ارزیابی فعالیت ضد میکروبی اسانس گیاه بادرنجبویه (Melissa officinalis) روی باکتری های غذازاد
محورهای موضوعی : آلودگی میکروبی مواد غذائی
سلمان حیدریان
1
,
مهرداد عطایی کچویی
2
,
صادق موسوی فرد
3
,
فریبرز معطر
4
1 - گروه گیاهان دارویی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران
2 - گروه گیاهان دارویی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران.
3 - گروه علوم باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه لرستان، خرم آباد، ایران
4 - گروه فارماکولوژی، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
کلید واژه: اسانس, بادرنجبویه, اثرات ضد میکروبی, باکتری های غذازاد,
چکیده مقاله :
بادرنجبویه گیاهی طبی با خصوصیات ضدمیکروبی است. مطالعه حاضر به منظور ارزیابی اثرات ضدمیکروبی اسانس بادرنجبویه روی باکتری های غذازاد انجام پذیرفت. اندام هوایی بادرنجبویه تهیه و پس از تایید توسط کارشناسان برای تهیه اسانس استفاده شد. قطر هاله عدم رشد باکتری های لیستریا مونوسایتوژنز، سالمونلا تیفی موریوم، اشریشیا کلی و استافیلوکوکوس اورئوس با استفاده از روش دیسک گذاری ارزیابی و با آنتی بیوتیک ها مقایسه شد. حداقل غلظت ممانعت کننده از رشد (MIC) و حداقل غلظت کشندگی (MBC) اسانس بادرنجبویه روی باکتری های مورد نظر ارزیابی شد. Citronellal (4/14 درصد) و Caryophyllene oxide (11 درصد) مهم ترین ترکیبات شناسایی شده بودند. قطر هاله عدم رشد باکتری ها در برابر اسانس بادرنجبویه رنجی معادل 42/0 ± 93/3 تا 17/1 ± 23/15 میلی متر داشتند. استفاده از غلظت 4 میلی گرم/میلی لیتر از اسانس بادرنجبویه سبب ایجاد بیشترین قطر هاله عدم رشد استافیلوکوکوس اورئوس (27/0 ± 70/14 میلی متر)، اشریشیا کلی (29/0 ± 33/10 میلی متر) و سالمونلا تیفی موریوم (52/0 ± 18/10 میلی متر) شد. اثرات ضد میکروبی اسانس بادرنجبویه وابسته به دوز بود (05/0 P<). کمترین و بیشترین میزان MIC و MBC اسانس بادرنجبویه برای استافیلوکوکوس اورئوس (به ترتیب 25/1 و 5/2) و سالمونلا تیفی موریوم (به ترتیب 10 و 20) بدست آمد. قطر هاله عدم رشد باکتری های تیمار شده با اسانس بادرنجبویه در مقایسه با بسیاری از آنتی بیوتیک ها، بیشتر اما از ونکومایسین کمتر بود. اسانس بادرنجبویه می تواند به عنوان یک ماده با خصوصیات ضدمیکروبی خصوصا در فیلم های خوراکی استفاده شود.
Melissa officinalis is a medicinal plant with high antimicrobial properties. The present study was performed to evaluate the antimicrobial effects of Melissa officinalis essential oil on food-borne bacteria. Melissa officinalis aerial parts were prepared and after approval by experts used to prepare essential oils. The diameter of the growth inhibition zone of Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Escherichia coli and Staphylococcus aureus was assessed using disk diffusion and compared with antibiotics. The minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum bacterial concentration (MBC) of Melissa officinalis essential oil were evaluated on the target bacteria. Citronellal (14.4%) and Caryophyllene oxide (11%) were the most important compounds identified in Melissa officinalis essential oil. The diameter of the growth inhibition zone of the bacteria against Melissa officinalis essential oil ranged from 3.93±0.42 to 15.23±1.17 mm. Application of 4 mg/ml concentration of Melissa officinalis essential oil caused the largest diameter of the growth inhibition zone of Staphylococcus aureus (14.70±0.27 mm), Escherichia coli (10.33±0.29 mm) and Salmonella typhimurium (10.18±0.52 mm). The antimicrobial effects of Melissa officinalis essential oil were dose-dependent (P <0.05). The lowest and highest levels of MIC and MBC of Melissa officinalis essential oil were obtained for Staphylococcus aureus (1.25 and 2.5, respectively) and Salmonella typhimurium (10 and 20, respectively). The diameter of the growth inhibition zone of bacteria treated with Melissa officinalis essential oil was higher than that of many antibiotics, but lower than that of vancomycin. Melissa officinalis essential oil can be used as a substance with antimicrobial properties, especially in food films.
