بررسی خواص پری‌بيوتيک نمونه های مخمر جدا شده از پساب كارخانجات صنايع غذايي

الموضوعات : Microbiology

محدثه لاری پور ¹ , محمد گلقران ² , غزاله فتوحی ³ , علی اخوان سپهی ⁴ , رضا صمصامی ⁵

1 - دانشیار گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، واحد تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
2 - کارشناسی ارشد گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، واحد تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
3 - دانشجوی دکتری میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، واحد بین المللی کیش، دانشگاه آزاد اسلامی، جزیره کیش، ایران
4 - دانشجوی کارشناسی ارشد گروه بیوتکنولوژی، دانشکده مهندسی شیمی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
5 - دانشیار گروه شیمی، واحد دزفول، دانشگاه آزاد اسلامی، اهواز، ایران

تاريخ الإرسال : 08 السبت , رمضان, 1446 تاريخ التأكيد : 12 السبت , ذو القعدة, 1446 تاريخ الإصدار : 05 الأربعاء , رمضان, 1446

الکلمات المفتاحية: اینولین, پروبيوتيك, پری‌بیوتیک, پلی‌ساکارید, مخمر ,

ملخص المقالة :

مقدمه: شيوع روز افزون مشكلات روده و معده، توجه به مصرف مكمل‏های غذایی و پروبيوتيكی را افزایش داده است. هدف از این مطالعه ارزيابي خواص پر‌ی بيوتيک پلی ساکارید حاصل از مخمرهای جداشده از پساب كارخانجات صنايع غذايي است.

مواد و روش‏ها: نمونه‌برداری و خالص‌سازی مخمر از پساب کارخانه مواد غذایی انجام شد. سپس مخمرها به روش مورفولوژی، بیوشیمیایی و میکروسکوپی شناسایی شدند. خصوصیات پری‌بیوتیکی پلی‌ساکارید مخمر‌ها با اینولین مقایسه شد. آنالیز ساختاری با استفاده از تبدیل فوریه مادون قرمز انجام شد و مقاومت آن در برابر هضم اسیدی و آنزیمی، اثربخشی در رشد باکتری‌های پروبیوتیک، ویژگی‌های تکنولوژیکی و آنتی‌اکسیدانی مورد ارزیابی قرار گرفت و بهترین سویه تولید کننده پری‌بیوتیک، با روش مولکولی PCR شناسایی شد.

یافته‌ها: پلی‌ساکاریدهای استخراج شده از Saccharomyces cerevisiae، Candida kefyr،Geotrichum candidum مقاومت به هضم قابل مقایسه و حتی بهتر از اینولین را نشان دادند. توانایی نگهداری آب و جذب روغن در پلی‌ساکاریدهای جداشده از Saccharomyces cerevisiae (03/0 ± 64/4، 03/0 ± 81/1)، Candida kefyr (03/0 ± 58/4، 03/0 ± 87/1)، Geotrichum candidum (03/0 ± 52/4 03/0 ± 92/1) قابل مقایسه و حتی بیشتر از اینولین بوده است. Saccharomyces cerevisiae حدود40 درصد فعالیت آنتی‌اکسیدانی بیشتر از دو سویه Candida kefyr،Geotrichum candidum داشته است. در غلظت‏های مورد مطالعه ارتباط مستقیمی بین غلظت پلی‌ساکارید و افزایش فعالیت آنتی‌اکسیدانی مشاهده گردید.

نتیجه‌گیری: نتایج حاصل از این بررسی نشان می‌دهد که پلی‌ساکاریدهاي جدا شده از مخمر قابلیت پری‌بیوتیکی بهتر از اینولین بامنشا گیاهی را دارند. بنابراین دیواره مخمری نه تنها می‌تواند جایگزین مناسبی برای اینولین با منبع گیاهی باشد، بلکه به حفظ گیاهان نیز کمک می‏کند.

المصادر:

Adt, I., Toubas, D., Pinon, J.M., Manfait, M. & Sockalingum, G.D., 2006. FTIR spectroscopy as a potential tool to analyse structural modifications during morphogenesis of Candida albicans. Arch Microbiol, 185, pp.277-285.
Azmi, A.F., Mustafa, S., Hashim, D.M. & Manap, Y.A., 2012. Prebiotic activity of polysaccharides extracted from Gigantochloa Levis (Buluh beting) shoots. Molecules, 17(2), pp.1635-1651.
Baliyan, S., Mukherjee, R., Priyadarshini, A., Vibhuti, A., Gupta, A., Pandey, R.P. & Chang, C.M., 2022. Determination of antioxidants by DPPH radical scavenging activity and quantitative phytochemical analysis of Ficus religiosa. Molecules, 27(4), p.1326.
Carvalho, A.F., Portela, M.C., Sousa, M.B., Martins, F.S., Rocha, F.C., Farias, D.F. & Feitosa, J.P., 2009. Physiological and physico-chemical characterization of dietary fibre from the green seaweed Ulva fasciata Delile. Brazilian Journal of Biology, 69, pp.969-977.
Curk, M.C., Peladan, F. & Hubert, J.C., 1994. Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy for identifying Lactobacillus species. FEMS Microbiol Lett, 123, pp.241-248.
Cutfield, S., Cutfield, J. & Mace, P., 2007. Bone Morphogenetic Protein Type II Receptor Structure in Two Crystal Forms. In Acta Crystallographica A-Foundation and Advances, 63, pp.S127-S127.
De Vrese, M. & Schrezenmeir, J., 2008. Probiotics, prebiotics, and synbiotics. Food biotechnology, pp.1-66.
Elleuch, M., Bedigian, D., Roiseux, O., Besbes, S., Blecker, C. & Attia, H., 2011. Dietary fibre and fibre-rich by-products of food processing: Characterisation, technological functionality and commercial applications: A review. Food Chemistry, 124(2), pp.411-421.
Erukhimovitch, V., Pavlov, V., Talyshinsky, M., Souprun, Y. & Huleihel, M., 2005. FTIR microscopy as a method for identification of bacterial and fungal infections. J Pharm Biomed Anal, 37, pp.1105-1108.
Figuerola, F., Hurtado, M.L., Estévez, A.M., Chiffelle, I. & Asenjo, F., 2005. Fibre concentrates from apple pomace and citrus peel as potential fibre sources for food enrichment. Food Chemistry, 91(3), pp.395-401.
Fuller, R. & Gibson, G.R., 1997. Modification of the intestinal microflora using probiotics and prebiotics. Scandinavian Journal of Gastroenterology, 32(sup222), pp.28-31.
Griffiths, A.J., Gelbart, W.M., Miller, J.H. & Lewontin, R.C., 2000. Modern Genetic Analysis. W. H. Freeman.
Haag, H., Gremlich, H.G., Bergmann, R. & Sanglier, J.J., 1996. Characterization and identification of actinomycetes by FT-IR spectroscopy. J Microbiol Meth, 27, pp.157-163.
Holzapfel, W.H., Haberer, P., Geisen, R., Björkroth, J. & Schillinger, U., 2001. Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition. The American Journal of Clinical Nutrition, 73(2), pp.365s-373s.
Kurtzman, C.P. & Fell, J.W., 1998. The Yeast: A Taxonomic Study. 4th ed. Elsevier Science B.V.
Larypoor Mohaddeseh, K., Karfaragheh, A. & Mohadi, M., 2023. Isolation and screening of facultative halophilic fungi producing industrial enzymes from forest parks in Tehran. Knowledge of Microbiology, 2(1), pp.68. (in Persian)
Liu, Y., Tran, D.Q. & Rhoads, J.M., 2018. Probiotics in disease prevention and treatment. The Journal of Clinical Pharmacology, 58, pp.S164-S179.
Lourens-Hattingh, A. & Viljoen, B.C., 2001. Yogurt as probiotic carrier food. International Dairy Journal, 11(1-2), pp.1-7.
Markowiak, P. & Śliżewska, K., 2017. Effects of probiotics, prebiotics, and synbiotics on human health. Nutrients, 9(9), p.1021.
Martínez-Villaluenga, C. & Gómez, R., 2007. Characterization of bifidobacteria as starters in fermented milk containing raffinose family of oligosaccharides from lupin as prebiotic. International Dairy Journal, 17(2), pp.116-122.
Matteuzzi, D., Swennen, E., Rossi, M., Hartman, T. & Lebet, V., 2004. Prebiotic effects of a wheat germ preparation in human healthy subjects. Food Microbiology, 21(1), pp.119-124.
Molan, A.L., Flanagan, J., Wei, W. & Moughan, P.J., 2009. Selenium-containing green tea has higher antioxidant and prebiotic activities than regular green tea. Food Chemistry, 114(3), pp.829-835.
Mohammadi Afshar, M., Larypoor, M. & Hosseini, F., 2024. Isolation, identification and microencapsulation of microbes isolated from the wastewater of dairy factories by alginate and polysaccharides of Lentinula edodes. Microbial Biology, 13(51), pp.97-128. (in Persian)
Nasiri Paruj Shahreh, Larypoor Mohaddeseh, Fazli, M.R. & Shariat Modari, F., 2023. Studying the probiotic potential of yeasts isolated from dairy products, sourdough and fruit peel. (in Persian)
Naumann, A., Navarro-Gonzalez, M., Peddireddi, S., Kues, U. & Polle, A., 2005. Fourier transform infrared microscopy and imaging: detection of fungi in wood. Fungal Genet Biol, 42, pp.829-835.
Naumann, D., 1985. The ultra rapid differentiation and identification of pathogenic bacteria using FT-IR techniques. SPIE Fourier Comput Infrared Spectrosc, 553, pp.268-269.
Nayak, S., 2010. Probiotics and immunity: A fish perspective. In: Fish and Shellfish Immunology, pp.21-32.
Norajit, K., Kim, K.M. & Ryu, G.H., 2010. Comparative studies on the characterization and antioxidant properties of biodegradable alginate films containing ginseng extract. Journal of Food Engineering, 98(3), pp.377-384.
Partyka, A., 2012. Enzymes antioxidant and peroxidation lipid activity in avian semen. Anim Reprod Sci, 134(3-4), pp.184-190.
Ramnani, P., Chitarraria, R., Tuohya, K. & Grant, J., 2007. Characterization of bifidobacteria as starters in fermented milk containing raffinose family of oligosaccharides from lupin as prebiotic. International Dairy Journal, 17, pp.116-122.
Rigobelo, E.C., Pereira, M.C., Vicari, D.V. & Millen, D.D., 2014. Utilização de probiótico e monensina sódica sobre o desempenho produtivo e características de carcaça de bovinos Nelore terminados em confinamento. Revista Brasileira de Saúde e Produção Animal, 15, pp.415-424.
Roberfroid, M.B., 2000. Prebiotics and probiotics: are they functional foods? The American Journal of Clinical Nutrition, 71(6), pp.1682S-1687S.
Timmins, E.M., Quain, D.E. & Goodacre, R., 1998. Differentiation of brewing yeast strains by pyrolysis mass spectrometry and Fourier transform infrared spectroscopy. Yeast, 14, pp.885-893.
Toubas, D., Essendoubi, M., Adt, I., Pinon, J.M., Manfait, M. & Sockalingum, G.D., 2007. FTIR spectroscopy in medical mycology: applications to the differentiation and typing of Candida. Anal Bioanal Chem, 387, pp.1729-1737.
Walker, G. & Grimm, M., 2012. Yeast Physiology and Biotechnology. Translated by Pournia, P. & Kachuei, R. Tehran: Jafari Publications.
Wichienchot, S., Jatupornpipat, M. & Rastall, R.A., 2010. Oligosaccharides of pitaya (dragon fruit) flesh and their prebiotic properties. Food Chemistry, 120(3), pp.850-857.
Wichienchot, S., Thammarutwasik, P., Jongjareonrak, A., Chansuwan, W., Hmadhlu, P., Hongpattarakere, T., Itharat, A. & Ooraikul, B., 2011. Extraction and analysis of prebiotics from selected plants from southern Thailand. Songklanakarin Journal of Science & Technology, 33(5).

