غربالگری پلی مورفیسم جایگاه Phe80Val ژن MLH1 در زنان مبتلا به سرطان تخمدان با تکنیک Tetra ARMS-PCR
محورهای موضوعی : نشانگر های زیستی پلاسما
1 - گروه ژنتیک، واحد تنکابن، دانشگاه آزاد اسلامی، تنکابن، ایران
کلید واژه: سرطان تخمدان, پروموتر, بیان ژن MLH1,
چکیده مقاله :
زمینه و هدف: ﺳﺮﻃﺎن اﭘﯽﺗﻠﯿﺎل ﺗﺨﻤﺪان 90% ﺑﺪﺧﯿﻤﯽ ﻫﺎي ﺗﺨﻤﺪان و 25% ﺑﺪﺧﯿﻤﯽﻫﺎي ﺗﻨﺎﺳـﻠﯽ زﻧﺎن را ﺗﺸﮑﯿﻞ ﻣﯽدﻫﺪ و از آﻧﺠﺎ ﮐﻪ دﯾـرتشخیص داده می شود،ﺑﻪ ﻫﻤﯿﻦ دﻟﯿﻞ در ﺑﯿﻦ همه ی ﺑﺪﺧﯿﻤﯽ ﻫﺎي دﺳﺘﮕﺎه ﺗﻨﺎﺳﻠﯽ زﻧـﺎن از ﺑـﺎﻻﺗﺮﯾﻦ ﻣﻮارد ﻣﺮگ وﻣﯿﺮ ﺑﺮﺧﻮردار اﺳت. ﺗﻐﯿﯿﺮات ریزRNA که بیان ژن را کنترل میکند در این سرطان به چشم می خورد. تغییر در الگوی متیله شدن در ناحیه پروموتر ژن ها نیز از دیگر پیشامد های سرطان تخمدان است.
مواد و روش ها: در مطالعه حاضر نمونه های مورد آزمايش افراد بيمار و افراد سالم از آزمایشگاه جمع آوري گردید.جمعيت مورد مطالعه شامل 25فرد مبتلا به سرطان تخمدان و 25فرد سالم در سنین مختلف بوده است. از روش کیت، برای استخراج DNA ژنومی از خون، استفاده شد. سپس از جایگاه Phe80Val ژن MLH1 جهت بررسی پلی مورفیسم آن با روش ARMS-PCR Tetraاستفاده و همچنین یک جفت پرایمر جهت تایید نهایی تکنیک ARMS-PCR Tetra طراحی گردید.
نتایج: از بین نمونه های مورد بررسی هیچکدام موتاسیونی مشاهده نشد و دو عدد از نمونه ها جهت تعیین توالی به خارج از کشور فرستاده شدند و جایگاه نوکلئوتید بدون هیچ تغییری مشاهده شد.
نتیجه گیری: بطور کلی نتایج تحقیق حاضر نشان داد که هیچگونه ارتباطی بین پلی مورفیسم Phe80Val ژن MLH1 و سرطان تخمدان در نمونه های حاضر وجود نداشت. هرچند نیاز به بررسی روی نمونه های بیشتراز سایر مناطق ایران می باشد.
Background & Aim: Epithelial ovarian cancer accounts for 90% of ovarian malignancies and 25% of gynecologic cancers. Since it is diagnosed late, it has the highest mortality rate among all malignancies of the female reproductive system. Moreover microRNA genes, which regulate gene expression, are observed in ovarian cancer. So, changes in methylation patterns in gene promoter regions are also among the events associated with ovarian cancer.
Materials & Methods: In the present study, samples including normal and cases were collected from hospitals of north of Iran . The samples including twenty five individuals women with ovarian cancer and twenty five individuals women with normal situation in different ages. A commercial kit was used to extract genomic DNA from human blood. The Val80Phe locus of the MLH1 gene was then examined for polymorphism using the Tetra ARMS PCR technique, then for final confirmation of the Tetra ARMS PCR technique, were designed a pair of primers and done PCR sequencing technique.
Results:No mutations were observed between normal and cases. Then two samples were sequenced and no observed single nucleotide polymorphism between them.
Conclusion: Overall, the findings of the present study indicated that there was no association between the MLH1 Val80Phe polymorphism and ovarian cancer in the examined samples. However, further studies on larger sample sizes from other regions of Iran are needed.
1. Flam, F., Einhorn, N., Sjovall Km, (1988), Symptomatology of ovarian cancer. Eur J Gynecol Obstet Reprod Bio. 27:53-7.
2. Stratton, J.F., Thompson, D., Bobrow L., et al. (1999), The genetic epidemiology of early- onset epithelial ovarian cancer: A population- based study Am. J. Hum. Genet. 65: 1725-1732.
3. Goodman, M.T., Howe, H.L., Tung, K.H. et al, (2003), incidence of ovarian cancer by race and ethnicity in the united states, 1992- 1997. Cancer. 97: 26-76.
4. Oscoe Klinck A.B. Lyna Inkel. Genevie`veDufresne-Martin, Julien Gervais-Bird, et al. (2008), Multiple Alternative Splicing Markers for Ovarian Cancer. 68(3): 7-11.
5. Pal, T., Permuth- wey, J., Betts, J.A., et al. (2005), BRCAI and BRCA2 mutations account for a large proportion of ovarian carcinoma cases. Cancer, 15(104), 12. 2807- 2816.
6. de Almeida Paiva, V., de Souza Gomes, I., Monteiro, C. R., Mendonça, M. V., Martins, P. M., Santana, C. A., ... & de Azevedo Silveira, S. (2022). Protein structural bioinformatics: An overview. Computers in Biology and Medicine, 147, 105695.
7.Santos, C., Azuara, D., Rodríguez-Moranta, F., & Moreno, V. (2018). MLH1 mutations and chemotherapy resistance in colorectal cancer. Oncotarget, 9(15), 12179–12191.
8. Hamna, L., Adams, M, (2006), Prevention of ovarian cancer best practice and research clinical obstetrics and gynecology. 2: 339-362.
9. Dowty, J.G., Win, A.K., Buchanan, D.D., et al, (2013), Cancer risks for MLH1 and MSH2 mutation carriers. Hum Mutat. 34(3):490-7.
