تعیین و مقایسه فراوانی مقاومت آنتی‌بیوتیکی در اشریشیاکلی جدا شده از گوشت مرغ در فارم‌های مبتلا به کلی باسیلوز و به ظاهر سالم

محورهای موضوعی : فصلنامه زیست شناسی جانوری

هانیه شفیعی ¹ , مجید غلامی آهنگران ² , آسیه احمدی دستگردی ³

1 - گروه دامپزشکی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران
2 - گروه دامپزشکی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران
3 - گروه علوم و صنایع غذایی، واحد اردستان، دانشگاه آزاد اسلامی، اردستان، ایران

تاریخ دریافت : 1402/02/11 تاریخ پذیرش : 1402/05/03 تاریخ انتشار : 1402/05/03

کلید واژه: مقاومت آنتی‌بیوتیکی, گوشت مرغ, اشریشیاکلی, ژن‌های مقاومت,

چکیده مقاله :

در این مطالعه به منظور ردیابی ژن های مقاومت علیه فلوروکینولونها و سوافانامیدها، 50 سویه باکتری از مواد پریکاردیت و پری هپاتیت جوجه های گوشتی جداسازی شد و با تست های میکروبی و بیوشیمیایی، کلنی های اشریشیاکلی تایید شد. سپس با روش معمول آنتی بیوگرام، مقاومت سویه ها نسبت به آنتی بیوتیک های تجاری انروفلوکساسین و سولفانامید+تری متوپریم بررسی شد. علاوه بر آن، با روش جوشاندن، ژنوم باکتری استخراج شد و با پرایمر های اختصاصی به تکثیر ژن های qnrA و sul1 جهت ارزیابی مقاومت آنتی بیوتیکی علیه فلوروکینولون ها و سولفانامیدها پرداخته شد. پس از تایید باکتری و انجام آنتی‌بیوگرام، سویه‌های جدا شده از مرغ‌های با سابقه کلی‌باسیلوز کمترین مقاومت آنتی‌بیوتیکی را نسبت به جنتامایسین (7 درصد) و بیشترین مقاومت را نسبت به تتراسایکلین (71 درصد) نشان دادند. در این بررسی 5/59 درصد این سویه‌ها حداقل به دو آنتی‌بیوتیک مقاومت نشان دادند و حدود 5/9 درصد سویه ها به تمامی 13 آنتی‌بیوتیک مورد استفاده در تست آنتی‌بیوگرام، مقاومت نشان دادند. همچنین الکتروفورز محصول PCR سویه‌های جدا شده از مرغ‌های با سابقه کلی‌باسیلوز نشان داد 10 و 15 و یک سویه از 42 سویه مورد بررسی توانستند قطعات 822، 670 و 286 جفت بازی را تکثیر کنند و به ترتیب، حامل ژن‌های Sul1، qnrA و Act(3)-IV باشند. به‌عبارتی 8/23 درصد سویه‌ها حاوی ژن Sul1، 7/35 درصد سویه‌ها حاوی ژن qnrA و 4/2 درصد سویه‌ها حامل ژن Act(3)-IV بودند. با توجه‌ به‌ روند رو به‌ گسترش مقاومت‌های‌ آنتی‌‌بیوتیکی‌ لازم است‌ با رعایت‌ اصول مناسب‌ بهداشت‌ از ورود بیماری‌ به‌ فارم ممانعت‌ شود. همچنین‌ با انجام واکسیناسیون به‌موقع‌ می‌توان از ابتلا طیور به‌ بیماری‌های‌ عفونی‌ تا حد زیادی‌ جلوگیری‌ کرد تا به‌ طبع‌ آن، از مصرف آنتی‌بیوتیک‌ها کاسته‌ شده و به‌ سمت‌ تولید فراورده-های بدون آنتی‌بیوتیک‌ گام برداریم‌.

چکیده انگلیسی:

In this study, for detecting of resistance genes to fluoroquinolones and sulfonamides, 50 bacterial strains were isolated from broiler chickens with pericarditis and perihepatitis and E. coli colonies were confirmed by microbial and biochemical tests. Then, the resistance of the strains to the commercial antibiotics (Enrofloxacin and sulfonamide + trimethoprim) was evaluated by the conventional antibiogram method. In addition, the bacterial genome was extracted by boiling method and the qnrA and sul1 genes were amplified with specific primers to evaluate antibiotic resistance against fluoroquinolones and sulfonamides. After confirming the bacteria and performing an antibiogram, the strains isolated from chickens with a history of colibacillosis showed the lowest antibiotic resistance to gentamicin (7%) and the highest resistance to tetracycline (71%). In this study, 59.5% of these strains showed resistance to at least two antibiotics, and about 9.5% of the strains showed resistance to all 13 antibiotics used in the antibiogram test. Also, the electrophoresis of the PCR product of the strains isolated from chickens with a history of colibacillosis showed that 10 and 15 and one strain out of the 42 investigated strains were able to amplify fragments of 822, 670 and 286 base pairs, respectively, carrying the gene Sul1, qnrA and Act (3)-IV. In other words, 23.8% of strains contained Sul1 gene, 35.7% of strains contained qnrA gene and 2.4% of strains carried Act (3)-IV gene. Therefore, according to the growing trend of antibiotic resistance, it is necessary to prevent the disease from entering the farm by following the proper principles of nutrition and health. Also, by timely vaccination, it is possible to prevent poultry from contracting infectious diseases to a large extent, so that we can reduce the use of different antibiotics and move towards the production of antibiotic-free products.

منابع و مأخذ:

