استفاده از نشانگر مولکولی در تایید اصالت ماهی و تشخیص تقلب
محورهای موضوعی : فرآورده های شیلاتمنا ایوز 1 , مهدی ذوالفقاری 2 * , مجتبی نصر اصفهانی 3 , حامد پاک‌نژاد 4
1 - گروه علوم و صنایع غذایی ، واحد نجف آباد، دانشگاه آزاد اسلامی، نجف آباد، ایران.
2 - گروه عمل آوری فرآورده‌های شیلاتی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان،گرگان، ایران
3 - گروه شیمی، واحد نجف آباد، دانشگاه آزاد اسلامی، نجف آباد، ایران.
4 - گروه تکثیر و پرورش آبزیان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان،گرگان، ایران.
کلید واژه: تقلب, کنسرو ماهی تن, واکنش زنجیرهای پلیمراز , سیتوکروم اکسیداز1,
چکیده مقاله :
برای بررسی تطابق نوع ماهی درج شده بر روی برچسب فراورده های دریایی با محتویات آنها روشهای مختلفی وجوددارد. هدف این تحقیق بررسی اصالت نوع ماهی مصرفی در مقایسه با برچسب درج شده بر روی کنسرو ماهی تن و توسعه روش DNA barcoding برای این منظور می باشد. در این مطالعه از کنسروماهی تن پرشده با گوشت یک تکه و تهیه شده در آب نمک و روغن و کنسروماهی تن پرشده با گوشت خرد شده و تهیه شده در آب نمک و روغن استفاده شد. برای این کار، پس از جمع‌آوری برندهای مختلف کنسرو ماهی تن از نقاط مختلف کشور استخراج DNA انجام و کیفیت و کمیت آن بررسی شد و سپس با استفاده از پرايمرهای طراحي شده برای ژن سيتوکروم اکسیداز1،واکنش زنجیره ایی پلیمراز برای تكثير ژن مورد نظر انجام گرفت. سپس میزان اختصاصیت پرایمرها بررسی گردید. در نهایت توالی یابی انجام شد. نتایج نشان داد که از میان پرایمرهای مورد استفاده تنها یک پرایمر با دستورالعمل طراحی شده توانست برای نمونههای مورد بررسی به طور اختصاصی عمل کند. نتایج حاصل از توالییابی نشان داد که تقلب در کنسرو ماهی تن خرد شده و فراوری شده در آب نمک در مقایسه با گوشت یک تکه و فراوری شده در روغن بیشتر بود و به طور کلی از 100 نمونه کنسرو مورد بررسی،20 مورد عدم تطابق برچسب گزارش شد. این روش به دلیل سرعت و دقت بالا و اختصاصي بودن، حتی برای کنسروهای تهیه شده در آب نمک و روغن که ممکن است قطعات DNA طی فرآیندهای تهیه کنسرو از بین برود، بسیار کاربردی است و استفاده از آن برای بررسی میزان تقلبات غذاهای فرآوری شده پیشنهاد میگردد.
There are different ways to assess the lable of marine product with their actual contents. The aim of this study was to compare the authenticity of the fish with the label on the canned tuna and to improve the identification technique is applied. Canned tuna stuffed with one piece meat in brine , oil and canned tuna stuffed with chopped meat in brine , oil were use . samples were abtained from different city of Iran. DNA extraction was performed on all samples and its quality and quantity were investigated. And then, polymerase chain reaction with designed primers for cytochrome oxidase 1 gene was performed . Then the accuracy and specificity of primers were evaluated using principle program . Finally, sequencing was performed and the results showed that among the examined primers one primer could work specifically for the examined samples. Most of fraud were in canned tuna with chopped meat in brine compared to one piece meat in oil, and out of 100 canned samples examined, 20 mis labeling were reported. Due to its high speed , accuracy and specificity, this method is very useful for to indentify of fraud in tuna canned prepared in brine and oil, that DNA fragments may be lost during the canning process, and is recommended to investigate the amount of fraud of processed foods.
1. میرخانی، ش.، چنگیزی، ر.، شجاعی، ل. 1392. بررسی و راستی آزمایی برخی نمونه های کنسرو ماهی تن هوور معمولی (unnus tonggol) موجود در بازار ایران با استفاده از روش DNA Barcoding دومین همایش ملی امنیت غذایی، سواد کوه.
2. هاشم¬زادگان م، تفویضی ف، حسینی س، بیات، م. بررسی تطابق مواد اولیه اصلی درج شده در برچسب همبرگرهای ممتاز شهر تهران توسط آنالیز مولکولی. نشریه نوآوري در علوم و فناوري غذايي. 1393؛ 6(4): 56-49.
3. Aryainejad S .h, Kavousi K, Fatuhi L, Mousavi Movahedi A. Detection of adulteration in meat products based on DNA sequence. Science Cultivation. 2017; 8(2): 143-147.(In persian)
4. Barcaccia G, Lucchin M, Cassandro M. DNA barcoding as a molecular tool to track down mislabeling and food piracy. Diversity. 2015; 8(1) :2-6.
5. ElShehawy S. M, Farag Z. S. Safety assessment of some imported canned fish using chemical, microbiological
and sensory methods. The Egyptian Journal of Aquatic Research. 2019; 45(4) : 389-394.
6. Fernandes T. J, Amaral J. S, Mafra I. DNA barcode markers applied to seafood authentication: An updated review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2021; 61(22) : 3904-3935.
7. Fiorino G. M, Garino C, Arlorio M, Logrieco A. F, Losito I, Monaci L. Overview on untargeted methods to combat food frauds: a focus on fishery products. Journal of food quality. 2018; 13(2):46-55.
8. Ganjeh A, Monfared A, Solanzadeh N. The Effect of Different Vegetable Oils on the Sensory Evaluation and Quality of Canned Tuna Fish. Journal of Health System Research. 2017; 13(3):278-284.
9. Heidarzadeh M. Selection the Most Suitable Method for DNA Extraction from Muscleof Iran's Canned Tuna, International Proceedings of Chemical, Biological and Environmental Engineering. 2015; 88(9):16-20.
10. Hoseini H, Barazandegan Kh, Akhoondzadeh A, Shemshadi B, tavakoli H, Khaksar R. Determination the kind of meat content of Patties marketed in Tehran in. Journal of Food Science and Technology. 2009; 9(3): 95-100. [In Persian]
11. Hoseini H, Rokni N, Kaamkar A. Collagen and Related Indices of Quantitative Values Indicatorsin Quality Control of Heated Red Meat Products in Iran. Journal of Food Science and Technology. 2006; 3(4): 23-30. [In Persia]
12. Inoue J. G, Miya M, Tsukamoto K, Nishida, M. Complete mitochondrial DNA sequence of Conger myriaster (Teleostei: Anguilliformes): novel gene order for vertebrate mitochondrial genomes and the phylogenetic implications for anguilliform families. Journal of Molecular Evolution. 2001; 52(4):311-320.
13. Janosi, A., 2006. Species specific detection of meat by Polymerase Chain Reaction techniques. PhDthesis, Budapest University.
14. Karimi M, Zeinali S. PCR (Translation). Authors: Mc Pherson MJ and Moller SG, Tehran Andisheye Zohor Publication, 84-117. [In Persian]
15. Kitpipit T, Sittichan K, d Thanakiatkrai P. Direct-multiplex PCR assay for meat species identification in food products, Food Chemistry. 2014; 16(3): 77–82.