10. Holschneider, C.H., Berek, J.S, (2000), Ovarian cancer: epidemiology, biology, and prognostic factors. Semin Surg Oncol. 19(1): 3-10.
11. Chuchu, Zhao., Saisai, Li., Menghuang, Zhao., Haiyan Zhu and Xueqiong Zhu, (2018), Prognostic values of DNA mismatch repair genes in ovarian cancer patients treated with platinum-based chemotherapy. Arch Gynecol Obstet. 297(1): 153–159.
12. Lin, KM., et al, (1998), Colorectal and extracolonic cancer variations in MLH1/MSH2 hereditary nonpolyposis colorectal cancer kindreds and the general population. Dis Colon Rectum. 41:428-33.
13. Wagner A, Tops C, Wijnen JT, Zwinderman K, van der Meer C, Kets M, et al.(2002). Genetic testing in hereditary nonpolyposis colorectal cancer families with a MSH2, MLH1, or MSH6 mutation. J Med Genet . 39:833-37.
14.Valérie Bonadona, Bernard Bonaïti, Sylviane Olschwang, et al, (2011), Cancer Risks Associated With Germline Mutations in MLH1, MSH2, and MSH6 Genes in Lynch Syndrome Article Information JAMA. 305(22):2304-2310.
15. Aquilina G, Ceccotti S, Martinelli S, Soddu S, Crescenzi M, Branch P, Karran P, Bignami M. (2000). Mismatch repair and p53 independently affect sensitivity to N-(2-chloroethyl)-N-cyclohexyl-N-nitrosourea. Clin Cancer Res. 6:671–680
16. Scartozzi M, De Nictolis M, Galizia E, Carassai P, Bianchi F, Berardi R, Gesuita R, Piga A, Cellerino R, Porfiri E. (2003). Loss of hMLH1 expression correlates with improved survival in stage III–IV ovarian cancer patients. Eur J Cancer. 39:1144–1149.
17. Hawn MT, Umar A, Carethers JM, Marra G, Kunkel TA, Boland CR, Koi M. (1995). Evidence for a connection between the mismatch repair system and the G2 cell cycle checkpoint. Cancer Res. 55:3721–3725.
18. Helleman J, van Staveren IL, Dinjens WN, van Kuijk PF, Ritstier K, Ewing PC, van der Burg ME, Stoter G, Berns EM. (2006). Mismatch repair and treatment resistance in ovarian cancer. BMC Cancer.6:201-208.
19. Ian H, Barry R, Harvey A. Risch, KS, Mario E. Beiner,JM, Ping S, Steven A. (2008). Narod Ovarian cancer risk is associated with a common variant in the promoter sequence of the mismatch repair gene MLH1. 109(3): 384–387.
20. Bandipalliam P. Syndrome of early onset colon cancers, hematologic malignancies & features ofneurofibromatosis in HNPCC families with homozygous mismatch repair gene mutations. FamCancer. 2005;4(4):323-33.
21. Scartozzi M, De Nictolis M, Galizia E, Carassai P, Bianchi F, Berardi R, Gesuita R, Piga A, Cellerino R, Porfiri E. (2003). Loss of hMLH1 expression correlates with improved survival in stage III–IV ovarian cancer patients. Eur J Cancer;39:1144–1149.
22. Wagner A, Tops C, Wijnen JT, Zwinderman K, Meer C, Kets M, et al. Genetic testing in hereditary non-polyposis colorectal cancer families with a MSH2, MLH1, or MSH5 mutation. J Med Genet 2002;39:833-37.
23. Stephenson BM, Finan PJ, Gascoyne J, Garbett F, Murday VA, Bishop DT, et al. (1995). Frequency of familial colorectal cancer. Br J Surg. 78:1162-66.
غربالگری پلی مورفیسم جایگاه Phe80Val ژن MLH1 در زنان مبتلا به سرطان تخمدان با تکنیک Tetra ARMS-PCR
فاطمه یوسف نژاد 1، ابوالحسن رضایی 2
1- دانش آموخته مقطع کارشناسی ارشد رشته ژنتیک، واحد تنکابن، دانشگاه آزاد اسلامی، تنکابن، ایران.
2- استادیارگروه ژنتیک، واحد تنکابن، دانشگاه آزاد اسلامی، تنکابن، ایران. نویسنده مسئول: ab.rezaei@tonekaboniau.ac.ir
تاریخ دریافت: 14/01/1404 تاریخ پذیرش: 15/04/1404
چکیده
زمینه و هدف: ﺳﺮﻃﺎن اﭘﯽﺗﻠﯿﺎل ﺗﺨﻤﺪان 90% ﺑﺪﺧﯿﻤﯽ ﻫﺎي ﺗﺨﻤﺪان و 25% ﺑﺪﺧﯿﻤﯽﻫﺎي ﺗﻨﺎﺳـﻠﯽ زﻧﺎن را ﺗﺸﮑﯿﻞ ﻣﯽدﻫﺪ و از آﻧﺠﺎ ﮐﻪ دﯾـرتشخیص داده می شود،ﺑﻪ ﻫﻤﯿﻦ دﻟﯿﻞ در ﺑﯿﻦ همه ی ﺑﺪﺧﯿﻤﯽ ﻫﺎي دﺳﺘﮕﺎه ﺗﻨﺎﺳﻠﯽ زﻧـﺎن از ﺑـﺎﻻﺗﺮﯾﻦ ﻣﻮارد ﻣﺮگ وﻣﯿﺮ ﺑﺮﺧﻮردار اﺳت. ﺗﻐﯿﯿﺮات ریزRNA که بیان ژن را کنترل میکند در این سرطان به چشم می خورد. تغییر در الگوی متیله شدن در ناحیه پروموتر ژن ها نیز از دیگر پیشامد های سرطان تخمدان است.
مواد و روش ها: در مطالعه حاضر نمونه های مورد آزمايش افراد بيمار و افراد سالم از آزمایشگاه جمع آوري گردید.جمعيت مورد مطالعه شامل 25فرد مبتلا به سرطان تخمدان و 25فرد سالم در سنین مختلف بوده است. از روش کیت، برای استخراج DNA ژنومی از خون، استفاده شد. سپس از جایگاه Phe80Val ژن MLH1 جهت بررسی پلی مورفیسم آن با روش ARMS-PCR Tetraاستفاده و همچنین یک جفت پرایمر جهت تایید نهایی تکنیک ARMS-PCR Tetra طراحی گردید.