1. Ansari Cheharsughi M. S., Ahmadi-Dastgerdi A., Gholami-Ahangaran M. 2020. Antibacterial effect of Capparis spinosa (Capparis spinosa) and Pistacia atlantica (Pistacia atlantica) extracts on growth of Escherichia coli in vitro and in vivo. Iranian Veterinary Clinical Pathology, 14(54):115-126.
2. Dehghani G.S., Gholami-Ahangaran M., Rahimi E. 2017. The comparison of Escherichia coli contamination rate in meat of conventional and without antibiotic chickens. Iranian Journal of Food Microbiology, 4(3):93-100.
3. Diarra Moussa S., Fred G., Silversides F., Diarrassouba J., Pritchard L., Masson R., Brousseau C. 2007. Impact of feed supplementation with antimicrobial agents on growth performance of broiler chickens, Clostridium perfringens and enterococcus counts, and antibiotic resistance phenotypes and distribution of antimicrobial resistance determinants in Escherichia coli isolates. Applied Environmental Microbiology, 73(20):6566-6576.
4. Emond-Rheault J., Jérémie Hamel J., Jeukens L., Freschi I., Kukavica-Ibrulj B., Boyle S. 2020. The Salmonella enterica plasmidome as a reservoir of antibiotic resistance. Microorganisms, 8(7):1016.
5. Ghaniei A., Mojaverrostami S., Lotfallahzadeh B., Darzi Lemraski M., Sepehrnia P., Imani Jajarmi A. 2014. Geographical and seasonal variation in antimicrobial susceptibility of Escherichia coli isolated from broiler chicken carcasses in Iran. European Journal of Experimental Biology, 4:173-177.
6. Gholami-Ahangaran M., Zia-Jahromi N. 2014. Identification of shiga toxin and intimin genes in Escherichia coli detected from canary (Serinus canaria domestica). Toxicologiy and Industrial Health, 30(8):724-727.
7. Gholami-Ahangaran M., Ahmadi-Dastgerdi A., Karimi-Dehkordi M. 2020. Thymol and carvacrol: as antibiotic alternative in green healthy poultry production. Planta Biotechnology Persa, 2(1):22-25.
8. Gholami-Ahangaran M., Moravvej A.H., Safizadeh Z., Sadeghi Nogoorani V., Zokaei M., Ghasemian S.O. 2021. The evaluation of ESBL genes and antibiotic resistance rate in Escherichia coli strains isolated from turkey meat and intestinal contents in Isfahan, Iran. Iranian Journal of Veterinary Research, 22(4):318- 325.
9. Gregova G., Kmetova M., Kmet V., Venglovsky J., Feher A. 2012. Antibiotic resistance of Escherichia coli isolated from a poultry slaughterhouse. Annals of Agricultural Environmental Medicine, 19:75-77.
10. Haghighi Khoshkhoo P., Ali-Nezhad I. 2010. Antibacterial Resistance Patterns of Escherichia coli isolated from Broilers Colibacillosis of Broilers chicks in Golestan Province. Iranian Journal of Veterinary Clinical Research, 1(1):39-47.
11. Horri M., Gholami-Ahangaran M. 2022. Phenotypic and Genotypic Characterization of Antibiotic Resistance in Escherichia coli Strains Isolated from Broiler Chickens with Suspected Colibacillosis in Isfahan Province, Iran. Infection Epidemiology and Microbiology, 8(3):193-201.
12. Jafari R., Ghanbarpour R., Ghorbanpour Najaf Abadi M., Mayahi M., Amani A. 2015. Determination of antibiotic resistance patterns in Escherichia coli isolated from healthy and colisepticemic broiler chickens in Ahvaz. Iranian Journal of Veterinary Microbiology,11(2):109-117 [In Persian].
13. Kilonzo-Nthenge A., Samuel N., Nahashon F., Nathaniel A. 2008. Prevalence and antimicrobial resistance of pathogenic bacteria in chicken and guinea fowl. Poultry Sciences, 87(9):1841-1848.
14. Mojaver Rostami S., Ghaniei A., Mohammadi V. 2018. Phenotypic and genotypic resistance of Escherichia coli isolated from broiler chickens of Urmia to sulfonamides. Iranian Veterinary Journal, 13(4):86-91.
15. Nolan L.K., Vaillancourt J., Barbieri N.L., Logue C.M. 2020. Colibacillosis. In: Swayne, DE; Boulianne, M; Logue, CM; McDougald, LR; Nair, V and Suarez, DL (Eds.), Disease of Poultry. (14th Edn.), Massachusetts, W.B. Publishing. PP. 770-790.
16. Ozaki H., Hidetake E., Kouhei T., Akira I., Yasutaka N., Azusa S., Norio H., Toshiyuki M. 2011. Antimicrobial resistance in fecal Escherichia coli isolated from growing chickens on commercial broiler farms. Veterinary Microbiology, 150(1-2):132-139.
17. Prescott L.M., Harley J.P., Klein K.A. 2002. Microbiology, 5th Ed., McGraw-Hill company, UK, pp: 53-66.
18. Privalsky M., Alexander M. Soohoo J., Wang T., Gerard D., Wright M., Gordon S., Gray Chaitan K. 2021. Prospects for antibacterial discovery and development. Journal of American Chemical Society, 143(50):21127-21142.
19. Ponce-Rivas E., Muñoz-Márquez M. E., Khan A. A. 2012. Identification and molecular characterization of class 1 integrons in multiresistant Escherichia coli isolates from poultry litter. Applied Environmental Microbiology, 78(15):5444-5447.
20. Rafiei Tabatabaei R., Nasirian A. 2003. Isolation, identification and antimicrobial resistance patterns of Escherichia coli isolated from chicken flocks. Iranian Journal of Pharmacological Therapeytics, 2:39-42.
21. Rajaeian H., Firouzi R., Jalaei J., Heydari D.F. 2003. Antibiotic resistance of several common bacterial species isolated from chickens in Shiraz area. Iranian Journal of Veterinary Research, 58(3):223-226.
22. Shahiri M., Gholami-Ahangaran M., Rahimi E. 2018. The comparing of antibiotic resistance pattern in Escherichia coli isolates from chicken meat that reared under conventional and without antibiotic condition. Iranian Journal of Food Microbiology, 5(2):11-18.
23. Soufi L., Sáenz Y., Vinué L., Abbasi MS., Ruiz E., Zaragaza M. 2011. Escherichia coli of poultry food origin as reservoir of sulphonamide resistance genes and integrons. International Journal of Food Microbiology, 144:497-502.
24. Yang H., Chen S., White D.G., Zhao S., McDermott P., Walker R. 2004. Characterization of multiple antimicrobial resistant Escherichia coli isolates from diseased chickens and swine in China. Journal of Clinical Microbiology, 42:3483-3489.
25. Zahraei Salehi T., Farashi Bonab S. 2006. Antibiotics susceptibility pattern of Escherichia coli strains isolated from chickens with colisepticemia in Tabriz province, Iran. International Journal of Poultry Sciences, 5:677-684.

متن کامل:



زیست­شناسی جانوري، سال شانزدهم، شماره دوم، زمستان 1402، صفحات 298-287، شفیعی و همکاران

 

 

تعیین و مقایسه فراوانی مقاومت آنتی­بیوتیکی در اشریشیا کلی جدا شده از گوشت مرغ در

فارم­های مبتلا به کلی­باسیلوز و به ظاهر سالم

هانیه شفیعی1، مجید غلامی آهنگران1*، آسیه احمدی دستگردی2

1- گروه دامپزشکی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران

2- گروه علوم و صنایع غذایی، واحد اردستان، دانشگاه آزاد اسلامی، اردستان، ایران

*مسئول مکاتبات: [e-mail]

تاریخ دریافت: 11/02/1402                          تاریخ پذیرش: 03/05/1402

DOI: 10.22034/ascij.2023.1985124.1488

چکیده

کلی‌ باسیلوز طیور یکی‌ از مهم‌ترین‌ بیماری‌های‌ ناشی‌ از اشریشیا کلی‌ است‌ که‌ موجب‌ خسارات اقتصادی‌ زیادی‌ به‌ صنعت‌ پرورش مرغ می‌ شود. با توجه‌ به‌ گسترش روزافزون مقاومت‌های‌ آنتی‌بیوتیکی‌ در این‌ باکتری‌ و ظهور سویه‌های‌ مقاوم اشریشیا کلی‌ (Escherichia coli) این‌ مطالعه‌ باهدف تعیین‌ الگوی‌ مقاومت‌ آنتی‌بیوتیکی‌ در سویه‌های اشریشیا کلی‌ جدا شده از مرغ‌های‌ با سابقه و بدون سابقه کلی باسیلوز در استان اصفهان انجام گرفت‌. در این مطالعه به منظور ردیابی ژن‌های مقاومت علیه فلوروکینولون­ها و سوافانامیدها، 50 سویه باکتری از مواد پریکاردیت و پری هپاتیت جوجه‌های گوشتی جداسازی شد و با تست­های میکروبی و بیوشیمیایی، کلنی­های اشریشیا کلی تایید شد. سپس با روش معمول آنتی­بیوگرام، مقاومت سویه‌ها نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های تجاری انروفلوکساسین و سولفانامید+تری متوپریم بررسی شد. علاوه بر آن، با روش جوشاندن، ژنوم باکتری استخراج شد و با پرایمر های اختصاصی به تکثیر ژن‌های qnrA و sul1 جهت ارزیابی مقاومت آنتی‌بیوتیکی علیه فلوروکینولون­ها و سولفانامیدها پرداخته شد. پس از تایید باکتری و انجام آنتی­بیوگرام، سویه­های جدا شده از مرغ‌های با سابقه کلی­باسیلوز کمترین مقاومت آنتی­بیوتیکی را نسبت به جنتامایسین (7 درصد) و بیشترین مقاومت را نسبت به تتراسایکلین (71 درصد) نشان دادند. در این بررسی 5/59 درصد این سویه­ها حداقل به دو آنتی­بیوتیک مقاومت نشان دادند و حدود 5/9 درصد سویه‌ها به تمامی 13 آنتی­بیوتیک مورد استفاده در تست آنتی­بیوگرام، مقاومت نشان دادند. همچنین الکتروفورز محصول PCR سویه­های جدا شده از مرغ‌های با سابقه کلی­باسیلوز نشان داد 10 و 15 و یک سویه از 42 سویه مورد بررسی توانستند قطعات 822، 670 و 286 جفت بازی را تکثیر کنند و به ترتیب، حامل ژن­های Sul1، qnrA و Act(3)-IV باشند. به­عبارتی 8/23 درصد سویه­ها حاوی ژن Sul1، 7/35 درصد سویه­ها حاوی ژن qnrA و 4/2 درصد سویه­ها حامل ژن Act(3)-IV بودند.