_||_
ارزیابی فعالیت ضد میکروبی اسانس گیاه بادرنجبویه (Melissa officinalis) روی باکتری های غذازاد
عنوان کوتاه: اثرات ضد میکروبی اسانس بادرنجبویه روی باکتریهای غذازاد.
چکیده
بادرنجبویه گیاهی طبی با خصوصیات ضدمیکروبی است. مطالعه حاضر به منظور ارزیابی اثرات ضدمیکروبی اسانس بادرنجبویه روی باکتری های غذازاد انجام پذیرفت. اندام هوایی بادرنجبویه تهیه و پس از تایید توسط کارشناسان برای تهیه اسانس استفاده شد. قطر هاله عدم رشد باکتری های لیستریا مونوسایتوژنز، سالمونلا تیفی موریوم، اشریشیا کلی و استافیلوکوکوس اورئوس با استفاده از روش دیسک گذاری ارزیابی و با آنتی بیوتیک ها مقایسه شد. حداقل غلظت ممانعت کننده از رشد (MIC) و حداقل غلظت کشندگی (MBC) اسانس بادرنجبویه روی باکتری های مورد نظر ارزیابی شد. Citronellal (4/14 درصد) و Caryophyllene oxide (11 درصد) مهم ترین ترکیبات شناسایی شده بودند. قطر هاله عدم رشد باکتری ها در برابر اسانس بادرنجبویه رنجی معادل 42/0 ± 93/3 تا 17/1 ± 23/15 میلی متر داشتند. استفاده از غلظت 4 میلی گرم/میلی لیتر از اسانس بادرنجبویه سبب ایجاد بیشترین قطر هاله عدم رشد استافیلوکوکوس اورئوس (27/0 ± 70/14 میلی متر)، اشریشیا کلی (29/0 ± 33/10 میلی متر) و سالمونلا تیفی موریوم (52/0 ± 18/10 میلی متر) شد. اثرات ضد میکروبی اسانس بادرنجبویه وابسته به دوز بود (05/0 P<). کمترین و بیشترین میزان MIC و MBC اسانس بادرنجبویه برای استافیلوکوکوس اورئوس (به ترتیب 25/1 و 5/2) و سالمونلا تیفی موریوم (به ترتیب 10 و 20) بدست آمد. قطر هاله عدم رشد باکتری های تیمار شده با اسانس بادرنجبویه در مقایسه با بسیاری از آنتی بیوتیک ها، بیشتر اما از ونکومایسین کمتر بود. اسانس بادرنجبویه می تواند به عنوان یک ماده با خصوصیات ضدمیکروبی خصوصا در فیلم های خوراکی استفاده شود.
کلمات کلیدی: بادرنجبویه، اسانس، اثرات ضد میکروبی، باکتری های غذازاد.