نص كامل:



علوم غذايي و تغذيه/ زمستان 1403 / سال بیست و دوم / شماره 1                                                                                                                           Food Technology & Nutrition / Winter 2025 / Vol. 22 / No. 1

 محدثه لاری پور و همكاران

 

بررسی خواص پری‌بيوتيکی پلی ساکارید حاصل از مخمرهای جدا شده از پساب كارخانجات صنايع غذايي

 

محدثه لاری پور*a، محمد گلقرانb، غزاله فتوحیc، علی اخوان سپهیd، رضا سمسامیe

 

a دانشیار گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، واحد تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

b کارشناسی ارشد گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، واحد تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

c دانشجوی دکتری میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، واحد بین المللی کیش، دانشگاه آزاد اسلامی، جزیره کیش، ایران

 d دانشجوی کارشناسی ارشد گروه بیوتکنولوژی، دانشکده مهندسی شیمی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

e دانشیار گروه شیمی، واحد دزفول، دانشگاه آزاد اسلامی، اهواز، ایران

 

تاریخ دریافت مقاله: 18/12/1403                        تاریخ پذیرش مقاله: 20/02/1404

 

 

 

 

 

 

چکيده

مقدمه: شيوع روز افزون مشكلات روده و معده، توجه به مصرف مكمل‏های غذایی و پروبيوتيكی را افزایش داده است. هدف از این مطالعه ارزيابي خواص پر‌ی بيوتيک پلی ساکارید حاصل از مخمرهای جداشده از پساب كارخانجات صنايع غذايي است.

مواد و روش‏ها: نمونه‌برداری و خالص‌سازی مخمر از پساب کارخانه مواد غذایی انجام شد. سپس مخمرها به روش مورفولوژی، بیوشیمیایی و میکروسکوپی شناسایی شدند. خصوصیات پری‌بیوتیکی پلی‌ساکارید مخمر‌ها با اینولین مقایسه شد. آنالیز ساختاری با استفاده از تبدیل فوریه مادون قرمز انجام شد و مقاومت آن در برابر هضم اسیدی و آنزیمی، اثربخشی در رشد باکتری‌های پروبیوتیک، ویژگی‌های تکنولوژیکی و آنتی‌اکسیدانی مورد ارزیابی قرار گرفت و بهترین سویه تولید کننده پری‌بیوتیک، با روش مولکولی PCR شناسایی شد.

یافته‌ها: پلی‌ساکاریدهای استخراج شده از Saccharomyces cerevisiae، Candida kefyr،Geotrichum candidum مقاومت به هضم قابل مقایسه و حتی بهتر از اینولین را نشان دادند. توانایی نگهداری آب و جذب روغن در پلی‌ساکاریدهای جداشده از Saccharomyces cerevisiae (03/0 ± 64/4، 03/0 ± 81/1)، Candida kefyr (03/0 ± 58/4، 03/0 ± 87/1)، Geotrichum candidum (03/0 ± 52/4، 03/0 ± 92/1) قابل مقایسه و حتی بیشتر از اینولین بوده است. Saccharomyces cerevisiae حدود40 درصد فعالیت آنتی‌اکسیدانی بیشتر از دو سویه Candida kefyr،Geotrichum candidum داشته است. در غلظت‏های مورد مطالعه ارتباط مستقیمی بین غلظت پلی‌ساکارید و افزایش فعالیت آنتی‌اکسیدانی مشاهده گردید. 

نتیجه‌گیری: نتایج حاصل از این بررسی نشان می‌دهد که پلی‌ساکاریدهاي جدا شده از مخمر قابلیت پری‌بیوتیکی بهتر از اینولین بامنشا گیاهی را دارند. بنابراین دیواره مخمری نه تنها می‌تواند جایگزین مناسبی برای اینولین با منبع گیاهی باشد، بلکه به حفظ گیاهان نیز کمک می‏کند.

 

واژه‌های کلیدی: اینولین، پروبيوتيك، پری‌بیوتیک، پلی‌ساکارید، مخمر

 

* نويسنده مسئول مكاتبات                                                                                                               email: [e-mail]

 

مقدمه

اولین بار پری بیوتیک‏ها در سال 1995 رایج شدند و این عبارت به موادی اشاره دارد که غیرقابل هضم بوده و به‌طور انتخابی موجب تحریک فعالیت و متابولیسم باکتری‌های مفید می‌شوند. این فرآیند به تشکیل کلونی این باکتری‌ها کمک کرده و در نهایت تعادل میکروفلور دستگاه گوارش میزبان را حفظ می‌کند (Fuller et al., 1997). برخلاف پروبیوتیک‌ها که شامل میکروارگانیسم‌های زنده هستند، پری‌بیوتیک‌ها نوعی کربوهیدرات غیرقابل هضم محسوب می‌شوند که رشد باکتری‌های مفید روده را بهبود بخشیده و تأثیر مثبتی بر سلامت میزبان دارند. از جمله انواع مختلف پری‌بیوتیک‌ها می‌توان به فروکتواولیگوساکاریدها، گلوکواولیگوساکاریدها و مانان‌اولیگوساکاریدها اشاره کرد (Cutfield et al., 2007). پروبيوتيك‌ها در حقیقت ميكروارگانيسم‌هايي هستند در قسمت‌های مختلف بدن (بويژه در روده) به تعداد مناسب که زنده و فعال هستند و با کارایی زيستي خود از طريق حفظ و بهبود توازن ميكروبي در روده تاثير مثبتي روی سلامت ميزبان مي‌گذارند و تعادل بهتری بر فلور دستگاه گوارش به خصوص به هضم دارند. فيبرها، به تحريك سيستم ايمني و پيشگيری و درمان اسهال کمك مي‌کنند (Liu et al., 2018). مکانیسم عمل پروبیوتیک‏ها شامل مهار چسبندگی باکتری‌ها، افزایش عملکرد سد مخاطی، تعدیل سیستم ایمنی ذاتی و تنظیم سیستم عصبی روده‌ای و مرکزی می‏باشد (DeVrese et al., 2008). تشخيص پروبيوتيك‌ها از طريق روش‏های ميكروب‌شناسي يك امر مشكل است که هزينه و وقت زيادی نياز دارد. بنابراين گرايش‌های مولكولي اخيراً، راه‌حل مناسبي جهت شناسايي آنها و همينطور ميكروب‏های غير قابل کشت در نمونه‌های روده‌ای شده است که شامل بررسي رشد و مقاومت ميكروارگانيسم در اسیدیته و دماهای مختلف و همچنين در برابر ترشحات معده و روده مي‌باشد. در کل مخمرهای جدا شده از محيط به عنوان پروبيوتيك، قدرت ماندگاری بيشتری در مراحل توليدی محصولات پروبيوتيكي دارد و همچنين پروبيوتيك جدا شده از محيط، به دليل حضور آنها در اکوسيستم طبيعي، سازگاری بيشتر و قدرت پروبيوتيكي بيشتری نيز دارد (Markowiak et al., 2017). استفاده از پروبيوتيك‌های بومي در محصولات غذايي اين مزيت را دارد که اين ميكروارگانيسم‌ها در طول زمان با سيستم گوارش سازش پيدا مي‌كنند و مي‌توانند اثرات بهتر و بيشتری را در بهبود کيفيت حيات ميزبان نشان دهند. همچنين مخمرها در مقايسه با گونه‌های باکتری به دليل ويژگي‌ها و برتری‌هايي که دارند از اهميت خاصي برخوردار مي‌باشند و در فرآيندهای پروبيوتيكي و بهينه‌سازی نقش مهمي را ايفا مي‌كنند. مخمرها موجودات يوکاريوتي تك سلولي هستند و جزء قارچ‏ها مي‌باشند. مخمرها تكثير خود را به روش جوانه زني انجام مي‌دهند، به اين صورت که سلول دختر يا کوچكتر روی سلول مادر تشكيل می‌شود. مخمرها در کاربردهای سنتی و قدیمی عمدتاً در تهیه غذاهای تخمیر شده استفاده می‏شدند. در حالی که در کاربردهای مدرن، می‏توان به تولید سوخت‏های الکلی، پروتئین‏های تک سلولی و سایر متابولیت‏های ارزشمند اشاره کرد (Lourens-Hattingh et al., 2001). مخمرها به رغم عدم حضور عمومی مانند باکتری‌ها، در محیط‌های طبیعی به‏شکل پراکنده وجود دارند. این سلول‌های تک‌سلولی فاقد کلروفیل و از نوع شیمیوارگانوتروف هستند، به این معنی که برای رشد و توسعه به منابع آلی و کربن تثبیت شده نیاز دارند. به همین دلیل، انتخاب نوع ماده غذایی تأثیر زیادی بر تنوع گونه‌های مخمر در زیستگاه‌های مختلف دارد (Partyka enzymes et al., 2012). روده جانوران، سطح گیاهان، خاک و همچنین محصولات غذایی، مناطقی هستند که دارای تنوع بالایی از باکتری‌ها و مخمرها می‌باشند و این موجودات معمولاً به صورت همزیست زندگی می‌کنند. برخی از این میکروارگانیسم‌ها که به عنوان پروبیوتیک‌ها شناخته می‌شوند، علاوه بر اینکه به هضم مواد غذایی پیچیده کمک می‌کنند، قادر به تولید ترکیبات مفیدی همچون ویتامین‌ها و آنتی‌بیوتیک‌ها هستند که در بهبود گوارش و سلامت کلی میزبان نقش مهمی دارند. سین‌بیوتیک‌ها به ترکیباتی اطلاق می‌شود که به صورت همزمان پروبیوتیک‌ها و پری‌بیوتیک‌ها را شامل می‌شوند. هدف از استفاده همزمان این دو عامل ایجاد هم‌افزایی در تأثیرات مثبت آن‌ها بر سلامت است. فرآورده‌های غذایی پروبیوتیک، پری‌بیوتیک و سین‌بیوتیک از جمله محصولات غذایی با ارزش افزوده محسوب می‌شوند که می‌توانند به بهبود سلامت انسان کمک می‏کند (Holzapfel et al., 2001). مخمرها منبع مهم آنزیم‌هاي پرکاربرد در صنایع غذایی، کشاورزي و تولید مواد شیمیایی و دارویی هستند. استفاده رو به رشد از مخمرها به عنوان منبع آنزیمی در صنایع شیمی و داروسازي منجر به تولیدات جدیدي مانند حد واسط هايی براي تولید مواد دارویی شده است (Sohail et al., 2022). از آنجایی که اثرات سلامتی بخش پروبیوتیک‏ها ثابت شده و با توجه به شيوع روز افزون مشكلات روده و معده، سرطان‏های از اين قبيل در جهان در حال افزايش مي‌باشد، اهميت باکتری‌ها و محصولات پروبيوتيك بيش از پيش مورد توجه قرار گرفته است (Kurtzman et al., 1998). هدف از این مطالعه ارزيابي خواص پر‌ی يوتيک پلی ساکارید حاصل از مخمرهای جداشده از پساب كارخانجات صنايع غذايي است.  