کلمات کلیدی: اشريشيا كلي، گوشت مرغ، ژن­هاي مقاومت، مقاومت آنتي­بيوتيكي.

مقدمه

 

مقاومت­های آنتی‌بیوتیکی یکی از بزرگترین و مهمترین مشکلات سازمان­های مرتبط با سلامت انسان و دام در سطح جهان است. در مکانیسم مقاومت، ارگانیسم­های مقاوم تغییراتی را درخود بوجود آورده­اند که دیگر آنتی­بیوتیک­ها قادر به مبارزه با آنها نمی­باشند. امروزه از ترکیبات ضد باکتریایی برای اهداف مختلفی در تولید و پرورش دام، طیور و آبزیان استفاده می­شود که این اهداف می­تواند شامل افزایش رشد، پیشگیری و درمان ببیماری­ها باشد (7). مصرف بی­رویه و بلند مدت آنتی­بیوتیک­ها برای درمان بیماری­ها و افزایش رشد در حیوانات باعث شده­است که مقاومت­های آنتی­بیوتیکی در باکتری­ها بویژه در اشریشیا کلی (Escherichia coli) افزایش پیدا کند (8). ﺍﺷﺮﻳﺸﻴﺎﻛﻠﻲ ﺍﻧﺘﺸﺎﺭ ﺟﻬﺎﻧﻲ ﺩﺍﺷﺘﻪ ﻭ ﺟﺰء ﻓﻠﻮﺭ ﻃﺒﻴﻌﻲ ﺩﺳﺘﮕﺎﻩ ﮔﻮﺍﺭﺵ ﺩﺭ ﺍﻧﺴﺎﻥ ﻭ ﺣﻴﻮﺍﻧﺎﺕ ﺍﺳﺖ (1، 18) ﻭ ﺑﻪ ﺁﺳﺎﻧﻲ ﺍﺯ ﻃﺮﻳﻖ ﻏﺬﺍ ﻭ ﺁﺏ (2) ﻭ ﻧﻴﺰ ﺗﺨﻢ ﭘﺮﻧﺪﮔﺎﻥ ﺩﺭ ﺍﻛﻮﺳﻴﺴﺘﻢﻫﺎي ﻣﺨﺘﻠﻒ ﺍﻧﺘﺸﺎﺭ ﻣﻲﻳﺎﺑﺪ. ﺑﻌﻀﻲ ﺍﺯ ﺳﻮﻳﻪﻫﺎي گوارشی ﺁﻥ ﺩﺭ ﭘﺮﻧﺪﮔﺎﻥ اﺯ ﭘﺎﺗﻮﮊﻥﻫﺎي ﻓﺮﺻﺖ­ﻃﻠﺐ ﻫﺴﺘﻨﺪ ﻛﻪ ﺍﻏﻠﺐ ﺑﻪ ﺩﻧﺒﺎﻝ ﻋﻮﺍﻣﻞ ﻣﺴﺘﻌﺪ­ﻛﻨﻨﺪﻩ ﻋﻔﻮﻧﻲ ﻳﺎ ﻏﻴﺮﻋﻔﻮﻧﻲ ﻣﻮﺟﺐ ﺟﺮﺍﺣﺎﺕ ﻣﻮﺿﻌﻲ ﻳﺎ ﻋﻤﻮﻣﻲ ﮔﺮﺩﻳﺪﻩ ﻭ ﺧﺴﺎﺭﺍﺕ ﺳﻨﮕﻴﻨﻲ ﺭﺍ ﺑﻪ ﺻﻨﻌﺖ ﻃﻴﻮﺭ ﻭﺍﺭﺩ ﻣﻲﻛﻨﻨﺪ (15). ﺩﺭ ﺍﻧﺴﺎﻥ ﻧﻴﺰ، ﺍﺑﻦ ﺑﺎﻛﺘﺮي ﺑﺎﻋﺚ ﻋﻔﻮﻧﺖ ﺧﺎﺭﺝ ﺭﻭﺩﻩ­ﺍي ﻣﺜﻞ ﻋﻔﻮﻧﺖ ﺍﺩﺭﺍﺭي ﻭ ﻣﻨﻨﮋﻳﺖ ﻣﻲﺷﻮﻧﺪ. ﺩﺭ ﺳﻪ ﺩﻫﻪ ﮔﺬﺷﺘﻪ، ﻣﻮﺍﺭﺩ ﻣﺘﻌﺪﺩي ﺍﺯ ﻣﻘﺎﻭﻣﺖ ﺑﻪ ﻛﻮﺋﻴﻨﻮﻟﻮﻥ ﻭ ﻓﻠﻮﺭﻓﻨﻴﻜﻞ ﺩﺭ ﺍﻧﺴﺎﻥ ﻭ ﺩﺍﻡ ﮔﺰﺍﺭﺵ ﺷﺪﻩﺍﻧﺪ ﻭ ﻳﻜﻲ ﺍﺯ ﺩﻻﻳﻞ ﺑﺮﻭﺯ ﻣﻘﺎﻭﻣﺖ ﺩﺭ ﺍﻧﺴﺎﻥ ﺍﺳﺘﻔﺎﺩﻩ ﮔﺴﺘﺮﺩﻩ ﺍﻳﻦ ﺩﺍﺭﻭﻫﺎ ﺩﺭ ﻓﺎﺭﻡ­ﻫﺎي ﭘﺮﻭﺭﺷﻲ ﻃﻴﻮﺭ ﺫﻛﺮ گردید (11). الگوی‌ مقاومت‌ آنتی‌بیوتیکی‌ در مناطق‌ مختلف‌ و مقاطع‌ زمانی‌ متفاوت و حتی‌ در یک‌ ناحیه‌ ممکن‌ است‌ متفاوت باشد. این‌ تفاوت احتمالاً ناشی‌ از تفاوت در نوع، میزان و تداوم مصرف ترکیبات آنتی‌باکتریال است‌ (2) و ﺑﻴﺸﺘﺮ ﺍﻧﻮﺍﻉ ﻣﻘﺎﻭﻣﺖ ﺩﺍﺭﻭﻳﻲ ﺑﻪ ﺁﻧﺘﻲﺑﻴﻮﺗﻴﻚﻫﺎ ﺑﻪ ﺩﻧﺒﺎﻝ ﺗﻐﻴﻴﺮ ﺳﺎﺧﺘﺎﺭ ﮊﻧﺘﻴﻜﻲ ﺩﺭ ﺑﺎﻛﺘﺮيﻫﺎي ﻣﻘﺎﻭﻡ ﺑﺮﻭﺯ ﻣﻲﻛﻨﺪ. ﺍﻳﻦ ﻣﻘﺎﻭﻣﺖﻫﺎ ﻣﻲﺗﻮﺍﻧﻨﺪ ﺑﻪ ﺩﻭ ﺻﻮﺭﺕ ﻛﺮﻭﻣﻮﺯﻭﻣﻲ ﻭ ﻳﺎ ﺧﺎﺭﺝ ﻛﺮﻭﻣﻮﺯﻭﻣﻲ ﺑﺮﺭﺳﻲ ﺷﻮﻧﺪ ﺩﺭ ﺣﺪﻭﺩ ٩٠ ﺩﺭﺻﺪ ﻣﻘﺎﻭﻣﺖﻫﺎي ﻗﺎﺑﻞ ﻣﺸﺎﻫﺪﻩ ﺩﺭ ﻣﻮﺍﺭﺩ ﺩﺭﻣﺎﻧﮕﺎﻫﻲ ﺭﺍ ﻣﻘﺎﻭﻣﺖﻫﺎي ﺧﺎﺭﺝ ﻛﺮﻭﻣﻮﺯﻭﻣﻲ ﻭ ﻛﻤﺘﺮ ﺍﺯ ١٠ ﺩﺭﺻﺪ ﺭﺍ ﻣﻘﺎﻭﻣﺖﻫﺎي ﻛﺮﻭﻣﻮﺯﻭﻣﻲ ﺷﺎﻣﻞ ﻣﻲﺷﻮﻧﺪ (4). حال با این تفاسیر و اهمیت این بیماری در صنعت طیور و سلامت جامعه در مطالعه اخیر به تعیین و مقایسه فراوانی ژن­های مقاومت آنتی­بیوتیکی در اشریشیا کلی جدا شده از گوشت مرغ در فارم­های مبتلا به کلی باسیلوز و به ظاهر سالم پرداختیم. نتایج‌ حاصل‌ از این‌ مطالعه‌ می‌تواند در برنامه‌ریزی‌های‌ بهداشتی‌ و درمانی‌ در صنعت‌ طیور مورد استفاده­ی‌ سیاست‌گذاران این‌ بخش‌ قرار گیرد. 