16. Kolengi M. H, Farahmand H, Aghilinejad S. M, Akbarzadeh A. Introduction of cytochrome b gene as a suitable gene to identify the identity of caviar and sturgeon fish of the Caspian Sea. Journal of Utilization and Cultivation of Aquatics. 2012; 1(2): 51-62.
17. Miandare H. K, Farahmand H, Akbarzadeh A, Ramezanpour S, Kaiya H, Miyazato M, Nikinma M. Developmental transcription of genes putatively associated with growth in two sturgeon species of different growth rate. General and Comparative Endocrinology. 2013; 18(2): 41-47.
18. Monjezi, N., 2010. Verification of some canned sardine fish samples available in the Iranian market using DNA Barcoding method. Security،Savadkuh،https://civilica.com/doc/303486
19. Nurilmala M, Widyastuti U, Kusuma WA, Nurjanaha N, Wulansari N, Widyatuti Y. DNA barcoding for identification of processed tuna fish in Indonesian market. Jurnal Teknologi. 2016; 12(78) :2-4.
20. Parchami nejad F, Hosseni SE, Tafvizi F, Tajabadi Ebrahimi M, Sharifan A. Fraud identificationin beef sausage in Tehran province using mitochondrial genes of animal species. Food Hygiene. 2014;4(13): 81-97.
21. Parkhemi nejad F, Hosseini S. A, Tawafi F, Tajabadi Ebrahimi M, Sharifan A. Identification of adulterations in cold cuts and sausages made from beef based on the identification of mitochondrial genes of animal species in Tehran province. Food Hygiene. 2013; 4(1): 81-97. (In persian)
22. Tarmizi D, Zainuddin Z. DNA Barcoding: A Tool To Deect Fraud In Seafood Products. Big Data In Agriculture. 2020; 2(1):20 -22.
23. Teletchea F, Bernillon J, Duffraisse M, Laudet V, Hänni C. Molecular identification of vertebrate species by oligonucleotide microarray in food and forensic samples. Journal of Applied Ecology. 2008; 45(3): 967-975.
24. Ulca P, Balta H, Çagın I, Senyuva H. Meat species identification and Halal authentication using PCR analysis of raw and cooked traditional Turkish foods. Meat Science. 2013; 94(4): 280–284.
25. Viljoen, GJ., Nel, L., Crowther, J. 2005. Molecular Diagnostic Pcr handbook.. Published by Springer.
26. Ward R. D, Zemlak T. S, Innes B. H, Last P. R, Hebert P. D. DNA barcoding Australia's fish species. Philosophical Transactions of the Royal Society. Biological Sciences. 2005; 360(1462): 1847-1857.
Journal of Innovation in Food Science and Technology , Vol 17, No 2, Summer 2025
Homepagr: https://sanad.iau.ir/journal/jfst E-ISSN: 2676-7155
(Original Research Paper)
The Use of Molecular Markers in Confirming the Authenticity of Fish and Detecting Fraud
Mona Aivaz1, Mehdi Zolfaghari 2*, Mojtaba Nasr Esfahani3, Hamed Pak Nejad4
1- Departement of Food Sciences and Technology, Najafabad Branch, Islamic Azad University, Najafabad, Iran.
2- Department of Fisheries products processing Technology , Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran.
3- Department of Chemistry, Najafabad Branch, Islamic Azad University , Najafabad, Iran.
4- Department of Aquatics Reproduction and culture. Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran.
Received:01/01/2023 Accepted:20/02/2023
DOI: 10.71810/jfst.2024.1004797
Abstract
There are different ways to assess the lable of marine product with their actual contents. The aim of this study was to compare the authenticity of the fish with the label on the canned tuna and to improve the identification technique is applied. Canned tuna stuffed with one piece meat in brine , oil and canned tuna stuffed with chopped meat in brine , oil were use . samples were abtained from different city of Iran. DNA extraction was performed on all samples and its quality and quantity were investigated. And then, polymerase chain reaction with designed primers for cytochrome oxidase 1 gene was performed . Then the accuracy and specificity of primers were evaluated using principle program . Finally, sequencing was performed and the results showed that among the examined primers one primer could work specifically for the examined samples. Most of fraud were in canned tuna with chopped meat in brine compared to one piece meat in oil, and out of 100 canned samples examined, 20 mis labeling were reported. Due to its high speed , accuracy and specificity, this method is very useful for to indentify of fraud in tuna canned prepared in brine and oil, that DNA fragments may be lost during the canning process, and is recommended to investigate the amount of fraud of processed foods.
Keywords: Fraud, Canned Tuna, Polymerase Chain Reaction (PCR), Cytochrome Oxidase 1.
Corresponding Author: zolfaghari.mz@gau.ac.ir
E-ISSN: 2676-7155 سایت مجله: https://sanad.iau.ir/journal/jfst
(مقاله پژوهشی)
استفاده از نشانگر مولکولی در تایید اصالت ماهی و تشخیص تقلب
منا ایوز1، مهدی ذوالفقاری2*، مجتبی نصراصفهانی3، حامدپاک‌نژاد4
1- گروه علوم و صنایع غذایی ، واحد نجف آباد، دانشگاه آزاد اسلامی، نجف آباد، ایران.
2- گروه عمل آوری فرآورده‌های شیلاتی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان،گرگان، ایران.
3- گروه شیمی، واحد نجف آباد، دانشگاه آزاد اسلامی، نجف آباد، ایران.
4- گروه تکثیر و پرورش آبزیان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان،گرگان، ایران.
تاریخ دریافت:11/10/1401 تاریخ پذیرش:01/12/1401
DOI: 10.71810/jfst.2024.1004797
چکیده
برای بررسی تطابق نوع ماهی درج شده بر روی برچسب فراورده های دریایی با محتویات آنها روشهای مختلفی وجوددارد. هدف این تحقیق بررسی اصالت نوع ماهی مصرفی در مقایسه با برچسب درج شده بر روی کنسرو ماهی تن و توسعه روش DNA barcoding برای این منظور می باشد. در این مطالعه از کنسروماهی تن پرشده با گوشت یک تکه و تهیه شده در آب نمک و روغن و کنسروماهی تن پرشده با گوشت خرد شده و تهیه شده در آب نمک و روغن استفاده شد. برای این کار، پس از جمع‌آوری برندهای مختلف کنسرو ماهی تن از نقاط مختلف کشور استخراج DNA انجام و کیفیت و کمیت آن بررسی شد و سپس با استفاده از پرايمرهای طراحي شده برای ژن سيتوکروم اکسیداز1،واکنش زنجیره ایی پلیمراز برای تكثير ژن مورد نظر انجام گرفت. سپس میزان اختصاصیت پرایمرها بررسی گردید. در نهایت توالی یابی انجام شد. نتایج نشان داد که از میان پرایمرهای مورد استفاده تنها یک پرایمر با دستورالعمل طراحی شده توانست برای نمونههای مورد بررسی به طور اختصاصی عمل کند. نتایج حاصل از توالییابی نشان داد که تقلب در کنسرو ماهی تن خرد شده و فراوری شده در آب نمک در مقایسه با گوشت یک تکه و فراوری شده در روغن بیشتر بود و به طور کلی از 100 نمونه کنسرو مورد بررسی،20 مورد عدم تطابق برچسب گزارش شد. این روش به دلیل سرعت و دقت بالا و اختصاصي بودن، حتی برای کنسروهای تهیه شده در آب نمک و روغن که ممکن است قطعات DNA طی فرآیندهای تهیه کنسرو از بین برود، بسیار کاربردی است و استفاده از آن برای بررسی میزان تقلبات غذاهای فرآوری شده پیشنهاد میگردد.