نتایج: از بین نمونه های مورد بررسی هیچکدام موتاسیونی مشاهده نشد و دو عدد از نمونه ها جهت تعیین توالی به خارج از کشور فرستاده شدند و جایگاه نوکلئوتید بدون هیچ تغییری مشاهده شد.
نتیجه گیری: بطور کلی نتایج تحقیق حاضر نشان داد که هیچگونه ارتباطی بین پلی مورفیسم Phe80Val ژن MLH1 و سرطان تخمدان در نمونه های حاضر وجود نداشت. هرچند نیاز به بررسی روی نمونه های بیشتراز سایر مناطق ایران می باشد.
کلمات کلیدی: سرطان تخمدان- پروموتر-بیان ژن- MLH1
مقدمه
موتاسیون ژن های زیادی در ایجاد سرطان تخمدان دخالت دارند که شامل BRCA1 ، BRCA2 ، MLH2 و PMS2 میباشد. این ژن ها معمولا در تعمیر پلی مورفیسم هایی که منجر به سرطان میشوند، دخالت دارند. خصوصا ژن MLH1 در جلوگیری از mismatch نوکلئوتیدی دخالت دارد. همچنین تغییرات ریز RNA که بیان ژن را کنترل می کند. در این سرطان به چشم می خورد تغییر در الگوی متیله شدن در ناحیه پروموتر ژن ها نیز از دیگر پیشامد های سرطان تخمدان است به ویژه بیش متیله شدن در پروموتر ژن های سرکوبگر تومور رخ می دهد که موجب خاموشی ژن می شود (1). از این رخداد می توان بعنوان نشانگر جهت تشخیص زود هنگام استفاده کرد.طور کلی در این تحقیق سعی بر این است با بررسی ژن MLH1 که وجود پلی مورفیسم در آن به عنوان یک مارکر با سرطان تخمدان مرتبط میباشد، از طریق تکنیک Tetra ARMS-PCRمورد بررسی قرار گیرد.در این خصوص پروتئین MLH1 با پروتئین دیگری به نام PMS2 (تولید شده از ژن PMS2) ترکیب می شود. این پیچیدگی، فعالیت پروتئین های دیگر را که خطاهای ایجاد شده در طی همانندسازی DNA ایجاد می کند را برطرف می نماید. پلی مورفیسم های متعددی در ارتباط با ژن MLH1 مرتبط می باشد که شامل پلی مورفیسم Phe80Val می باشد. این تغییر کدون، کدون فنیل آلانین و کدون والین که هر دو خنثی و غیرقطبی است، در کدون 80 پروتئین MLH1 (p.Phe80Val) جایگزین می کندکه این تغییر نادرست در افراد با ویژگی های بالینی سندرم لینچ مشاهده شده است به طور خلاصه، شواهد موجود در حال حاضر نشان می دهد که این نوع پلی مورفیسم می توااند بیماری زا باشد، اما برای اثبات قطعی آن به داده های بیشتری نیاز است. بنابراین، احتمالا می تواند به عنوان یک پلی مورفیسم جهش زا طبقه بندی شود.
همچنین پلی مورفیسم p.F80V (به عنوان c.238T>G شناخته می شود)، واقع در ناحیه کد کننده اگزون شماره 3 ژن MLH1، از جایگزینی T به G در موقعیت نوکلئوتیدی 238 قرار دارد. فنیل آلانین در کدون 80 با والین، یک اسید آمینه با خواص بسیار مشابه جایگزین می شود. این تغییر در فردی با سابقه شخصی و خانوادگی سرطان روده بزرگ تشخیص داده شد و تومور پروباند ناپایداری ریزماهواره‌ای بالا (MSI-H) اما رنگ‌آمیزی طبیعی MLH1 IHC را نشان داد . در یک مطالعه عملکردی، این تغییر کاهش (23.7٪) فعالیت MMR آزمایشگاهی را نسبت به نوع وحشی، بیان نسبی MLH1 > 75٪ و یک اثر جهش دهنده منفی غالب در یکی از سه مطالعه مخمر نشان داد. این نوع بر اساس گروه‌های جمعیتی در پایگاه داده تجمع ژنوم (gnomAD) نادر است. این موقعیت اسید آمینه در گونه های مهره داران موجود به شدت حفظ شده است. علاوه بر این، این تغییر در تجزیه و تحلیل سیلیکو پیش بینی می شود که مضر باشد. بر اساس اکثر شواهد موجود تا به امروز، این پلی مورفیسم احتمالاً بیماری زا است(3و2).
اصلاح ژن MLH1 با حذف یک بخش از DNA که شامل اشتباهات توالی مورد نظر که جایگزین بخشی از توالی اصلاح شده DNA می باشد، صورت می گیرد . تغییرات ارثی در ژن MLH1 خطر ابتلا به سرطان تخمدان و سایر انواع سرطان را افزایش می دهد(4).همچنینMLH1 یکی از 5 پروتیین مهم برای عملکرد MMR است. از دست دادن آن با بدست آوردن یک فنوتیپ جهش، بی ثباتی استعداد یک سرطان را نشان می دهد(3). جهش های به ارث رسیده در ژن MLH1 با یک نسبت خانوادگی همراه با سندرم سرطان کولون و غربالگری سرطان تخمدان همراه است. اخیرا نشان داده شده که یک نوع پلی مورفیک غیر کدینگ در MLH1 به سرطان کولون و آندومتر منجر می شود، اما با کاهش شدت نفوذ به دنبال ایجاد این موضوع که آیا این نوع پلی مورفیک نیز به سرطان تخمدان مرتبط بوده یا خیرمی باشد(4-6). در یک تحقیقی ژنوتایپ 899 فرد مبتلا به سرطان تخمدان مورد بررسی قرار گرفت ، نتایچ نشان داد که موتاسیون درژن MLH1 با افزایش خطر ابتلا به سرطان تخمدان مهاجم همراه است. در مطالعه ای مشاهده شد به طور سیستمیک بررسی نقش پیش آگهی هفت ژن MMR، MSH2، MSH3، MSH6، MLH1، MLH3، PMS1 و PMS2 در بیماران مبتلا به سرطان تخمدان تحت درمان با شیمی درمانی بودند که حاوی داده های بیان ژن و اطلاعات بقا از بیماران سرطان تخمدان بوده که مورد بررسی قرار گرفت. در میان هفت ژن، افزایش بیان mRNAرا در این ژن ها MSH6، MLH1 و PMS2 مشاهده کردند. به طور قابل توجهی با بقای همه بیماران مبتلا به سرطان تخمدان درمان شده با شیمی درمانی مبتنی بر پلاتین،به خصوص در بیماران مبتلا به سرطان تخمدان در مرحله نهایی مرتبط بود. افزایش بیان ژن هایMSH6 و PMS2 با بیماران سرطان تخمدان ارتباط دارد.در تحقیق حاضر هدف بررسی غربالگری ژن MLH1 در زنان مبتلا به سرطان تخمدان می باشد، با توجه به اهمیت شیوع سرطان تخمدان در ایران ، ضروری است که تحقیقات در این زمینه صورت گیرد.