مواد و روش­ها

جمع­آوری نمونه: در تابستان 1400، به مدت 6 ماه، 20 مرغداری واقع در استان اصفهان، که به شکل عادی پرورش جوجه گوشتی داشتند پایش شدند که از مجموع 20 فارم پرورشی 6 فارم در طول دوره پرورش سابقه ابتلا به بیماری کلی­باسیلوز داشتند و 14 فارم فاقد سابقه بیماری کلی­باسیلوز بودند. سپس در پایان دوره پرورش در محیط کشتارگاه از تمامی فارم­های با سابقه کلی­باسیلوز (6 فارم) و 10 فارم فاقد سابقه کلی­باسیلوز و مجموعا 16 فارم نمونه­گیری شد. به ازای هر فارم 10 قطعه پرنده به شکل تصادفی نمونه­گیری شد. نمونه­ها شامل یک قطعه عضله سینه مرغ بود که پس از تخلیه امعاء و احشا اقدام به نمونه­گیری شد. نمونه­ها در ظروف مجزا جمع­آوری شد و در کنار یخ منتقل گردید.

شناسایی اشریشیا کلی: به منظور شناسايي باكتري اشرشياكلي در نمونه مورد نظر با سواب يا انس استريل در كنار شعله با تلقيح بر روي نمونه مورد نظر بر روي محيط كشت مك كانگي بصورت خطي كشت داده مي‌شود و به مدت 24 ساعت در انكوباتور 37 درجه سانتي­گراد نگهداري مي­شود. در صورت رويت شدن پرگنه‌هاي لاكتوز مثبت (صورتي رنگ)، از پركنه‌هاي مشكوك بر روی محيط  EMBبصورت خطي كشت داده شده و به مدت 24 ساعت در دماي 24 درجه سانتي­گراد انكوبه مي‌شود. پرگنه‌هاي لاكتوز مثبت كه بر روي محيط EMB ايجاد جلاي سبز فلزي نموده­اند به صورت اوليه به­عنوان باكتري اشرشيا كلي شناسايي مي‌گردند. سپس بر روي اين پرگنه‌ها تست­هاي افتراقي IMVIC انجام مي‌شود. در صورتي­كه از لحاظ تست­هاي بيوشيميايي توليد ايندول، احياي متيل رد،VP  و احياي سيترات به صورت مثبت، مثبت، منفي، منفي باشند به­عنوان اشريشيا كلي شناسايي مي‌گردند (6).

تعیین مقاومت آنتی‌بیوتیکی: برای تعیین حساسیت باکتری جدا شده نسبت به داروهای آنتی­باکتریال رایج، از روش انتشار دیسکی ساده به روش استاندارد کربی بوئر استفاده شد. معمولا این روش بر اساس انتشار آنتی­بیوتیک بر روی محیط جامد و ممانعت از رشد باکتری حساس در محوطه حرکت استوار است.  در این آزمون از محیط کشت مولر هینتون آگار و دیسک­های آنتی­بیوتیکی شرکت پادتن طب ایران استفاده شد که شامل: انروفلوکساسین (5 میکروگرم/دیسک)، سولفانامید + تری­متوپریم، فلورفنیکل ( 30 میکروگرم/ بدیسک)، جنتامایسین (10 میکروگرم/دیسک)، اکسی­تتراسیکلین (30 میکروگرم/دیسک)، لینکواسپکتین (200/15 میکروگرم/دیسک)، داکسی­سیکلین (30 میکروگرم/ دیسک)، دیفلوکساسین (10 میکروگرم/ دیسک)، کلرامفنیکل (30 میکروگرم/دیسک)، نئومایسین (30 میکروگرم/دیسک)، کلستین (10 میکروگرم/دیسک)، آمپی­سیلین (10میکروگرم/دیسک)، آموکسی­سیلین (25 میکروگرم/دیسک) است. برای انجام آزمایش انتشار از دیسک، هر جدایه باکتری را بر روی محیط مک کانکی آگار به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگ­راد کشت داده شدند. سپس 4 تا 5 پرگنه از محیط مک­کانکی آگار به لوله آزمایش حاویTSB  منتقل و به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتی­گراد برای تهیه کدورت  5/0 مک فارلند انکوبه شدند. پس از آن با سواب استریل از سوسپانسیون باکتریایی 5/0 مک فارلند روی محیط مولر هینتون آگار کشت خطی داده شد. پس از گذشت تقریبا 10 دقیقه، دیسک­های آنتی­بیوتیکی بر روی محیط مولر هینتون تلقیح شده قرار داده شد و پلیت­ها به مدت 18 ساعت در دمای 35 درجه سانتی­گراد انگوبه گردیدند. سپس قطر هاله عدم رشد هر دیسک اندازه­گیری و در نهایت میزان مقاومت و حساسیت هر جدایه با مقایسه با استاندارد جهانی CLSI قرائت شد.

استخراج DNA: دراین بررسي DNA ازجدایه­هاي موردنظر به روش جوشانیدن و طبق پروتکل قبلی (7) استخراج شد. سپس ژنوم استخراج شده در فریزر منهاي 20 درجه سانتی­گراد ذخیره گردید.

مراحل انجام PCR: به­منظور شناسایی وضعیت مقاومت باکتریایی نسبت به آنتی­بیوتیک­های دسته فلوروکینولون­ها، سولفانامیدها و جنتامایسین، ژن­های مربوط به مقاومت نسبت به کوینولون­ها (qnr)، سولفانامیدها (Sul 1) و جنتامایسین (aac-3-IV) در نمونه های مورد بررسی مورد تکثیر قرار گرفت. واکنش PCR در حجم نهایی 25 میکرولیتر شامل 5/2 میکرولیتر PCR بافر X10، 5/1 میلی­مول کلرید منیزیم، 2/0 میلی­مول dNTP، 100 نانوگرم DNA الگو، 5/0 میکرومول از هر پرایمر، و یک واحد آنزیم Taq Polymerase در حجم نهایی 25 میکرولیتر آماده­سازی شد. واکنش PCR در دستگاه ترموسیکلر اپندورف آلمان انجام شد. برنامه دمایی واکنش  PCR به صورت واسرشت سازی اولیه در دمای 95 درجه برای 3 دقیقه، و 35 سیکل شامل واسرشت­سازی در دمای 94 درجه برای 60 ثانیه، هم­سرشت­سازی در دمای Anealing (جدول 1) برای90 ثانیه و گسترش در دمای 72 درجه برای 60 ثانیه به همراه گسترش نهایی در 72 درجه برای 10 دقیقه انجام شد. محصول PCR رنگ آمیزی شده با اتیدیوم بروماید بر روی ژل آگارز 5/1 درصد (3/0 گرم آگارز در 25 میلی لیتر بافر 1XTBE حل شد) الکتروفورز شد و با UV doc مشاهده و ثبت شد.

