توسعه روش استخراج فاز جامد پخشی تلفیق شده با میکرواستخراج مایع- مایع کمک شده با هوا برای اندازه‌گیری باقی‌مانده آنتی‌بیوتیک‌های سولفونامیدی در نمونه‌های شیر پاستوریزه به وسیله کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

محورهای موضوعی : شیمی مواد غذایی

مریم تجلائی ¹ , آذر حقیقت آسیابر ² , محمدرضا افشار مقدم ³ , جلیل خندقی ⁴

1 - دانش‌آموخته کارشناسی ارشد علوم و صنایع غذایی، واحد سراب، دانشگاه آزاد اسلامی ، سراب، ایران
2 - مربی علوم و صنایع غذایی، واحد سراب، دانشگاه آزاد اسلامی ، سراب، ایران
3 - استادیار مرکز ایمنی غذا و دارو، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، تبریز، ایران و استادیار مرکز آنالیز دارویی، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، تبریز، ایران
4 - استادیار گروه علوم و صنایع غذایی، واحد سراب، دانشگاه آزاد اسلامی ، سراب، ایران و استادیار گروه بیوتکنولوژی مواد غذایی، مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی، واحد تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران

تاریخ دریافت : 1402/05/11 تاریخ پذیرش : 1402/09/30 تاریخ انتشار : 1402/10/01

کلید واژه: کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا, شیر, : آنتی‌بیوتیک‌های سولفونامیدی, استخراج فاز جامد پخشی, میکرواستخراج مایع-مایع پخشی کمک شده با هوا,

چکیده مقاله :

مقدمه: لزوم مصرف شیر در جامعه اهمیت ایمنی و کیفیت این ماده غذایی را به‌خوبی آشکار می‌کند. باقیمانده آنتی‌بیوتیک‌ها یکی از مهم‌ترین آلاینده‌های مواد غذایی با منشاء دامی مانند شیر می‌باشند و وجود آن‌ها در مواد غذایی می‌تواند سلامت مصرف کننده را به مخاطره اندازد. لذا پایش میزان باقیمانده آنتی‌بیوتیک‌ها در شیر جهت آگاهی بخشی به متولیان سلامت حائز اهمیت زیادی است و در این راستا تحقیقات متعددی برای تعیین باقیمانده آنتی‌بیوتیک‌های مختلف در شیر با استفاده از روش‌های متنوع سنتی و کروماتوگرافیکی انجام شده است. در این مطالعه تلاش شد تا یک روش کارا برای اندازه‌گیری باقیمانده برخی آنتی‌بیوتیک‌های سولفونامیدی در نمونه‌های شیر پاستوریزه توسعه و ارائه گردد.مواد و روش‌ها: باقیمانده سه آنتی‌بیوتیک سولفادیازین، سولفامتوکسازول و سولفامتازین پس از روش استخراج فاز جامد پخشی تلفیق شده با میکرواستخراج مایع-مایع کمک شده با هوا از نمونه شیر پاستوریزه، با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا مجهز به آشکارساز آرایه دیودی اندازه‌گیری شدند. پس از ارزیابی عوامل موثر در روش استخراج و بهینه‌سازی آن‌ها، اعتبارسنجی روش با محاسبه پارامترهای تجزیه‌ای مانند محدوده خطی، حدود تشخیص و اندازه‌گیری، تکرارپذیری و راندمان استخراج انجام شد.یافته‌ها: ارقام شایستگی ایده‌ال در روش استخراج دو مرحله‌ای توسعه یافته حاصل شد به‌طوریکه ضریب تعیین بالاتر از 995/0 خطی بودن روش را نشان داد. حدود تشخیص و اندازه‌گیری به ترتیب کمتر از 2/1 و 2/3 نانوگرم در میلی‌لیتر بدست آمدند که کمتر از حد مجاز باقیمانده تعیین شده برای این آنتی‌بیوتیک‌ها در شیر می‌باشد. آنالیز نمونه‌های حقیقی وجود سولفامتوکسازول در سه نمونه شیر در مقادیر 1/0±13 ، 2/0±9 و 5/0±6/9 نانوگرم در میلی‌لیتر را نشان داد و سایر آنتی‌بیوتیک‌ها در نمونه‌های مورد مطالعه یافت نشد.نتیجه‌گیری: به‌طور کلی روش توسعه داده شده روشی حساس، دقیق و قابل اعتماد بوده و از کارایی بالایی در تعیین آنتی‌بیوتیک‌های انتخابی در نمونه شیر برخوردار است.

چکیده انگلیسی:

  Introduction: One of the significant contaminants in animal-derived foods, such as milk, is antibiotic residues, which put consumers' health at risk. Monitoring the amount of antibiotic residue in milk is crucial in order to alert the nation's health authorities and in this regard, several researches have been conducted for determination of different antibiotic residues in milk using various traditional and chromatographic methods. In this study, an efficient method for determining the residual levels of some sulfonamides in pasteurized milk was developed and presented. Materials and Methods: After dispersive solid-phase extraction combined with air-assisted liquid-liquid microextraction of analytes, the residues of sulfadiazine, sulfamethoxazole, and sulfamethazine in the pasteurized milk were determined using HPLC with a diode array detector. Following the evaluation of the effective factors in the extraction and optimizing them, the validation of method was carried out by calculating analytical parameters such as linear range, LOD, LOQ, repeatability, and extraction recovery. Results: In the developed two-step extraction method, satisfactory figures of merit were obtained, therefore the method's linearity was shown with a coefficient of determination higher than 0.995. The limits of detection and measurement were less than 1.2 and 3.2 ng ml-1, respectively, which is less than the MRLs established for these antibiotics in milk. The analysis of real samples showed the presence of sulfamethoxazole in three milk samples in concentrations of 13±0.1, 9±0.2 and 9.6±0.5 ng ml-1 and no other antibiotics were discovered in the examined samples. Conclusion: Overall, the established approach is a sensitive, accurate and reliable method and has high efficiency in determining selected antibiotics in milk samples.

منابع و مأخذ:

Afshar Mogaddam, M., Khandaghi, J. & Vajdi HokmAbad, S. (2023). Use of Temperature-controlled Ionic Liquid-assisted Dispersive Liquid-Liquid Microextraction Method for the Detection of Amoxicillin, Cloxacillin and Erythromycin Residues in Cow Milk using High Performance Liquid Chromatography. Iranian Journal of Nutrition Sciences & Food Technology, 18(1), 119-126. https://doi.org/ 20.1001.1.17357756.1402.18.1.10.7 [In Persian].

Amini, R., Khandaghi, J. & Afshar Mogaddam, M. (2018). Combination of Vortex-Assisted Liquid–Liquid Extraction and Air-Assisted Liquid–Liquid Microextraction for the Extraction of Bisphenol A and Bisphenol B in Canned Doogh Samples. Food Analytical Methods, 11(11), 3267-3275. https://doi.org/10.1007/s12161-018-1260-8

Anastassiades, M., Lehotay, S. J., Štajnbaher, D. & Schenck, F. J. (2003). Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and “dispersive solid-phase extraction” for the determination of pesticide residues in produce. Journal of AOAC International, 86(2), 412-431. https://doi.org/10.1093/jaoac/86.2.412

Anon. European Commission, Council Regulation 2377/90/EC. Procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin. Official Journal of the European Union, pp. 1–8.