مواد و روش کار
افراد مورد بررسی از بین مراجعه کنندگان به آزمایشگاهای استان های گلستان و مازندران انتخاب شده اند . افراد مورد تحقیق شامل50نمونه از دو گروه زنان مبتلا به سرطان تخمدان، و کنترل که افراد سالم بودند انتخاب شدند.
اطلاعات اولیه از پرونده بیماران که در پرونده افراد مورد بررسی، ابتلا به سرطان با گرید های مختلف قید شده بود، انتخاب و پس از اخذ رضایت کتبی، نمونه گیری انجام شد . اطلاعات مورد نیاز شامل ( سن ابتلا به بیماری های مورد بررسی، زمان قاعدگی، یائسگی و غیره ) می گردد . پس از تکمیل پرسشنامه و گرفتن رضایتنامه از بیماران، مقدار cc2 نمونه خون از بیماران گرفته شد و در لوله های حاوی EDTA ریخته شد.
تحقیق حاضر در دانشگاه آزاد اسلامی واحد تنکابن با کد اخلاق به شماره IR.IAU.TON.REC.1401.051 ثبت گردیده بود. همچنین نمونه خون سالم و بیمار در ویال های 3 سی سی حاوی EDTA ریخته شد و در ظرفی دارای یخ به آزمایشگاه دانشگاه آزاد اسلامی واحد تنکابن منتقل و در فریزر در دمای -20ºC نگهداري شد تا استخراج DNA انجام گیرد.
به منظور استخراج DNA از نمونه های خون، از کیت استخراج wizbiosolutions استفاده شد. طبق پروتکل کیت استخراج DNA، ابتدا 200 میکرولیتر از نمونه خونی داخل میکروتیوب جدید منتقل سپس 200 میکرولیتر از بافر GB به همراه 20 میکرولیتر پروتئیناز K به آن اضافه و به مدت 10 دقیقه در دمای C◦56 انکوبه و سپس 200 میکرولیتر اتانول 95 درجه به آن اضافه و نهایتا ورتکس گردید. در مرحله بعد به ستون استخراج منتقل و در دور 13000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ گردید. سپس به ستون استخراج 500 میکرولیتر بافر WB1 اضافه و به مدت 1 دقیقه در دور 13000 سانتریفیوژ شد. باقیمانده ویال سپس دور ریخته شده و به آن یافر WB2 به مقدار 500 میکرولیتر اضافه و نهایتا به مدت 1 دقیقه در دور 13000 سانتریفیوژ شد. سپس باقی مانده در وﻳﺎل ﺟﻤﻊ ﻛﻨﻨﺪه را دور ریخته و ﺳﺘﻮن اﺳﺘﺨﺮاج،در همان ویال ﺟﻤﻊ ﻛﻨﻨﺪه قبلی ﻗﺮار داده شد.و به مدت 2 دقیقه با دور 13000 ﺳﺎﻧﺘﺮﻳﻔﻮژ شد تا ﺑﻪ ﻃﻮر ﻛﺎﻣﻞ اﺗﺎﻧﻮل آن ازﺑﻴﻦ ﺑﺮود.سپس 700 میکرولیتر Elution buffer به ستون استخراج اضافه و به مدت یک دقیقه در دور 13000 سانتریفیوژ شد. محلول باقی مانده در ﻣﻴﻜﺮوﺗﻴﻮپ ﻫﻤﺎن DNA اﺳﺘﺨﺮاج ﺷﺪه بود. همچنین در این تحقیق جهت تکثیر محصولات PCR، جایگاه Phe80Val ژن MLH1 که در آن آلل نرمال (T allele) و پرایمرهای موتانت (G allele) مطابق با گزارش سایت NCBI (جدول 1) ، به کمک نرم افزار oligo 7 طراحی پرایمر انجام شد پرایمر های مورد بررسی در جدول 2 آورده شده بود.
جدول 1- جایگاه Phe80Val ژن MLH1 در آن آلل نرمال (T allele) و پرایمرهای موتانت G یا A تبدیل می گردد. مطابق با گزارش سایت NCBI .
| Phe80Val (Homo Sapiens) |
SNV | Variant type |
T>A, G | Alleles |
3:37000985 | Chromosome |
MLH1 | Gene |
Intron _ Variant, missense_ Variant, 5_Prime_UTR | Functional Consequence |
Pathogenic, Likely -Pathogenic | Clinical significance |
NC_000003.12:g.37000985T>A, NC_000003.12:g.37000985T>G, NC_000003.11:g.37042476T>A | HGVS |
جدول 2- پرایمر های آلل نرمال (T allele) و پرایمرهای موتانت (G allele) ژن MLH1 مورد استفاده برای تکنیک Tetra ARMS-PCR
Primer (5'→3') | Phe80Val |
AGATCTGGATATTGTATGTGAAAGGTG | Forward Inner |
CAAAGGACTGCAGTTTACTAGTAGTGA | Reverse Inner |
CTGAGAAGGAGCCACCTAGTAAG | Forward Outer |
GAAACATATATCAGAGGTCTCTGCAGG | Reverse Outer |
جدول 3- پرایمرهای مورد استفاده جهت انجام PCR sequencing
PCR product size | size | TM(°C) | Sequence | Primer |
261 | 29 mer | 60 | GAT TAA ATC AAG AAA ATG GGA ATT CAA AG | Forward |
261 | 28 mer | 58.6 | GAG AAA TAC ATA CTA ACA AAT GAC AGA C | Reverse |
باند آلل موتانت ,314=(FI-OR)باند کنترل,1064=(FO-OR)باند آالل نرمال803=(FO-IR) جفت باز می باشد. علاوه بر آن به منظور صحت انجام واکنش Tetra ARMS-PCR یک جفت پرایمر در محدوده جهش ژن مورد بررسی جهت PCR-Sequencing طراحی و بصورت جدول شماره 3 نشان داده شده بود.