واژه های کلیدی: تقلب، کنسرو ماهی تن،واکنش زنجیرهای پلیمراز ، سیتوکروم اکسیداز1.
مسئول مکاتبات: zolfaghari.mz@gmail.com
1-مقدمه
مصرف كنسرو ماهي به خصوص كنسرو ماهي تن به علت استفاده راحت و آسان در کشور رو به افزایش است (8). به طوری که ظرفیت صنعت کنسروسازی ماهی ایران 134 واحد بوده که حدود 717 میلیون قوطی در سال ظرفیت دارند. که ظرفیت عملیاتی این صنعت 564 میلیون قوطی در سال میباشد. توسعه این صنعت به نحوی است که از 33 محصول فرآوری شده شیلاتی، 12 محصول آن کنسروی بوده است (7). تن ماهیان مورد استفاده در کنسرو در ایران به طور عمده شامل ماهیان ارزشمندی نظیر گیدر (تن زردباله)، ماهی هوور، هوور مسقطی، ماهی زرده میباشد. طبق استانداردهای غذا و دارو تولیدکنندگان موظف به درج نوع ماهی مورد استفاده در تولید کنسرو هستند. با توجه به ارزش اقتصادی بالای ماهیان تن مذکور و علاقه‌مندی بیشتر مصرف کنندگان به خرید کنسرو این ماهیان، این کنسروها جایگاه بهتری در سبد خرید مصرف کنندگان دارند. همواره این احتمال وجود دارد در صنعت تولید کنسرو تن ماهیان نیز همچون بسیاری از صنایع غذایی دیگر تولید کنندگان به منظور دستیابی به سود بیشتر اقدام به جایگزینی گونه های کم ارزش به جای گونه هایی که قیمت بالایی داشته و مورد پسند مصرف کنندگان می باشد نموده و با نصب برچسب جعلی روی محصولات خود باعث می شوند مصرف کننده بدون هیچ اطلاعی هزینه بیشتر از محصول ارزش واقعی محصول خریداری شده پرداخت کند.(5) به طور کلی تقلب از دیدگاه های اقتصادی، مذهبی و سلامتی حایز اهمیت است (14و20). بنابراین ابتکارات لازم برای افزایش آگاهی عمومی و ایجاد ابزارهای موثر برای احراز هویت محصولات میتواند نوع گونه ماهی را شناسایی و از ایجاد تقلب جلوگیری کند. برای شناسایی اصالت گوشت حلال و تفکیک آن از گوشت حرام از واکنش زنجیره ای پلیمراز و سایر روشهای پروتئینی استفاده شده است که در این بین بیشتر مطالعات بر پایه واکنش زنجیره ای پلیمراز و با به کارگیری تکنیک های مختلف آن بوده است.(10)
منجزی و همکاران طی پژوهشی، تعداد 18 نمونه شامل 5 برند وارداتی کنسرو ماهی و 1 برند داخلی از 6 فروشگاه در شمال شهر تهران بررسی نمودند. نتایج بیانگر وجود گونه‌های مختلف غیر از گونه‌ی برچسب شده روی کنسروهای مورد نظر بود(18). میرخانی و همکاران (1392) به بررسی وجود ماهی تن هوور معمولی موجود در 48 نمونه کنسرو موجود در بازار تهران با استفاده از واکنش زنجیره ایی پلیمراز پرداختند. نتایج حاصل حاکی از وجود گونه هایی غیر از نمونه اصلی در کنسروها بود (1). هاشم زادگان و همکاران (1393) در تحقیقی به بررسی همبرگرهای شهر تهران در ارتباط با اثبات وجود پروتئین سویا بر خلاف برچسب تایید شده به همراه گوشت گاو در تمامی نمونههای همبرگر ممتاز پرداختند (2). زانیاد و همکاران (2020) از روش بارکد گذاری در شناسایی انواع محصولات دریایی فیله نامشخص اقیانوس آرام، بالههای سینهای برای استیک، فیله پلوک کوبیده، مخلوط ماهی کاد، ماهی ساردین کنسرو شده و سوش ماهی قزل آلا استفاده کردند (23). اثر فناوری به کار رفته در تولید کنسرو ماهی تن بر توانایی استخراج DNA و تشخیص مولکولی PCR در مطالعه حیدرزاده (2015) نشان داده شده است. طبق این گزارش میزان راندمان استخراج DNA در کنسرو آب نمک به طور معنی داری کمتر از کنسرو در روغن ماهی تن بود که این امر نشان دهنده لزوم توسعه و بهینه سازی فناوری تشخیص مولکولی DNA گوشت برای کنسرو آب نمک علاوه بر کنسرو ماهی در روغن می باشد (9). با توجه به تحقیقات انجام شده مشخص گردید تاکنون مطالعهای در مورد بررسی قابلیت استفاده از روش تشخیص مولکولی فرآورده کنسرو ماهی تن تولید شده در آب نمک و روغن بر مبنای DNA صورت نگرفته است، همچنین وضعیت میزان تقلب در بازار کنسرو ماهی تن در ایران نامشخص است. از این رو، بررسی وضعیت بازار ایران از این حیث نیز ضروری به نظر می‌رسد. بنابراین در این تحقیق از واکنش زنجیره ایی پلیمراز برای تشخیص دقیق گونه‌های رایج ماهی تن کنسروی فراوری شده در
آب نمک و روغن استفاده شد و اختصاصیت پرایمرها بررسی شد و میزان عدم تطابق برچسب نمونه ها اعلام شد.
2- مواد و روش ها
برای جمع آوری نمونه ها از برندهای وجود در بازار کنسروهای ماهی تن جمع آوری شد. پس از بررسی مشخصات موجود روی قوطیهای تن، این اطلاعات اعم از نوع گونه و روش فرآوری آن نظیر کنسرو در آب نمک یا کنسرو در روغن و نوع گوشت یک تکه یا خردشده ثبت گردید. از هر برند سه نمونه تهیه شد، و در فریزر20- درجه سانتیگراد نگهداری شد .
2-1-استخراج DNA
به منظور استخراج DNA، به میزان 25 میلیگرم از نمونه گوشت کنسرو توسط ازت مایع و هاون چینی کاملا پودر و در ادامه با استفاده از کیت DNA xPLuS ساخت شرکت سیناکلون و بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده استخراج گردید.(3)
2-2- ارزیابی کیفیت DNA
به این منظور از دستگاه الکتروفورز افقی استفاده شد. برای ارزیابی کیفی DNA استخراج شده از ژل آگاروز 1 درصد استفاده گردید. برای این منظور بر اساس سینی ژل، آگارز تهیه شد. میزان 4/0 گرم آگارز با 40 میلی‌لیتر بافر TAE1 مخلوط و با کمک مایکرویو، ژل آماده و پس از کاهش دما ژل در سینی ریخته شد. برای ارزیابی DNA استخراج شده، نمونه آماده شده از DNA به چاهکهای موجود روی ژل منتقل شده و بر اساس بار الکتریکی DNA، از سمت منفی به سمت مثبت حرکت آن مورد بررسی قرار گرفته شد. جهت رویت DNA بر روی ژل از رنگ DNA Safe Stain استفاده گردید (17و20).