 

مواد و روش‌ها

-       نمونه برداری

از پساب مواد غذایی 6 کارخانه بنام شرکت قارچ دزفول، خمیر مایه دز، فرآورده‏های گوشتی تکین، مواد پروتئینی و کشتارگاه هدایت، رب گوجه دزفول،روغن ساعی 30نمونه جمع آوری شد. برای کشت100 ميكروليتر از رقت‏های
4-10 و تعداد کلنی /میلی لیتر 10-5 به پليت ) گلوکز10 گرم بر لیتر ،20 گرم بر لیتر ،پپتون20 گرم بر لیتر ، تكميل شده با 05/0 % کلرامفنيكل( اضافه و به روش کشت چمني، کشت داده شد و در انكوباتور 30 درجه سانتي گراد به مدت 24 تا 48 ساعت انكوبه گردیدوتا جداسازی به صورت تک کلنی این مرحله تکرار شد. سپس نمونه‏های خالص را سانتريفيوژ کرده و پس از رسوب، سوپرناتانت و کل نمونه‏ها هم برای افزايش احتمال جداسازی به صورت مجزا مجدد کشت داده شد (Larypoor et al., 2023).

 

-       شناسايي مورفولوژي و تشخيص اوليه جدایه ها

به منظور بررسي کلني‏ها، رنگ کلنی، شكل کلني، قوام خامه اي اندازه کلني، مورفولوژی از بالا، از نيم رخ، رنگ و حالت کلني بررسي شد تا کلني مخمرها از کلني قارچ‏های رشته اي قابل تفكيك باشد.سپس برای تشخيص اوليه مخمر از باکتری، گسترشي از مخمر آماده شد و رنگ آميزی با لاکتوفنل کاتن بلو انجام شده و با استفاده از روغن ايمرسيون ولنز 100 مشاهده‏ی سلول‏های مخمری با جوانه يا بدون جوانه انجام گردید. هر کدام از کلني‏های متفاوت و خالص با استفاده از روش کشت خطي بر روی محيط‏های پايه مانند عصاره مخمرآگار ، پوتیتو دکستروز اگار ومحیط کشت کورن میل آگار کشت داده شده و کلني‏های خالص بدست آمد.

 

-       شناسايي بيوشيميايي و ميكروسكوپي

شناسایی گونه کانديدا با انجام آزمايشات مختلف بيوشيميايي براساس روش استاندارد CLSI2022 صورت گرفت.

الف) تست جذب وتخميرقند: کشت تازه مخمر بر روی محيط واجد قند کشت داده شد. ترکيب محيط تخمير قند فنل رد براث، قند مورد بررسي، اسیدیته محيط در محدوده 7/6 تا 7 تنظيم شد. قندهای مورد استفاده در اين بررسي شامل آرابينوز، مالتوز، رافينوز، لاکتوز، مانيتول، زايلوز، گالاکتوز، سوکروز و سلبيوز مي‌باشند. محيط کشت به مدت چهل و هشت ساعت در دمای 36 درجه سانتیگراد گرماگذاری شد و نتایج مثبت گزارش شد. 

ب) تست جذب ازت: يك کلني از کشت تازه مخمر برداشته و در محيط حاوی نيترات تلقيح نموده وسپس نمونه‏ها را به مدت دو روز گرماگذاری شدند. ظهور رنگ قرمز پس از افزودن دو معرف، نشانه وجود نيتريت در محيط و مثبت بودن آزمايش بود که گزارش گردید.

ج) تست توليد آسكواسپور: توليد آسكواسپور بالغ به رنگ آبي متمايل به سبز وسلول‏های زايا به رنگ قرمز مي‌باشد.

د) تست لوله زايا: کانديدا در اين محيط لوله زايا ايجاد مي‏كند که طول آن 9/2 برابر قطر سلول مادر مي‌شود.

 

-       جداسازی ديواره پلي ساکاريدی مخمر

در این تحقیق از روش سونیکاسیون به منظور تخریب سلول‌های مخمر استفاده شد. ابتدا یک سوسپانسیون از رسوب سلول‌های مخمر که از طریق سانتریفیوژ به دست آمده بود، با استفاده از بافر فسفات سدیم سرد (با غلظت 1/0 مولار برابر و با 7/2اسیدیته) تهیه گردید. سپس این سوسپانسیون به مدت دو دقیقه با دامنه‌ی 60 درصد در دستگاه سونیکاتور تحت تاثیر قرار گرفت. به‏منظور جلوگیری از افزایش دمای محلول و پروب سونیکاتور، دستگاه به مدت چهار دقیقه خاموش شد و این فرآیند چندین بار تکرار گردید. ارزیابی میزان تخریب سلول‌های مخمری با استفاده از میکروسکوپ نوری انجام شد. پس از اطمینان از تخریب سلول‌ها، سوسپانسیون به مدت یک دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد و با دور 500 g× سانتریفیوژ شد تا سلول‌های سالم از سلول‌های تخریب شده جدا شوند. رسوب به دست آمده به عنوان دیواره سلولی در نظر گرفته شد و سپس با 10 میلی‌لیتر آب مقطر استریل به صورت سوسپانسیون درآمد. این سوسپانسیون به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد و با دور 1000 g× سانتریفیوژ شد. فرآیند شستشوی دیواره سلولی سه بار تکرار گردید و نهایتاً رسوب حاصل به روش لیوفیلیزه شده و در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری گردید. برای تهیه بافر لیزکننده فسفات سدیم 1/0 مولار، ابتدا 0716/0 گرم از Na2HPO4.7H2O و 0285/0 گرم از Na2H2PO4.2H2O وزن شده و در یک لیتر آب مقطر حل شده و سپس اتوکلاو گردید. این مراحل به دقت انجام شد تا اطمینان حاصل شود که شرایط لازم برای تخریب سلول‌ها فراهم شده است و دیواره‌های سلولی با کیفیت مطلوبی به دست می‌آیند.(Nasiri Paruje et al., 2021) 

 

-       تهيه سوش استاندارد پروبيوتيك

باکتری لاکتوباسیلوس کازِییIBRC-M 10711 Lactobacillus casei به عنوان سوش استاندارد پروبيوتيك از مرکز ملي ذخاير ژنتيكي و زيستي ايران تهيه شد.