Cavaliere, C., Curini, R., Di Corcia, A., Nazzari, M. & Samperi, R. (2003). A simple and sensitive liquid chromatography− mass spectrometry confirmatory method for analyzing sulfonamide antibacterials in milk and egg. Journal of agricultural and food chemistry, 51(3), 558-566. https://doi.org/ 10.1021/jf020834w

Chandran, S. & Singh, R. (2007). Comparison of various international guidelines for analytical method validation. Die Pharmazie-An International Journal of Pharmaceutical Sciences, 62(1), 4-14. https://doi.org/ 10.1691/ph2007.1.5064

Farajpour, S., Afshar Mogaddam, M. & Khandaghi, J. (2023). Combination of QuEChERS Dispersive Liquid-Liquid Microextraction based on Magnetic Ionic Liquids for extraction of Carbamate Pesticides from Apple Samples prior to their analysis by High Performance Liquid Chromatography. Journal of Food Technology and Nutrition, 20. https://doi.org/10.30495/JFTN.2023.72129.11241 [In Persian].

Farajzadeh, M. A. & Afshar Mogaddam, M. (2012). Air-assisted liquid–liquid microextraction method as a novel microextraction technique; Application in extraction and preconcentration of phthalate esters in aqueous sample followed by gas chromatography–flame ionization detection. Analytica Chimica Acta, 728, 31-38. https://doi.org/10.1016/j.trac.2019.115734

Ghasemi, R., Mirzaei, H., Afshar Mogaddam, M., Khandaghi, J. & Javadi, A. (2022). Application of magnetic ionic liquid-based air–assisted liquid–liquid



microextraction followed by back-extraction optimized with centroid composite design for the extraction of antibiotics from milk samples prior to their determination by HPLC–DAD. Microchemical Journal, 181, 107764. https://doi.org/ 10.1016/j.microc.2022.107764

Gholizadeh, S., Mirzaei, H., Khandaghi, J., Afshar Mogaddam, M. & Javadi, A. (2022). Ultrasound–assisted solvent extraction combined with magnetic ionic liquid based-dispersive liquid–liquid microextraction for the extraction of mycotoxins from tea samples. Journal of Food Composition and Analysis, 114, 104831. https://doi.org/ 10.1016/j.jfca.2022.104831

González, A. G. & Herrador, M. Á. (2007). A practical guide to analytical method validation, including measurement uncertainty and accuracy profiles. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 26(3), 227-238. https://doi.org/10.1016/j.trac.2007.01.009

Jadhav, V. J. & Badgujar, P. C. (2021). Development of a HPLC fluorescence method for determining efficacy of milk pasteurization. Food Analytical Methods, 14(2), 260-267. https://doi.org/10.1007/s12161-020-01865-6

Jayalakshmi, K., Paramasivam, M., Sasikala, M., Tamilam, T. & Sumithra, A. (2017). Review on antibiotic residues in animal products and its impact on environments and human health. Journal of Entomology and Zoology Studies, 5(3), 1446-1451. https://doi.org/

Jeddy, M. & Khandaghi, J. (2019). Detection and quantification of phytosterols in yogurt using gas chromatography. Food Hygiene, 9(1 (33)), 59-70. https://doi.org/ 10.30495/JFH.2019.545850 [In Persian].

Limoei Khosrowshahi, B., Marzi Khosrowshahi, E., Afshar Mogaddam, M. & KHandaghi, J. (2022). Use of Dispersive Solid-Phase Extraction in Combination with Dispersive Liquid-Liquid Microextraction for the Assessment of Organophosphorus Pesticides in Fruit Juice Samples Using Gas Chromatography-Nitrogen-Phosphorus Detector. Iranian Journal of Nutrition Sciences & Food Technology, 87-98. https://doi.org/20.1001.1.17357756.1401.17.2.8.0 [In Persian].

Llompart, M., Celeiro, M. & Dagnac, T. (2019). Microwave-assisted extraction of pharmaceuticals, personal care products and industrial contaminants in the environment. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 116, 136-150. https://doi.org/10.1016/j.trac.2019.04.029

Meshkini, K., AfsharMogaddam, M. & Khandaghi, J. (2021). Development of Homogeneous Liquid-Liquid Extraction in Combination with Dispersive Liquid-Liquid Microextraction Based on Deep Eutectic Solvents for the Extraction and Assessment of Phytosterols in Animal Cream Samples using Gas Chromatography Equipped with Flame Ionization Detector. Iranian Journal of Nutrition Sciences & Food Technology, 16(2), 57-67. https://doi.org/ 10.52547/nsft.16.2.57 [In Persian].

Mirzaei, H., Afshar Mogaddam, M. & Khandaghi, J. (2022). Simultaneous determination of four biogenic amines in whey samples using a new solid phase extraction method prior to their analysis by HPLC-MS/MS. Microchemical Journal, 177, 107313. https://doi.org/10.1016/j.microc.2022.107313

Mohebbi, A., Yaripour, S., Farajzadeh, M. A. & Afshar Mogaddam, M. (2018). Combination of dispersive solid phase extraction and deep eutectic solvent–based air–assisted liquid–liquid microextraction followed by gas chromatography–mass spectrometry as an efficient analytical method for the quantification of some tricyclic antidepressant drugs in biological fluids. Journal of Chromatography A, 1571, 84-93. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2018.08.022

Nebot, C., Regal, P., Miranda, J. M., Fente, C. & Cepeda, A. (2013). Rapid method for quantification of nine sulfonamides in bovine milk using HPLC/MS/MS and without using SPE. Food Chemistry, 141(3), 2294-2299. https://doi.org/ 10.1016/j.foodchem.2013.04.099

Rasi, H., AfsharMogaddam, M. & Khandaghi, J. (2021). Application of a new extraction method coupled to high performance liquid chromatography for tetracyclines monitoring in cow milk. Journal of food science and technology (Iran), 18(113), 339-349. https://doi.org/ 10.52547/fsct.18.113.339 [In Persian].

Sachi, S., Ferdous, J., Sikder, M. H. & Hussani, S. A. K. (2019). Antibiotic residues in milk: Past, present, and future. Journal of advanced veterinary and animal research, 6(3), 315. https://doi.org/ 10.5455/javar.2019.f350

Tolmacheva, V. V., Apyari, V. V., Furletov, A. A., Dmitrienko, S. G. & Zolotov, Y. A. (2016). Facile synthesis of magnetic hypercrosslinked polystyrene and its application in the magnetic solid-phase extraction of sulfonamides from water and milk samples before their HPLC determination. Talanta, 152, 203-210. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2016.02.010

Yao, T. & Du, K. (2020). Simultaneous determination of sulfonamides in milk: In-situ magnetic ionic liquid dispersive liquid-liquid microextraction coupled with HPLC. Food chemistry, 331, 127342. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2020.127342

Zare Sani, M., Afshar Mogaddam, M. & Khandaghi, J. (2021). Combination of cold induced HLLME with an effervescence-assisted DLLME based on deep eutectic solvent decomposition; application in extraction of some pyrethroid and carbamate pesticides from edible oils. International Journal of Environmental Analytical Chemistry, 1-16. https://doi.org/ 10.1080/03067319.2021.1955110

Zeiadi, S., Afshar Mogaddam, M., Farajzadeh, M. A. & Khandaghi, J. (2020). Combination of dispersive solid phase extraction with lighter than water dispersive liquid–liquid microextraction for the extraction of organophosphorous pesticides from milk. International Journal of Environmental Analytical Chemistry, 1-14. https://doi.org/10.1080/03067319.2020.1804892

متن کامل:



علوم غذايي و تغذيه/ زمستان 1402 / سال بیست و یکم / شماره 1                                                                                                                           Food Technology & Nutrition / Winter 2024 / Vol. 21 / No. 1

مریم تجلائی و همكاران

 

توسعه روش استخراج فاز جامد پخشی تلفیق شده با میکرواستخراج مایع- مایع کمک شده با هوا برای اندازه‌گیری باقی‌مانده آنتی‌بیوتیک‌های سولفونامیدی در نمونه‌های شیر پاستوریزه به وسیله کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

 