مقدمه
باکتری های منتقله از طریق مواد غذایی که اغلب به عنوان عوامل بروز بیماری های غذازاد در نظر گرفته می شوند، در سال های اخیر منجبر به بروز طیف وسیعی از همه گیری های منجبر به مرگ و بستری شدن بیماران و خسارات اقتصادی فراوان شده اند (Pires et al., 2021). نگرانی دیگر از حضور این دسته از باکتری ها در مواد غذایی، امکان انتقال مقاومت های آنتی بیوتیکی از طریق غذا به حوامع بشری می باشد که موجب افزایش نگرانی ها در این ارتباط شده است (Hashempour-Baltork et al., 2019). از بین باکتری های عامل بروز مسمومیت ها و عفونت های غذایی، استافیلوکوکوس اورئوس، اشریشیا کلی، سالمونلا تیفی موریوم و لیستریا مونوسیاتوژنز، از اهمیت بیشتری برخوردار هستند (Abebe et al., 2020). احتمالا تولید زهرابه، حضور فاکتور های حدت آنتی ژنیک، مقاومت بالا نسبت به شرایط محیطی و مقاومت قابل توجه در برابر اغلب آنتی بیوتیک ها، دلایل عمده اهمیت بیشتر این باکتری ها هستند (Heredia and Garcia, 2018).
استافیلوکوکوس اورئوس، یک کوکسی گرم مثبت، هوازی بی هوازی اختیاری و کاتالاز مثبت است که به عنوان عامل اصلی در بروز عفونت های بیمارستانی و همچنین مسمومیت های غذایی با دوره کمون 2 تا 4 ساعت و علائم استفراغ، تهوع، ضعف و دل پیچه و بعضا اسهال، میباشد (Dehkordi et al., 2017). توانایی تولید انتروتوکسین اغلب منجر به افزایش اهمیت این باکتری در موارد مسمومیت های غذایی می شود (Momeni Shahraki et al., 2020). اشریشیا کلی یک باسیل گرم منفی و بی هوازی اختیاری از باکتری های روده ای است که عامل بروز مسمومیت های غذایی در انسان می باشد (Dehkordi et al., 2014). تولید سم شیگا توسط برخی از سویه های این باکتری (سویه های شیگاتوکسیزنیک) عامل اصلی بروز اسهال خونی و غیرخونی، کولیت خونریزی دهنده، آنمی همولیتیک، ترومبوسیتوپنی و اختلالات کلیوی پس از مصرف مواد غذایی آلوده به باکتری در انسان است (Momtaz et al., 2012). لیستریا مونوسایتوژنز باسیل گرم مثبت، متحرک و بی هوازی اختیاری است که به عنوان عامل بالقوه بروز مننزیت، سپسیس و سقط جنین پس از مصرف مواد غذایی آلوده به باکتری در نظر گرفته می شود (Li et al., 2018). سالمونلا تیفی موریوم باسیل کوتاه گرم منفی و جز باکتری های روده ای است که عامل ایجاد مسمومیت غذایی مهلک با علائمی مانند گاستروانتریت، اسهال، کرامپ شکمی و تب های انتریک (تب حصبه) می باشد (Ehua et al., 2021).
از جمله راه های اصلی درمان برخی از موارد مسمومیت های غذایی، تجویز آنتی بیوتیک ها است. با این وجود، شیوع بالای مقاومت آنتی بیوتیکی در باکتری های غذازاد، درمان موارد ابتلا را با مشکل روبرو کرده است. لذا کارخانجات تولید کننده داروهای ضد میکروبی بدنبال استفاده از ترکیبات گیاهی و سنتی به عنوان جایگزین برای دارو های ضدمیکروبی هستند (Yu et al., 2020).
گیاه بادرنجبویه با نام علمیMelissa officinalis ، در رده دولپه ای ها، راسته لب گلی ها و خانواده نعناعیان (Lamiaceae) قرار دارد و بومی مناطق مدیترانه ای و غرب آسیا است (Zarei et al., 2015). اسانس بادرنجبویه از گل و شاخه های تازه یا خشک و برگ های آن، با تقطیر بخارآب یا استخراج شیمیایی تمیه می شود که بوی لیمو تازه و رنگ زرد کمرنگ دارد. بادرنجبویه در طب سنتی ایران به عنوان تسکین دهنده، تب بر، ضداسپاسم، ضدتشنج، معرق، خوشبوکننده و ضدنفخ کاربرد دارد. همچنین از این گیاه در درمان بی خوابی و اختلالات خواب، اضطراب، افسردگی، بیماری های عصبی، میگرن، حالت تموع، ناراحتی عصبی معده، کم اشتمایی، کولیک، سرفه، قاعدگی نامنظم، دندان درد و لرزش های عصبی استفاده می شود (Shakeri et al., 2016). مطالعات بسیاری نیز اثرات ضدمیکروبی این گیاه را تایید نموده اند (Carvalho et al., 2021; Ehsani et al., 2017).