2-3- ارزیابی کمیت DNA
به این منظور از روش اسپکتروفتومتری استفاده شد. مقدار جذب نوری نمونهها در طول موج260-280 نانومتر و نسبت 260/280 به وسیله دستگاه اندازهگیری و ثبت گردید. اگر نسبت رقت 8/1 = A1/A2 باشد، DNAاستخراجی دارای کیفیت مناسب است و اگر این نسبت بزرگتر از 8/1 باشد، DNA دارای ناخالصیRNA بوده و اگر کمتر از این مقدار باشد نشانه ناخالصی فنول و پروتئین است. پروتئین معمولا در280 نانومتر و پلیساکاریدها در230 نانومتر جذب زیادی دارند. بنابراین، میزان آلودگی محصول به پروتئین و هیدراتهای کربن از طریق میانگین این جذبها تشخیص داده شد (21).
2-4- انتخاب پرایمر
پرایمرهای بکار رفته در این پژوهش در جدول شماره1 ارایه گردیده است. انتخاب و سنتز آغازگرها بر اساس اطلاعات موجود در منابع مختلف صورت پذیرفت. لازم به ذکر است توالی آغازگرهای این ژن در تمام آبزیان تقریبا یونیورسال میباشد.(12و26)
2-5- واکنش زنجیر ه ایی پلیمراز
2-5-1-فرآیند PCR
آمادهسازی نمونهها برای انجام PCR طبق جدول 2 انجام گرفت. مخلوط به مدت 10 ثانیه میکس شده، سپس میکروتیوب حاوی مواد در دستگاه PCR قرار گرفت. طبق برنامه داده شده به دستگاه جدول3 و4 عملیات تکثیر انجام گرفت (12و26).
[1] 1- Tris-Acetate-EDTA
جدول1- آغازگرهای مورد استفاده در آزمایش زنجیره ایی پلیمراز برای تشخیص تقلب در کنسروهای ماهی تن
کد | پرایمر | توالی |
VT | TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC | |
FFT | FishF2_t1 | TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC |
FRT | FishR2_t1 | CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA |
FT | FR1d_t1 | CAGGAAACAGCTATGACACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA |
LC | L5956-COI | ACAAAGACATTGGCACCCT |
HC | H6558-COI | CCTCCTGCAGGGTCAAAGAA |
MB | MiniBarcode | ATCACAAAGACATTGGCACCCT |
جدول2- بهینه سازی مواد مورد نیاز برای انجام فرآیند PCR نمونههای مورد بررسی
مواد | ماکرولیتر |
PCR Master Mix | 15 |
F Primer | 1 |
R Primer | 1 |
DNA | 1 |
H2O | 7 |
جدول3- برنامه اول تکثیر ژن بکار برده شده در واکنش زنجیر ه ایی پلیمراز
دما(درجه سانتیگراد) | زمان |
| مراحل واکنش زنجیره ایی پلیمراز |
|
|
|
|
95 | 5 دقیقه |
| دناتوراسیون اولیه |
|
|
|
|
94 | 30 ثانیه | دناتوراسیون | تکثیر |
55 | 40 ثانیه | اتصال |
|
72 | 1 دقیقه | طویل سازی |
|
| 40 | تعداد سیکل |
|
72 | 10 دقیقه |
| طویل سازی نهایی |
جدول 4- برنامه دوم تکثیرژن در واکنش زنجیره ایی پلیمراز
دما(درجه سانتیگراد) | زمان |
| مراحل واکنش زنجیره ایی پلیمراز |
|
|
|
|
95 | 5 دقیقه |
| دناتوراسیون اولیه |
|
|
|
|
94 | 30 ثانیه | دناتوراسیون | تکثیر |
50 | 45 ثانیه | اتصال |
|
72 | 1 دقیقه | طویل سازی |
|
| 35 | تعداد سیکل |
|
72 | 10 دقیقه |
| طویل سازی نهایی |
2-6- الکتروفورز
از دستگاه الکتروفورز افقی استفاده شد. محصولات واکنش زنجیر ه ایی پلیمراز روی ژل آگاروز که با رنگ DNA safe stain رنگ آمیزی شده است برده شدند. در چاهک اول ژل، محلولLader را و در باقی چاهک ها محصول PCR هر یک ازنمونه های مورد بررسی به کمک بافر سنگین کننده، بارگذاری شدند. پس از پایان الکتروفورز، از ژل عکس گرفته شد. به منظور عکس برداری از ژل آگارز از دستگاه مستندسازی ژل، با نام ژل داک( مدل بیورد، ایکس آر) استفاده شد. پس از انجام PCR و اطمینان از حصول باندهای مورد نظر نمونهها جهت ارزیابی و صحت برای توالی یابی بر اساس پروتکل شرکت توالی یابی کننده آماده سازی شد.(23)
2-7-بررسی اختصاصیت واکنش زنجیره ایی پلیمراز
به منظور تایید اختصاصی بودن پرایمرهای مورد استفاده با توجه به نزدیک بودن توالیها و بررسی دقت تکنیک و شرایط آزمون، هریک از پرایمرها با DNA نمونه ها مورد آزمون قرار گرفت تا در صورت اتصال غیراختصاصی و ایجاد باندهای اضافی نامطلوب آن مورد مشخص و از بدست آمدن نتایج مثبت نادرست جلوگیری به عمل آید.
2-8- تجزيه و تحليل اطلاعات
پس از توالی یابی نمونه با کمک برنامههای همچون Bioedit وMEGA توالیها مورد ارزیابی قرار گرفتند. و گونه ماهی مورد استفاده در نمونه کنسرو مشخص شد. (17)
2-9- بررسی آماری
تحقیق حاضر از لحاظ هدف، از نوع کاربردی و از نظر نحوه گردآوری دادهها، از نوع میدانی بود. محدوده مکانی این تحقیق تا حد امکان شهرهای مختلف کشور در نظر گرفته شد. جامعه آماری کنسروهای برندهای مختلف موجود در فروشگاه‌ها و سوپرمارکت های شهرهای مختلف بودند. نمونه برداری به روش تصادفی ساده انجام شد. این تحقیق به لحاظ تجزیه و تحلیل دادهها به منظور بیان و یا توضیح میزان عدم تطابق محتوا با اطلاعات برچسب در هر قوطی کنسرو، تحقیق کیفی است. همچنین چون این تحقیق به توصیف ویژگیها و مشخصات محتوای کنسرو می پردازد و به دنبال امکان یا عدم امکان تشخیص گوشت در هر فرآورده با روش DNA barconding بوده و همچنین حضور یا عدم حضور ماهی مورد انتظار در هر کنسرو را بررسی می کند، از نوع توصیفی می باشد. برای ترسیم نمودارها و محاسبه درصدها از نرم افزار Excell استفاده گردید.(17)
3- نتایج و بحث
3-1- نتایج بررسی کیفیت و کمیت DNA استخراجی از تن ماهی کنسرو شده
3-1-1-استفاده از روش الکتروفورز افقی برای سنجش کیفیت
باندهای ایجاد شده در تصاویر، قوی، شفاف و روشن بود و این یعنی کیفیت DNA استخراجی مناسب بوده وحاوی میزان کمی از آلودگی های پروتئینی، فنولی و RNA بوده است. در مورد نمونه های دارای باند ضعیف یا دارای پخش شدگی زیاد، استخراج دوباره انجام شد (شکل 1). به این طریق کیفیت DNA های استخراج شده به منظور استفاده در واکنش زنجیرهای پلیمراز مورد تایید قرار گرفت.
