تشخیص و شناسایی گونه‌های کریپتوسپوریدیوم با استفاده از روش‌های Nested PCR (Nested polymerase chain reaction) و (RFLP) Restriction fragment length polymorphism در گوساله‌های شهرستان شاهرود

محورهای موضوعی : پاتوبیولوژی مقایسه ای

مصطفی مشکات ¹ , بهار شمشادی ² , کیومرث امینی ³

1 - گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات، تهران، ایران
2 - گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات، تهران، ایران
3 - گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی ساوه، ساوه، ایران

تاریخ دریافت : 1400/08/12 تاریخ پذیرش : 1400/08/12 تاریخ انتشار : 1400/03/01

کلید واژه: کریپتوسپوریدیوز, گوساله‌ها, RFLP, شاهرود,

چکیده مقاله :

گونه های کریپتوسپوریدیوم به شاخه اپی کمپلکس ها تعلق دارد و پروتوزواهای فرصت طلبی هستند که سیستم های تنفسی و گوارشی در انسان و حیوان ها را آلوده می کند. این مطالعه به منظور بررسی شیوع، تشخیص و شناسایی گونه های کریپتوسپوریدیوم با استفاده از روش های Nested PCR و (RFLP) Restriction Fragment Length Polymorphism در گوساله های شهرستان شاهرود انجام شد. 256 نمونه ی مدفوع از گوساله های زیر 2 ماه جمع آوری شد و نمونه های مثبت با استفاده از روش زیل-نلسون رنگ آمیزی شدند. پرایمرهای اختصاصی برای بررسی Nested PCR استفاده شد و زیرگونه ها توسط روش RFLP بررسی شدند. نتایج مطالعه میکروسکوپی نشان داد که 27 نمونه (54/10 %) از نمونه های مورد بررسی مثبت بودند. نتایج برای روش Nested PCR نشان داد که از مجموع نمونه های مورد بررسی، به ترتیب 59/92 % و 41/7 % به ترتیب برای کریپتوسپوریدیوم پارووم و کریپتوسپوریدیوم اندرسونی مثبت بودند. نتایج نشان داد که 25 نمونه تحت تأثیر آنزیم VSP در نواحی 104 و 628 جفت باز قرار گرفتند، که نشان دهنده ی که تأیید کننده ی زیرگونه های کریپتوسپوریدیوم پارووم گاوی و زیرگونه ی ژن A بودند. نمونه های تحت تأثیر آنزیم Ssp I قرار گرفتند و نتایج باندهایی را در 385 و 448 جفت باز نشان داد که نشان دهنده ی زیر گونه های C. muris/C. andersoni بودند. نتایج توسط آنزیم dde، باندهایی را در 156، 186 و 224 جفت باز نشان داد که نشان دهنده ی زیر گونه ی C. muris بود. گونه ها و زیرگونه های مختلف با استفاده از روش های مختلف شناسایی شدند که می تواند به کنترل کریپتوسپوریدیوز کمک کند.

چکیده انگلیسی:

Cryptosporidium species belong to Apicomplexa phylum and are opportunistic protozoans that infect the gastrointestinal and respiratory systems of some animals and humans. This study was conducted to investigate the prevalence, detection, and identification of Cryptosporidium species by nested PCR and restriction fragment length polymorphism (RFLP) in calves in Shahroud town.  A total number of 256 calves was collected from fecal samples of pre-weaned calves (≤2 months) in Shahroud town, and positive samples were stained by Ziehl-Neelsen (ZN) staining method. Specific primers were used to investigate the Nested-PCR and sub-species were investigated by RFLP method. The microscopic results showed that 27 samples (10.54 %) of the samples were positive. The results for nested-PCR showed that out of samples, 92.59 % and 7.41 % of samples were positive for C. parvum and C. Andersoi, respectively. The results showed that 25 samples were affected by VSP enzyme in regions of 104 and 628 bp that belong C. parvum bovine, and genotype A gene sub-species. The samples were affected by Ssp I enzyme and the results showed bands in regions of 385 and 448 bp that show C. muris/C. andersoni sub-species. The results for dde enzyme showed bands in regions of 156, 186, and 224 bp that confirm C. muris sub-specie. The different species and sub-species were identified by different methods and can help to control of the cryptosporidiosis.