 

-       شناسایی پلی ساکارید با روش فوربه مادون قرمز (FTIR)

ساختار پلي‏ساکاريد استخراج شده با استفاده از دستگاه تبديل فوريه مادون قرمز شناسايي شد. طيف تبديل فوريه مادون قرمز از 4000 تا 1- m 650 با قدرت تفكيك1- cm 1 با استفاده از اسپكترومترساخت شرکت Bruker مجهز به سيستم ATR ثبت شد. به منظور بررسی مقاومت به هضم پلی ساکاریدها، بر اساس روش‏های ژان و همکاران شیره معده شبیه سازی وتهیه شد. (Adt, et al., 2006) و در همان زمان اینولین تجاری با پلی ساکارید استخراج شده به عنوان یک پری بیوتیک شاخص مقایسه شد. برای شبیه سازی کلرید سدیم معده و مخلوط هیدروکلرایداسید به نسبت مشخص استفاده شد واسیدیته آن به 5/0± 2 /1 تنظيم مي شد (بافر1) برای شبيه سازی شرایط روده از پتاسيم دی هيدروژن فسفات و سود به نسبت‏های مشخص و اسیدیته آن به 4/7رسانده شد (بافر2) برای شبيه سازی مخلوط معده و روده از بافرهای 1 و 2 به نسبت 39:61 مخلوط شده و اسیدیته آن به 5/4 تنظيم شد. پلی‏ساکاریدهای استخراج شده از مخمر و اینولین به بافرهای مشخص شده اضافه شده و در انکوباتور شیکر با سرعت 100 دور در دقیقه و دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه شدند. پس از یک ساعت، سانتریفیوژ انجام شد و بافر رویی برای ارزیابی غلظت قندهای آزاد نمونه برداری شد. میزان قند آزاد با استفاده از روش دی نیتروسالسیلیک اسید (DNS) اندازه گیری شد و درجه هیدرولیز بر اساس نسبت قند آزاد آزاد شده نسبت به محتوای قند کل محاسبه شد. در مرحله سوم هضم، آنزیم آلفا آمیلاز به بافر 3 وارد شد و مقاومت آن در برابر هیدرولیز آنزیمی پس از آن مورد ارزیابی قرار گرفت.در مرحله سوم هضم به بافر 3آنزيم آلفا آميلاز اضافه شد و مقاومت آن به هيدروليز آنزيمي نيز ارزيابي گردید. (Mohammadi Afshar et al., 2024)

 

-       اثر پلي‏ساکاريد استخراج شده بر رشد باکتری پروبيوتيك

باکتری لاکتو باسیلوس کازئی Lactobacillus casei IBRC-M 10711 به عنوان سوش استاندارد پروبيوتيك از مرکز ملي ذخاير ژنتيكي و زيستي ايران تهيه شد. فعال سازی ميكروب مذکور دو بار در محيط یست اکسترکت آگارانجام گرفت. محيط پايه برای اضافه کردن ترکيب پروبيوتيك محيط یست اکسترکت آگار بدون قند انتخاب شد و اجزا تشكيل دهنده محيط مذکور باهم ترکیب شدند. سپس برا‏ی بررسي رشد باکتری در حضور ترکيب پری بيوتيك به محيط مورد نظر به نسبت (وزنی/حجمی 2%) پلي ساکاريد استخراج شده از مخمر اضافه شد.به منظور مقايسه رشد باکتری پروبيوتيك در حضور پلي ساکاريد جدا شده از مخمر محيط‏هاى شامل 2% گلوکز و 2% اينولين به عنوان پری بيوتيك تجاری شاخص تهيه شد. باکتری فعال شده به نسبت (2% حجمی/حجمی) به محيط‏هاى مذکور اضافه گردید. از محيط هاى مذکور در زمان‏های 0, 24 , 48 و 72 ساعت نمونه برداری شده و طبق روش مايلز- ميسرا در سال 1938 کشت و شمارش انجام شد. اسیدیته نمونه‏ها نيز در زمان‏های مذکور اندازه گيری شدند. براي بررسی مقاومت به هضم پلی‌ساکارید استخراج شده از جدایه 1 (Saccharomyces cerevisiae)، جدایه 2 (Candida kefyr)، جدایه 3 (Geotrichum candidum) شبیه سازی شیره‏های گوارشی در سه مرحله انجام شد. درصد هیدرولیز پلی ساکارید استخراج شده از این سه سویه، همراه با اینولین به عنوان یک پری بیوتیک تجاری استاندارد، در طی سه مرحله هضم مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

 

-       بررسي خصوصيات زیست فناوری

ظرفيت نگه‏داری آب (WHC) و ظرفيت جذب چربي (LAC) پلي‏ساکاريد استخراج شده از مخمر و نيز اينولين به عنوان پری بيوتيك شاخص، طبق روش کاروال هو و همكاران در سال 2009 اندازه گيری شد. در اين روش برای اندازه‏گيری ظرفيت نگه داری آب، 30 ميلي ليتر آب مقطر به 1 گرم نمونه اضافه شده و خوب هم زده شد. مخلوط مورد نظر 1 ساعت در دمای اتاق نگه داری و سپس در گرم 12000 به مدت 20 دقيقه سانتريفوژ شد. مايع رويي دور ريخته و باقیمانده وزن شد. ظرفيت نگه داری آب به صورت نسبت وزن آب به وزن نمونه گزارش شد. با اندازه گیری ظرفیت جذب چربی، 3 گرم از نمونه را با 18 میلی لیتر روغن آفتابگردان مخلوط کرده و به مدت 24 ساعت در دمای اتاق قرار دادند. سپس مخلوط به مدت 10 دقیقه در 1500 g× سانتریفیوژ شد و پس از آن روغن اضافی دور ریخته شد. باقی مانده پس از آن وزن شد. ظرفيت جذب چربي به عنوان نسبت وزن روغن به وزن نمونه گزارش گردید. ترکیباتی که قابلیت بالایی در نگهداری آب دارند، می‌توانند با افزایش گرانروی توده غذایی در دستگاه گوارش، حجم مدفوع و تعداد دفعات دفع را افزایش دهند و بدین ترتیب به کاهش سرعت جذب مواد غذایی کمک کنند. این ویژگی در کنترل وزن و بهبود وضعیت سلامتی، به ویژه در پیشگیری از بیماری‌های قلبی عروقی و دیابت، مؤثر است. ظرفیت جذب روغن به توانایی شبکه پلی‌ساکارید در جذب روغن بستگی دارد. ترکیباتی که توانایی بالایی در جذب روغن دارند و از نظر خواص زیست‌فناوری مناسب هستند، می‌توانند در پایداری بافت امولسیون‌های پرچرب مورد استفاده قرار گیرند. همچنین، از نظر فیزیولوژیکی، به دلیل توانایی در جذب چربی، می‌توانند به کاهش جذب چربی‌های غذایی به خون کمک کنند. در واقع، یکی از مکانیسم‌های مؤثر فیبرها در کاهش چربی خون، کنترل وزن و بهبود وضعیت سلامتی، به خاطر قابلیت‌های آن‌ها در جذب آب و چربی است. با توجه به ویژگی جذب چربی و آب مطلوب پلی‌ساکاریدهاي جدا شده از مخمرها و هم چنین اثبات خصوصیت پری بیوتیکی آن در بخش قبل می‏تواند گزینه مناسبی به عنوان یک پلی‌ساکارید زیست فعال و قابل رقابت با اینولین براي کاربردهاي زیست فناوری در مواد غذایی و یا حتی دارویی باشد.

 

-       بررسي خصوصيت آنتي اکسيداني

برای بررسی ویژگی‌های آنتی‌اکسیدانی پلی‌ساکارید استخراج‌شده از مخمر،2/0 گرم از این پلی‌ساکارید با 5 میلی‌لیتر متانول ترکیب و به مدت 3 ساعت در انکوباتور همزن‌دار به‌طور مداوم هم زده شد. سپس نمونه 3000× g به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد و مایع رویی به‌دست‌آمده برای ارزیابی فعالیت آنتی‌اکسیدانی مورد استفاده قرار گرفت. به‏منظور مقایسه فعالیت آنتی‌اکسیدانی پلی‌ساکاریدهای استخراج‌شده از مخمر با اینولین به‌عنوان پری بیوتیک استاندارد، درشرایط مشابهی برای اینولین بررسی شد. همچنین، به‌عنوان کنترل مثبت، از محلول 1000 میکرومولار اسید اسکوربیک استفاده شد. برای بررسی تأثیر غلظت بر فعالیت آنتی‌اکسیدانی پلی‌ساکارید استخراج‌شده از مخمر، محدوده غلظتی 04/0 تا 05/0 گرم بر میلی‌لیتر نمونه تهیه و سپس مراحل هم‌زدن و سانتریفیوژ کردن مشابه قبل انجام گرفت. برای ارزیابی فعالیت آنتی‌اکسیدانی، از روش سنجش ظرفیت آنتی‌اکسیدانی به‌روش رادیکال DPPH استفاده گردید.

برای انجام این آزمایش، 500 میکرولیتر عصاره متانولی به سرعت به 5 میلی لیتر محلول متانولی با غلظت 0.1 میلی مولار اضافه شد و به خوبی مخلوط شد. مخلوط به دست آمده به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق و در محیط تاریک نگهداری شد و سپس جذب آن در طول موج 517 نانومتر اندازه گیری شد. همچنین میزان جذب محلول متانولی خود در طول موج 517 نانومتر برای ارزیابی ظرفیت آنتی اکسیدانی مشاهده و میزان فعالیت آنتی اکسیدانی با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد (Baliyan et al., 2022).

Scavenging activity%= (Absblank _Abssample) /Absblank×100

 

Absblank: جذب محلول متانولي بدون نمونه پلي ساکاريدی رزیابی ظرفیت آنتی‌اکسیدانی به‏ روش رادیکال (DPPH)

Abssample: جذب محلول متانولي با نمونه پلي‏ساکاريدی رزیابی ظرفیت آنتی‌اکسیدانی به روش رادیکال

 

-       شناسايي مولكولي

پس از خالص‏سازی مخمر و انجام آزمايشات زيستي تعداد حداقل 5 سويه مخمری، دو سويه از بهترين مخمرها از نظر فعاليت زيستي به صورت ژنتيكي شناسايي و معرفي شد. برای شناسايي مخمر جداسازی شده، پرايمرهای ITS1 و ITS4 با توالي‏هايي که در جدول 1 آمده است برای تكثير ژن S rRNA 18 مخمر استفاده گردید. اين پرايمرها از شرکت تكاپوزيست تهيه شدند. از روش واکنش زنجيرهای پليمراز ( (PCR - کلني برای تكثير قطعه مورد نظر استفاده شد. برای شناسایی از جفت پرایمرهای NL1 و NL4 به منظور تکثیر ناحیه D1/D2 و از جفت پرایمرهای ITS1 و ITS4 برای تکثیر قسمت انتهای ژن زیرواحد کوچک ریبوزومی S18، ناحیه فاصله انداز رونویسی شونده درونی (ITS1)، ژن ریبوزومی S8/5، ناحیه فاصله انداز رونویسی شونده درونی (ITS4) و قسمت ابتدایی ژن زیرواحد بزرگ ریبوزومی (S 28/26) استفاده گردید. توالی این پرایمرها از شرکت سیناژن گرفته شد.