 

جدول 1- مشخصات پرایمرهای مورد استفاده در شناسایی ژن‌های مقاومت آنتی­بیوتیکی در اشریشیا کلی (11)

آنتی‌بیوتیک	ژن مقاومت	توالی	اندازه محصول	دمای همسرشت سازی
کینولون­ها	qnrA	F: GGGTATGGATATTATTGATAAAG R: CTAATCCGGCAGCACTATTTA	670	50
سولفانامیدها	Sul 1	F: TTCGGCATTCTGAATCTCAC R: ATGATCTAACCCTCGGTCTC	822	47
جنتامایسین	Aac(3)-IV	F: CTTCAGGATGGCAAGTTGGT R: TCATCTCGTTCTCCGCTCAT	286	55

 

نتایج

 

شناسایی اشریشیا کلی: سویه­ها از جهت خصوصیات کشت بر روی محیط مک­کانکی و EMB مورد بررسی قرار گرفتند و پس از تایید، تست­های بیوسیمیایی IMViC در مورد آنها انجام شد. از 100 نمونه اخذ شده از مرغ‌های بدون سابقه کلی­باسیلوز 40 سویه و از 60 نمونه با سابقه کلی­باسیلوز 42 سویه اشریشیا کلی جدا شد. تمامی 82 سویه مورد بررسی با ایجاد رنگ ارغوانی بر روی محیط کشت مک­کانکی و ایجاد جلای سبز فلزی بر روی EMB تایید اولیه شدند و تست IMViC را به صورت ایندول مثبت، MR مثبت، VP منفی و سیترات منفی نشان دادند.

مقاومت آنتی‌بیوتیکی: پس از تایید باکتری و انجام آنتی­بیوگرام، سویه­های جدا شده از مرغ‌های با سابقه کلی­باسیلوز کمترین مقاومت آنتی­بیوتیکی را نسبت به جنتامایسین (7 درصد) و بیشترین مقاومت را نسبت به تتراسایکلین (71 درصد) نشان دادند. در این بررسی 5/59 درصد این سویه­ها حداقل به دو آنتی­بیوتیک مقاومت نشان دادند و حدود 5/9 درصد سویه‌ها به تمامی 13 آنتی­بیوتیک مورد استفاده در تست آنتی­بیوگرام، مقاومت نشان دادند. نتایج آنتی بیوگرام در جدول 2 آمده است. 

ردیابی ژن­های مقاومت آنتی‌بیوتیکی: الکتروفورز محصول PCR سویه­های جدا شده از مرغ‌های با سابقه کلی­باسیلوز نشان داد 10 و 15 و یک سویه از 42 سویه مورد بررسی توانستند قطعات 822 (شکل 1)، 670 (شکل 2 ) و 286 ( شکل 3 ) جفت بازی را تکثیر کنند و به ترتیب، حامل ژن­های Sul1، qnrA و Act(3)-IV باشند. به­عبارتی 8/23 درصد سویه­ها حاوی ژن Sul1، 7/35 درصد سویه­ها حاوی ژن qnrA و 4/2 درصد سویه­ها حامل ژن Act(3)-IV بودند. در این بررسی 6/47 درصد سویه­های مقاوم به سولفانامید به­علاوه تری متوپریم (10 سویه از 21 سویه) حامل ژن Sul1 و 7/51 درصد سویه­های مقاوم به انروفلوکساسین (15 سویه از 29 سویه) حامل qnrA و 33 درصد سویه­های مقاوم به جنتامایسین (یک سویه از 3 سویه) حامل Act(3)-IV بودند. در این بررسی هیچ سویه­های یافت نشد که حامل ژن­های مقاومت باشد اما از نظر فنوتیپی مقاومت آنتی­بیوتیکی را نشان ندهد اما سویه­هایی که از نظر فنوتیپی مقاوم شناخته شدند همگی واجد ژن­های مقاومت نبودند. به­عبارتی 11 سویه از 21 سویه مقاوم به ترکیبات سولفانامیدی (4/52 درصد)، 14 سویه از 29 سویه مقاوم به انروفلوکساسین (3 /48 درصد ) و 2 سویه مقاوم به جنتامایسین (6/66 درصد) از نظر فنوتیپی مقاوم بودند اما حامل ژن­های مورد بررسی نبودند.

 

جدول 2- درصد مقاومت آنتی‌بیوتیکی در سویه‌های اشریشیا کلی جدا شده از مرغ‌های با سابقه (الف) و بدون سابقه کلی باسیلوز (ب)

آنتی‌بیوتیک	الف (42 سویه)		ب (40 سویه)
	درصد	فراوانی	درصد	فراوانی
انروفلوکساسین	69	29	20	8
سولفانامید+ تری­متوپریم	50	21	10	4
فلورفنیکل	8/42	18	10	4
تتراسایکلین	4/71	30	15	6
آمپی سیلین	5/59	25	5	2
جنتامایسین	1/7	3	0	0
نئومایسین	5/59	25	20	8
لینکواسپکتین	5/28	12	10	4
اکسی تتراسایکلین	2/64	27	10	4
کلرامفنیکل	7/35	15	10	4
کلستین	1/57	24	15	6
دیفلوکساسین	3/33	14	5/12	5
داکسی سیکلین	2/45	19	5/12	5

 

 

جدول 3- فراوانی ژن­های مقاومت در سویه­های اشریشیا کلی جدا شده از مرغان با سابقه کلی­باسیلوز طیور

ژن هدف	Sul1	qnrA	Aac(3)-IV
درصد ردیابی (42 = n)	8/23 درصد (10 سویه)	7/35 درصد (15 سویه)	4/2 درصد (1 سویه)
درصد ردیابی در سویه­های مقاوم به سولفانلمید+ تری متوپریم (21 = n)	6/47 درصد (10 سویه)	-	-
درصد ردیابی در سویه­های مقاوم به انروفلوکساسین (29 = n)	-	7/51 درصد (15 سویه)	-
درصد ردیابی در سویه­های مقاوم به جنتامایسین (3 = n)	-	-	2 درصد (1 سویه)

 

 

        

 

شکل 1- الکتروفورز محصول PCR مربوط به تکثیر ژن Sul1 (ستون 1 تا 6: نمونه­های مثبت 822 جفت بازی، ستون 7: مارکر، ستون 8: کنترل منفی).

 

شکل 2- الکتروفورز محصول PCR مربوط به تکثیر ژن  qnrA(M: مارکر، ستون 1 تا 3: نمونه­های مثبت 670 جفت بازی، ستون 4: کنترل منفی)

 

شکل 3- الکتروفورز محصول PCR مربوط به تکثیر ژن Aac(3)-IV (M: مارکر، ستون 1: نمونه مثبت 286 جفت بازی، ستون 2: کنترل منفی).

بحث

 