با توجه به نقش باکتری های غذازاد در بروز مسمومیت های غذایی و نبود مطالعات مدون روی اثرات ضدمیکروبی اسانس اخذ شده از اندام هوایی گیاه بادرنجبویه، مطالعه حاضر به منظور ارزیابی اثرات ضد میکروبی اسانس بادرنجبویه روی باکتری های اشریشیا کلی، استافیلوکوکوس اورئوس، لیستریا مونوسیاتوژنز و سالمونلا تیفی موریوم، انجام پذیرفت.
مواد و روش ها
نوع مطالعه
مطالعه حاضر از نوع تجربی، توصیفی و مقایسه ای می با شد.
جمع آوری گیاهان دارویی
اندام هوایی (گل) گیاه بادرنجبویه در مرحله گادهی در فصل تابستان سال 1399 از مزرعه تحقیقاتی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد جمع آوری و توسط بخش گیاه شناسی مرکز تحقیقات جهاد کشاورزی استان چهارمحال و بختیاری، تایید شد. اندام هوایی گیاه در سایه و دمای محیط به صورت کامل خشک و به قطعات کوچک خرد و به مرکز تحقیقات گیاهان دارویی و معطر دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد منتقل شد.
تهیه اسانس
استخراج اسانس در آزمایشگاه به روش تقطیر با آب (فارماکوپه انگلستان) و با استفاده از دستگاه کلونجر انجام شد. برای این منظور، 50 گرم از اندام هوایی خشک شده گیاه بادرنجبویه توزین و عملیات اسانس گیری به مدت 3 ساعت انجام پذیرفت. به منظور آبگیری از اسانس، از سولفات سدیم استفاده شد. اسانس نهایی تا زمان استفاده در دمای 4 درجه سانتی گراد و در شیشه های تیره رنگ، نگهداری شد.
آنالیز ترکیبات اسانس
اسانس‌های بدست آمده جهت تعیین نوع ترکیبات توسط دستگاه کاروماتوگرافی گازی متصل به طیف سنج جرمی (GC-MS) در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. شناسایی و بررسی ترکیبات اسانس توسط دستگاه کروماتوگرافی گازی (HP-6890, Hewlett Packard, USA) با طیف سنج جرمی انجام شد. دستگاه استفاده شده در این پژوهش دارای ستونی به طول 60 متر، 2/0 میلی متر قطر و 25/0 میکرون ضخامت و نوع ستون HP-IMS بود. دمای اولیه 160 درجه سانتی گراد، دمای نهایی 230 درجه سانتی گراد و گرادیان دمایی7 درجه سانتی گراد در هر دقیقه بود. دمای تزریق 250 درجه سانتی گراد بود. از گکاز هلیوم با شدت جریان 1 میلی متر در دقیقه به عنوان گاز حاما استفاده شد.دستگاه طیف سنج (HP-5970, Hewlett Packard, USA) مورد استفاده با انرژی یونیزاسیون 70 الکترون ولت، دمای محفظه پوشش 150 درجه سانتی گراد و نوع و دمای تجزیه گر جرمی آن کوادروپل و 230 درجه سانتی گراد بود.