 

یافته‏ها

30 نمونه از پساب مواد غذایی از 6 کارخانه بنام شرکت قارچ دزفول، خمیر مایه دز، فرآورده‏های گوشتی تکین، مواد پروتئینی و کشتارگاه هدایت، رب گوجه دزفول،روغن ساعی جمع‏آوری شد. مشخصات نمونه‏ها شامل مکان نمونه برداری، اسیدیته و شماره نمونه‏ها در جدول 2 نشان داده شده است.

 

-       جداسازی مخمرها

شکل یک تصاویر مخمر‏های جداسازی شده با روش اسپرید پلیت بر روی محیط یست اکسترکت گلوکز کلرامفنیکل آگار و بررسی ماکروسکوپی و میکروسکوپی جدایه‌های مخمری و پس از72 ساعت گرمخانه‌گذاری ، تعیین ویژگی‌های کلنی که در دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد انجام شد ، ظاهر کلنی ازنظر برجستگی، قوام، رنگ و حاشیه با استریومیکروسکوپ بررسی شد و همچنی تعداد مخمرهاي جداسازي شده در اين کار تحقيقاتي حدود 25 سويه مخمري بود که در جدول شماره 3 آمده است.

 

 

جدول 1- مشخصات پرایمرهای مورد استفاده برای شناسایی ژنتیکی

Table 1- Specifications of primers used for genetic identification

Reference	Melting point (℃)	Nucleotide	sequence Primer	Primer name
	50-70	18	5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′	NL1
(Hesham et al.,2014)	50-70	22	5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′	NL4
	63	19	5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3′	ITS1
(Morshed et al., 2017)	1.54	20	5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′	ITS4

 

جدول 2- مشخصات نمونه‏های جمع آوری شده از پساب مواد غذایی

Table 2- Characteristics of samples collected from food waste 

pH	Sample number	Sampling location
7	5-1	Dezful Mushroom Company
8	10-6	Dez Yeast Paste
9	15-11	Takin Meat Products
6	20-16	Hedayat Protein Materials and Slaughterhouse
6	25-21	Dezful Tomato Paste
9	30-26	Saei Oil

 

Figure 1- Identified yeasts Identification by macroscopic and microscopic methods Isolated yeasts. A: Candida kefyr, B: Geotrichum candidum, C: Saccharomyces cerevisiae D Result of red ascospore test from food factory effluent

شکل1- مخمرهای شناسایی شده شناسایی با روش‏های ماکروسکوپی و میکروسکوپی

مخمرهای جداسازی شده. A: Candida kefyr، B: Geotrichum candidum، C: Saccharomyces cerevisiea D نتیجه تست آسکوسپوربه رنگ قرمز از پساب کارخانه مواد غذایی

 

جدول 3- خصوصیات مورفولوژی مخمر‏ها

Table 3- Morphological characteristics of yeasts

 

Identified isolates	Fermentative material	Microscopic shape	l Number of strains
001	Yeast/Yogurt	Round and sometimes with sprouts	8
002	Proteinaceous materials	Oval and filamentous	10
003	mushroom/yeast	Oval or cylindrical	7

 

 

-       شناسايي مخمرها

نتایج شناسایی سه جدایه از مخمرها به روش‌های میکروسکوپی و بیوشیمیایی انجام شد و نتایج بیوشیمیاییآن در جدول شماره 4 دیده می‌شود.

 

-       شناسايي خصوصيات ساختاری پلي ساکاریدی استخراج شده با روش تبديل فوريه مادون قرمز (FTIR)

روش تبدیل فوریه مادون قرمز معمولا در پلی‌ساکاریدها براي بررسی نوع پیوندهاي گلیکوزیدي، نوع مونوساکاریدها و گروه هاي عاملی مورد استفاده قرار می‏گیرد( Curk et al., 1998). نتایج باندهاي مشاهده شده در 1023، 1080 و cm-11152 مرتبط با پیوندهاي C-C و C-O می‏باشند. باند مشاهده شده در cm-1 2923 مربوط به پیوند C-H بوده که این باند به عنوان باند شاخص را نشان می‌دهد. وجود باندهای 1372 ،1241 و cm-11419 مربوط به پیوندهای C-H، COH و C-O-C می‏باشد. وجود باند در ناحیه 857 و cm-1 926 مبین وجود پیوندهای آلفا و بتا در فرم پیرانوزی نشان دهنده قندهاست. باند مشاهده شده در ناحیه cm-1 763 مربوط به حضور دی زایلور است. مشاهده باندهای شاخص در ناحیه 3387، 3391 و cm-1 3300 وجود پلی‌ساکارید به عنوان ترکیب اصلی و غالب به ترتیب در ساکارومایسس سرویزیه، ژئوتریکوم کاندیدوم و کاندیدا کفیر استخراج شده است.که در شکل2 نشان داده شده است.

 

-       مقاومت به هضم اسيدی وآنزيمي پلي‏ساکاريد استخراج شده

شبیه‌سازي شیره‌هاى گوارشی در سه مرحله انجام گرفت. درصد هیدرولیز محاسبه شده براي پلی‌ساکارید استخراج شده از این سه سویه و اینولین به عنوان پریبیوتیک شاخص تجاري در سه مرحله هضم در شکل‌3 نشان داده شده است. درصد هیدرولیز پلی‌ساکارید استخراج شده از مخمرها در مرحله اول هضم یعنی در معده بسیار کمتر از اینولین بوده و در سطح 1% با هم اختلاف معنی‌دار دارند. (01/0P<) در مرحله دوم یعنی مخلوط معده و روده و در مرحله سوم یعنی روده و در حضور آنزیم آلفا آمیلاز درصد هیدرولیز هر دو نمونه (پلی‌ساکارید استخراج شده از مخمرهای شناسایی شده و اینولین) بسیار ناچیز بوده تقریباً مشابه همدیگر بوده‌اند. نتایج این بخش نشان می‌دهد پلی‌ساکارید جدا شده از مخمرها در مقایسه با اینولین بسیار مقاوم‌تر بوده به طوري که تقریبا بیش از 85 درصد آن هیدرولیز نشده باقی می‌ماند.

 

 

 

 

-       اثر پلي‏‎ساکاريد استخراج شده از مخمرها بر رشد باکتری پروبيوتيك

نتایج بدست آمده از شمارش مخمر پروبیوتیک نشان داد،

پلی‌ساکارید استخراج شده اثر تحریک کننده بر رشد باکتري داشته است به طوري که جمعیت آن پس از 24 ساعت افزایش قابل ملاحظه‌اي داشته است. از طرفی قابلیت زنده ماندن میکروب تا 72 ساعت مطالعه شده افزایش یافته است در حالی که جمعیت باکتری در محیط حاوي گلوکز پس از 24 ساعت کاهش شدیدي نشان داده است. علاوه بر این، رفتار باکتری در محیط حاوی پلی‌ساکاریدهای استخراج‌شده از سویه‌های مخمر ، بهبود بقا را در مقایسه با آنچه در محیط حاوی اینولین، (پری بیوتیک تجاری) مشاهده می‌شود، نشان داد.نتایج مقایسه شده در شکل 4 نشان داده است.

 

 

جدول 4- تست‏های بیوشیمیایی مخمرهای شناسایی شده

Table 4 - Biochemical tests of identified yeasts 

 

 

 

 

Figure 2- A Fourier transform infrared spectrum of polysaccharide extracted from Saccharomyces cerevisiae/B Fourier transform infrared spectrum of polysaccharide extracted from Geotrichum candidum/C Fourier transform infrared spectrum of polysaccharide extracted from Candida kefyr Results of investigation of resistance to acid and enzymatic digestion of extracted polysaccharide.

شکل 2- A طیف تبدیل فوریه مادون قرمز پلی‌ساکارید استخراج شده از Saccharomyces cerevisiae/ B طیف تبدیل فوریه مادون قرمز پلی‌ساکارید استخراج شده از / Geotrichum candidum Cطیف تبدیل فوریه مادون قرمز پلی‌ساکارید استخراج شده از Candida kefyr.

 

 

Figure 3-A. Investigation of the resistance to digestion of polysaccharides extracted from Saccharomyces cerevisiae B / Investigation of the resistance to digestion of polysaccharides extracted from Candida kefyr / C. Investigation of the resistance to digestion of polysaccharides extracted from Geotrichum candidum.

شکل 3-A. بررسی مقاومت به هضم پلی‌ساکارید استخراج شده از Saccharomyces cerevisiae B / .بررسی مقاومت به هضم پلی‌ساکارید استخراج شده از Candida kefyr / C .بررسی مقاومت به هضم پلی‌ساکارید استخراج شده از Geotrichum candidum.

 

 

 

Figure 4 - Growth curve of Lactobacillus casei in the presence of identified yeast polysaccharides compared to inulin and glucose (study medium: yeast extract agar without sugar and 2% inulin, without sugar and 2% polysaccharides isolated from yeasts, yeast extract agar without sugar and 2% glucose.

شکل 4 – منحنی رشد لاکتو باسیلوس کازئی در مجاورت پلی‌ساکارید مخمرهای شناسایی شده در مقایسه با اینولین و گلوکز (محیط مورد مطالعه yeast extract agar بدون قند و 2٪ اینولین، بدون قند و 2٪ پلی‌ساکاریدهاي جدا شده از مخمرها yeast extract agar بدون قند و 2٪گلوکز).