نتایج
نتایج آنالیز واکنش PCR برای بررسی پلی مورفیسم جایگاه Phe80Val ژن MLH1
در ﻣﻄﺎﻟﻌﻪ ﺣﺎﺿﺮ ﺟﻬﺖ آزﻣﺎﻳﺶ ﻣﻮﻟﻜﻮﻟﻲ PCR ﺑﺮاى ﺑﺮرﺳﻲ ﭘلی مورﻓﻴﺴﻢ ﻣﻮردﻧﻈﺮ از ﭘﺮاﻳﻤﺮ ﻫـﺎى اﺧﺘﺼﺎﺻـﻲﺑــﺮاى ﻧﺎﺣﻴــﻪ ﻣــﻮرد ﻧﻈــﺮ اﺳــﺘﻔﺎده ﺷــﺪ پس از انجام PCR نتایج حاصل با استفاده ازدستگاه الکتروفورز ، ترانسلومیناتور و Ladder مورد آنالیز قرار گرفت.
محصولات PCR مربوط به Phe80Val ژن MLH1 با تکنیک Tetra ARMS – PCR تکثیر گردیده همانطور که در شکل شماره 1 نشان داده شده یک باند 803 جفت بازی که از پرایمر فوروارد و ریورس مربوط به فرد نرمال تکثیر شده است.در حالی که از پرایمر های موتانت هیچگونه تکثیری مشاهده نشد.
شکل 1- محصولات PCR مربوط به جایگاه Phe80Val ژن MLH1 که با تکنیک Tetra ARMS-PCR. همانطور که در شکل فوق مشاهده میشود یک قطعه حدود 803 جفت بازی است. که باند نرمال می باشد.چاهک ها به ترتیب از راست به چپ عبارتند از: DNA ladderو چاهک شماره 1 کنترل منفی و چاهک شماره 2 و 3 نمونه های سالم جهت صحت تکنیک Tetra ARMS-PCR ، یک نمونه جهت تعیین توالی فرستاده شد. همانطور که در شکل نشان داده شده یک باند 261 جفت بازی مشاهده میشود.
آﻧﺎﻟﻴﺰ ﭘﻠﻰ ﻣﻮرﻓﻴﺴﻢ جایگاه Phe80Val ژن MLH1 ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از نرم افزار BLAST در ﺳﺎﻳﺖ NCBI
ﻧﻤﻮﻧﻪ ﻫﺎى ﺗﻌﻴﻴﻦ ﺗﻮاﻟﻲ ﺷﺪه ﺑﻪ ﻣﻨﻈﻮر اﻃﻼع از وﺿﻌﻴﺖ ﻫﻤﻮﻟﻮژى آن ﻫﺎ و ﻧﺤﻮه ﻗﺮار ﮔﻴﺮى ﻣﻮﺗﺎﺳﻴﻮن ﻫﺎى ﺗﻚ ﻧﻮﻛﻠﺌﻮﺗﻴﺪى ﺑﺎ ﺑﺮﻧﺎﻣﻪ BLAST آﻧﺎﻟﻴﺰ ﺷﺪﻧﺪ و ﻫﻤﻮﻟﻮژى ١٠٠ درﺻﺪ ﺑﺎ ﺗﻮاﻟﻲ ﺛﺒﺖ ﺷﺪه در ﺑﺎﻧﻚ ژن و ﺑﺪون ﻫﻴﭻ ﮔﻮﻧﻪ SNP ﻣﺸﺎﻫﺪه ﮔﺮدﻳﺪ (ﺷﻜﻞ 3).
آﻧﺎﻟﻴﺰ ﭘﻠﻰ ﻣﻮرﻓﻴﺴﻢ Phe80Val ژن MLH1 ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از ﺑﺮﻧﺎﻣﻪChromas
نتایج تعیین توالی به کمک برنامه Chromas آنالیز و نتایج آن در شکل شماره5 نشان داده شده است . همانطور که در شکل نشان داده شده است هیچگونه موتاسیونی در جایگاه مورد نظر مشاهده نمی شود.
ﺷﻜﻞ 3- آﻧﺎﻟﻴﺰ ﺗﻮاﻟﻲ ﺗﻌﻴﻴﻦ ﺷﺪه ﭘﻠﻲ ﻣﻮرﻓﻴﺴﻢ جایگاه Phe80Val ژن MLH1 ﻫﻤﻮﻟﻮژى ١٠٠ درﺻﺪ ﺑﺎ ﺗﻮاﻟﻲ ﺛﺒﺖ ﺷﺪه در ﺑﺎﻧﻚ ژن و ﺑﺪون ﻫﻴﭻ ﮔﻮﻧﻪ SNP ﻣﺸﺎﻫﺪه ﮔﺮدﻳﺪ.
بحث
سرطان تخمدان کشنده‌ترین سرطان ژنیکولوژیک زنان است و 2% زنانی‌که سابقه فامیلی ابتلا به آن را ندارند، ممکن است در طول عمر خود به آن مبتلا شوند. متأسفانه تاکنون نه آزمون غربالگری و نه روش پیشگیری که باروری را نیز حفظ کند برای این بیماری وجود ندارد (7). سرطان تخمدان چهارمین سرطان شایع و شایع‌ترین علت مرگ ناشی از سرطان‌های ژنیکولوژیک در زنان آمریکایی شمالی، اروپای شمالی و اروپای غربی و سرطان اپی‌تلیال تخمدان ششمین سرطان شایع در زنان است (8). سرطان اپی‌تلیال تخمدان 90% بدخیمی های تخمدان و 25% بدخیمی های تناسلی را تشکیل می دهد.از آنجا که دیر تشخیص داده می شود مرگبار است. خطر ابتلای به سرطان تخمدان در طول عمر زنان فاقد سابقه مثبت خانوادگی در آمریکا 2% میباشد (12-9).