میکروارگانیسم ها و شرایط رشد
به منظور ارزیابی اثرات ضد میکروبی اسانس اندام هوایی گیاه بادرنجبویه از باکتری های لیستریا مونوسایتوژنز (PTCC 1298)، اشریشیا کلی (PTCC 1533)، سالمونلا تیفی موریوم (PTCC 1730) و استافیلوکوکوس اورئوس (PTCC 1015)، استفاده شد. باکتری ها از گروه میکروب شناسی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد تهیه شد. ابتدا یک گرانول از لوله های کرایو مورد نظر در شرایط سترون خارج و به 10 میلی لیتر از محیط کشت BHI (مرک، آلمان) منتقل و در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت گرمخانه گذاری شد. سپس از هر یک از باکتری ها در محیط BHI آگار کشت داده و نگهداری شد.
ارزیابی قطر هاله عدم رشد باکتری ها در برابر اسانس
باکتری ها قبل از استفاده به شکل متوالی دوبار تجدید کشت یافتند. برای این منظور 4 کلنی تیپیک از محیط کشت BHI آگار به 10 میلی لیتر محیط BHI براث منتقل و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد گرم خانه گذاری شد. برای کشت دوم، 100 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتریایی به 10 میلی لیتر محیط BHI براث منتقل و به مدت 20 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد گرم خانه گذاری شد. سپس از کشت 20 ساعته، رقت مورد نظر تهیه و تعداد باکتری با استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتر روی استاندارد نیم مک فارلند که معادل 108 × 5/1 عدد باکتری بود، تنظیم شد. سپس باکتری های بدست آمده دو بار در محیط کشت پپتون واتر 1/0 درصد (1 میلی لیتر از باکتری و 9 میلی لیتر از محیط پپتون واتر) رقیق شد تا تعداد باکتری به 106 × 5/1 عدد برسد. سپس 100 میکرولیتر از باکتری های مورد نظر روی محیط کشت مولر هینتون آگار (مرک، آلمان) به صورت متراکم کشت داده شد. سپس روی محیط ها، دیسک های کاغذی 6 میلی متری در شرایط استریل و با فاصله مناسب قرار گرفت. سپس از غلظت های 5/0، 1، 2 و 4 میلی گرم/میلی لیتر از اسانس اندام هوایی گیاه بادرنجوبیه به میزان 20 میکرولیتر روی دیسک های خالی ریخته شد. به منظور مقایسه اثرات ضد میکروبی اسانس، از دیسک های آنتی بیوتیکی سفتازدیم (30 میکروگرم/دیسک)، جنتامایسین (10 میکروگرم/دیسک)، ونکومایسین (30 میکروگرم/دیسک)، پنی سیلین (10 میکروگرم/دیسک)، تتراسایکلین (30 میکروگرم/دیسک)، و آمپی سیلین (10 میکروگرم/دیسک) (Himedia, India) نیز استفاده شد. سپس محیط ها به مدت 24 ساعت در 37 درجه سانتی گراد گرم خانه گذاری شدند. سپس هاله عدم رشد باکتری ها که در اطراف هر دیسک ایجاد شده بود با استفاده از کولیس اندازه گیری شد (Ehsani et al., 2017).