 

-       اسیدیته

نتایج مربوط به کاهش اسیدیته محیط‏های مورد بررسی در شکل 5 نشان می‏دهد،که اسیدیته هر سه محیط با هم اختلاف معنی داري دارند که با توجه به کاهش بسیار شدید اسیدیته در محیط حاوي گلوکز و جمعیت بالاي باکتری پروبیوتیک در محیط هاى حاوي اینولین و پلی ساکاریدهای مخمرها احتمالا حاکی از طی مسیرهاي متابولیکی متفاوت به وسیله میکروارگانیسم در سه محیط مورد بررسی می‏باشد. نتایج این بخش به همراه نتایج بخش مقاومت به هضم، قابلیت پری بیوتیکی پلی ساکاریدهاي مخمرها را اثبات می‏کنند.

 

-       خصوصیات زیست فناوری پلی‌ساکاریدها

براي بررسی قابلیت کاربرد زیست فناوری پلی‌ساکاریدهاي جدا شده از جدایه 1(Saccharomyces cerevisiae)، جدایه 2 (Candida kefyr)، جدایه 3 (Geotrichum candidum) در بافت هاي تغذیه ای و اثر آن بر پایداري خصوصیت توانایی نگهداري آب(WHC) و توانایی جذب روغن (LAC) در بافت اندازه گیري شد. نتایج مربوط به LAC و WHC پلی‌ساکاریدهاي جدا شده از این مخمرها بر اساس داده‏ها ی میانگین حاصل از سه تکرارمی باشد، که مقایسه آن با اینولین در جدول 5 نشان داده شده است. همان‏طور که دیده می‌شود، توانایی نگهداری آب در پلی‌ساکاریدهای مخمر به‌مراتب بیشتر از اینولین است و این تفاوت در سطح 1 درصد به‌طور معناداری قابل‌توجه است. ویژگی بافتی توانایی نگهداری آب (WHC) به قابلیت شبکه پلی‌ساکاریدی برای جذب و حفظ آب اشاره دارد. این خصوصیت از جنبه‏های زیست‏فناوری و فیزیولوژی اهمیت بسزایی دارد.

 

 

 

Figure 5- Results related to the reduction of acidity of the studied media. A: Yeast extract agar medium without sugar and 2% inulin, B: Yeast extract agar medium without sugar and 2% glucose, C: Yeast extract agar medium without sugar and 2% polysaccharide isolated from Candida, D: Yeast extract agar medium without sugar and 2% polysaccharide isolated from Saccharomyces, E: Yeast extract agar medium without sugar and 2% polysaccharide isolated from Geotrichum. (Data are the average of three replicates).

شکل5- اسیدیته محیط‏های مورد بررسی.A: محیط yeast extract agar بدون قند و 2% اینولین، B: محیط yeast extract agar بدون قند و 2% گلوکز، C: محیط yeast extract agar بدون قند و 2% پلی‌ساکارید جدا شده از کاندیدا، D: محیط yeast extract agar بدون قند2% پلی‌ساکارید جدا شده از ساکارومایسس، E: محیط yeast extract agar بدون قند و 2% پلی‌ساکارید جدا شده از ژئوتریکوم. (داده‏ها حاصل از میانیگن سه تکرار می‏باشد).

 

جدول5- اندازه گیري خصوصیات تکنولوژیکی و فیزیولوژیکی پلی‌ساکاریدهاي جدا شده از مخمرها

Table 5-Measurement of technological and physiological properties of polysaccharides isolated from yeasts

 

Oil absorption ability	Water retention ability	Polysaccharide
1.83 ± 0.03	0.68 ± 0.03	Inulin
4.64 ± 0.03	1.81 ± 0.03	Candida Extracted Polysaccharide
4.58 ± 0.03	1.87 ± 0.03	Saccharomyces Extracted Polysaccharide
4.52 ± 0.03	1.92 ± 0.03	Geotrichum Extracted Polysaccharide

 

 

-       خصوصیت آنتی‌اکسیدانی پلی‌ساکاریدهاي استخراج شده از مخمرهای شناسایی شده

در مطالعات انجام شده فعالیت آنتی‌اکسیدانی پلی‌ساکاریدها را مرتبط با خصوصیات ساختاري آن‏ها از جمله نوع مونوساکاریدهاي تشکیل دهنده، نوع پیوندهاي گلیکوزیدي، وزن مولکولی، وجود برخی گروه‏ها مانند کربونیل، سولفونیل، آمینو، کربوکسیل دانسته اند.همان طور که در شکل۶ مشاهده می‌شود اثر غلظت بر فعالیت آنتی‌اکسیدانی پلی‌ساکاریدهاي جدا شده از مخمرها با افزایش غلظت فعالیت آنتی‌اکسیدانی افزایش یافته است. فعالیت آنتی‌اکسیدانی مطلوب پلی‌ساکاریدهاي جداشده از مخمرها می‏تواند یکی از دلایل افزایش زنده ماندن در میکروب‏های پروبیوتیک در محیط کشت حاوي پلی‌ساکاریدهاي جدا شده از مخمرها باشد.

 

-       شناسايي مولكولي سویه‏ها

برای شناسایی از جفت پرایمرهای NL1 و NL4 به منظور تکثیر ناحیه D1/D2 و از جفت پرایمرهای ITS1 و ITS4 برای تکثیر قسمت انتهای ژن زیرواحد کوچک ریبوزومی S18، ناحیه فاصله انداز رونویسی شونده درونی (1ITS1)، ژن ریبوزومی S 8/5، ناحیه فاصله انداز رونویسی شونده درونی4 (ITS4) و قسمت ابتدایی ژن زیرواحد بزرگ ریبوزومی (S 28/26) استفاده گردید. توالی این پرایمرها از شرکت سیناژن گرفته شد.نتایج حاصل برای تصویر ژل الکتروفورز قطعات حاصل PCR اینگونه بود که در ردیف A که مربوط به نمونه ساکارومایسس سرویزیه بود باند در ناحیه bp500 و برای ژئوتریکوم کاندیدومدر ردیف B ناحیه bp 860 و در نهایت در ردیف C برای کاندیدا کفیر در ناحیه bp 700 مشاهده شد. جهت شناسایی سویه مخمر منتخب قطعه S18ریبوزمی آن توالی یابی گردید. سپس توالی بدست آمده در بانک اطلاعات بیوانفورماتیک NCBI مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. با استفاده از قسمت بلاست در پایگاه مذکور مشخص شد که توالی قطعه S18سویه هدف با سویه ساکارومایسس سرویزیه بیشترین شباهت را داشت بنابراین نتایج تعیین توالی مشخص نمود که سویه‏ی مخمرمنتخب ساکارومایسز سرویزیه است که این مخمر Saccharomyces cerevisiae گل 235 نامیده شد. 

شکل 8 نشان دهنده درخت فیلوژنی بر اساس داده‏های مولکولی و توالی به دست آمده می‏باشد.

 

 

 

Figure 6- Effect of concentration on the antioxidant activity (nm) of identified polysaccharides

شکل 6- اثر غلظت بر ميزان فعاليت آنتي اكسيدانی (جذب نوری) پلی‌ساکاریدهاي شناسایی شده

 

 

Figure 7- Electrophoresis results from PCR. A: Saccharomyces sample, B: Candida sample, C: Geotrichum sample. DNA Ladder. On the left: Band related to the amplification of the S gene of 18 yeast strains.

شکل 7- نتايج الکتروفورز حاصل از PCR ا A: نمونه ساکارومایسس، B: نمونه کاندیدا، C: نمونه ژئوتریکوم DNA Ladder در سمت چپ: باند مربوط به تکثیر ژن S 18 سویه مخمر.

 

 

Figure 8 - Phylogeny tree of the three identified strains

شکل 8 - درخت فیلوژنی سه سویه شناسایی شده

 

 

بحث

پلی‌ساکاریدهای پری‏بیوتیک، به عنوان ترکیبات غیرقابل هضمی، نقش مهمی در بهبود سلامت میزبان ایفا می‏کنند (Matteuzzi et al,.2004). آن‌ها با تحریک انتخابی رشد یا تغییر فعالیت میکروب‌های موجود در روده بزرگ، اثرات مثبتی بر سلامتی دارند. این پلی‌ساکاریدها به دلیل ساختار متخلخل خود، قابلیت جذب آب و چربی را دارند که می‌تواند بر پایداری و اصلاح بافت‌های غذایی و دارویی تأثیرگذار باشد (Figuerola et al.,2005). ویژگی‌های این چنینی به لحاظ فیزیولوژی بسیار حائز اهمیت هستند، زیرا می‌توانند در بهبود وضعیت چربی خون و کنترل چاقی مؤثر باشند (Carvalho et al ., 2009; Elleuch et al .,2011). هدف از بکارگیری پری‌بیوتیک‌ها تحریک فعالیت کشت‌های پروبیوتیکی و افزایش اثرات مفید آن‏ها می‌باشد. برای دستیابی به تحریک مطلوب و تکثیر میکروارگانیسم‏های پروبیوتیک، پری بیوتیک‌ها بایستی مورد استفاده (برای مثال تخمیر) آن‏ها قرار گیرند، اما خود را از هضم آنزیمی توسط دستگاه گوارش میزبان رها سازند و سرانجام شرایط مطلوب را در انتهای دستگاه گوارش میزبان برای میکروارگانیسم‏های پروبیوتیک فراهم آورند (Obayomi et al.,2024). پلی‌ساکاریدهای زیست فعال از منابع جدید یکی از موضوعات روز دانشمندان در حال افزایش است بر اساس آمارهای سازمان بهداشت جهانی شیوع بیماری‌های نظیر پوکی استخوان بیماری‌های قلبی و عروقی سرطان‌ها و بیماری‌های دهان و دندان به دلیل تغییرات سبک زندگی و الگوهای تغذیه‌ای در حال افزایش می‌باشد بسیاری از ترکیبات زیست فعال موثر بر سلامتی معمولا در برخی مواد غذایی و منابع گیاهی وجود دارد با این حال مشکلاتی مانند عدم سهولت مصرف مناسب بودن طعم غذا و شرایط محدود و ذائقه و منطقه و فصل مصرف عمومی منابع را محدود می‌کند بنابراین جداسازی ترکیبات زیست فعال از منابع جدید و شناسایی و ارزیابی خصوصیات آنها می‌تواند به افزایش استفاده از اثرات سلامتی آنها کمک کند یک پری بیوتیک باید مقدار جزئی در جیره غذایی قرار بگیرد تا فضای زیادی را اشغال نکند و مقادیر انرژی و پروتئین جیره را تحت تاثیر قرار ندهد اگر پروبیوتیک‌ها به صورت آشامیدنی ارائه شوند باید به قدری محلول باشد که از ایجاد در مسیر عبور آب جلوگیری نکند(Álvarez-Mercado et al.,2022).