كلي­باسيلوز يكي از عوامل اصلي مرگ و مير در گله­هاي طيور مي­باشد كه به منظور كنترل آن آنتي­بيوتيك­هاي وسيع الطيف استفاده مي­گردد كه اين اقدام باعث افزايش راندمان مواد غذايي و افزايش وزن­گيري مي­شود. در استفاده طولاني مدت آنتي­بيوتيك­ها، تنوع و درجات وسيعي از مقاومت آنتي­بيوتيكي در گونه­هاي مختلف باكتري ايجاد مي­گردد كه در نهايت منجر به عدم كارايي آنتي­بيوتيك­هاي رايج مي­گردد (13). در این‌ مطالعه‌ کمترین مقاومت آنتی­بیوتیکی را نسبت به جنتامایسین (7 درصد) و بیشترین مقاومت را نسبت به تتراسایکلین (71 درصد) نشان دادند. در این بررسی 5/59 درصد این سویه­ها حداقل به دو آنتی­بیوتیک مقاومت نشان دادند و حدود 5/9 درصد سویه‌ها به تمامی 13 آنتی­بیوتیک مورد استفاده در تست آنتی بیوگرام، مقاومت نشان دادند. در این راستا. در مطالعه‌ رجائیان و همکاران نیز که‌ لاشه‌های‌ طیور گوشتی‌ اطراف شیراز را مورد بررسی‌ قرار دادند، بیش‌ترین‌ حساسیت‌ نسبت‌ به‌ تتراسایکلین ‌ گزارش کردند (21).  اگر چه‌ همان طور که‌ اشاره شد الگوی‌ مقاومت‌ میکروبی‌ جدایه‌های‌ مناطق‌ مختلف‌ ممکن‌ است‌ با یکدیگر متفاوت باشد اما نتایج‌ حاصل‌ از مطالعه‌ حاضر با نتایج‌ نامبردگان تا حدی‌ مطابقت‌ دارد. حقیقی خشخو و علی‌نژاد در سال ١٣٨٨ در نمونه‌های‌ جدا شده از موارد کلی‌ باسیلوز طیور استان تهران، بیشترین مقاومت‌ را به‌ نالیدیکسیک‌اسید، اریترومایسین‌، آمپی‌سیلین‌، کلستین‌، تتراسیکلین‌ گزارش نمودند (10).  اگرچه‌ همان­طور که‌ اشاره شد الگوی‌ مقاومت‌ میکروبی‌ جدایه‌های‌ مناطق‌ مختلف‌ ممکن‌ است‌ با یکدیگر متفاوت باشد (5) اما سایر مطالعات در ایران مربوط به‌ استان­هاي فارس، تهران، خوزستان و آذربایجان شرقی‌ نشان می­دهد که‌ این‌ الگو تا حدود زیادي مشابه‌ است‌ و نشان از توسعه‌ مقاومت‌ آنتی­بیوتیکی‌ در سویه‌­هاي اشریشیا کلی‌ دارد. در همین‌ رابطه‌، جعفري و همکاران (١٣٩٤) بیشترین‌ مقاومت‌ آنتی‌­بیوتیکی‌ را در جدایه‌­هاي اشریشیا کلی‌ طیور در اهواز با ٩٠ درصد مقاومت‌ نسبت‌ به‌ انروفلوکساسین‌ مشاهده کردند (12). Diarra و همكاران (٢٠٠٧) در بررسي مقاومت آنتي­بيوتيكي ٧٩١ جدايه­هاي اشريشيا كلي همزيست بدست آمده از جوجه گوشتي در طي ٥٣ روز تحت تيمار با انواع محرک رشد مشاهده كردند كه تقريباً تمام جدايه­ها درجات متفاوتي از مقاومت به چند آنتي­بيوتيك را نشان دادند. همچنين ميزان مقاومت به تتراسايكلين را ٥/٨٦ درصد گزارش كردند كه داراي بيشترين فراواني بود. همچنين حدود نيمي از جدايه­ها به آموكسي­سيلين، سفتيوفور، اسپكتينومايسين و همچنين سولفاناميد مقاومت نشان دادند (3). رفیعی‌ و همکاران (٢٠٠٣) در تهران بیشترین‌ مقاومت‌ را مربوط به‌ تتراسایکلین ‌(٩٤ درصد) و سپس‌ سولتریم‌ (٥٦ درصد) و انروفلوکساسین‌ با ٤٤ درصد گزارش کردند (20). زهرایی صالحی‌ و همکاران ( ٢٠٠٦) در تبریز نیز بیشترین‌ مقاومت‌ را نسبت‌ به‌ داکسی‌ سایکلین‌ گزارش کردند (٨٨ درصد) اما مقاومت‌ در برابر انروفلوکساسین‌ نیز با ٧٦ درصد در رده سوم قرار داشت (25)‌. مصرف گسترده انروفلوکساسین‌ به‌ تنهایی‌ و مصرف هم‌ زمان با برخ ی‌ از خانواده­هاي آنتی‌بیوتیکی‌ می‌تواند دلیل‌ این‌ مقاومت‌ بالا باشد که‌ در فارم­هاي پرورش طیور در سراسر ایران مورد استفاده قرار می­گیرد. علاوه بر آن، مطالعات خارج از کشور نیز نشان می‌دهد که‌ این‌ آنتی‌بیوتیک‌ در سایر کشورها نیز از مقاومت‌ بالایی‌ برخوردار است‌ و بیشترین‌ درصد مقاومت‌ را به‌ خود اختصاص داده است‌. در بررسی‌ Gregova و همکاران (٢٠١٢) در اسلواکی ‌(9) و یانگ‌ و همکاران (٢٠٠٤) در چین ‌(24) نیز بیشترین‌ مقاومت‌ در جدایه‌هاي اشریشیا کلی‌ طیور نسبت‌ به‌ انروفلوکساسین‌ گزارش شده است‌. وجود مقاومت‌ بالاي آنتی‌­بیوتیکی‌ نسبت‌ به‌ انروفلوکساسین‌، سولفونامید به‌ همراه متوپریم‌، فلورفنیکل‌ و داکسی­سایکلین‌ می‌تواند به‌ دلیل‌ استفاده متداول از این‌ آنتی‌­بیوتیک‌­ها در کنترل بیماري کلی‌­باسیلوز باشد که‌ تجویز پی‌درپی‌ این‌ آنتی‌­بیوتیک‌­ها بعضاً بدون انجام تست‌هاي حساسیت‌ آنتی‌بیوتیکی‌ باعث‌ ظهور و گسترش میکروارگانیسم­هاي مقاوم به‌ این‌ آنتی‌­بیوتیک­ها شده است‌. از آن جایی‌ که‌ که‌ ژن­هاي مقاومت‌ آنتی­بیوتیکی‌ در گسترش مقاومت‌ در بین‌ میکروارگانیسم‌ها نقش‌ عمده­اي دارند و اخیراً براي شناسایی‌ سویه‌­هاي مقاوم بیشتر مورد توجه‌ قرار گرفته‌ است‌، الکتروفورز محصول PCR این مطالعه سویه­های جدا شده از مرغ‌های با سابقه کلی­باسیلوز نشان داد 10 و 15 و یک سویه از 42 سویه مورد بررسی به ترتیب، حامل ژن­های Sul1، qnrA و Act(3)-IV بودند. به­عبارتی 8/23 درصد سویه­ها حاوی ژن Sul1، 7/35 درصد سویه­ها حاوی ژن qnrA و 4/2 درصد سویه­ها حامل ژن Act(3)-IV بودند. در این بررسی 6/47 درصد سویه­های مقاوم به سولفانامید به­علاوه تری متوپریم (10 سویه از 21 سویه) حامل ژن Sul1 و 7/51 درصد سویه­های مقاوم به انروفلوکساسین ( 15 سویه از 29 سویه) حامل qnrA و 33 درصد سویه­های مقاوم به جنتامایسین (یک سویه از 3 سویه) حامل Act(3)-IV بودند. در این بررسی هیچ سویه­های یافت نشد که حامل ژن­های مقاومت باشد اما از نظر فنوتیپی مقاومت آنتی­بیوتیکی را نشان ندهد اما سویه­هایی که از نظر فنوتیپی مقاوم شناخته شدند همگی واجد ژن­های مقاومت نبودند. به­عبارتی 11 سویه از 21 سویه مقاوم به ترکیبات سولفانامیدی (4/52 درصد)، 14 سویه از 29 سویه مقاوم به انروفلوکساسین (3 /48 درصد ) و 2 سویه مقاوم به جنتامایسین (6/66 درصد) از نظر فنوتیپی مقاوم بودند اما حامل ژن­های مورد بررسی نبودند. در همین راستا در مطالعات قبلی‌ در خصوص بررسی‌ ژن‌هاي مقاومت‌ در برابر سولفانامیدها، مجاور‌ رستمی و همکاران (١٣٩٦) میزان مقاومت‌ به‌ سولفادیازین‌ را در سویه‌­هاي اشریشیا کلی‌ جدا شده از موارد کلی‌­باسیلوز جوجه‌­هاي گوشتی‌ در ارومیه‌ حدود ٤٥ درصد گزارش کردند و بیان کردند که‌ حدود ٥٧ درصد از جدایه­هاي اشریشیا کلی‌ داراي ژن sul و ٥ جدایه‌ که‌ حامل‌ ژن sul بودند نسبت‌ به‌ سولفانامید مقاومت‌ نشان ندادند (14). نتایج‌ مطالعه‌ اخیر با مطالعه‌ مجاور‌ و همکاران در این‌ خصوص هم‌­خوانی‌ دارد.  Soufi و همكارن (2011) در بررسي ژن­هاي مقاومت در گوشت ماكيان گزارش كردند كه در ١٦٦ جدايه اشريشيا كلي بدست آمده از گوشت ماكيان ٢٨ جدايه حامل ژن tet A/B و همچنين ٨٦ جدايه حامل ژن 1sul و ٧٣ جدايه از اين ٨٦ جدايه واجد اينتگرون كلاس 1 حامل ژن 1sul بودند. همچنين اين اينتگرون حامل 2sul و 3sul نيز بودند كه نشان می­دهد اشريشيا كلي جدا شده از غذاي انسان به­عنوان مخزني از ژن­هاي مقاومت آنتي­بيوتيكي و حامل ژن­هاي مقاومت سولفاناميد و اينتگرون­ها به شمار مي­رود (23).