مریم تجلائیa، آذر حقیقت آسیابرb، محمدرضا افشارمقدمc، جلیل خندقیd *

 

a دانش‌آموخته کارشناسی ارشد علوم و صنایع غذایی، واحد سراب، دانشگاه آزاد اسلامی، سراب، ایران

b مربی علوم و صنایع غذایی، واحد سراب، دانشگاه آزاد اسلامی، سراب، ایران

c  استادیار مرکز ایمنی غذا و دارو، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، تبریز، ایران و استادیار مرکز آنالیز دارویی، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، تبریز، ایران

d  استادیار گروه علوم و صنایع غذایی، واحد سراب، دانشگاه آزاد اسلامی، سراب، ایران و استادیار گروه بیوتکنولوژی مواد غذایی، مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی، واحد تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران

 

تاریخ دریافت مقاله: 11/05/1402                        تاریخ پذیرش مقاله: 30/09/1402

DOI. 10.30495/jftn.2023.74523.11269

 

چکيده

مقدمه: باقیمانده آنتی‌بیوتیک‌ها یکی از مهم‌ترین آلاینده‌های مواد غذایی با منشاء دامی مانند شیر می‌باشند و وجود آن‌ها در مواد غذایی می‌تواند سلامت مصرف کننده را به مخاطره اندازد. لذا پایش میزان باقیمانده آنتی‌بیوتیک‌ها در شیر جهت آگاهی بخشی به متولیان سلامت حائز اهمیت زیادی است و در این راستا تحقیقات متعددی برای تعیین باقیمانده آنتی‌بیوتیک‌های مختلف در شیر با استفاده از روش‌های متنوع سنتی و کروماتوگرافیکی انجام شده است. در این مطالعه تلاش شد تا یک روش کارا برای اندازه‌گیری باقیمانده برخی آنتی‌بیوتیک‌های سولفونامیدی در نمونه‌های شیر پاستوریزه توسعه و ارائه گردد.

مواد و روش‌ها: باقیمانده سه آنتی‌بیوتیک سولفادیازین، سولفامتوکسازول و سولفامتازین پس از روش استخراج فاز جامد پخشی تلفیق شده با میکرواستخراج مایع - مایع کمک شده با هوا از نمونه شیر پاستوریزه، با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا مجهز به آشکارساز آرایه دیودی اندازه‌گیری شدند. پس از ارزیابی عوامل موثر در روش استخراج و بهینه‌سازی آن‌ها، اعتبارسنجی روش با محاسبه پارامترهای تجزیه‌ای مانند محدوده خطی، حدود تشخیص و اندازه‌گیری، تکرارپذیری و راندمان استخراج انجام شد.

يافته‌ها: در روش استخراج دو مرحله‌ای توسعه یافته ارقام شایستگی ایده‌ال حاصل شد بطوریکه خطی بودن روش با ضریب تعیین بالاتر از 995/0 نشان داده شد. حدود تشخیص و اندازه‌گیری به ترتیب کمتر از 2/1 و 2/3 نانوگرم در میلی‌لیتر بدست آمدند که کمتر از حد مجاز باقیمانده تعیین شده برای این آنتی‌بیوتیک‌ها در شیر می‌باشد. آنالیز نمونه‌های حقیقی وجود سولفامتوکسازول در سه نمونه شیر در مقادیر 1/0±13، 2/0±9 و 5/0±6/9 نانوگرم در میلی‌لیتر را نشان داد و سایر آنتی‌بیوتیک‌ها در نمونه‌های مورد مطالعه یافت نشد.

نتیجه‌گیری: به‌طور کلی روش توسعه داده شده روشی حساس، دقیق و قابل اعتماد بوده و از کارایی بالایی در تعیین آنتی‌بیوتیک‌های انتخابی در نمونه شیر برخوردار است.

 

واژه‌های کلیدی: آنتی‌بیوتیک‌های سولفونامیدی، استخراج فاز جامد پخشی، شیر، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، میکرواستخراج مایع-مایع پخشی کمک شده با هوا

 

* نويسنده مسئول مكاتبات                                                                                                                 email: [e-mail]

 

مقدمه

لزوم مصرف شیر در جامعه به‌خصوص برای گروه‌های سنی حساس مانند کودکان و سالخوردگان، اهمیت ایمنی و کیفیت این ماده غذایی را به‌خوبی مشخص می‌سازد. باقیمانده داروها یکی از مهم‌ترین آلوده کننده‌های مواد غذایی با منشاء دامی مانند شیر می‌باشند. آنتی‌بیوتیک‌ها از جمله داروهای پرکاربرد مورد استفاده در صنعت دامپروری می‏باشند که برای تضمین رشد و نمو مطلوب دام‌ها و کنترل بیماری‌های باکتریایی استفاده می‏شوند (Jayalakshmi et al., 2017). وجود باقیمانده آنتی‏بیوتیک‏ها در مواد غذایی می‌تواند سلامت مصرف کننده را به مخاطره انداخته و منجر به ایجاد آلرژی، اختلالات متابولیکی، ایجاد میکروارگانیسم‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک و مقاومت در برابر درمان آنتی‌بیوتیکی در انسان شود (Sachi et al., 2019). بنابراین بررسی و پایش میزان باقیمانده آنتی‌بیوتیک‏ها در محصولات غذایی پرمصرفی مانند شیر جهت آگاهی بخشی به متولیان تغذیه و سلامت کشور و عموم مردم بسیار حائز اهمیت است. 

با توجه به اینکه معمولا حد مجاز باقیمانده بسیاری از آنتی‌بیوتیک‌ها در مواد غذایی انسان در حد ppb است معمولا از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا یا HPLC¹ به عنوان ابزار تجزیه‌ای دقیق و حساس برای آنالیز و تشخیص باقیمانده این آنالیت‌ها استفاده می‌گردد (Ghasemi et al., 2022). با این حال، علیرغم پیشرفت‏های صورت گرفته در ساخت ابزارهای تجزیه‏ای، آناليز نمونه‏های شیر به دلیل ماتریکس پیچیده‏ی نمونه‏ و مقادیر غلظتی پایین داروها بدون آماده‏سازی غير‏ممكن می‏باشد (Afshar Mogaddam et al., 2023). بنابراین، توسعه و استفاده از روش‌های آماده‌سازی آسان و کارا قبل از آنالیز نمونه‌ها بسیار حائز اهمیت است. تا به حال روش‌های مختلفی جهت آماده سازی نمونه‌ها به کار رفته که از این جمله می‌توان به استخراج مایع - مایع (Jeddy & Khandaghi, 2019)، استخراج فاز جامد (Mirzaei et al., 2022)، استخراج فاز جامد پخشی یا DSPE² (Zeiadi et al., 2020) و میکرواستخراج مایع - مایع پخشی یا DLLME³ (Farajpour et al., 2023) اشاره کرد.

در روش DSPE، ذرات جاذب بطور مستقیم به داخل محلول نمونه اضافه شده و این ذرات براساس گروه عاملی خود، آنالیت‌های موجود در نمونه را جذب می‌کنند. سپس ذرات جاذب به‏ وسیله‌ی سانتریفیوژ از محلول آزمایشی جدا شده و به‏ وسیله‏‌ی یک حلال قابل امتزاج با آب شسته می‌شوند تا آنالیت‌ها واجذب گردند (Anastassiades et al., 2003). جاذب مورد استفاده در این روش می‌تواند کارایی استخراج را تحت تاثیر قرار دهد (Limoei Khosrowshahi et al., 2022). 

در روش میکرواستخراج مایع مایع کمک شده با هوا یا AALLME⁴ یک حلال استخراج‏کننده غیرقابل‏اختلاط با آب که چگالی متفاوتی نسبت به آب دارد به داخل نمونه آبی حاوي آنالیت‌ها اضافه می‏شود. سپس مخلوط نمونه آبی و حلال استخراج‏کننده به داخل یک سرنگ شیشه‏ای کشیده شده و مجدداً به لوله آزمایش برگردانده می‏شود. این عمل چندین بار صورت می‏گیرد. طی این عمل حلال استخراج‏کننده به صورت قطرات بسیار ریزی در درون محلول آبی پخش شده و یک محلول ابری تشکیل می‏شود. سپس محلول کدر سانتریفوژ شده و فاز آلی حاوی آنالیت‏های تغلیظ‏شده جمع‏آوری می‏گردد (Farajzadeh & Mogaddam, 2012). این روش از نظر انجام بسیار ساده بوده و در زمان کوتاهی انجام می‏شود و نیازی به حلال پخش‏کننده ندارد (Amini et al., 2018).