شکل 1- نتایج سنجش کیفیت DNA استخراجی
3-1-2-استفاده از روش طیف سنجی جذبی1 برای سنجش کمیت
با استفاده از دستگاه نانودراپ میزان جذب در طول موج nm260 و nm280 محاسبه گردید. نسبت جذب طول موج 260 به 280 بیانگر چگونگی کمیت می باشد. نمونه هایی که این نسبت برای آن ها بین 8/1 تا 2 بود استفاده گردید و در مورد سایر نمونه ها استخراج DNA تکرار شد(شکل 2و3).
3-2- نتایج به دست آمده از شرایط دمایی مناسب برای انجام فرآیند PCR نمونههای مورد بررسی
در نمونه حاصل از برنامه اول (جدول3 ) دایمر )یک محصول است که به صورت بالقوه در PCR تولید می شود و به صورت primer dimer که حاوی پرایمرها هیبرید شده با هم به جای هیبرید شدن هر پرایمر با یک رشته از DNA الگواست. (26(اگر قرار باشد بارها و بارها یک نوع واکنش زنجیرهای پلیمراز انجام شود لازم است تا مقدار پرایمرهای مورد استفاده و دمای اتصال پرایمرها ست گردد. کاهش تعداد سیکل ها و کاهش غلظت پرایمرها که با کاهش حجم برداشتی از آن ها جهت رفع مشکل دایمرها قابل استفاده است که در این مطالعه تعداد سیکلها کاهش داده شد. همچنین در تکرار نمونه های دیگر در ژل اسمیر( ایجاد حالت سایه ای در پس زمینه شکل)ایجاد شده و همچنین باند ایجاد شده وضوح کافی را نداشتند. به همین خاطر برنامه دوم جهت بررسی نمونه ها مورد ارزیابی قرار گرفت (جدول4 ). برنامه دوم تکثیر ژن به کاربرده شده در دستگاه PCR تصاویری واضحتر نسبت به برنامه اول نشان می دهد)شکل2) بنابراین این برنامه به همراه مارکر مناسب روشی مناسب و اثبات شده جهت تشخیص نوع گونه ماهی تن کنسرو شده می باشد.
شکل2- نتایج به دست آمده از الکتروفورز محصول PCR برای نمونههای مورد بررسی
[1] - Spectrophotometry
3-3- نتایج PCR
پس ازبررسی اولیه برنامه انتخابی میزان اختصاصیت پرایمرها بررسی شد نتایج مشخص گردید که از بین پرایمرهای مورد استفاده پرایمر مینی بارکدینگ ((Minibarcoding به عنوان پرایمر اختصاصی عمل کرده و تمام تکثیرها بر اساس این پرایمر صورت گرفت. (شکل 2) این توالی قابلیت شناسایی گونه های مورد نظر ماهی تن فراوری شده را دارد. این موضوع در تصاویر ژل الکتروفورز مشاهده گردید (شکل2). ناحیه سیتوکروم اکسیداز 1 میتوکندری در کلیه نمونه ها به طور موفقیت آمیزی با استفاده از واکنش زنجیره ایی پلیمراز تکثیر و توالی یابی شد. سپس توالی توسط پایگاه اطلاعاتی BOLD مورد ارزیابی قرار گرفت که نتایج آن در جداول 3 و4 و5 و6 وآماده است. نتایج حاصل نشان داد که از100 نمونه کنسرو 80 نمونه دارای 97 درصد شباهت ژنتیکی به تن ماهیان بودند. 20 نمونه با آن چه که روی آن برچسبگذاری شده بود، تفاوت داشت 10 مورد مربوط به کنسروهای پر شده با گوشت خرد شده در آب نمک و6 مورد مربوط به کنسروهای پرشده با گوشت خرد شده در روغن می باشد و 4 مورد مربوط به کنسرو پرشده با گوشت یک تیکه در آب نمک و2 مورد مورد مربوط به گوشت یک تیکه در روغن می باشد به طور کل بر اساس جدول5 بیشترین عدم تطابق برچسب مربوط به کنسروهای پرشده با گوشت خرد شده مشاهده گردید. و همچنین براساس جدول 6 در کنسروهای فراوری شده در آب نمک بیشترین عدم تطابق گزارش شد. در جدول 7 مشاهده میگردد که از 10 مورد تقلب صورت گرفته در کنسرو ماهی تن تهیه شده از گوشت خرد شده و فرآوری شده در آب و نمک، 7 مورد به خانواده شورت ماهیان، 1 مورد به خانواده برگ ماهی و 1 مورد متعلق به گونه راس چکربورد بود. میزان ماهی شورت به طور عمده در مناطق صید ماهی تن فراوان است و این موضوع باعث می شود همراه انواع ماهیان تن صید شود و در مرحله تولید به جای ماهی تن در کنسرو استفاده شود. در جدول 8 مشاهده میگردد که از 6 مورد تقلب صورت گرفته در کنسرو ماهی تن تهیه شده از گوشت خرد شده و فرآوری شده در روغن، تمامی موارد به خانواده شورت ماهی تعلق دارند. در جدول 9 مشاهده میگردد که از 2 مورد تقلب صورت گرفته در کنسرو ماهی تن تهیه شده از گوشت یک تکه و فرآوری شده درآب و نمک، هر دو مورد به خانواده شورت ماهی تعلق دارند. در جدول10 مشاهده میگردد که تنها یک مورد تقلب در کنسرو ماهی تن تهیه شده از گوشت یک تکه و فرآوری شده در روغن صورت گرفته است که به خانواده شورت ماهی تعلق دارند. از 100 کنسرو مورد بررسی، 80 نمونه دارای 97 درصد شباهت ژنتیکی به تن ماهیان بودند. با این وجود در 18 نمونه 90 درصد شباهت ژنتیکی به شورت ماهیان1داشت . این ماهی در مناطق کم عمق خلیجها و دریاها زندگی میکند، اگرچه ارزش غذایی قابل توجهی دارد، اما چون محتویات درون قوطی کنسرو با برچسب روی آن تفاوت داشت، این مورد نیز به عنوان تقلب در نظر گرفته شد. همچنین، 1 نمونه دارای 83 درصد شباهت به ماهی برگ ماهی2 است. این ماهی در سال 2012 توسط Britz در آبهای بخش جنوبی اقیانوس هند شناسایی شد. همچنین، 1 نمونه از 20 مورد تقلب دارای شباهت 75% به راس چکر3 بورد بود گونه متعلق به آبهای اقیانوس هند است که گاهی به صورت اتفاقی به دریای عمان و خلیج فارس وارد میشود. یک نمونه نیز بر خلاف برچسب قوطی کنسرو حاوی ماهی بچه زرده بود که با وجود این که ماهی گرانتری نسبت به ماهی هوور بوده اما به دلیل عدم تطابق با برچسب قوطی به عنوان مورد عدم تطابق لحاظ گردید. شکل 3 میزان تنوع ماهیان استفاده شده در کنسروهای ماهی تن با عدم تطابق گونه را نشان می دهد.