Ponce-Rivas و همكاران (2012) نشان دادند که حدود ۵۲ درصد از جدایه‌های اشریشیا کلی واجد ژن qnrA بوده و در مجموع حدود ۷3 درصد از جدایه‌ها یکی از ژن‌های مقاومت کوینولون را دارا بودند که در بسیاری از جدایه‌ها ژن‌های qnr همراه با کلاس یک اینتگرون ردیابی نمودند (19). مطالعات گسترده­اي در نقاط مختلف جهان از جمله ايران بر سويه­هاي اشريشيا كلي طيور و مقاومت آنتي­بيوتيكي در آنها انجام شده است. در اين مطالعه روش كار به­گونه­اي برنامه­ريزي شد تا بتوان از نتايج بدست آمده براي مطالعات اپيدميولوژيك و بررسي­هاي تكميلي سرولوژيكي و ژنوتيپي در آينده استفاده گردد، تا بتوان سياست پيشگيري و درماني مناسبي در منطقه اتخاذ نمود. الگوي مقاومت دارويي در مناطق مختلف و مقاطع زماني متفاوت و حتي در يك ناحيه ممكن است متفاوت باشد كه مي­تواند ناشي از تفاوت در نوع، ميزان و تداوم مصرف تركيبات آنتي­بيوتيك­ها باشد. با اين وجود الگوي مقاومت دارويي يك نشانگر مفيد براي جدايه­هاي باكتريايي يك منطقه به شمار مي­رود (22). گزارشات در رابطه با افزايش مقاومت سويه­هاي پاتوژن اشريشيا كلي نسبت به تركيبات آنتي­باكتريال در حال افزايش است و الگوي مقاومت دارويي نواحي مختلف جغرافيايي نيز متنوع و در حال تغيير مي­باشد (5). بطوركلي پلاسميدها، مقاومت آنتي­بيوتيكي را به باكتري­ها اعطا مي­كنند. عوامل R يا پلاسميدها حامل ژن­هايي هستند كه كد كننده آنزیم­هاي تخريب كننده يا تغييردهنده آنتي­بيوتيك­ها مي­باشند. برخي از اين پلاسميدها فقط يك ژن مقاومت را دارا هستند در حال كه تعدادي از آنها قادرند تا هشت ژن مقاومت را عليه داروها با خود حمل كنند. اغلب ژن­هاي مقاومت دارويي درون ترانسپوزن­ها قرار دارند و از اين­رو برخي از سويه­هاي باكتريايي همچون اشريشيا كلي قادرند پلاسميدهاي مقاومت چندگانه را به سرعت توليد كنند. به­عبارتي ديگر پلاسميدهاي مقاومت چندگانه دارويي از تجمع ترانسپوزن در يك پلاسميد منتج مي­شوند و چون ترانسپوزن­ها بين پلاسميدها و كروموزوم­هاي اوليه تردد مي­كنند، ژن­هاي مقاومت دارويي مي­توانند بين اين نواحي به راحتي جابجا شوند كه در نهايت منجر به گسترش بيشتر مقاومت دارويي مي­گردد. از اين رو، بي­ترديد حضور پلاسميدهاي مقاومت چند گانه در باكتري­هايي همچون اشريشيا كلي، درمان بيماري را با مشكلات جدي­تري مواجه مي­سازد (17). دستگاه گوارش ماكيان نيز محيطي مناسب براي انتقال ژن­هاي كدكننده مقاومت دارويي از جدايه­هاي مقاوم به جدايه­هاي حساس اشريشيا كلي مي­باشد، كه مي­تواند دليل افزايش مقاومت در مزارع با مصرف آنتي­بيوتيك و نيز در مزارع فاقد مصرف آنتي­بيوتيك باشد كه ممكن است ناشي از كلونيزاسيون جوجه­ها با اشريشيا كلي مقاوم محيطي باشد و يا اينكه در نتيجه فشار انتخابي و رشد بيش از حد سويه­هايي باشد كه پيش از ورود جوجه به مزرعه دردستگاه گوارش آنها حضور داشته­اند (16).

نتیجه­گیری

بنابراین‌ بررسی‌ الگوی‌ مقاومت‌ در مناطق‌ و زمان­های‌ مختلف‌ جهت‌ اخذ سیاست‌های‌ مناسب‌ ضروری‌ به‌ نظر می‌رسد. همچنین‌ با روند روبه‌ گسترش مقاومت‌های‌ آنتی‌­بیوتیکی‌ لازم است‌ با رعایت‌ اصول مناسب‌ تغذیه‌ و بهداشت‌ نظیر استفاده از شیوه­های‌ مدیریتی‌ مناسب‌ مانند انتخاب جوجه‌ی‌ سالم‌، تغذیه‌ مناسب‌، بهسازی‌ بستر، معدوم سازی‌ جوجه­های‌ مبتلا و جلوگیری‌ از ورود بیماری‌ به‌ فارم و همچنین‌ واکسیناسیون به‌موقع‌ از ابتلا طیور به‌ بیماری‌های‌ عفونی‌ تا حد زیادی‌ جلوگیری‌ کرد تا به‌ طبع‌ آن از مصرف آنتی‌بیوتیک‌های‌ مختلف‌ کاسته‌ شده و به‌ سمت‌ تولید فراورده­های‌ بدون آنتی‌بیوتیک‌ گام برداریم‌.

تقدیر و تشکر

از تمامی کسانی که در نمونه گیری و انجام آزمایشات مساعدت داشتند کمال تشکر و قدردانی به عمل می­آید.

منابع

1.       Ansari Cheharsughi M. S., Ahmadi-Dastgerdi A., Gholami-Ahangaran M. 2020. Antibacterial effect of Capparis spinosa (Capparis spinosa) and Pistacia atlantica (Pistacia atlantica) extracts on growth of Escherichia coli in vitro and in vivo. Iranian Veterinary Clinical Pathology, 14(54):115-126.

2.       Dehghani G.S., Gholami-Ahangaran M., Rahimi E. 2017. The comparison of Escherichia coli contamination rate in meat of conventional and without antibiotic chickens. Iranian Journal of Food Microbiology, 4(3):93-100.

3.       Diarra Moussa S., Fred G., Silversides F., Diarrassouba J., Pritchard L., Masson R., Brousseau C. 2007. Impact of feed supplementation with antimicrobial agents on growth performance of broiler chickens, Clostridium perfringens and enterococcus counts, and antibiotic resistance phenotypes and distribution of antimicrobial resistance determinants in Escherichia coli isolates. Applied Environmental Microbiology, 73(20):6566-6576.

4.       Emond-Rheault J., Jérémie Hamel J., Jeukens L., Freschi I., Kukavica-Ibrulj B., Boyle S. 2020. The Salmonella enterica plasmidome as a reservoir of antibiotic resistance. Microorganisms, 8(7):1016.