در این ‌کار پژوهشی باقیمانده آنتی‌بیوتیک‏های سولفونامیدی سولفادیازین⁵، سولفامتوکسازول6 و سولفامتازین7 در نمونه‌های مختلف شیر پاستوریزه بررسی شده است. برای این منظور ابتدا آنتی‌بیوتیک‌ها با استفاده از روش استخراج فاز جامد پخشی تلفیق شده با میکرواستخراج مایع - مایع کمک شده با هوا از بافت نمونه شیر استخراج شده و سپس با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا مجهز به دتکتور آرایه دیودی یا DAD 8 اندازه‌گیری شدند.

 

مواد و روش‌ها

-       مواد شیمیایی و نمونه‌های حقیقی 

سولفات روی، اکتا دسیل سیلان (ODS)، ⁶PSA و کربن فعال گرافیتی یا GCB2، سدیم‌کلرید، اکتانول، دکانول و n-هگزانول با درجه خلوص تجزیه‌ای از شرکت مرک (Merck, Germany) و استاندارد آنتی‌بیوتیک‌های مورد بررسی از شرکت سیگما (Sigma, USA) تهیه شد. برای سنجش کاربرد روش توسعه یافته در استخراج آنتی‌بیوتیک‌های هدف از نمونه‌های شیر نیز تعداد 10 نمونه شیر پاستوریزه در بهار سال 1402 به‌صورت تصادفی از محل‌های عرضه در شهر تبریز تهیه و در آزمایشگاه مرکز ایمنی غذا و داروی دانشگاه علوم پزشکی‌تبریز تحت شرایط بهینه‌شده استخراج و آنالیز شدند. به‌منظور كنترل كيفی سيستم كروماتوگرافی، محلول استاندارد آنتی‌بیوتیک‌ها (25 میلی‌گرم در لیتر) هر روز سه‌بار به دستگاه HPLC (Agilent Technologies, Model 1200, DAD system, USA) تزريق و فاكتور تغليظ و راندمان استخراج مورد ارزیابی قرارگرفت.

 

-       روش استخراج 

آماده‌سازی و استخراج باقیمانده‌های آنتی‌بیوتیکی از نمونه‌های شیر در این مطالعه بر پایه تلفیق روش استخراج فاز جامد پخشی و میکرواستخراج مایع-مایع پخشی کمک‌شده با هوا صورت گرفته‌است. برای این منظور، ابتدا 5 میلی لیتر از نمونه شیر برداشته شده و با حجم 3 میلی‌لیتر از محلول سولفات روی 20 درصد وزنی/حجمی (به عنوان عامل رسوب دهنده) در داخل یک لوله آزمایش مخلوط شد. پس از سانتریفیوژ، فاز رویی برداشته شده و در یک لوله‌ی آزمایش دیگر 30 میلی‌گرم از اکتا دسیل سیلان (ODS) روی آن اضافه شده و مخلوط به مدت سه دقیقه ورتکس گردید. پس از سانتریفیوژ، جاذب از محلول جدا شده و فاز رویی دور ریخته شد. در مرحله بعد، آنالیت‌های جذب شده به روی جاذب تحت امواج التراسونیک و با استفاده از 100 میکرولیتر n-هگزانول در مدت زمان دو دقیقه واجذب شد. فاز آلی بدست آمده برداشته شده و چند بار به سرعت به داخل پنج میلی‌لیتر آب دیونیزه تزریق و مجددا به‌داخل سرنگ کشیده شد تا محلول ابری تشکیل گردد. پس از سانتریفیوژ محلول حاصل، فاز آلی روئی برداشته شده و به سیستم کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا تزریق گردید. برای دستیابی به حداکثر تفکیک در سیستم کروماتوگرافی، شرایط کارکرد HPLC-DAD برای جداسازی آنتی‌بیوتیک‌ها مطابق جدول 1 انتخاب شد.

 

جدول 1- شرایط کارکرد HPLC-DAD به منظور آنالیز آنتی‌بیوتیک‌های سولفونامیدی در نمونه‌های شیر

Table 1- Optimized condition of the HPLC-DAD for analysis of sulfonamides in milk samples

 

Zorbax SB–Aq C18 column, L=15 cm, ID= 4.6 mm, Particle size= 5 μm	Column
A gradient elution composed of 0.01 M phosphate buffer pH 5.0: acetonitrile (82:18 (v/v)), 0.7 ml/min	Mobile phase
Temperature: 40 °C, Loop= 10 μL	Injector
256 nm	Detection wavelength

 

-       بهینه‌سازی شرایط استخراج ⁷

برای این منظور مقدار عامل رسوب‌دهنده یعنی سولفات روی از بین مقادیر10، 15، 20 و 25 درصد وزنی/حجمی انتخاب شد. همچنین عوامل موثر در مرحله استخراج فاز جامد پخشی مانند نوع جاذب (از بین اکتا دسیل سیلان، PSA و کربن فعال)، مقدار جاذب (از بین مقادیر 5 تا 50 میلی‌گرم)، مدت زمان‌های یک تا 5 دقیقه ورتکس کردن نمونه‌ها و اثر pH (در مقادیر 2 تا 8) بهینه‌سازی گردید. عوامل موثر در مرحله استخراج مایع-مایع پخشی شامل نوع و حجم حلال واجذبی (با اضافه کردن 100 تا 250 میکرولیتر از سه حلال آلی سبک‌تر از آب یعنی اکتانول، دکانول و n-هگزانول)، اثر نمک‌زنی (با افزودن مقادیر متفاوتی از نمک در محدوده صفر تا 8 درصد وزنی/حجمی) و یک تا چهار دقیقه اولتراسوند کردن نمونه‌ها برای حداکثر واجذبی آنالیت‌ها نیز بررسی و بهترین حالت انتخاب گردید. برای بررسی عوامل موثر در روش توسعه داده‌شده از روش "یک پارامتر در یک زمان" استفاده و تاثیر این عوامل با مقایسه سطح زیر پیک حاصل از آنالیت‌ها در شرایط مختلف بررسی شد (Chandran & Singh, 2007).

 

 

-       اعتبارسنجی 

پس از ترسیم نمودار معیارگیری یا منحنی کالیبراسیون (با آنالیز محلول‏های استانداردی با غلظت‏های 15، 20، 30، 50، 100، 200، 500 و 1000 نانو‏گرم در میلی‌لیتر از آنتی‌بیوتیک‏های سولفونامیدی)، مشخصات تجزیه‌ای روش به‌کار رفته، شامل تعیین محدوده خطی یا LR1، حد تشخیص یا LOD2، حد اندازه‌گیری یا LOQ3⁸، تکرارپذیری در یک روز و در بین روزها براساس انحراف استاندارد نسبی یا RSD% 4 و راندمان استخراج یا ER 5 محاسبه شدند (González & Herrador 2007). 

 

-       بررسی اثر بافت نمونه در استخراج

ماتریکس نمونه‌های شیر می‌تواند در اندازه‏گیری آنتی‌بیوتیک‏ها تداخل ایجاد نماید، لذا استخراج آنتی‌بیوتیک‌ها از سه نمونه شیر (اسپایک ‏شده با مقادیر 2 و 50 نانوگرم در میلی‌لیتر از هر کدام از آنالیت‏ها) انجام و مقادیر آنالیت‏ها با روش پیشنهادی یافت شد. مقادیر بازیابی نسبی محاسبه و اثر ماتریکس ارزیابی شد. 