منابع و مأخذ:

1. Cho Y-i, Yoon K-J. An overview of calf diarrhea-infectious etiology, diagnosis, and intervention. J Vet Sci. 2014;15(1):1-17.

2. Tyzzer E. Cryptosporidium parvum (sp. nov.), a coccidium found in the small intestine of the common mouse. Arch Protistenkd. 1912;26:394-412.

3. Lindsay DS, Upton SJ, Owens DS, Morgan UM, Mead JR, Blagburn BL. Cryptosporidium andersoni n. sp.(Apicomplexa: Cryptosporiidae) from cattle, Bos taurus. J Eukaryot Microbiol. 2000;47(1):91-5.

4. Ralston B, Thompson R, Pethick D, McAllister T, Olson M. Cryptosporidium andersoni in Western Australian feedlot cattle. Aust Vet J. 2010;88(11):458-60.

5. Zambriski JA, Nydam DV, Bowman DD, Bellosa ML, Burton AJ, Linden TC, et al. Description of fecal shedding of Cryptosporidium parvum oocysts in experimentally challenged dairy calves. Parasitol Res. 2013;112(3):1247-54.

6. Chalmers RM, Davies AP. Minireview: clinical cryptosporidiosis. Exp Parasitol. 2010;124(1):138-46.

7. Chalmers R, Giles M. Zoonotic cryptosporidiosis in the UK–challenges for control. J Appl Microbiol. 2010;109(5):1487-97.

8. Wells B, Shaw H, Hotchkiss E, Gilray J, Ayton R, Green J, et al. Prevalence, species identification and genotyping Cryptosporidium from livestock and deer in a catchment in the Cairngorms with a history of a contaminated public water supply. Parasites & vectors. 2015;8(1):66.

9. Chalmers RM, Katzer F. Looking for Cryptosporidium: the application of advances in detection and diagnosis. Trends in parasitology. 2013;29(5):237-51.

10. Thomson S, Innes EA, Jonsson NN, Katzer F. A multiplex PCR test to identify four common cattle-adapted Cryptosporidium species. Parasitology Open. 2016;2.

11. Smith R, Clifton-Hadley F, Cheney T, Giles M. Prevalence and molecular typing of Cryptosporidium in dairy cattle in England and Wales and examination of potential on-farm transmission routes. Vet Parasitol. 2014;204(3-4):111-9.

12. Rekha K, Puttalakshmamma G, D’Souza PE. Comparison of different diagnostic techniques for the detection of cryptosporidiosis in bovines. Veterinary world. 2016;9(2):211.

13. Xiao L, Fayer R, Ryan U, Upton SJ. Cryptosporidium taxonomy: recent advances and implications for public health. Clin Microbiol Rev. 2004;17(1):72-97.

14. Xiao L, Lal AA, Jiang J. Detection and differentiation of Cryptosporidium oocysts in water by PCR-RFLP. Public Health Microbiology: Springer; 2004. p. 163-76.

15. Ranjbar-Bahadon S, Toni S. Infection to Cryptosporidium in diarrheic calves: a provincial study in southern Khorasan. Journal of Veterinary Research. 2013;68(1):13-9.

16. Changizi E, Salimi-Bejestani M, Vayeghan A. The Cryptosporidium ryanae infection commence in Iranian cattle. Journal of Veterinary Research. 2012;67(2):127-33.

17. Utaaker KS, Chaudhary S, Bajwa RS, Robertson LJ. Prevalence and zoonotic potential of intestinal protozoans in bovines in Northern India. Veterinary Parasitology: Regional Studies and Reports. 2018;13:92-7.

18. Tahvildar Bidrooni F, Dalimi Asl A, Kazemi D B. Using a 1055 bp fragment of 18s rRNA for differentiation of human and cattle Cryptosporidiosis. Research in Medicine. 2008;32(1):5-10.

19. Mohammadi Ghaleh Bin B, Fallah E, Asgharzadeh M, Kazemi A. Detection of Cryptosporidium species in water resources of Ardabil Province by PCR, RFLP. Journal of Ardabil University of Medical Sciences. 2007;7(2):177-83.