ارزیابی حداقل غظلت ممانعت کننده از رشد (MIC) و حداقل غلظت کشندگی (MBC) اسانس
ابتدا از کشت تازه باکتری ها در محیط تریپتیک سوی براث، کدورتی معادل 5/0 مک فارلند تهیه شد. سپس کدورت تهیه شده از هر باکتری به نسبت 1 به 100 رقیق شد تا غلظتی معادل 1×106 کلنی در هر میلی لیتر از محیط ایجاد شود. بدین منظور از محیط کشت باکتری مقداری با لوپ استریل برداشته شده و درون لوله ازمایشی حاوی 4-5 میلی لیتر آب مقطر استریل ریخته و آنقدر باکتری اضافه شده تا کدورت محلول باکتری و لوله حاوی کدورتی معادل 5/0 مک فارلند یکسان شوند. سپس از اسانس اندام هوایی گیاه بادرنجبویه با استفاده از سرنگ استریل رقت های متوالی در محیط براث تهیه شد. سپس در پليت ٩٦ خانه پلي استايرن ١٠٠ ميكروليتر از رقت هاي مختلف اسانس كه حاوي ١٠٠ ميكرو ليتر سوسپانسيون باكتري بود، ريخته شد. رقت سازی اسانس با استفاده از آب مقطر استریل انجام شد (625/0، 25/1، 5/2، 5، 10 و 20 میلی گرم/میلی لیتر). همچنين چاهك هايي حاوي ٢٠٠ ميكروليتر محيط براث به عنوان كنترل منفي و چاهك هايي حاوي محيط كشت و باكتري به عنوان كنترل مثبت در نظر گرفته شد. چاهك هايي نيز به عنوان شاهد كدورت حاوي ١٠٠ ميكرو ليتر محيط و ١٠٠ ميكرو ليتر از هر رقت در نظر گرفته شد. سپس سطح پليت ها پوشيده شد و به مدت ٢٤ ساعت در انكوباتور در دماي ٣٧ درجه سانتی گراد گرم خانه گذاری شدند. پس از اتمام گرم خانه گذاری، کدورت در طول موج 630 نانومتر با استفاده از دستگاه الایزا ریدر (Statfax 2100, USA) قرائت شد. كمترين غلظتي از اسانس كه باعث كاهش ٩٠ درصدي كدورت در مقايسه با گروه كنترل شده بود به عنوان MIC و کمترین غلظتي از مواد كه باعث رفع کامل کدورت شده بود به عنوان MBC در نظر گرفته شد (Etame et al., 2018).
تجزیه و تحلیل آماری
نتايج بدست آمده با استفاده از نرم افزار MiniTab19 در قالب طرح کاملاً تصادفی مورد بررسی قرار گرفت و مقایسه میانگین داده‌ها با آزمون Fisher برای داده های کیفی و تست ANOVA برای داده های کمی در سطح احتمال 5 درصد صورت پذیرفت.
نتایج
جدول 1 ترکیبات فیتوشیمیایی موجود در اسانس گیاه بادرنجبویه را نشان می دهد. بر طبق نتایج، تجزیه فیتوشیمیایی اسانس گیاه بادرنجبویه 29 ترکیب معادل 3/89 درصد را نشان داد. از بین ترکیبات، Citronellal (4/14 درصد)، Caryophyllene oxide (11 درصد)، Geraniol acetate (2/10 درصد)، Isogeraniol (4/6 درصد)، Nerol acetate (1/5 درصد) و cis-p-Meth-2 en-7-ol (8/3 درصد) فراوانترین ترکیبات شناسایی شده در اسانس گیاه بادرنجبویه بودند.
جدول 1. ترکیبات فیتوشیمیایی موجود در اسانس گیاه بادرنجبویه.
فراوانی (درصد) | RI | ترکیبات | ردیف |
2/1 | 915 | Camphene | 1 |
6/0 | 936 | a-pinen | 2 |
8/3 | 956 | cis-p-Meth-2 en-7-ol | 3 |
75/1 | 967 | 2-pinene-4-one | 4 |
1/5 | 980 | Nerol acetate | 5 |
4/14 | 1021 | Citronellal | 6 |
6/0 | 1036 | Nerol | 7 |
6/1 | 1062 | Patchoulene | 8 |
7/1 | 1077 | 1R-a-Pinene | 9 |
4/6 | 1089 | Isogeraniol | 10 |