یافته‌های این پژوهش نشان می‌دهند که پلی‌ساکاریدهای استخراج‌شده از سه گونه مخمر Saccharomyces cerevisiae،Geotrichum candidum و Candida kefyr که از پساب صنایع غذایی جداسازی شده‌اند، پتانسیل بالایی برای استفاده به‌عنوان ترکیبات پری‌بیوتیکی دارند. زیرا این پلی‌ساکاریدها نه‌تنها در برابر هیدرولیز آنزیمی مقاومت بالایی از خود نشان داده بلکه ویژگی‌هایی که برای عبور مؤثر از مجاری فوقانی دستگاه گوارش ضروری است نیز در مقایسه با پری‌بیوتیک‌های گیاهی رایج نظیر اینولین، عملکردی مناسب و حتی برتر را نشان داد.

تکنیک طیف‏سنجی مادون قرمز روشی سریع، کارآمد و بدون نیاز به مواد واکنش‏گر است که برای شناسایی انواع میکروارگانیسم‏ها قابل استفاده بوده و تنها به مقدار ناچیزی از توده سلولی نیاز دارد. با این حال، شناسایی مخمرها با استفاده از روش‏های رایج فنوتیپی )ریخت‌شناسی( دشوار است و در برخی موارد امکان‌پذیر نیستHaag et al., ) (1996; Timmins et al., 1998. عملکرد تکنیک طیف‏سنجی مادون قرمز (FT-IR) ممکن است تحت تأثیر عواملی نظیر دمای رشد، روش کشت و حتی شیوه خشک کردن نمونه‌های میکروارگانیسمی قرار گیرد. به همین دلیل، آماده‏سازی مناسب نمونه‏ها اهمیت بالایی پیدا می‏کند (Erukhimovitch et al., 2005). علاوه بر این، استفاده از این تکنیک به وجود یک کتابخانه جامع از طیف‏های مرجع وابسته است که می‌تواند محدودیتی برای آن محسوب شود (Toubas et al., 2007). نتایج آزمون‌های FTIR در تحقیق حاظر این ادعا را تأیید می‌کنند؛ به‌طوری‌که بیش از ۸۵٪ از ساختار پلی‌ساکاریدها در برابر تخریب آنزیمی پایدار باقی ماندند. چنین پایداری در ساختار، پیش‌نیاز تغذیه مؤثر میکروارگانیسم‌های مفید روده‌ی بزرگ است. این نتایج تایید کننده نتایج بررسی یافته‌های Wang و همکاران (2024) می‏باشد، که در پژوهش خود به افزایش رشد سویه‌های پروبیوتیکی همچونLactobacillus plantarum و Bifidobacterium longum در حضور پلی‌ساکاریدهای مخمری اشاره کرده‌اندWang et al.,) (2024.

در محصولات غذایی حاوی پروبیوتیک، ترکیبات پری‌بیوتیکی موجب افزایش رشد و بقای میکروارگانیسم‏های مفید می‏شوند و نقش حمایتی ایفا می‌کنند .(Martínez-Villaluenga., 2007) در محیط‏های حاوی قند ساده رشد میکروب‏ها ممکن است به دلیل ایجاد پدیده مهار فعالیت‏های کاتابولیکی محدود شود. ضمن آن که با توجه کاهش بسیار شدید اسیدیته در محیط حاوي گلوکز وجمعیت بالای میکروب‌های پروبیوتیک در محیط‏های حاوی اینولین و پلی‌ساکاریدهای مخمر نشان‌دهنده احتمال وجود مسیرهای متابولیکی متفاوت توسط میکروارگانیسم‌ها در سه محیط مورد بررسی است. قابلیت پری‌بیوتیکی پلی‌ساکاریدهای استخراج‏شده از مخمرهادر تحقیق حاظرنیز نشان‌دهنده توانایی آن‌ها در تحمل شرایط اسیدی است. این موضوع به‌ویژه از آن جهت اهمیت دارد که در تعریف‏های اخیر پری‏بیوتیک‏ها، تأکید بیشتری بر تفاوت در فعالیت میکروبی یا نوع متابولیت‏های تولیدشده توسط پروبیوتیک‌ها در حضور پری‌بیوتیک‌ها شده است (Azmi et al., 2012; Norajit et al., 2010). 

در مورد خواص عملکردی در تحقيق حاضر بايد متذكر شد كهنمونه‌های مورد بررسی ظرفیت بالایی در نگهداری آب و جذب چربی داشتند که آن‌ها را به گزینه‌ای جذاب برای کاربرد در صنایع غذایی و دارویی تبدیل می‌کند. مطالعه Dong همکاران (2024) نیز به ساختار متخلخل‌تر پلی‌ساکاریدهای مخمری نسبت به اینولین اشاره کرده که این ویژگی مستقیماً بر توانایی جذب آب و چربی تأثیرگذار است و می‌تواند در بهبود بافت محصولات عملکردی نقش داشته باشد (Dong et al., 2024).

فعالیت آنتی‌اکسیدانی این ترکیبات نیز در تحقيق حاضرقابل‌توجه بود و در برخی موارد عملکرد بهتری نسبت به اینولین نشان دادند. داده‌های Wu و همکاران (2020) در این زمینه مؤید آن است که پلی‌ساکاریدهای مخمری قادر به کاهش مؤثر در زمینه رادیکال‌های آزاد هستند و از اکسیداسیون در شرایط بیولوژیکی جلوگیری می‌کنند.عاملی که به افزایش پایداری و زنده‌مانی باکتری‌های پروبیوتیک در شرایط سخت دستگاه گوارش کمک می‌کند. (Wichienchot et al., 2010).

مقایسه با دیگر منابع پلی‌ساکاریدی نظیر جلبک‌ها یا گیاه بامبو نیز نکات قابل‌توجهی را نشان می‌دهد. پژوهش‌هایی مانند مطالعه Ramnani و همکاران (2014) و Firdous و همکاران (2012) بیان می‌کنند که منشأ استخراج پلی‌ساکارید دارای تأثیر قابل‌توجهی بر پایداری عملکرد پری‌بیوتیکی آن دارد. پلی‌ساکاریدهای استخراج‌شده از بامبو، در مقایسه با نمونه‌های جلبکی، دوام عملکردی بیشتری داشته‌اند موضوعی که در این تحقیق نیز در بررسی حاظردر مورد پلی‌ساکاریدهای مخمری تأیید شد (Griffiths et al.,1998; Ramnani et al., 2014).

در تحقيق حاضراز نظر تحمل محیط و شرایط اسیدی، پلی‌ساکاریدهای مخمری عملکرد بهتری نسبت به منابع گیاهی مانند اینولین از خود نشان دادند. نتایج پژوهش Azmi و همکاران (2012) نیز گویای این نکته است که ساختار مقاوم‌تر پلی‌ساکاریدهای غیرگیاهی، درعبور از محیط اسیدی معده را به خوبی عمل کرده و موجب افزایش زنده‌مانی باکتری‌های مفید در بخش‌های انتهایی دستگاه گوارش می‌شود (Azmi et al., 2012) با در نظر گرفتن چالش‌هایی مانند طعم خاص، محدودیت‏ها در تولید فصلی و هزینه‌های بالای استخراج پری‌بیوتیک‌های گیاهی، و آسیب‏های محیط زیستی پلی‌ساکاریدهای مخمری به‌عنوان منابع زیستی نوظهور با قابلیت استخراج مقرون‌به‌صرفه تر و عملکرد فیزیولوژیکی قابل‌توجه، گزینه‌ای عملی برای استفاده در صنایع غذایی و دارویی به‌شمار می‌آیند. این پژوهش، همسو با مستندات علمی اخیر، نشان می‌دهد که پلی‌ساکاریدهای مخمری می‌توانند به‌عنوان جایگزین یا مکمل مؤثری برای پری‌بیوتیک‌های سنتی گیاهی، به‌ویژه اینولین، مطرح شوند و کاربردهای گسترده‌ تری در توسعه محصولات متنوع مورد نیاز داشته باشند.

 

نتیجه‏گیری

نتایج این پژوهش نشان داد که پلی‌ساکاریدهای استخراج شده از مخمر قابلیت پری‌بیوتیکی دارند که قابل مقایسه با اینولین بوده و حتی ممکن است از پلی‌ساکارید گیاهی اینولین (به‌عنوان یک پری‏بیوتیک تجاری) بهتر باشند. همچنین، ویژگی‌های عملکردی پلی‌ساکاریدهای استخراج ‌شده از سه نوع مخمر مورد بررسی نشان داد که ظرفیت نگهداری آب و جذب چربی این پلی‌ساکاریدها به‌طور قابل توجهی بالا بوده و حتی بسیار بیشتر از اینولین است، به‌گونه‏ای که می‌توان آن را با فیبرهای رژیمی مقایسه کرد. علاوه بر این، فعالیت آنتی‌اکسیدانی این پلی‌ساکاریدها نیز نسبتاً مطلوب و بیشتر از اینولین ارزیابی شد.

 

سپاسگزاری

از دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال و همچنین از همه اساتیدی که در غنای مطالب حاضر یاری رسان بودند، نهایت تشکر و قدردانی به عمل می‌آید. 

