌ی ساشه و کپسول جداسازی شد که نوع سویه با ادعای تولیدکننده مطابقت داشت، ولی سویه­ لاکتوباسیلوس پاراکازئی جداسازی شده از نمونه کپسول با ادعای تولیدکننده مطابقت نداشت. در برخي از مطالعات قبلي نيز تفاوت در نوع ميکروارگانيسم­ها و يا جداسازي ميکروب­هاي کاملا متفاوت در نمونه­هاي تجاري گزارش شده است. در مطالعه­ايي که در سال 2003 انجام شد، مشخص شد که سویه‌های ادعا شده بر روی محصول پروبیوتیکی در برخی از محصولات با سویه‌های شناسایی شده متفاوت می‌باشد. همچنين برخي از محصولات تجاري حاوي باکتري انتروکوکوس فکاليس بوده است در حاليکه محصول مورد آزمايش ادعاي ديگري را بر محصولات درج نموده است [21]  .در مطالعه ديگري توسط پاترون¹⁹ و همکاران در سال 2016 مشخصه‌های مولکولی و میکروبیولوژیکی پروبیوتیک‌های تجاری حاوی باسیلوس کلاوسی از هند و پاکستان بررسی شد. در این مطالعه میزان جمعیت اسپور ادعاشده بر روی محصول تجاری و شناسایی گونه‌های آن‌ها انجام گرفت. روش‌ شناسایی جدايه ها در این مطالعه، روش S rDNA16بود. نتایج مطالعات این محققان نشان داد که جمعیت اسپور ادعا شده بر روی دو محصول با جمعیت شمارش شده یکسان می‌باشد، ولی جمعیت اسپور شمارش شده از دو محصول ديگر کمتر از میزان ادعا شده بود. همچنین نتایج شناسایی مولکولی نشان داد که يکي از محصولات به جای باسیلوس کلاوسی حاوي باسیلوس سرئوس و باسیلوس آمیلولیکوئی‌فاشینس بوده است [12].

مخمر پروبيوتيک ساکارومايسس بولاردي خواص فيزيولوژيک منحصر به فردي از قبيل تحمل به تغييرات pH، دما، آنتي بيوتيک­ها، استرس هاي موضعي دستگاه گوارش و ... دارد. اين مخمر همچنين با سازوکارهايي مي­تواند موجب حذف باکتري­هاي بيماريزا و نيز جلوگيري از اتصال باکتري­هاي بيماريزا به غشاي مخاطي شود [24,16]. با توجه به اينکه براي اثرگذاري پروبيوتيک­ها بايد تعداد مشخصي از ميکروارگانيسم­هاي زنده مصرف شود، تعداد مخمرهاي زنده قابل کشت در نمونه تجاري ديليست شمارش شد. نتایج حاصل از شمارش مخمر پروبیوتیک ساکارومایسس بولاردی در محصول تجاری دیلیست به روش پلیت کانت نشان داد که میزان جمعیت قابل کشت شمارش شده با مقدار درج شده بر روی محصول اختلاف دارد و جمعیت شمارش شده بر روی پلیت کمتر از مقدار درج شده بر روی محصول بسته‌بندی شده است و درصد قابل کشت حاصل از روش کشت برابر با 18/33 درصد 
می­باشد. این تفاوت در جمعیت می‌تواند به دلایل متعدد نظير از دست رفتن سلول‌های زنده در محصول در طول مدت نگهداری، نامناسب بودن محيط کشت، کاهش تعداد سلول­هاي قابل کشت پس از آبگيري مجدد و غیره باشد.