[2] 2-Pristolepis rubripinni
[3] 3-Halichoeres hortulanus
جدول 5- نتایج بررسی عدم تطابق نوع کنسرو ماهی با برچسب بر اساس نوع گوشت
نوع محصول | تعداد کل | نمونه های دارای عدم تطابق | درصد نمونه های رد شده |
کنسرو ماهی با گوشت خرد شده | 50 | 16 | 32% |
کنسرو ماهی با گوشت یک تیکه | 50 | 4 | 8% |
جدول 6- نتایج بررسی عدم تطابق نوع کنسرو ماهی با برچسب بر اساس نوع فراوری
نوع محصول | تعداد کل | نمونه های دارای عدم تطابق | درصد نمونه های رد شده |
کنسرو تن ماهی در آب نمک | 50 | 12 | 24% |
کنسرو تن ماهی در روغن | 50 | 8 | 16% |
شکل 3- میزان تنوع ماهیان استفاده شده در کنسروهای ماهی تن با عدم تطابق گونه
کد نمونه | نوع گوشت | مشخصات نمونه | طول قطعه | میزان شباهت(%) | گونه تشخیص داده شده | کد دسترسی بانک ژن | |||||||
89-141686-1-R | خردشده | ماهی تن | 266 | %75 | Halichoeres hortulanus | JF434990.1 | |||||||
90-141687-2-R | خردشده | ماهی تن | 269 | 78/94% | |||||||||
91-141688-3-R | خردشده | ماهی تن | 266 | 32/95% | |||||||||
92-141689-4-R | خردشده | ماهی تن | 268 | 94/96% | 92-141689-4-R | ||||||||
42-144989-5-R | خردشده | ماهی تن | 266 | 95/97% | Sillago sihama | JF494530.1 | |||||||
29-143150-16-R | خردشده | ماهی تن | 263 | 18/99% | Sillago sihama | JF494530.1 | |||||||
30-143151-17-R | خردشده | ماهی تن | 262 | 35/98% | Sillago sihama | JF494530.1 | |||||||
20-143155-18-R | خردشده | ماهی تن | 263 | 18/99% | Sillago sihama | JF494530.1 | |||||||
21-1413156-19-R | خردشده | ماهی تن | 261 | 13/83% | Pristolepis rubripinnis | MG923398.1 | |||||||
22-143157-20-R | خردشده | ماهی تن | 267 | 97% | Sillago sihama | JF494530.1 | |||||||
جدول 8- عدم تطابق گونه ماهی شناسایی شده در نمونههای کنسرو با نوع گوشت خردشده تن ماهیهای تهیه شده در روغن
کد نمونه | نوع گوشت | مشخصات نمونه | طول قطعه | میزان شباهت(%) | گونه تشخیص داده شده | کد دسترسی بانک ژن |
93-141690-5-R | خردشده | ماهی تن | 267 | 57/99% | Sillago sihama | JF494530.1 |
32-143066-6-R | خردشده | ماهی تن | 267 | 72/98% | Sillago sihama | EF609617.1 |
31-143070-8-R | خردشده | ماهی تن | 266 | 17/96% | Sillago sihama | EF609617.1 |
26-143147-13-R | خردشده | ماهی تن | 266 | 17/96% | Sillago sihama | EF609617.1 |
27-143148-14-R | خردشده | ماهی تن | 265 | 96% | Sillago sihama | EF609617.1 |
28-143149-15-R | خردشده | ماهی تن | 265 | 95% | Sillago sihama | EF609617.1 |
کد نمونه | نوع گوشت | مشخصات نمونه | طول قطعه | میزان شباهت(%) | گونه تشخیص داده شده | کد دسترسی بانک ژن |
43-144990-20-R | یک تکه | ماهی تن | 271 | 95/99% | Sillago sihama | JF494530.1 |
23-143158-21-R | یک تکه | ماهی تن | 263 | 57/99% | Sillago sihama | JF494530.1 |
جدول 10- عدم تطابق گونه ماهی شناسایی شده در نمونههای کنسرو با نوع گوشت یک تکه تن ماهیهای تهیه شده در روغن
کد نمونه | نوع گوشت | مشخصات نمونه | طول قطعه | میزان شباهت(%) | گونه تشخیص داده شده | کد دسترسی بانک ژن |
25-143160-23-R | یک تکه | ماهی تن | 263 | 57/99% | Sillago sihama | JF494530.1 |
27-143160-23-R | یک تکه | ماهی تن | 263 | 6/99% | Auxis thazard | JF494530.1 |
یکی از جنبه های سلامت و ایمنی محصولات کنسرو ماهی تشخیص تقلبات مربوط به اصالت ماهی به کار رفته در کنسرو می باشد که از نظر اقتصادی و مذهبی نیز حائز اهمیت است. از متداول ترین روش های بررسی این موضوع متدهای مبتنی بر تشخیص DNA و شناسایی پروتئین ها می باشد. (1و18) یکی از روش های رایج تشخیص پروتئین استفاده از تکنیک الایزا می باشد.(11) و از آن جایی که استفاده از این روش ها همواره مشکلاتی مانند واکنش های متقاطع و نتایج کاذب را به دنبال دارد و نیز با توجه به این که حضور و تشخیص پروتئین یک پارامتر وابسته به سن و نوع گوشت به کار رفته در فراورده می باشد. به نظر می رسد روش های بر پایه تشخیص DNA با استفاده از تکنیک PCR روش های مناسب تری هستند چرا که در این جا مهم نیست DNA استخراج شده از کدام قسمت گوشت و یا حتی بافت چربی باشد زیرا از هر ناحیه ایی که نمونه استخراج شود قابل تشخیص است. (13) مزیت دیگر این تکنیک نسبت به تجزیه و تحلیل پروتئین این است که اگرچه DNA با پردازشهای مختلف (کنسرو، گرمایش) ممکن است تغییر کند؛ اما، از مقاومت بیشتری در برابر حرارت نسبت به پروتئینها برخوردار است و همچنان میتوان قطعات کوچک DNA با اطلاعات کافی برای شناسایی به روش PCR را تقویت کرد. علاوه بر این، DNA به طور بالقوه میتواند از هر نمونهای بازیابی شود؛ زیرا تقریباً در تمام سلولهای موجود زنده وجود دارد. همچنین، به دلیل از بین رفتن کد ژنتیکی و وجود بسیاری از مناطق غیر کد کننده، DNA اطلاعات بسیار بیشتری را نسبت به پروتئینها فراهم میکند.(15) تکنیک های مخنلفی در PCR برای شناسایی تقلبات در اصالت محصولات فراوری شده دریایی مورد استفاده قرار گرفته است (4و6). میرخانی و همکاران (1392) به بررسی وجود ماهی تن هوور معمولی در 48 نمونه کنسرو موجود در بازار تهران با استفاده از روشDNA بارکدینگ پرداختند. نتایج نشان داد گونه اصلی که باید در کنسروها باشد 23 درصد بوده است.