همچنین برای بررسی قابلیت روش توسعه داده شده در اندازه‏گیری آنتی‌بیوتیک‌ها، اقدام به اندازه‏گیری آنالیت‏ها در 10 نمونه‏ی مختلف شیر شد. نمونه‌های شیر طبق شرایط بهینه با روش پیشنهادی تغلیظ و آماده‌سازی شدند و سپس با HPLC-DAD مورد آنالیز قرار گرفتند.

 

یافته‌ها

-       انتخاب غلظت و حجم ماده رسوب دهنده پروتئین شیر

نتایج این آزمون نشان داد که بالاترین درصد بازیابی آنالیت‌ها در استفاده از مقدار 3 میلی‌لیتر سولفات روی 20 درصد حاصل شد (شکل 1) که در ادامه مطالعه نیز از این مقدار سولفات روی برای رسوب پروتئین‌های شیر استفاده گردید.

 

-       نتایج بهینه‏سازی مرحله استخراج فاز جامد پخشی

-       نوع و مقدار جاذب

همان‌طوریکه در شکل 2 نشان داده شده است، در بین مواد جاذب تجاری استفاده شده، اکتا دسیل سیلان قابلیت بیشتری در استخراج آنتی‌بیوتیک‌های هدف دارد و از اين رو این ترکیب به عنوان مناسب‏ترین جاذب انتخاب گردید. همچنین بهترین نتیجه استخراج در به‌کارگیری 30 میلی‌گرم از جاذب مذکور حاصل شد (شکل2).

 

 

 

 

 

Figure 1- Selecting the zinc sulfate concentration for precipitation of milk proteins in the extraction of sulfonamide residues from milk samples

شکل 1- انتخاب غلظت سولفات روی برای رسوب پروتئین‌های شیر در استخراج باقیمانده آنتی‌بیوتیک‌های سولفونامیدی از نمونه‌های شیر⁹

 

-       - اثر pH¹⁰

برای بررسی اثر این پارامتر، pH محلول‌های آزمایشی از 2 تا 8 تنظیم شد که بالاترین مقدار بازیابی آنالیت‌ها در محدوده خنثی بدست آمد (شکل2) لذا ادامه آزمایشات در pH نرمال محلول‌های آزمایشی انجام شد.

 

-       مدت زمان هم‌زدن نمونه

در این مطالعه برای تماس هر چه بیشتر نمونه با جاذب از

ورتکس کردن نمونه و جاذب استفاده گردید و مشاهده شد (شکل2) که با افزايش مدت زمان هم زدن تا 3 دقیقه، راندمان استخراج آنالیت‏ها افزایش و بعد از آن تقریبا ثابت می‌ماند.

 

-       نتایج بهینه‏سازی مرحله استخراج مایع - مایع پخشی

-       نوع و حجم حلال واجذبی

نوع حلال واجذبی، از بین حلال های سبکتر از آب و با قابلیت انحلال نسبتاً کم انتخاب شد. حلال‌های سبکتر از آب دارای سمیت کمتری نسبت به حلال‌های آلی سنگین‌تر از آب می‌باشند همچنین به دلیل حلالیت کم آن‌ها، امکان تغلیظ بیشتر در مرحله میکرواستخراج مایع - مایع پخشی کمک شده با هوا فراهم می‌شود. در بین حلال‏های مورد بررسی، راندمان استخراج با n-هگزانول بیشتر بوده و این حلال برای مراحل بعدی انتخاب شد (شکل3). همچنین نتایج نشان داد که افزایش حجم این حلال در مقادیر بالاتر از 100 میکرولیتر تاثیر مثبتی در افزایش کارائی استخراج نداشت لذا آزمایشات با حجم 100 میکرولیتر از n-هگزانول ادامه یافت (شکل 3). لازم به‌توضیح است در مقادیر کمتر از این مقدار، حجم فاز جمع شده پس از سانتریفیوژ جهت تزریق به HPLC کافی نبود.

 

-       اثر نمک‌زنی

در مرحله استخراج مایع مایع پخشی برای بررسی اثر نیروی یونی بر روی کارایی استخراج، مقادیر مختلفی از کلرید سدیم به داخل نمونه آبی به دست آمده از مرحله استخراج فاز جامد پخشی اضافه و روش پیشنهادی ادامه یافت. مطابق شکل3، افزایش نمک سبب کاهش کارایی روش پیشنهادی گردید. لذا کلیه آزمون‌ها بدون افزودن نمک انجام شد.

 

---

[1] 2 Dispersive Solid Phase Extraction

[2] 4 Air assisted Liquid-Liquid Microextraction

7 Sulfamethazine      8 Diode Array Detector

[3] 1 High Performance Liquid Chromatography 

[4] 3 Dispersive Liquid-Liquid Microextraction

[5]  Sulfadiazine               6 Sulfamethoxazole

[6] 2 Graphitized carbon black

[7] 1 Primary Secondary Amine

[8] 3 Limit of Quantitation  4 Relative Standard Deviation

 

[9] 1 Linear range        2 Limit of Detection

[10] 5 Extraction Recovery

 

 

 

  

 

Figure 2- Selecting the absorbent type (A), absorbent amount (B), pH effect and vortexing time (C) in DSPE stage for the extraction of sulfonamide residues from milk samples

شکل 2- انتخاب نوع جاذب (A)، مقدار جاذب (B)، اثر pH و زمان ورتکس کردن (C) در مرحله استخراج فاز جامد پخشی برای استخراج باقیمانده آنتی‌بیوتیک‌های سولفونامیدی از نمونه‌های شیر

 

 

 

-       مدت زمان واجذب نمونه

همانگونه که در شکل3 دیده می‌شود، بالاترین بازده استخراج آنتی‌بیوتیک‌ها و واجذب آن‌ها از ذرات جاذب به حلال استخراج کننده در مدت زمان یک دقیقه (همراه با اولتراسوند کردن نمونه‌ها) ثبت گردید.

 

-       مشخصات تجزیه‏ای روش پیشنهادی

پارامترهای تجزیه‌‏ای روش حاضر تحت شرایط بهینه محاسبه شدند. منحنی‌های کالیبراسیون با اسپایک کردن هفت غلظت از آنالیت‏های مورد مطالعه (مقادیر 5، 10، 25، 50، 75، 100، 150 و 250 نانوگرم در میلی‏لیتر نسبت به هر یک از آنتی‏بیوتیک‏های مورد مطالعه) پس از اجرای روش توسعه‌ یافته رسم شد و محدوده خطی برای هر یک از آنالیت‏ها بدست آمد. حد تشخیص و حد اندازه‌گیری روش به ترتیب برابر غلظت‏هایی که در آن‌ها نسبت سیگنال به نوبه به‌ترتیب 3 و 10 می‌باشد درنظر گرفته شد. تکرارپذیری آزمون‌ها نیز با استفاده از انحراف استاندارد نسبی (RSD %) حاصل شد و نشان دهنده دقت بالای روش ارائه شده در اندازه‌گیری آنتی‌بیوتیک‌های هدف بود. نتایج اعتبارسنجی روش پیشنهادی در جدول 2 ارائه شده است.

 

-       اثر بافت شیر در استخراج و صحت روش

مقایسه سیگنال‏های تجزیه‏ای بدست آمده برای تعداد سه نمونه شیر با شیوه افزایش استاندارد مورد مطالعه قرار گرفت. برای این منظور نمونه‌های شیر با آنالیت‌های مورد مطالعه اسپایک شده و سپس مقدار آن‌ها با روش پیشنهادی اندازه گرفته شد. مقادیر بازیابی نسبی با تقسیم مقادیر یافت شده به مقادیر اسپایک شده، محاسبه و گزارش گردید. نتایج حاصل در جدول 3، نشان می‌دهد که ماتریکس نمونه‏های شیر تأثير محسوسی در کارایی روش پیشنهادی ندارد.