ژن MLH1 دستورالعمل هایی برای ساخت پروتئینی است که نقش قابل توجهی در ترمیم DNA دارد و به رفع اشتباهاتی که هنگام کپی DNA انجام می شود کمک می کند.این Complex فعالیت پروتئین های دیگر را که خطاهای ایجاد شده در طی تکرار DNA را برطرف می کند، هماهنگ می کند(13).
ژن MLH1 ژن سرکوب کننده تومور است. ژن های سرکوب کننده تومور باعث کاهش بخشی از سلول می شوند (14). تعمیر اشتباه DNA و یا مرگ سلولی ،هنگامی که آنها به درستی کار نمی کنند، سلول ها می توانند رشد کنند که می تواند منجر به سرطان شود.همانند اکثر ژن ها، هر فرد دارای دو نسخه از آن است اگر ژن MLH1 یکی از هرکدام به ارث رسیده باشد(15). یعنی ژن به ارث رسیده از یک والدین باشد، سبب سندرم لینچ می شود، خطر ابتلا به سرطان کولورکتال، رحم، تخمدان و دیگر سرطان ها را افزایش می دهد(16-19). اگر یک زن دارای جهش درژن MLH1 باشد، شانس او برای رشد تخمدان، کولورکتال،رحم، سیستم عصبی مرکزی، پانکراس، نئوپلاسم های چربی، سرطان روده کوچک ، معده و مجاری ادراری بیشتر از زنان متوسط ایالات متحده است این به این معنا نیست که او دارای تشخیص سرطان است و یا او قطعا در معرض سرطان قرار خواهد گرفت.(20) جهش های مختلفی در خصوص ژن MLH1 توسط محققین مختلف مورد بررسی قرار گرفته است(جدول شماره 3). همانطور که در جدول شماره 3 نشان داده شده است پلی مورفیسم های مختلفی در ارتباط با موتاسیون ژن MLH1 مورد بررسی قرار گرفته است. همانطور که نشان داده شده این جایگاه ها با بسیاری از بیماری های مختلف نظیر سرطان کولون، سرطان معده ، سرطان پستان، سرطان دهانه رحم و سرطان تخمدان مرتبط می باشد و نشان دهنده ریسک بالای جایگاه های فوق در ایجاد بیماری بودند.
جدول شماره 3. پلی مورفیسم ژن MLH1 که در آن فراوانی هاپلوتیپ های مختلف مورد بررسی قرار گرفته است.
همچنین محققین دیگری در خصوص سایر پلی مورفیسم های ژن فوق مور بررسی قرار دادند در این خصوص سه موتاسيون ژرم لاين جديد براي اولين بار در ژن MLH1تعيين شد. اولين موتاسيون يك جهش متقاطع (Transversion)(C>A.364c)بود كه سبب تغيير اسيد آمينه ترئونين به پرولين در كدون 116 شده بود. اين كدون در منطقه بشدت حفظ شده بخش HATPase پروتئين MLH1قرار دارد. دومين موتاسيون نيز يك موتاسيون transversion بود كه در موقعيت 736 باعث تغيير نوكلئوتيد آدنين به تيمين و در نتيجه سبب تغيير اسيدآمينه ايزولوسين به لوسين شده بود. سومين جهش يك موتاسيون تغيير قاب (فريم شيفت) بود كه با حذف 2 نوكلئوتيد تيمين و گوانين باعث ايجاد يك كدون خاتمه زودهنگام در 5 كدون پايين دست ژن شده بود. با ايجاد اين موتاسيون فريم شيفت، 5 اسيد آمينه پايين دست موتاسيون تغيير كرده بود كه متعاقبا سبب ايجاد كدون خاتمه زوهنگام شده بود. يكي از بيماران از نظر ماركرهاي تواليهاي تكراري داراي پايداري بود، در حاليكه بيمار ديگر ناپايداري در ماركرهاي تواليهاي تكراي را نشان ميداد(20).
در خصوص جایگاه Phe80Val ژن MLH1 تاکنون مطالعه ای صورت نگرفته است و در تحقیق حاضر هیچگونه موتاسیونی مشاهده نشده بود. دلایل مختلفی در این خصوص پیشنهاد می گردد، اولا هرچند که در سایت NCBI در بخش SNP عملکرد پلی مورفیسم Phe80Val بصورت پاتوژنیک قید شده است ولی با توجه به تعداد کم جمعیت مورد مطالعه(50 فرد که 25 فرد بیمار و 25 فرد سالم) می تواند بر نتایج تاثیرگذار باشد. ثانیا منطقه جغرافیایی و اینکه تمامی نمونه ها از دو منطقه (استان مازندران و گلستان) بودند و پراکندگی معنی داری وجود نداشته است می تواند تاثیرگذار باشد. ثالثا تکنیک ARMS-PCR می تواند نتایج متفاوتی نسبت به سایر تکنیک ها نظیر PCR Sequencing که یک متد با sensivity بالاست. بطور کلی دلایل متفاوتی می تواند در اینکه پلی مورفیسم مورد مطالعه تاثیرگار نبوده است وجود داشته است. نکته مهم دیگری که در تحقیق فوق مورد مطالعه قرار گرفته است تعیین توالی تعداد دو نمونه از نتایج تکنیک تکنیک ARMS-PCR بوده است. هدف از تعیین توالی تعیین صحت تکنیک ARMS-PCR می باشد و احتمال خطا در آن ممکن است وحود داشته باشد. روش ARMS روش آسان و سریع و قابل اعتماد برای تشخیص و مشاهده حذف یا اضافه شده کوچک در توالی مولکولی DNA ،جهش های نقطه ای ،چند شکلی های طولی قطعه محدودشده (RFLP) میباشد. این روش بر پایه تفاوت نوکلئوتیدهای ´3 پرایمرهابرای آلل های مختلف ساخته شده است. اساس این تکنیک تکثیر اختصاصی آلل ها توسط PCR (PCR Amplification Specific Alleles ) نیزخوانده می شوند، می باشد. دو واکنش PCR بوسیله ی یک مولکول DNA یا الگوصورت می گیرد، که در هر واکنش صورت گرفته یک پرایمر مشترک به همراه یک یا دوپرایمراختصاصی الل مورد بررسی قرار می گیرد. حالت اختصاصی این پرایمرها برای