 

منابع

Adt, I., Toubas, D., Pinon, J. M., Manfait, M. & Sockalingum, G. D. (2006). FTIR spectroscopy as a potential tool to analyse structural modifications during morphogenesis of Candida albicans. Archives of Microbiology, 185(4), 277–285. https://doi.org/10.1007/s00203-006-0094-8

 

Álvarez-Mercado, A. I. & Plaza-Díaz, J. (2022). Dietary polysaccharides as modulators of the gut microbiota ecosystem: An update on their impact on health. Nutrients, 14(19), 4116. https://doi.org/10.3390/nu14194116

Azmi, A. F., Mustafa, S., Hashim, D. M. & Manap, Y. A. (2012). Prebiotic activity of polysaccharides extracted from Gigantochloa levis (Buluh beting) shoots. Molecules, 17(2), 1635–1651. https://doi.org/10.3390/molecules17021635

Baliyan, S., Mukherjee, R., Priyadarshini, A., Vibhuti, A., Gupta, A., Pandey, R. P. & Chang, C. M. (2022). Determination of antioxidants by DPPH radical scavenging activity and quantitative phytochemical analysis of Ficus religiosa. Molecules, 27(4), 1326. https://doi.org/10.3390/molecules27041326

Carvalho, A. F., Portela, M. C., Sousa, M. B., Martins, F. S., Rocha, F. C., Farias, D. F. & Feitosa, J. P. (2009). Physiological and physico-chemical characterization of dietary fibre from the green seaweed Ulva fasciata Delile. Brazilian Journal of Biology, 69, 969–977. https://doi.org/10.1590/s1519-69842009000400028

Curk, M. C., Peladan, F. & Hubert, J. C. (1994). Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy for identifying Lactobacillus species. FEMS Microbiology Letters, 123, 241–248. https://doi.org/10.1016/0378-1097(94)90204-6

Cutfield, S., Cutfield, J. & Mace, P. (2007). Bone Morphogenetic Protein Type II Receptor Structure in Two Crystal Forms. Acta Crystallographica Section A: Foundations and Advances, 63, S127–S127. https://doi.org/10.1107/s0108767307097218

De Vrese, M. & Schrezenmeir, J. (2008). Probiotics, prebiotics, and synbiotics. In Food Biotechnology (pp. 1–66). https://doi.org/10.1007/10_2008_097

Dong, W., Li, Y., Xue, S., Wen, F., Meng, D., Zhang, Y. & Yang, R. (2024). Yeast polysaccharides: The environmentally friendly polysaccharides with broad application potentials. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 23(5), e70003. https://doi.org/10.1111/1541-4337.70003

Elleuch, M., Bedigian, D., Roiseux, O., Besbes, S., Blecker, C. & Attia, H. (2011). Dietary fibre and fibre-rich by-products of food processing: Characterisation, technological functionality and commercial applications: A review. Food Chemistry, 124(2), 411–421. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2010.06.077

Erukhimovitch, V., Pavlov, V., Talyshinsky, M., Souprun, Y. & Huleihel, M. (2005). FTIR microscopy as a method for identification of bacterial and fungal infections. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 37, 1105–1108. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2004.08.035

Figuerola, F., Hurtado, M. L., Estévez, A. M., Chiffelle, I. & Asenjo, F. (2005). Fibre concentrates from apple pomace and citrus peel as potential fibre sources for food enrichment. Food Chemistry, 91(3), 395–401. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2004.04.036

Fuller, R. & Gibson, G. R. (1997). Modification of the intestinal microflora using probiotics and prebiotics. Scandinavian Journal of Gastroenterology, 32(Suppl 222), 28–31. https://doi.org/10.1080/00365521.1997.11720714

Griffiths, A.J.F., Miller, J.H., Suzuki, D.T., Lewontin, R. & Gelbart, W.M. (2002). An Introduction to Genetic Analysis. Biologia Plantarum. https://doi.org/10.1023/a:1015187026471

Haag, H., Gremlich, H. G., Bergmann, R. & Sanglier, J. J. (1996). Characterization and identification of actinomycetes by FT-IR spectroscopy. Journal of Microbiological Methods, 27, 157–163. https://doi.org/10.1016/S0167-7012(96)00943-8

Hesham, A. E.-L., Wambui, V., Ogola, J. O. H. & Maina, J. M. (2014). Phylogenetic analysis of isolated biofuel yeasts based on 5.8S-ITS rDNA and D1/D2 26S rDNA sequences. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology. https://doi.org/10.1016/j.jgeb.2014.01.001

Holzapfel, W. H., Haberer, P., Geisen, R., Björkroth, J. & Schillinger, U. (2001). Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition. The American Journal of Clinical Nutrition, 73(2), 365s–373s. https://doi.org/10.1093/ajcn/73.2.365s

Kurtzman, C. P. & Fell, J. W. (1998). The Yeasts: A Taxonomic Study (4th ed.). Elsevier Science B.V. https://doi.org/10.1016/b978-044481312-1/50000-9

Larypoor Mohaddeseh, K., Kargar Faragheh, A. & Mohadi, M. (2023). Isolation and screening of facultative halophilic fungi producing industrial enzymes from forest parks in Tehran. Knowledge of Microbiology, 2(1), 68. (In Persian). https://sanad.iau.ir/Journal/jknm/Article/783940/FullText

Liu, Y., Tran, D. Q. & Rhoads, J. M. (2018). Probiotics in disease prevention and treatment. The Journal of Clinical Pharmacology, 58(Suppl 10), S164–S179. https://doi.org/10.1002/jcph.1121

Lourens-Hattingh, A. & Viljoen, B. C. (2001). Yogurt as probiotic carrier food. International Dairy Journal, 11(1–2), 1–17. https://doi.org/10.1016/S0958-6946(01)00036-X

Markowiak, P. & Śliżewska, K. (2017). Effects of probiotics, prebiotics, and synbiotics on human health. Nutrients, 9(9), 1021. https://doi.org/10.3390/nu9091021

Martínez-Villaluenga, C. & Gómez, R. (2007). Characterization of bifidobacteria as starters in fermented milk containing raffinose family of oligosaccharides from lupin as prebiotic. International Dairy Journal, 17(2), 116–122. https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2006.01.006

Matteuzzi, D., Swennen, E., Rossi, M., Hartman, T. & Lebet, V. (2004). Prebiotic effects of a wheat germ preparation in human healthy subjects. Food Microbiology, 21(1), 119–124. https://doi.org/10.1016/S0740-0020(03)00063-2

Mohammadi Afshar, M., Larypoor, M. & Hosseini, F. (2024). Isolation, identification and microencapsulation of microbes isolated from the wastewater of dairy factories by alginate and polysaccharides of Lentinula edodes. Microbial Biology, 13(51), 97–128 [In Persian]. https://doi.org/10.22108/bjm.2024.141002.1590

Molan, A. L., Flanagan, J., Wei, W. & Moughan, P. J. (2009). Selenium-containing green tea has higher antioxidant and prebiotic activities than regular green tea. Food Chemistry, 114(3), 829–835. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2008.10.028

Morshed, M., Omrani, M. D., & Fazeli, S. (2017). Molecular identification of yeast isolates by ITS sequencing and phylogenetic analysis. Journal of Mycology Research, 11(3), 157–165. https://doi.org/10.1016/j.mycol.2017.01.005

Nasiri Poroj, S., Larypoor, M., Fazeli, M. R. & Shariatmadari, F. (2022). Study of probiotic potential of yeasts isolated from dairy products, sourdough, and fruit peel. Journal of Applied Microbiology in Food Industry, 7(4), 69–87. https://sid.ir/paper/984938/en

Naumann, A., Navarro-Gonzalez, M., Peddireddi, S., Kues, U. & Polle, A. (2005). Fourier transform infrared microscopy and imaging: detection of fungi in wood. Fungal Genetics and Biology, 42, 829–835. https://doi.org/10.1016/j.fgb.2005.06.002

Norajit, K., Kim, K. M. & Ryu, G. H. (2010). Comparative studies on the characterization and antioxidant properties of biodegradable alginate films containing ginseng extract. Journal of Food Engineering, 98(3), 377–384. https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2010.01.015

Obayomi, O. V., Olaniran, A. F. & Owa, S. O. (2024). Unveiling the role of functional foods with emphasis on prebiotics and probiotics in human health: A review. Journal of Functional Foods. https://doi.org/10.1016/j.jff.2024.106337

Partyka, A. (2012). Enzymes antioxidant and peroxidation lipid activity in avian semen. Animal Reproduction Science, 134(3–4), 184–190. https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2012.07.007

Ramnani, C. P., Martínez-Villaluenga, C., Chitarraria, R., Tuohya, K. & Grant, J. (2007). Characterization of bifidobacteria as starters in fermented milk containing raffinose family of oligosaccharides from lupin as prebiotic. International Dairy Journal, 17(2), 116–122. https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2006.02.003

Sohail, M., Barzkar, N., Michaud, P., Tamadoni Jahromi, S., Babich, O., Sukhikh, S., Das, R. & Nahavandi, R. (2022). Cellulolytic and xylanolytic enzymes from yeasts: Properties and industrial applications. Molecules, 27(12), 3783. https://doi.org/10.3390/molecules2712378

Timmins, E. M., Quain, D. E. & Goodacre, R. (1998). Differentiation of brewing yeast strains by pyrolysis mass spectrometry and Fourier transform infrared spectroscopy. Yeast, 14, 885–893. https://doi.org/10.1002/(SICI)1097-0061(199807)14:10<885::AID-YEA286>3.0.CO;2-G

Toubas, D., Essendoubi, M., Adt, I., Pinon, J. M., Manfait, M. & Sockalingum, G. D. (2007). FTIR spectroscopy in medical mycology: Applications to the differentiation and typing of Candida. Analytical Bioanalytical Chemistry, 387, 1729–1737. https://doi.org/10.1007/s00216-006-1005-1

Wang, X., Li, X., Zhang, L., An, L., Guo, L., Huang, L. & Gao, W. (2024). Recent progress in plant-derived polysaccharides with prebiotic potential for intestinal health by targeting gut microbiota: A review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 64(33), 12242–12271. https://doi.org/10.1080/10408398.2023.2248631

Wichienchot, S., Jatupornpipat, M. & Rastall, R. A. (2010). Oligosaccharides of pitaya (dragon fruit) flesh and their prebiotic properties. Food Chemistry, 120(3), 850–857. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2009.11.026

 

 

 

 

39