 

 

  

 

  

 

Figure 3- Selecting the solvent type (A), solvent volume (B) salting effect (C) and desorption time in DLLME stage for the extraction of sulfonamide residues from milk samples

شکل3- انتخاب نوع حلال (A)، حجم حلال (B)، اثر نمک‌زنی (C) و مدت زمان واجذب در مرحله میکرواستخراج مایع مایع پخشی برای استخراج باقیمانده آنتی‌بیوتیک‌های سولفونامیدی از نمونه‌های شیر

 

جدول 2- ارقام شایستگی روش توسعه داده شده برای استخراج آنتی‌بیوتیک‏های سولفونامیدی از نمونه‌های شیر

Table 2- Quantitative features of the developed method for sulfonamides extraction from milk samples

 

Analyte	LRa	LODb	LOQc	r2 d	precision (RSD%)e		ER ± SDf
					Intra-day	Inter-day
Sulfadiazine	2.2-250	0.6	2.2	0.996	4.2	5.4		73 ±4
Sulfamethoxazole	3.2-250	1.1	3.2	0.998	3.9	6.1		70 ± 2
Sulfamethazine	1.6-250	0.48	1.6	0.995	2.6	5.3		74 ± 2

a) Linear range (ng ml−1)

b) Limit of detection (S/N = 3) (ng ml−1)

c) Limit of quantification (S/N = 10) (ng ml−1)

d) Coefficient of determination

e) Relative standard deviation (n = 6)

f) Extraction recovery ± standard deviation (n = 3)

 

جدول3- نتایج بررسی اثر ماتریکس شیر در استخراج آنتی‌بیوتیک‌های سولفونامیدی

Table 3- Results of assays to check the milk sample matrix effect on sulfonamides extraction

 

Mean relative recovery ± standard deviation (n = 3)			Analyte
Sample3	Sample2	Sample1
All samples were spiked with each analyte at a concentration of 5 ng ml−1
93 ± 2	94 ± 4	92 ± 2	Sulfadiazine
92 ± 2	93 ± 3	90 ± 5	Sulfamethoxazole
95 ± 6	95 ± 3	93 ± 4	Sulfamethazine
All samples were spiked with each analyte at a concentration of 50 ng ml−1
96 ± 5	100 ± 4	95 ± 2	Sulfadiazine
91 ± 1	89 ± 4	98 ± 3	Sulfamethoxazole
93 ± 6	96 ± 5	101 ± 4	Sulfamethazine

 

 

همچنین برای بررسی صحت روش آنالیز آنتی‌بیوتیک‏های سولفونامیدی هدف، مقدار آن‌ها در 10 نمونه شیر تحت شرایط بهینه اندازه‏گیری شد. مقایسه کروماتوگرام‏های حاصل از نمونه‏های حقیقی و نمونه‏ استاندارد نشان دهنده وجود سولفامتوکسازول در سه نمونه‏ شیر در مقادیر 1/0±13 ، 2/0±9 و 5/0±6/9 نانوگرم در میلی‌لیتر بود که همگی کمتر از حد مجاز باقیمانده تعیین شده (ppb100) در نمونه شیر بودند (Regulation 2377/90/EC). سایر آنتی‌بیوتیک‌ها در نمونه‌های
مورد مطالعه یافت نشد. شکل4 ، کروماتوگرام‏های
HPLC-DAD مربوط به تزریق مستقیم استاندارد آنالیت‌های مورد مطالعه و یک نمونه‏ی شیر اسپایک نشده را نشان می‏دهد.

 

بحث

به‌کار بردن عوامل رسوب‌دهنده برای حذف مزاحمت موادی مانند پروتئین‌ها و استخراج بهتر آنالیت‌های فاز آبی شیر از جمله آنتی‌بیوتیک‌ها ضروری است و یکی از روش‌های متداول این کار در نمونه‌های شیر استفاده از سولفات روی است. کاتیون‌های روی مانند پل‌های عرضی مولکول‏های پروتئین را به‌هم چسبانده و حلالیت آنها را در نمونه آبی کاهش می‌دهند (Ghasemi et al., 2022). مقدار کم این ترکیب قادر به رسوب‌دهی کامل پروتئین‏ها نخواهد بود، ضمن اینکه مقدار زیاد آن نیز می‏تواند سبب تغییر ماهیت نمونه شود (Jadhav & Badgujar, 2021) لذا بهینه‌سازی مقدار ماده رسوب دهنده لازم است. 

در تحقیق حاضر از یک ماده جامد ‏برای استخراج آنتی‌بیوتیک‌ها از نمونه‏های شیر استفاده ‏شد. ضمن اینکه ماده جاذب باید از قدرت جذب بالایی برخوردار باشد، ابعاد و دانه‌بندی آن نیز باید منظم باشد تا بتواند به‌طور یکنواخت در داخل محلول حاوی آنالیت‏ها پخش شود. از طرفی این جاذب باید قابلیت جداشدن از نمونه شیر طی فرایند سانتریفیوژ را داشته باشد (Mohebbi et al., 2018). با در نظر گرفتن این شرایط سه جاذب اکتا دسیل سیلان ، PSA و کربن فعال‌شده به‌عنوان جاذب استخراج‌کننده انتخاب شدند. مقدار جاذب نیز جزو پارامتر‏های موثر در کارایی مرحله اول استخراج می‏باشد. این تاثیر به نسبت فاز جامد و حجم محلول نمونه ارتباط دارد یعنی در مقادیر کم جاذب، نسبت فازها کم بوده و راندمان استخراج پایین است و برعکس، با افزایش مقدار جاذب نسبت فازها افزایش یافته

 

 

 

Figure 4- Typical HPLC–DAD chromatograms of direct injection of standard solution of the target antibiotics at a concentration of 5 mg L−1 (A) and un-spiked milk sample (B) after performing the suggested method. 

شکل 4- کروماتوگرام HPLC-DAD حاصل از (A) تزریق مستقیم محلول استاندارد آنتی‌بیوتیک‌های مورد مطالعه به غلظت 5 میلی‌گرم بر لیتر و (B) نمونه شیر اسپایک نشده، پس از اجرای روش پیشنهادی.

 

 

و راندمان استخراج افزایش می‏یابد (Rasi et al., 2021) لذا مقدار جاذب هم باید بهینه شود. 

انتخاب حلال استخراج کننده مناسب یکی از پارامتر‌های مهم در اجرای روش میکرو استخراج مایع مایع پخشی می‏باشد. در این روش حلال استخراج‏ کننده باید آنالیت‌ها را از ذرات جامد واجذب نموده و در فاز مایع پخش کند. از این رو حلال مورد استفاده باید حلالیت کمی در فاز آبی داشته و قابلیت پخش شدن در آن را داشته باشد. از طرف دیگر این حلال باید دارای دانسیته متفاوت از آب باشد تا جمع‌آوری آن با سانتریفیوژ ممکن باشد (Meshkini et al., 2021). در این مطالعه از حلال‌های سبک تر از آب برای این منظور استفاده گردید. مزیت عمده روش میکرواستخراج مایع مایع پخشی کمک شده با هوا در حذف حلال پخش کننده آنالیت در فاز آبی است و این‌کار با چند بار دمیده شدن و مکیده شدن سریع حلال استخراج کننده بداخل سرنگ انجام می‌شود (Farajzadeh & Mogaddam, 2012). چون حجم این حلال بازده استخراج و تکرارپذیری نتایج را تحت‌تاثیر قرار می‌دهد از دیگر پارامتر‏هایی است که نیاز به ارزیابی و بهینه‏سازی دارد. به‌عبارت دیگر، حجم بالای حلال موجب افزایش حجم فاز جمع‌شده نهایی، كاهش فاكتور تغليظ و کاهش سیگنال‌های تجزیه‌ای می‌شود. همچنین کاهش حجم حلال نیز باعث کاهش کارایی استخراج و تکرارپذیری می‌گردد لذا حجم حلال‌ استخراج‌کننده باید بهینه‌سازی شود (Gholizadeh et al., 2022). 