 ميکروارگانيسم هايي که به عنوان پروبيوتيک مطرح مي شوند بايد بتوانند شوک­هاي مختلف نظير شوک دما، اسيد، وجود نمک صفراوي و ... را تحمل نمايند [14]. در اين راستا در بخش دوم اين پژوهش تحمل دمايي محصول تجاري ديلييست بررسي شد. تحمل شوک حرارتي هم از لحاظ نگهداري محصول و هم از لحاظ عملکرد سلول­ها در بدن ميزبان اهميت دارد. از طرفي طي 30 سال گذشته استفاده از فلوسايتومتري براي تعيين زندماني مخمرها در محصولات مختلف غذايي و دارويي رايج شده است [2,5]. نتایج حاصل از بررسی زنده­ماني محصول حاوی مخمر پروبیوتیک طی 30 روز در دماهای مختلف به روش پلیت کانت و فلوسایتومتری مشخص نمود که سلول­های مخمر ساکارومایسس بولاردی در دماي 4 درجه سلسیوس (دماي يخچال) بیشترین زنده­مانی را طي 30 روز نشان داد. با افزایش دمای نگهداری به 50 درجه سلسیوس (دمايي که گاهي اوقات محصولات طي حمل نقل به مناطق گرمسير متحمل مي­شوند)، میزان زنده­­مانی و قابلیت کشت سلول­ها کاهش یافت. نکته جالب در اين زمينه اين بود که  نتایج حاصل از تعیین زنده‌مانی سلول‌های مخمر به روش فلوسایتومتری، تعداد سلول زنده‌ بيشتري را در مقایسه با روش پلیت کانت نشان داد. همچنين، به عنوان مثال بايد شوک خفيف حرارتي ناشي از دماي داخلي بدن پستانداران را تحمل نمايند در این مطالعه از رنگ‌های پروپیدیوم یدید و تیازول نارنجی برای رنگ‌آمیزی سلول‌ها استفاده شد. رنگ پروپيديوم يديد توانايي عبور از غشای سيتوپلاسمي سالم و منسجم را ندارد، لذا سلول­هاي سالم بي­رنگ باقي مي­مانند، درمقابل سلول­هاي آسيب ديده يا مرده به دليل نشت²⁰ در غشاي سيتوپلاسمي اجازه ورود رنگ را به داخل سلول داده و در نتيجه رنگ­دار خواهند شد[18,19,17]. بنابراين، مي­توان استنباط کرد که زنده­ماني تعيين شده با رنگ پروپيديوم يديد وابسته به انسجام غشاي سلول است. با توجه به اينکه رشد و تکثير سلول که مبناي تعيين سلول­هاي زنده در روش پليت کانت است وابسته به سالم بودن بسياري از عوامل سلول است، لذا مي­توان گفت که هر گونه آسيب جزئي به سلول يا فراهم نشدن شرايط براي کشت سلول­هاي آسيب ديده، مي­تواند منجر به عدم رشد و کاهش تعداد سلول­هاي شمارش شده بر روي پليت گردد. اين امر در نهايت باعث تفاوت معني­دار در نتايج تعيين سلول­هاي زنده در هر روش مي­گردد. همانطور که قبلا اشاره شد استفاده از فلوسيتومتري براي تعيين تعداد و افتراق سلول­هاي مخمري قدمت زيادي دارد. به عنوان مثال Hutter  و همکاران (1979)  ميزان خلوص سلول­هاي مخمر را با استفاده از روش‌های فلوسایتومتری  و ايمنوفلورسانس بررسی کردند آنها به اين نتيجه رسيدند که نتايج تعيين خلوص با روش­هاي مذکور بسيار شبيه نتايج تعيين خلوص با روش کشت است [9]. در مطالعه ديگري که توسط Prudêncio و همکاران (1998) برای تشخیص سلول‌های تحت تنش و بدون تنش در جمعیت مخمرهای آبجو  توسط رنگ‌های فلورسنت و فلوسایتومتری انجام شد، آن­ها به اين نتيجه رسيدند که تنش اسيدي موجب تغييراتي در سلول­ها مي­شود که نهايتا منجر به تفاوت معني­دار در تعيين زنده­ماني به روش پليت کانت با نتايج حاصل از تعيين زنده­ماني توسط فلوسيتومتري مي­شود [13]. بر اين اساس نمي­توان انتظار داشت که نتايج روش­هاي مختلف براي بررسي زنده­ماني هميشه با يکديگر همخواني داشته باشد.