5.       Ghaniei A., Mojaverrostami S., Lotfallahzadeh B., Darzi Lemraski M., Sepehrnia P., Imani Jajarmi A. 2014. Geographical and seasonal variation in antimicrobial susceptibility of Escherichia coli isolated from broiler chicken carcasses in Iran. European Journal of Experimental Biology, 4:173-177.

6.       Gholami-Ahangaran M., Zia-Jahromi N. 2014. Identification of shiga toxin and intimin genes in Escherichia coli detected from canary (Serinus canaria domestica). Toxicologiy and Industrial Health, 30(8):724-727.

7.       Gholami-Ahangaran M., Ahmadi-Dastgerdi A., Karimi-Dehkordi M. 2020. Thymol and carvacrol: as antibiotic alternative in green healthy poultry production. Planta Biotechnology Persa, 2(1):22-25.

8.       Gholami-Ahangaran M., Moravvej A.H., Safizadeh Z., Sadeghi Nogoorani V., Zokaei M., Ghasemian S.O. 2021. The evaluation of ESBL genes and antibiotic resistance rate in Escherichia coli strains isolated from turkey meat and intestinal contents in Isfahan, Iran. Iranian Journal of Veterinary Research, 22(4):318- 325.

9.       Gregova G., Kmetova M., Kmet V., Venglovsky J., Feher A. 2012. Antibiotic resistance of Escherichia coli isolated from a poultry slaughterhouse. Annals of Agricultural Environmental Medicine, 19:75-77.

10.        Haghighi Khoshkhoo P., Ali-Nezhad I. 2010. Antibacterial Resistance Patterns of Escherichia coli isolated from Broilers Colibacillosis of Broilers chicks in Golestan Province. Iranian Journal of Veterinary Clinical Research, 1(1):39-47.

11.        Horri M., Gholami-Ahangaran M. 2022. Phenotypic and Genotypic Characterization of Antibiotic Resistance in Escherichia coli Strains Isolated from Broiler Chickens with Suspected Colibacillosis in Isfahan Province, Iran. Infection Epidemiology and Microbiology, 8(3):193-201.

12.        Jafari R., Ghanbarpour R., Ghorbanpour Najaf Abadi M., Mayahi M., Amani A. 2015. Determination of antibiotic resistance patterns in Escherichia coli isolated from healthy and colisepticemic broiler chickens in Ahvaz. Iranian Journal of Veterinary Microbiology,11(2):109-117 [In Persian].

13.        Kilonzo-Nthenge A., Samuel N., Nahashon F., Nathaniel A. 2008. Prevalence and antimicrobial resistance of pathogenic bacteria in chicken and guinea fowl. Poultry Sciences, 87(9):1841-1848.

14.        Mojaver Rostami S., Ghaniei A., Mohammadi V. 2018. Phenotypic and genotypic resistance of Escherichia coli isolated from broiler chickens of Urmia to sulfonamides. Iranian Veterinary Journal, 13(4):86-91.

15.        Nolan L.K., Vaillancourt J., Barbieri N.L., Logue C.M. 2020. Colibacillosis. In: Swayne, DE; Boulianne, M; Logue, CM; McDougald, LR; Nair, V and Suarez, DL (Eds.), Disease of Poultry. (14th Edn.), Massachusetts, W.B. Publishing. PP. 770-790.

16.        Ozaki H., Hidetake E., Kouhei T., Akira I., Yasutaka N., Azusa S., Norio H., Toshiyuki M. 2011. Antimicrobial resistance in fecal Escherichia coli isolated from growing chickens on commercial broiler farms. Veterinary Microbiology, 150(1-2):132-139.

17.        Prescott L.M., Harley J.P., Klein K.A. 2002. Microbiology, 5th Ed., McGraw-Hill company, UK, pp: 53-66.

18.        Privalsky M., Alexander M. Soohoo J., Wang T., Gerard D., Wright M., Gordon S., Gray Chaitan K. 2021. Prospects for antibacterial discovery and development. Journal of American Chemical Society, 143(50):21127-21142.

19.        Ponce-Rivas E., Muñoz-Márquez M. E., Khan A. A. 2012. Identification and molecular characterization of class 1 integrons in multiresistant Escherichia coli isolates from poultry litter. Applied Environmental Microbiology, 78(15):5444-5447.

20.        Rafiei Tabatabaei R., Nasirian A. 2003. Isolation, identification and antimicrobial resistance patterns of Escherichia coli isolated from chicken flocks. Iranian Journal of Pharmacological Therapeytics, 2:39-42.

21.        Rajaeian H., Firouzi R., Jalaei J., Heydari D.F. 2003. Antibiotic resistance of several common bacterial species isolated from chickens in Shiraz area. Iranian Journal of Veterinary Research, 58(3):223-226.

22.        Shahiri M., Gholami-Ahangaran M., Rahimi E. 2018. The comparing of antibiotic resistance pattern in Escherichia coli isolates from chicken meat that reared under conventional and without antibiotic condition. Iranian Journal of Food Microbiology, 5(2):11-18.

23.        Soufi L., Sáenz Y., Vinué L., Abbasi MS., Ruiz E., Zaragaza M. 2011. Escherichia coli of poultry food origin as reservoir of sulphonamide resistance genes and integrons. International Journal of Food Microbiology, 144:497-502.

24.       Yang H., Chen S., White D.G., Zhao S., McDermott P., Walker R. 2004. Characterization of multiple antimicrobial resistant Escherichia coli isolates from diseased chickens and swine in China. Journal of Clinical Microbiology, 42:3483-3489.

25.        Zahraei Salehi T., Farashi Bonab S. 2006. Antibiotics susceptibility pattern of Escherichia coli strains isolated from chickens with colisepticemia in Tabriz province, Iran. International Journal of Poultry Sciences, 5:677-684.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

The Determination and Comparing of Antibiotic Resistance in Escherichia coli Isolated from Chicken Meat with Colibacillosis and Apparently Healthy Flocks

 

Hanieh Shafei 1, Majid Gholami-Ahangaran1*, Asiye Ahmadi Dastgerdi2

 

1.       Department of Veterinary Medicine, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran

2.       Department of Food Science and Technology, Ardestan Branch, Islamic Azad University, Ardestan, Iran

*Correspondence Author Email: [e-mail]

 

Abstract

Colibacillosis is one of the most important diseases caused by Escherichia coli (E. coli), which causes a lot of economic damage to the poultry industry. Considering the increasing spread of antibiotic resistance in this bacterium and the emergence of resistant strains of E. coli, this study was conducted with the aim of determining the pattern of antibiotic resistance in E. coli strains isolated from chicken carcasses referred to veterinary diagnostic laboratories in Isfahan province. In this study, for detecting of resistance genes to fluoroquinolones and sulfonamides, 50 bacterial strains were isolated from broiler chickens with pericarditis and perihepatitis and E. coli colonies were confirmed by microbial and biochemical tests. Then, the resistance of the strains to the commercial antibiotics (enrofloxacin and sulfonamide + trimethoprim) was evaluated by the conventional antibiogram method. In addition, the bacterial genome was extracted by boiling method and the qnrA and sul1 genes were amplified with specific primers to evaluate antibiotic resistance against fluoroquinolones and sulfonamides. After confirming the bacteria and performing an antibiogram, the strains isolated from chickens with a history of colibacillosis showed the lowest antibiotic resistance to gentamicin (7%) and the highest resistance to tetracycline (71%). In this study, 59.5% of these strains showed resistance to at least two antibiotics, and about 9.5% of the strains showed resistance to all 13 antibiotics used in the antibiogram test. Also, the electrophoresis of the PCR product of the strains isolated from chickens with a history of colibacillosis showed that 10 and 15 and one strain out of the 42 investigated strains were able to amplify fragments of 822, 670 and 286 base pairs, respectively, carrying the gene Sul1, qnrA and Act (3)-IV. In other words, 23.8% of strains contained Sul1 gene, 35.7% of strains contained qnrA gene and 2.4% of strains carried Act (3)-IV gene. 

 

Keywords: Escherichia coli, Chicken meat, Resistance genes, Antibiogram.

 

 

298