ایجاد قدرت یونی محلول آزمایشی با افزودن کلرید سدیم ممکن است دو اثر متقابل داشته باشد یعنی هم می‌تواند سبب کاهش میزان دسترسی مولکول‌های آنالیت به آب و بنابراین انتقال آن‏ها به داخل حلال استخراج‏ کننده شده و سبب افزایش کارایی روش ‌شود و هم ممکن است حل شدن حلال در فازآبی را کاهش داده و منجربه افزایش حجم فاز آلی جمع‌شده گردیده و باعث کاهش سیگنال تجزیه‌ای در اثر رقیق‌‏ شدن نمونه شود (Zare Sani et al., 2021). در این کار پژوهشی کاهش کارائی روش با افزودن کلرید سدیم در انتخاب شرایط بهینه استخراج به اثبات رسید که مطالعه بدون افزودن نمک ادامه یافت.

یکی دیگر از عواملی که موجب تسریع فرایند استخراج می‌شود افزایش تحرکات مولکولی و ضرایب توزیع آنالیت‏ها می‌باشد. این ویژگی که معمولا به کمک ورتکس کردن (Amini et al., 2018) یا اولتراسوند نمودن (Farajpour et al., 2023) نمونه عملی می‌گردد سبب افزایش دمای محلول آزمایشی و بالا رفتن سرعت واکنش‌ها نیز می‌شود. از طرف دیگر افزایش مدت زمان هم زدن نمونه می‏تواند سبب تخریب ترکیبات هدف موثر شده و منجر به کاهش راندمان استخراج شود (Llompart et al., 2019). در تحقیق حاضر بالاترین کارائی استخراج آنتی‌بیوتیک‌های هدف در مدت زمان دو دقیقه مایکروویو کردن نمونه‌ها حاصل گردید.

به‌منظور ارزیابی کارایی روش پیشنهادی در استخراج آنتی‌بیوتیک‌های سولفونامیدی، برخی پارامترهای تجزیه‌ای روش توسعه داده شده با چند روش به‌کار رفته برای استخراج این آنالیت‌ها از نمونه‌های شیر مقایسه شد. این بررسی نشان داد مقادیر شایستگی روش ارائه شده در استخراج آنتی‌بیوتیک‌های هدف قابل قبول و در مواردی حتی بهتر از مقادیر به‌دست آمده با روش‌های حساس‌تری مانند به‌کارگیری آشکارساز اسپکترومتر جرمی می‌باشد (جدول 3).

 

 

جدول3- مقایسه روش حاضر با سایر روش‌های منتشر شده برای تعیین آنتی‌بیوتیک‌های سولفونامیدی در نمونه شیر

Table 3- Comparison of the current method with other published methods for the determination of sulfonamides in milk sample

 

Analyte	LOD	LOQ	RSD (%)	ER (%)	Method	References
Sulfadiazine	3	4	10	105	LLE-HPLC–MS/MS	(Nebot et al., 2013)
Sulfamethoxazole	1	1	5	82
Sulfamethazine	2	4	10	96
Sulfadiazine	-	12.5	4.9	89	SPE-LC/MS	(Cavaliere et al., 2003)
Sulfamethoxazole	-	35	5.3	97
Sulfamethazine	-	25	9.1	102
Sulfadiazine	0.89	2.97	3.74	97.4	MIL-DLLME- HPLC/ UV	(Yao & Du, 2020)
Sulfamethazine	0.60	2.03	4.17	98.2
Sulfamethazine	2	6	7	96	MSPE-HPLC/AD	(Tolmacheva et al., 2016)
Sulfamethoxazole	2	6	8	98
Sulfadiazine	0.6	2.2	4.2	73	DSPE-ALLME-HPLC/DAD	This method
Sulfamethoxazole	1.1	3.2	3.9	70
Sulfamethazine	0.48	1.6	2.6	74

 

Abbreviations: 

LOD: Limit of detection (ng ml−1)

LOQ: Limit of quantification (ng ml−1)

RSD: Relative standard deviation 

ER: Extraction recovery 

LLE-HPLC-MS/MS: liquid liquid extraction coupled to high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.

SPE-LC/MS: solid phase extraction coupled to liquid chromatography tandem mass spectrometry.

MIL-DLLME- HPLC/ UV–vis: magnetic ionic based dispersive liquid liquid microextraction coupled to high performance liquid chromatography ultraviolet detector.

MSPE-HPLC/AD: magnetic solid phase extraction coupled to high performance liquid chromatography tandem amperometric detection.

DSPE-ALLME-HPLC/DAD: combination of dispersive solid phase extraction and air-assisted liquid liquid microextraction coupled to high performance liquid chromatography tandem diode array detector.

 

 

 

نتیجه‏گیری

در این مطالعه تلفیق دو روش استخراج فاز جامد پخشی و میکرواستخراج مایع-مایع پخشی کمک شده با هوا برای آماده سازی و پيش‏تغليظ آنتی‌بیوتیک‏های سولفادیازین، سولفامتازین و سولفامتوکسازول از نمونه‏های شیر توسعه داده شده و سپس اندازه‏گیری کمی آن‏ها با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارائی بالا مجهز به آشکارساز آرایی دیودی انجام شد. خطی بودن روش پیشنهادی (ضریب تعیین بالاتر از 995/0) در محدوده 2/3 تا 250 نانوگرم در میلی‌لیتر و حدتشخیص پایین در محدوده 1/1-48/0 نانوگرم در میلی‌لیتر (کمتر از حد مجاز قابل قبول برای باقیمانده آنتی‌بیوتیک‌های هدف در شیر) تکرارپذیری روش در محدوده 6/2 تا 1/6 و بازده استخراج بالاتر از 70 درصد، تایید می‌کند که این روش دقیق و قابل اعتماد بوده و از کارایی بالایی در تجزیه و تعیین آنالیت‌های هدف در نمونه شیر برخوردار است. به‌علاوه اجرای روش مذکور بر روی نمونه‌های شیر وجود سولفامتوکسازول در سه نمونه شیر را نشان داد که کمتر از حد مجاز تعیین شده برای باقیمانده این آنتی بیوتیک در شیر بود.

 

سپاسگزاری

نویسندگان مقاله بر خود لازم می‌دانند تا به این وسیله از همکاری‌ آزمایشگاه کنترل غذا و داروی مرکز تحقیقات ایمنی غذا و داروی دانشگاه علوم پزشکی تبریز در انجام این پژوهش صمیمانه قدردانی ‌نمایند.

 

منابع

Afshar Mogaddam, M., Khandaghi, J. & Vajdi HokmAbad, S. (2023). Use of Temperature-controlled Ionic Liquid-assisted Dispersive Liquid-Liquid Microextraction Method for the Detection of Amoxicillin, Cloxacillin and Erythromycin Residues in Cow Milk using High Performance Liquid Chromatography. Iranian Journal of Nutrition Sciences & Food Technology, 18(1), 119-126. https://doi.org/ 20.1001.1.17357756.1402.18.1.10.7 [In Persian].

Amini, R., Khandaghi, J. & Afshar Mogaddam, M. (2018). Combination of Vortex-Assisted Liquid–Liquid Extraction and Air-Assisted Liquid–Liquid Microextraction for the Extraction of Bisphenol A and Bisphenol B in Canned Doogh Samples. Food Analytical Methods, 11(11), 3267-3275. https://doi.org/10.1007/s12161-018-1260-8

Anastassiades, M., Lehotay, S. J., Štajnbaher, D. & Schenck, F. J. (2003). Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and “dispersive solid-phase extraction” for the determination of pesticide residues in produce. Journal of AOAC International, 86(2), 412-431. https://doi.org/10.1093/jaoac/86.2.412

Anon. European Commission, Council Regulation 2377/90/EC. Procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin. Official Journal of the European Union, pp. 1–8.