 

نتیجه­گیری

اين تحقيق با هدف بررسي تعداد ميکروارگانيسم­هاي زنده و قابل کشت در چند محصول تجاري و نيز بررسي تاثير دماي نگهداري بر زندماني مخمرهاي موجود در يک محصول تجاري پروبيوتيک انجام شد. براساس نتايج بدست آمده، تعداد ميکروارگانيسم درج شده بر روی محصولات تجاری پروبیوتیک در برخی موارد با تعداد سلول­هاي شمارش شده در اين تحقيق تفاوت داشت. با توجه به نتايج بدست آمده سه نتيجه­گيري کاربردي از اين مطالعه مي­توان گرفت: 1) براي شمارش باکتري­هاي موجود در محصولات تجاري، لازم است از محيط کشت­هاي مختلف و متناسب با ميکروارگانيسم­هاي موجود و نيز شرايط مطلوب رشد ميکروارگانيسم­ها استفاده نمود. 2) استفاده از فلوسایتومتر نسبت به روش پلیت کانت، سریع­تر و با دقت بیشتر می­تواند زنده­مانی سلول­های مخمر پروبیوتیک را بررسی کند. 3) قابليت کشت سلول­ها (به خصوص در محصولات تجاري خشک) تحت تاثير شرايط مختلف نظير نوع محيط کشت، شرايط گرمخانه­گذاری و غیره است، لذا در صورت مغايرت نوع و تعداد سلول­ها با ادعاي درج شده بر محصولات، لازم است که با استفاده از روش­هاي ديگر، زنده­ماني و تعداد ميکروارگانيسم­ها بررسي شود. از طرف ديگر در اين تحقيق مشخص شد که شرايط نامطلوب نگهداري نظير افزایش دمای نگهداری محصول پروبیوتیک مخمري سبب کاهش معنادار در سلول­هاي زنده و نيز تعداد مخمرهاي قابل کشت در محصول می­شود؛ بنابراين توصيه مي­شود شرايط نگهداري دقيقا مطابق با شرايط توصيه شده توسط شرکت سازنده باشد. 

منابع

1. Ansarian E, Kazemi M, Nematy M, Akhondzadeh BA, Mousavi T (2013) A comparative study of total colony count of the lactobacilli strains during the shelf-life in some samples of commercial probiotic yoghurts. Daneshvar medicine 20:1-11

2. Bunthof CJ, Bloemen K, Breeuwer P, Rombouts FM, Abee T (2001) Flow cytometric assessment of viability of lactic acid bacteria. Appl Environ Microbiol 67:2326-2335

3. Coeuret V, Gueguen M, Vernoux JP (2004) Numbers and strains of lactobacilli in some probiotic products. Int J Food Microbiol 97:147-156

4. Dave RI, Shah NP (1997) Viability of yoghurt and probiotic bacteria in yoghurts made from commercial starter cultures. Int Dairy J 7:31-41

5. Doolan IA, Wilkinson MG, Hickey DK (2015) The application of flow cytometry to the study of lactic acid bacteria fermentations. In: Flow Cytometry in Microbiology: Technology and Applications. Caister Academic Press UK, pp 159-173

6. Elliott E, Teversham K (2004) An evaluation of nine probiotics available in South Africa, August 2003. S Afr Med J 94:121-124

7. Govender M, Choonara YE, Kumar P, du Toit LC, van Vuuren S, Pillay V (2014) A review of the advancements in probiotic delivery: conventional vs. non-conventional formulations for intestinal flora supplementation. J Am Assoc Pharmaceut Sci 15:29-43

8. Holzapfel WH, Haberer P, Geisen R, Björkroth J, Schillinger U (2001) Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition. Am J Clin Nutr 73:365s-373s

9. Hutter K, Punessen U, Eipel H (1979) Rapid determination of the purity of yeast cultures by immunofluorescence and flow cytometry. J Inst Brew 85:21-22

10. Jankovic I, Sybesma W, Phothirath P, Ananta E, Mercenier A (2010) Application of probiotics in food products—challenges and new approaches. Curr Opin Biotechnol 21:175-181

11. Odhav B, Krishna SBN (2012) Probiotics: Recent understandings and bio-medical applications.

12. Patrone V, Molinari P, Morelli L (2016) Microbiological and molecular characterization of commercially available probiotics containing Bacillus clausii from India and Pakistan. Int J Food Microbiol 237:92-97

13. Prudêncio C, Sansonetty F, Côrte‐Real M (1998) Flow cytometric assessment of cell structural and functional changes induced by acetic acid in the yeasts Zygosaccharomyces bailii and Saccharomyces cerevisiae. Cytometry 31:307-313

14. Psomas E, Andrighetto C, Litopoulou-Tzanetaki E, Lombardi A, Tzanetakis N (2001) Some probiotic properties of yeast isolates from infant faeces and Feta cheese. Int J Food Microbiol 69:125-133