(1) مزیت مطالعه حاضر استفاده از نمونه هایی حاوی انواع ماهی تن نه تنها هوور ، برنامه تکثیر کاربردی ، توسعه روش شناسایی در مورد کنسروهای فراوری شده در آب نمک و حاوی گوشت خرد شده می باشد. در تحقیق حاضر، بیشترین میزان تقلب در کنسروهای تهیه شده از گوشت خرد شده مشاهده شد. زیرا، در این روش پر کردن قوطیهای کنسرو که یا به صورت اتوماتیک یا به صورت دستی توسط نیروی انسانی انجام میگیرد، ممکن است گوشتهای به جا مانده از سایر گونهها که قابلیت تولید کنسرو را دارند، نیز با تکههای گوشت ماهی تن مخلوط شود و چون قابلیت تشخیص گوشت پس از پخت به دلیل تغییر ظاهر آن کاهش مییابد (6)، این مشکل و یا به عبارتی تقلب ممکن است سهوی بوده باشد. که البته پیشنهاد میگردد که برای حل این مشکل در کارخانههای تولید کنسرو بخشی طراحی گردد که از کنسروها به طور تصادفی برای بررسی این تقلبهای سهوی با روشهای مولکولی تستهای مربوطه صورت گیرد. الگا و همکاران (2013) از روش Real time-PCR برای تعیین نوع گوشت به کار رفته در محصولات گوشتی تهیه شده از گوشت گوسفند، بوقلمون، مرغ و خوک استفاده کردند . در چهار نمونه (10درصد ) عدم تطابق برچسب گزارش شد. مزیت روش بکار گرفته شده در مطالعه الگا و همکاران تعیین میزان گوشت در نمونه مورد بررسی می باشد (24). علت استفاده از واکنش زنجیره ایی دراین مطالعه صرف هزینه کمتر و کفایت مسئله ایمنی و کنترل کیفیت در اثبات حضور یا عدم حضور گونه مورد بررسی می باشد. بنابراین مطالعه حاضر موجب به صرفه بودن انجام آزمون های شناسایی نوع گوشت ماهی در فراورده های کنسروی ماهی می باشد. در روش های مولکولی شناسایی و اطمینان از DNA تکثیر شده با توالی پرایمر انتخاب شده یک مرحله حساس و ضروری است. در این بررسی نیز، از میان پرایمرهای مورد استفاده یکی از پرایمرها به صورت اختصاصی عمل کرد.شرایط بهینه سازی شده واکنش زنجیره ایی پلیمراز اختصاصیت پرایمرهای بکار رفته در این مطالعه را اثبات کرد همچنین مشاهده باندهای مربوط به نمونه ها این مطلب را تایید کرد، در تطابق با نتایج حاصل از تحقیق حاضر، کلنگی و همکاران (212) به بررسی تشخیص تقلب در انواع ماهیان خاویاری پرداختند. برای این منظور، DNA استخراج شده از نمونهها با استفاده از سه عدد پرايمر (R1، F1a و F2a)، طراحي شده بر اساس ژن سيتوكروم b،طي واكنش زنجيره‌اي پليمراز تكثير شدند. نتایج نشان داد پرايمرهاي R1 و F2a به‌عنوان یک پرایمر اختصاصی برای گونه ازون برون معرفی شدند.(16) استفاده ازDNA میتوکندریایی به دلایلی مانند تعداد کپی های فراوان آن در تمام سلول ها و پایین بودن احتمال نوترکیبی ان نسبت به سایر انواع ژن ها از ارجحیت برخوردار است. ضمن این که مقاومت حرارتی و تعداد کپی های بالای این ژن شانس بقای آن را در شرایط مختلف افزایش داده و تضمین کننده مقدار کافی محصول PCR در آزمایشات می باشد (20). در پژوهش حاضر، اگرچه، قطعات DNA ممکن بود به خاطر درجه حرارت بالای ناشی از اتوکلاو کنسروها شکسته شده باشد، ولی DNA میتوکندریایی (سیتوکروم اکسیداز1) بسیار پایدارتر از DNA سلولی بوده و در تحقیق حاضر با استفاده از ژن سیتوکروم اکسیداز1 که یک قطعه DNA میتوکندریایی مقاوم بود، توانستیم به تقلبات موجود در کنسروهای تن ماهیان در برندهای مختلف موجود در بازار ایران پی ببریم. همچنین در تحقیقی که در کشور اندونزی در سال 2016 برای چهار محصول ماهی تن به صورت (کنسرو شده سوشی1 و فیش بال2 و فلاس3) انجام گرفت از ژن سیتوکرو اکسیداز برای تشخیص نوع ماهی به کار رفته در محصول استفاده شد.و عدم تطابق بر چسب تنها در مورد کنسرو ماهی تن مشخص شد (19). Tarmizia و Zainudd (2020) از روش بارکد گذاریDNA به عنوان ابزاری برای کشف تقلب در محصولات غذاهای دریایی استفاده نمودند. هدف اصلی این مطالعه بررسی تأثیر روش PCR در شناسایی انواع محصولات دریایی شامل فیله نامشخص اقیانوس آرام، بالههای سینهای برای استیک، فیله پلوک کوبیده، مخلوط ماهی کاد، ماهی ساردین کنسرو شده و سوش ماهی قزل آلا بود. با استفاده از کیت استخراج DNA بافت نمونهها، DNAژنومی با موفقیت از همهی نمونهها استخراج شد. از ژن سیتوکرو اکسیداز 1 استفاده شد. نتایج حاصل از توالیهای تقویت شده تنها توانست سه
[1] - Sushi
[2] - Meat ball
[3] - Fish floss
نمونه یعنی فیله پولاک کوبیده، سوش ماهی قزل آلا و کنسرو ساردین را شناسایی کند (22). در تحقیق حاضر نیز توانستیم با استفاده از ژن میتوکندری نتایج قابل اعتمادی به دست آوریم. فشار اسمز ی و حرارت در طول فراوری کنسرو تهیه شده در آب نمک باعث کاهش کیفیت و کمیت DNA استخراجی می شود که این مورد باعث کاهش دقت روش PCR در تشخیص نوع گونه می گردد در پژوهش حاضر توانستیم با بهینه سازی روش واکنش زنجیره ایی و برنامه کاربردی تکثیر نوع ماهی به کار رفته در کنسرو های فراوری شده در آب نمک را تشخیص دهیم و با کاهش هزینه ها و زمان آزمون نتایجی دقیق به دست آمد. حیدر زاده در سال 2015 طی تحقیقی از روش های مختلف برای استخراج DNA ماهی تن کنسرو شده در اب نمک و روغن استفاده کرد و کیفیت و کمیت DNA استخراج شده را با روش های اسپکتوفتومتری و ژل آگارز تعیین کرد و در نهایت بهترین روش استخراج را معرفی کرد. DNA استخراج شده به روش Wizard و CTBA کمترین آلودگی به پروتئین وRNA و سایر مواد داشت. همچنین خرد شدن و تکه شدن DNA در طی استخراج به این دو روش کمتر اتفاق افتاد وDNA استخراجی بیشترین غلظت و بهترین کیفیت را داشت که این مورد به عواملی مهمی مانند طول زمان استخراج و نوع مواد شیمیایی به کار رفته بستگی دارد.که با نتایج تحقیق فوق همخوانی داشت همچنین میزان غلظت DNA استخراجی در کنسرو آب نمکی و روغن نیز تفاوت داشت به طوری که غلظت به دست آمده از کنسرو روغنی 95 درصد و آب نمکی 75 درصد گزارش شد. (9)
4- نتیجه گیری
شرایط بهینه سازی شده آزمون واکنش زنجیره ای پلیمراز، اختصاصی بودن پرایمر به کار رفته در این مطالعه را اثبات کرد. همچنین مشاهده باندهای مربوط به نمونه ها این مطلب را تایید کرد که مواد و شرایط به کار رفته در فناوری کنسرو اثر منفی در واکنش زنجیره ایی پلیمراز و تشخیص گونه ماهی نداشته است که بدلیل پایداری حرارتی DNA (ژن میتوکندری) حتی زمانی که محصول تحت فرایند شدید حرارتی قرار داشته، میباشد.در این مطالعه روش DNA barcoding بر مبنای واکنش زنجیره ایی پلیمراز در تشخیص نوع ماهی بکار رفته در کنسروهای فراوری شده در آب نمک بهبود داده شد. نهایتا یافته های پژوهش نشان داد مسئله تقلب در فرارده های کنسرو ماهی تن در کشور وجود دارد و این امر لزوم نظارت مستمر و منظم نهاد های ناظر بر بهداشت و سلامت جامعه در کنار به کارگیری روش های نوین برای کشف تقلبات در مواد غذایی را بیش از پیش آشکار میکند.