Cavaliere, C., Curini, R., Di Corcia, A., Nazzari, M. & Samperi, R. (2003). A simple and sensitive liquid chromatography− mass spectrometry confirmatory method for analyzing sulfonamide antibacterials in milk and egg. Journal of agricultural and food chemistry, 51(3), 558-566. https://doi.org/ 10.1021/jf020834w

Chandran, S. & Singh, R. (2007). Comparison of various international guidelines for analytical method validation. Die Pharmazie-An International Journal of Pharmaceutical Sciences, 62(1), 4-14. https://doi.org/ 10.1691/ph2007.1.5064

Farajpour, S., Afshar Mogaddam, M. & Khandaghi, J. (2023). Combination of QuEChERS Dispersive Liquid-Liquid Microextraction based on Magnetic Ionic Liquids for extraction of Carbamate Pesticides from Apple Samples prior to their analysis by High Performance Liquid Chromatography. Journal of Food Technology and Nutrition, 20. https://doi.org/10.30495/JFTN.2023.72129.11241 [In Persian].

Farajzadeh, M. A. & Afshar Mogaddam, M. (2012). Air-assisted liquid–liquid microextraction method as a novel microextraction technique; Application in extraction and preconcentration of phthalate esters in aqueous sample followed by gas chromatography–flame ionization detection. Analytica Chimica Acta, 728, 31-38. https://doi.org/10.1016/j.trac.2019.115734

Ghasemi, R., Mirzaei, H., Afshar Mogaddam, M., Khandaghi, J. & Javadi, A. (2022). Application of magnetic ionic liquid-based air–assisted liquid–liquid

microextraction followed by back-extraction optimized with centroid composite design for the extraction of antibiotics from milk samples prior to their determination by HPLC–DAD. Microchemical Journal, 181, 107764. https://doi.org/ 10.1016/j.microc.2022.107764

Gholizadeh, S., Mirzaei, H., Khandaghi, J., Afshar Mogaddam, M. & Javadi, A. (2022). Ultrasound–assisted solvent extraction combined with magnetic ionic liquid based-dispersive liquid–liquid microextraction for the extraction of mycotoxins from tea samples. Journal of Food Composition and Analysis, 114, 104831. https://doi.org/ 10.1016/j.jfca.2022.104831

González, A. G. & Herrador, M. Á. (2007). A practical guide to analytical method validation, including measurement uncertainty and accuracy profiles. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 26(3), 227-238. https://doi.org/10.1016/j.trac.2007.01.009

Jadhav, V. J. & Badgujar, P. C. (2021). Development of a HPLC fluorescence method for determining efficacy of milk pasteurization. Food Analytical Methods, 14(2), 260-267. https://doi.org/10.1007/s12161-020-01865-6

Jayalakshmi, K., Paramasivam, M., Sasikala, M., Tamilam, T. & Sumithra, A. (2017). Review on antibiotic residues in animal products and its impact on environments and human health. Journal of Entomology and Zoology Studies, 5(3), 1446-1451. https://doi.org/

Jeddy, M. & Khandaghi, J. (2019). Detection and quantification of phytosterols in yogurt using gas chromatography. Food Hygiene, 9(1 (33)), 59-70. https://doi.org/ 10.30495/JFH.2019.545850 [In Persian].

Limoei Khosrowshahi, B., Marzi Khosrowshahi, E., Afshar Mogaddam, M. & KHandaghi, J. (2022). Use of Dispersive Solid-Phase Extraction in Combination with Dispersive Liquid-Liquid Microextraction for the Assessment of Organophosphorus Pesticides in Fruit Juice Samples Using Gas Chromatography-Nitrogen-Phosphorus Detector. Iranian Journal of Nutrition Sciences & Food Technology, 87-98. https://doi.org/20.1001.1.17357756.1401.17.2.8.0 [In Persian].

Llompart, M., Celeiro, M. & Dagnac, T. (2019). Microwave-assisted extraction of pharmaceuticals, personal care products and industrial contaminants in the environment. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 116, 136-150. https://doi.org/10.1016/j.trac.2019.04.029

Meshkini, K., AfsharMogaddam, M. & Khandaghi, J. (2021). Development of Homogeneous Liquid-Liquid Extraction in Combination with Dispersive Liquid-Liquid Microextraction Based on Deep Eutectic Solvents for the Extraction and Assessment of Phytosterols in Animal Cream Samples using Gas Chromatography Equipped with Flame Ionization Detector. Iranian Journal of Nutrition Sciences & Food Technology, 16(2), 57-67. https://doi.org/ 10.52547/nsft.16.2.57 [In Persian].

Mirzaei, H., Afshar Mogaddam, M. & Khandaghi, J. (2022). Simultaneous determination of four biogenic amines in whey samples using a new solid phase extraction method prior to their analysis by HPLC-MS/MS. Microchemical Journal, 177, 107313. https://doi.org/10.1016/j.microc.2022.107313

Mohebbi, A., Yaripour, S., Farajzadeh, M. A. & Afshar Mogaddam, M. (2018). Combination of dispersive solid phase extraction and deep eutectic solvent–based air–assisted liquid–liquid microextraction followed by gas chromatography–mass spectrometry as an efficient analytical method for the quantification of some tricyclic antidepressant drugs in biological fluids. Journal of Chromatography A, 1571, 84-93. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2018.08.022

Nebot, C., Regal, P., Miranda, J. M., Fente, C. & Cepeda, A. (2013). Rapid method for quantification of nine sulfonamides in bovine milk using HPLC/MS/MS and without using SPE. Food Chemistry, 141(3), 2294-2299. https://doi.org/ 10.1016/j.foodchem.2013.04.099

Rasi, H., AfsharMogaddam, M. & Khandaghi, J. (2021). Application of a new extraction method coupled to high performance liquid chromatography for tetracyclines monitoring in cow milk. Journal of food science and technology (Iran), 18(113), 339-349. https://doi.org/ 10.52547/fsct.18.113.339 [In Persian].

Sachi, S., Ferdous, J., Sikder, M. H. & Hussani, S. A. K. (2019). Antibiotic residues in milk: Past, present, and future. Journal of advanced veterinary and animal research, 6(3), 315. https://doi.org/ 10.5455/javar.2019.f350

Tolmacheva, V. V., Apyari, V. V., Furletov, A. A., Dmitrienko, S. G. & Zolotov, Y. A. (2016). Facile synthesis of magnetic hypercrosslinked polystyrene and its application in the magnetic solid-phase extraction of sulfonamides from water and milk samples before their HPLC determination. Talanta, 152, 203-210. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2016.02.010

Yao, T. & Du, K. (2020). Simultaneous determination of sulfonamides in milk: In-situ magnetic ionic liquid dispersive liquid-liquid microextraction coupled with HPLC. Food chemistry, 331, 127342. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2020.127342

Zare Sani, M., Afshar Mogaddam, M. & Khandaghi, J. (2021). Combination of cold induced HLLME with an effervescence-assisted DLLME based on deep eutectic solvent decomposition; application in extraction of some pyrethroid and carbamate pesticides from edible oils. International Journal of Environmental Analytical Chemistry, 1-16. https://doi.org/ 10.1080/03067319.2021.1955110

Zeiadi, S., Afshar Mogaddam, M., Farajzadeh, M. A. & Khandaghi, J. (2020). Combination of dispersive solid phase extraction with lighter than water dispersive liquid–liquid microextraction for the extraction of organophosphorous pesticides from milk. International Journal of Environmental Analytical Chemistry, 1-14. https://doi.org/10.1080/03067319.2020.1804892

 

15