15. Rezaei H, Fazeli H, Mirlohi M (2017) An evaluation of the Lactobacillus population and presence of Lactobacillus acidophilus in probiotic and non-probiotic dairy products marketed in Isfahan, Iran. Hlth Syst Res 13:187-197

16. Salih SM, Ahmed MF, Abdul-Kareem AY (2013) Saccharomyces boulardii as effective probiotic against Salmonella typhimurium in Mice. J Univ Anbar Pure Sci 7:20-24

17. Shafiei R, Delvigne F, Babanezhad M, Thonart P (2013) Evaluation of viability and growth of Acetobacter senegalensis under different stress conditions. Int J Food Microbiol 163:204-213

18. Shafiei R, Leprince P, Delvigne F (2019) Effect of sequential acclimation to various carbon sources on the proteome of Acetobacter senegalensis and its tolerance to downstream process stresses. Front Microbiol 10:608

19. Shafiei R, Zarmehrkhorshid R, Bentaib A, Babanezhad M, Leprince P, Delvigne F, Thonart P (2014) The role of protein modifications in senescence of freeze-dried Acetobacter senegalensis during storage. Microb Cell Fact 13:1-16

20. Shah N (2000) Probiotic bacteria: selective enumeration and survival in dairy foods. J Dairy Sci 83:894-907

21. Temmerman R, Pot B, Huys G, Swings J (2003) Identification and antibiotic susceptibility of bacterial isolates from probiotic products. Int J Food Microbiol 81:1-10

22. Williams NT (2010) Probiotics. Am J Health-System Ph 67:449-458

23. Yonejima Y, Hisa K, Kawaguchi M, Ashitani H, Koyama T, Usamikrank Y, Kishida N, Kishino S, Ogawa J (2015) Lactic acid bacteria-containing chocolate as a practical probiotic product with increased acid tolerance. Biocatal Agr Biotechnol 4:773-777

24. Zbar NS, Nashi LF, Saleh SM (2014) Saccharomyces boulardii as effective probiotic against Shiegella flexneri in mice. J Biotechnol Res Cent 8:55-58

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Quantitative and qualitative assessment of cells in several commercial probiotic products and evaluation of storage conditions on cell culturability and viability of a probiotic yeast

Running title: Assessment of cell viability in some commercial probiotic products

Abstract

One of the important criteria for determining the quality of products containing probiotics is the presence of a certain number of viable cells per gram of product. To transmit enough viable cells to the gastrointestinal tract, the population of probiotic microorganisms should be preserved during storage. In the present study, culturable cells of some commercial products were isolated and enumerated by the plate count and flow cytometric methods. The isolates were then identified by biochemical and molecular methods. The viability of yeast cells were then assessed at different temperatures during 30 days by the aforementioned methods. The results showed that Protexin restore® contained the same types and number of bacteria which were claimed by the manufacturer. In contrast, protexin balance® and Dailyeast® contained lower number of bacterial cells and yeast cells, respectively. It is noteworthy that only 33% of yeast cells were culturable on YPG agar while flow cytometric analysis showed that 87% of cells were viable and exhibited cell membrane integrity. In addition, yeast cells in Dailyeast® product were stable at 4-35°C. In conclusion, using different culture media and physico-chemical conditions for enumeration of viable and culturable cells may lead to different results. Thus, a combination of different methods should be used to get proper results.

 

Keywords: Sacchraomyces boulardi, Viability, Flow cytometry, Probiotics

 

---

[1]  Polymerase Chain Reaction

[2]  Electrophoresis

[3]  Aspergillus

[4]  Saccharomyces

[5]  Protexin balance® capsule

[6]  Protexin restore® sachet

[7]  Dailyeast® capsule 

[8]   Saccharomyces boulardii

[9]   Spread plate technique

[10]   Biomerieux

[11]   Mineral oil

[12]   NCBI (National Center for Biotechnology Information)

[13]  Propidium iodide (PI)

[14]  Thiazole orange (TO)

[15]  Accelerated Death Kinetics

[16]  Neighbor joining

[17]  Bootstrap

[18]  ‌Cell membrane integrity

[19]  Patrone

[20]  Leakage

---