هریک ازاین الل‌ها حاکی از تفاوت درنوکلئوتیدهای آنها می باشدو مربوط به نقطه متفاوت بین دو الل است، استفاده از Tag DNA پلی‌مراز ویا یک DNA پلی‌مراز یکسان که فاقدخاصیت اگزونوکلئازی بوده دراین واکنش ضروری است (19). تکنیک ARMSبرای بررسی تعداد زیادی از چندشکلی‌های ژنتیکی ،تشخیص پیش از تولد بیماری‌های ژنتیکی ،تعیین ناقلین ژن‌های بیماری ، جهش‌های ارثی واکتسابی، ،تعیین میزان سلول های باقیمانده در درمان سرطان مورد استفاده قرارگرفته است (23-20). در این مطالعه ی تجربی نمونه گیری از نمونه خون از زنان مبتلا به سرطان تخمدان (25 نمونه) انجام گرفت. قبل از انجام عمل استخراج، تمامی نمونه ها پس از جمع آوری به آزمایشگاه ژنتیک منتقل شده و تا استخراج DNA در فریزرمنفی 20 درجه سانتیگراد نگهداری می شوند. استخراج DNA ژنومی از خون با استفاده از کیت طبق پروتکل شرکت سازنده انجام شد. به منظور بررسی کیفی از استخراج مناسب DNA و اینکه روش استخراج به درستی انجام شده است، نمونه ها بر روی ژل آگارز 1 درصد، الکتروفورز گردید و به منظور بررسی کمی خلوص DNA استخراج شده از نسبت جذب 260 به 280 استفاده شد. پس از استخراج DNA، پرایمر اختصاصی توسط نرم افزار oligo برای دو آلل نرمال و جهش یافته ی ژن MLH1 طراحی شد وDNA های زنان مبتلا به سرطان تخمدان با استفاده از واکنش Tetra ARMS PCR برای بررسی حضور آلل مورد نظرتکثیر شدند که این امر بواسطه ی پروتکل حرارتی ذکر شده در بخش روش کار انجام پذیرفت. در نهایت جهت مشاهده محصول PCR، DNA های تکثیر یافته بر روی ژل آگارز ۱ درصد برده شده و طبق اندازه محصول PCR مورد نظر وجود جهش مشاهده شد. هم چنین جهت اطمینان از روش PCR sequencing استفاده شد و نتایج حاصله با استفاده از نرم افزار کروماس تجزیه و تحلیل شد. هدف از این مطالعه غربالگری جهش جایگاه Phe80Val ژن MLH1 درخون زنان مبتلا به سرطان تخمدان با روش Tetra ARMS PCR می باشد.
در ارتباط با این پژوهش، مطالعات اندکی در کشورهای مختلف انجام گرفته است و مطالعه ای مبنی بر غربالگری جهش جایگاه Phe80Val ژن MLH1 در خون زنان مبتلا به سرطان تخمدان یافت نشد. از این رو این مطالعه با محدودیت هایی در این زمینه همراه بود و در راستای این مطالعه به بررسی مطالعاتی مرتبط با بررسی وجود پلی مورفیسم های دیگر در ژن MLH1در بیماران مبتلا به سرطان تخمدان با استفاده از روش های PCR پرداخته شد.
نتایج مطالعه حاضر نشان دادند که از 25فرد مبتلا به سرطان تخمدان هیچ یک از نمونه های مورد بررسی دارای جهش جایگاه Phe80Val در ژن MLH1 نبودند و این نتایج با استفاده از روش PCR sequencing نیز تایید گردید. نتایج پژوهش حاضر و هم چنین نتایج مطالعات دیگر محققین نشان دهنده آن است که جهش جایگاه Phe80Val ژن MLH1 به ندرت رخ داده و نیاز به مطالعات بیشتر در جمعیت های دیگر دارد.آنچه که قابل بررسی است محدودیت های جمع آوری نمونه بوده است این محدودیت ها شامل تعداد کم نمونه های بیمار ، نحوه جمع آوری نمونه ها و عوامل دیگر دخیل بوده است. همانطور که در بخش بحث ذکر گردید از سایر تکنیک های مولکولی نظیر Real Time PCR و PCR Sequencing جهت بررسی نمونه ها مورد استفده قرار گیرد و احتمالا می تواند در نتایچ تاثیرگذار باشد.
تشکر و قدردانی.
مقاله حاضر برگرفته از پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد، مصوب معاونت علمی دانشگاه آزاد اسلامی واحد تنکابن می باشد. بدین وسیله، نویسندگان از این معاونت تشکر و قدردانی به عمل می آورند.
تعارض منافع
نویسندگان هیچگونه تعارض منافعی را برای این مقاله گزارش نمیکنند.
فهرست منابع
2. Stratton, J.F., Thompson, D., Bobrow L., et al. (1999), The genetic epidemiology of early- onset epithelial ovarian cancer: A population- based study Am. J. Hum. Genet. 65: 1725-1732.
3. Goodman, M.T., Howe, H.L., Tung, K.H. et al, (2003), incidence of ovarian cancer by race and ethnicity in the united states, 1992- 1997. Cancer. 97: 26-76.
4. Oscoe Klinck A.B. Lyna Inkel. Genevie`veDufresne-Martin, Julien Gervais-Bird, et al. (2008), Multiple Alternative Splicing Markers for Ovarian Cancer. 68(3): 7-11.
5. Pal, T., Permuth- wey, J., Betts, J.A., et al. (2005), BRCAI and BRCA2 mutations account for a large proportion of ovarian carcinoma cases. Cancer, 15(104), 12. 2807- 2816.
6. de Almeida Paiva, V., de Souza Gomes, I., Monteiro, C. R., Mendonça, M. V., Martins, P. M., Santana, C. A., ... & de Azevedo Silveira, S. (2022). Protein structural bioinformatics: An overview. Computers in Biology and Medicine, 147, 105695.