5- سپاسگزاری
با سپاس از دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی گرگان و دانشگاه آزاد نجف آباد که در انجام این کار همکاری نمودند.
6- منابع
1. میرخانی، ش.، چنگیزی، ر.، شجاعی، ل. 1392. بررسی و راستی آزمایی برخی نمونه های کنسرو ماهی تن هوور معمولی (unnus tonggol) موجود در بازار ایران با استفاده از روش DNA Barcoding دومین همایش ملی امنیت غذایی، سواد کوه.
2. هاشمزادگان م، تفویضی ف، حسینی س، بیات، م. بررسی تطابق مواد اولیه اصلی درج شده در برچسب همبرگرهای ممتاز شهر تهران توسط آنالیز مولکولی. نشریه نوآوري در علوم و فناوري غذايي. 1393؛ 6(4): 56-49.
3. Aryainejad S .h, Kavousi K, Fatuhi L, Mousavi Movahedi A. Detection of adulteration in meat products based on DNA sequence. Science Cultivation. 2017; 8(2): 143-147.(In persian)
4. Barcaccia G, Lucchin M, Cassandro M. DNA barcoding as a molecular tool to track down mislabeling and food piracy. Diversity. 2015; 8(1) :2-6.
5. ElShehawy S. M, Farag Z. S. Safety assessment of some imported canned fish using chemical, microbiological
and sensory methods. The Egyptian Journal of Aquatic Research. 2019; 45(4) : 389-394.
6. Fernandes T. J, Amaral J. S, Mafra I. DNA barcode markers applied to seafood authentication: An updated review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2021; 61(22) : 3904-3935.
7. Fiorino G. M, Garino C, Arlorio M, Logrieco A. F, Losito I, Monaci L. Overview on untargeted methods to combat food frauds: a focus on fishery products. Journal of food quality. 2018; 13(2):46-55.
8. Ganjeh A, Monfared A, Solanzadeh N. The Effect of Different Vegetable Oils on the Sensory Evaluation and Quality of Canned Tuna Fish. Journal of Health System Research. 2017; 13(3):278-284.
9. Heidarzadeh M. Selection the Most Suitable Method for DNA Extraction from Muscleof Iran's Canned Tuna, International Proceedings of Chemical, Biological and Environmental Engineering. 2015; 88(9):16-20.
10. Hoseini H, Barazandegan Kh, Akhoondzadeh A, Shemshadi B, tavakoli H, Khaksar R. Determination the kind of meat content of Patties marketed in Tehran in. Journal of Food Science and Technology. 2009; 9(3): 95-100. [In Persian]
11. Hoseini H, Rokni N, Kaamkar A. Collagen and Related Indices of Quantitative Values Indicatorsin Quality Control of Heated Red Meat Products in Iran. Journal of Food Science and Technology. 2006; 3(4): 23-30. [In Persia]
12. Inoue J. G, Miya M, Tsukamoto K, Nishida, M. Complete mitochondrial DNA sequence of Conger myriaster (Teleostei: Anguilliformes): novel gene order for vertebrate mitochondrial genomes and the phylogenetic implications for anguilliform families. Journal of Molecular Evolution. 2001; 52(4):311-320.
13. Janosi, A., 2006. Species specific detection of meat by Polymerase Chain Reaction techniques. PhDthesis, Budapest University.
14. Karimi M, Zeinali S. PCR (Translation). Authors: Mc Pherson MJ and Moller SG, Tehran Andisheye Zohor Publication, 84-117. [In Persian]
15. Kitpipit T, Sittichan K, d Thanakiatkrai P. Direct-multiplex PCR assay for meat species identification in food products, Food Chemistry. 2014; 16(3): 77–82.
16. Kolengi M. H, Farahmand H, Aghilinejad S. M, Akbarzadeh A. Introduction of cytochrome b gene as a suitable gene to identify the identity of caviar and sturgeon fish of the Caspian Sea. Journal of Utilization and Cultivation of Aquatics. 2012; 1(2): 51-62.
17. Miandare H. K, Farahmand H, Akbarzadeh A, Ramezanpour S, Kaiya H, Miyazato M, Nikinma M. Developmental transcription of genes putatively associated with growth in two sturgeon species of different growth rate. General and Comparative Endocrinology. 2013; 18(2): 41-47.
18. Monjezi, N., 2010. Verification of some canned sardine fish samples available in the Iranian market using DNA Barcoding method. Security،Savadkuh،https://civilica.com/doc/303486
19. Nurilmala M, Widyastuti U, Kusuma WA, Nurjanaha N, Wulansari N, Widyatuti Y. DNA barcoding for identification of processed tuna fish in Indonesian market. Jurnal Teknologi. 2016; 12(78) :2-4.
20. Parchami nejad F, Hosseni SE, Tafvizi F, Tajabadi Ebrahimi M, Sharifan A. Fraud identificationin beef sausage in Tehran province using mitochondrial genes of animal species. Food Hygiene. 2014;4(13): 81-97.
21. Parkhemi nejad F, Hosseini S. A, Tawafi F, Tajabadi Ebrahimi M, Sharifan A. Identification of adulterations in cold cuts and sausages made from beef based on the identification of mitochondrial genes of animal species in Tehran province. Food Hygiene. 2013; 4(1): 81-97. (In persian)
22. Tarmizi D, Zainuddin Z. DNA Barcoding: A Tool To Deect Fraud In Seafood Products. Big Data In Agriculture. 2020; 2(1):20 -22.
23. Teletchea F, Bernillon J, Duffraisse M, Laudet V, Hänni C. Molecular identification of vertebrate species by oligonucleotide microarray in food and forensic samples. Journal of Applied Ecology. 2008; 45(3): 967-975.
24. Ulca P, Balta H, Çagın I, Senyuva H. Meat species identification and Halal authentication using PCR analysis of raw and cooked traditional Turkish foods. Meat Science. 2013; 94(4): 280–284.
25. Viljoen, GJ., Nel, L., Crowther, J. 2005. Molecular Diagnostic Pcr handbook.. Published by Springer.
26. Ward R. D, Zemlak T. S, Innes B. H, Last P. R, Hebert P. D. DNA barcoding Australia's fish species. Philosophical Transactions of the Royal Society. Biological Sciences. 2005; 360(1462): 1847-1857.