7.Santos, C., Azuara, D., Rodríguez-Moranta, F., & Moreno, V. (2018). MLH1 mutations and chemotherapy resistance in colorectal cancer. Oncotarget, 9(15), 12179–12191.
8. Hamna, L., Adams, M, (2006), Prevention of ovarian cancer best practice and research clinical obstetrics and gynecology. 2: 339-362.
9. Dowty, J.G., Win, A.K., Buchanan, D.D., et al, (2013), Cancer risks for MLH1 and MSH2 mutation carriers. Hum Mutat. 34(3):490-7.
10. Holschneider, C.H., Berek, J.S, (2000), Ovarian cancer: epidemiology, biology, and prognostic factors. Semin Surg Oncol. 19(1): 3-10.
11. Chuchu, Zhao., Saisai, Li., Menghuang, Zhao., Haiyan Zhu and Xueqiong Zhu, (2018), Prognostic values of DNA mismatch repair genes in ovarian cancer patients treated with platinum-based chemotherapy. Arch Gynecol Obstet. 297(1): 153–159.
12. Lin, KM., et al, (1998), Colorectal and extracolonic cancer variations in MLH1/MSH2 hereditary nonpolyposis colorectal cancer kindreds and the general population. Dis Colon Rectum. 41:428-33.
13. Wagner A, Tops C, Wijnen JT, Zwinderman K, van der Meer C, Kets M, et al.(2002). Genetic testing in hereditary nonpolyposis colorectal cancer families with a MSH2, MLH1, or MSH6 mutation. J Med Genet . 39:833-37.
14.Valérie Bonadona, Bernard Bonaïti, Sylviane Olschwang, et al, (2011), Cancer Risks Associated With Germline Mutations in MLH1, MSH2, and MSH6 Genes in Lynch Syndrome Article Information JAMA. 305(22):2304-2310.
15. Aquilina G, Ceccotti S, Martinelli S, Soddu S, Crescenzi M, Branch P, Karran P, Bignami M. (2000). Mismatch repair and p53 independently affect sensitivity to N-(2-chloroethyl)-N-cyclohexyl-N-nitrosourea. Clin Cancer Res. 6:671–680
16. Scartozzi M, De Nictolis M, Galizia E, Carassai P, Bianchi F, Berardi R, Gesuita R, Piga A, Cellerino R, Porfiri E. (2003). Loss of hMLH1 expression correlates with improved survival in stage III–IV ovarian cancer patients. Eur J Cancer. 39:1144–1149.
17. Hawn MT, Umar A, Carethers JM, Marra G, Kunkel TA, Boland CR, Koi M. (1995). Evidence for a connection between the mismatch repair system and the G2 cell cycle checkpoint. Cancer Res. 55:3721–3725.
18. Helleman J, van Staveren IL, Dinjens WN, van Kuijk PF, Ritstier K, Ewing PC, van der Burg ME, Stoter G, Berns EM. (2006). Mismatch repair and treatment resistance in ovarian cancer. BMC Cancer.6:201-208.
19. Ian H, Barry R, Harvey A. Risch, KS, Mario E. Beiner,JM, Ping S, Steven A. (2008). Narod Ovarian cancer risk is associated with a common variant in the promoter sequence of the mismatch repair gene MLH1. 109(3): 384–387.
20. Bandipalliam P. Syndrome of early onset colon cancers, hematologic malignancies & features ofneurofibromatosis in HNPCC families with homozygous mismatch repair gene mutations. FamCancer. 2005;4(4):323-33.
21. Scartozzi M, De Nictolis M, Galizia E, Carassai P, Bianchi F, Berardi R, Gesuita R, Piga A, Cellerino R, Porfiri E. (2003). Loss of hMLH1 expression correlates with improved survival in stage III–IV ovarian cancer patients. Eur J Cancer;39:1144–1149.
22. Wagner A, Tops C, Wijnen JT, Zwinderman K, Meer C, Kets M, et al. Genetic testing in hereditary non-polyposis colorectal cancer families with a MSH2, MLH1, or MSH5 mutation. J Med Genet 2002;39:833-37.
23. Stephenson BM, Finan PJ, Gascoyne J, Garbett F, Murday VA, Bishop DT, et al. (1995). Frequency of familial colorectal cancer. Br J Surg. 78:1162-66.
Screening of the Phe80Val polymorphism of the MLH1 gene in women with ovarian cancer by Tetra ARMS-PCR technique
FAthemeh Yousefnejad1, Abolhasan Rezaei2
1- M.Sc. Graduated, Department of Genetics, Tonekabon Branch, Islamic Azad University, Tonekabon, Iran.
2- Assistant Professor, Department of Genetics, Tonekabon Branch, Islamic Azad University, Tonekabon, Iran. Corresponding Author: ab.rezaei@tonekaboniau.ac.ir
Received:2025.04.03 Accepted: 2025.07.06
Abstract
Background & Aim: Epithelial ovarian cancer accounts for 90% of ovarian malignancies and 25% of gynecologic cancers. Since it is diagnosed late, it has the highest mortality rate among all malignancies of the female reproductive system. Moreover microRNA genes, which regulate gene expression, are observed in ovarian cancer. So, changes in methylation patterns in gene promoter regions are also among the events associated with ovarian cancer.
Materials & Methods: In the present study, samples including normal and cases were collected from hospitals of north of Iran . The samples including twenty five individuals women with ovarian cancer and twenty five individuals women with normal situation in different ages. A commercial kit was used to extract genomic DNA from human blood. The Val80Phe locus of the MLH1 gene was then examined for polymorphism using the Tetra ARMS PCR technique, then for final confirmation of the Tetra ARMS PCR technique, were designed a pair of primers and done PCR sequencing technique.
Results:No mutations were observed between normal and cases. Then two samples were sequenced and no observed single nucleotide polymorphism between them.
Conclusion: Overall, the findings of the present study indicated that there was no association between the MLH1 Val80Phe polymorphism and ovarian cancer in the examined samples. However, further studies on larger sample sizes from other regions of Iran are needed.
Keywords: Ovarian Cancer, Promoter, Gene Expression, MLH1.