1 | 1137 | Geraniol | 11 |
9/0 | 1136 | Verbenol | 12 |
32/2 | 1149 | Carane | 13 |
2/10 | 1151 | Geraniol acetate | 14 |
2/2 | 1172 | Menthol | 15 |
7/0 | 1206 | Cinerone | 16 |
6/0 | 1235 | cis-Z-Bisabolene oxide | 17 |
6/0 | 1259 | Verbenone | 18 |
8/1 | 1333 | Aromadendrene oxide | 19 |
6/0 | 1365 | Andropholide0 | 20 |
11 | 1411 | Caryophyllene oxide | 21 |
6/0 | 1446 | cis-Myrtanol | 22 |
2/1 | 1489 | Germanicol | 23 |
7/0 | 1449 | Longifolene | 24 |
7/0 | 1515 | Himachalene | 25 |
6/0 | 1565 | Cubenole | 26 |
8/1 | 1586 | Pimara-7,15-dien-3-one | 27 |
9/0 | 1632 | Cholest-5-en-7-ol | 28 |
5/0 | 1665 | Lupan-3-ol acetate | 29 |
3/89 | کل | ||
جدول 2 قطر هاله عدم رشد باکتری های غذازاد در برابر غلظت های مختلف اسانس اخذ شده از اندام هوایی گیاه بادرنجبویه و دیسک های آنتی بیوتیکی را نشان می دهد. قطر هاله عدم رشد باکتری های مورد ارزیابی در برابر اسانس گیاه بادرنجبویه رنجی معادل 42/0 ± 93/3 تا 17/1 ± 23/15 میلی متر داشتند. بیشترین قطر هاله عدم رشد باکتری های لیستریا مونوسایتوژنز (17/1 ± 23/15 میلی متر)، اشریشیا کلی (29/0 ± 33/10 میلی متر)، استافیلوکوکوس اورئوس (27/0 ± 70/14 میلی متر) و سالمونلا تیفی موریوم (52/0 ± 18/10 میلی متر) به ترتیب در برابر ونکومایسین، اسانس بادرنجبویه 4 میلی گرم/میلی لیتر، اسانس بادرنجبویه 4 میلی گرم/میلی لیتر و اسانس بادرنجبویه 4 میلی گرم/میلی لیتر، بدست آمد. اثرات ضد میکروبی اسانس گیاه بادرنجبویه وابسته به دوز بود و با کاهش دوز از 4 به 5/0 میلی گرم/میلی لیتر اثرات ضد میکروبی آن برای تمام باکتری ها به شکل معنی دار کاهش یافت (05/0 P<). باکتری لیستریا مونوسایتوژنز هیچگونه رشد قابل تشخیصی در اطراف دیسک سفتازیدیم نداشت. همچنین باکتری های اشریشیا کلی، استافیلوکوکوس اورئوس و سالمونلا تیفی موریوم هیچگونه رشد قابل تشخیصی در اطراف دیسک ونکومایسین نداشتند.
جدول 2. قطر هاله عدم رشد باکتری های غذازاد در برابر غلظت های مختلف اسانس گیاه بادرنجبویه و دیسک های آنتی بیوتیکی.
قطر هاله عدم رشد (میلی متر) | تیمارها | ||||
سالمونلا تیفی موریوم | استافیلوکوکوس اورئوس | اشریشیا کلی | لیستریا مونوسیاتوژنز | ||
a 52/0 ± 18/10 | a 27/0 ± 70/14 | a 29/0 ± 33/10 | b* 94/0 ± 71/13 | 4 | اسانس بادرنجبویه (میلی گرم/میلی لیتر) |
b 43/0 ± 09/8 | b 66/0 ± 30/11 | b 24/0 ± 71/7 | c 15/0 ± 25/11 | 2 | |
c 21/0 ± 14/6 | b 15/0 ± 24/10 | c 28/0 ± 30/6 | d 40/0 ± 41/8 | 1 | |
d 42/0 ± 93/3 | c 37/0 ± 01/8 | d 30/0 ± 58/4 | e 22/0 ± 34/6 | 5/0 | |
b 34/0 ± 56/8 | a 71/0 ± 54/13 | ab 37/0 ± 25/8 | عدم رشد | سفتازدیم (30) | دیسک آنتی بیوتیک (میکروگرم/دیسک) |
a 32/0 ± 15/10 | b 04/1 ± 70/11 | a 29/0 ± 08/10 | c 55/0 ± 18/11 | جنتامایسین (10) | |
عدم رشد | عدم رشد | عدم رشد | a 17/1 ± 23/15 | ونکومایسین (30) | |
b 68/0 ± 71/8 | b 26/0 ± 41/11 | ab 51/0 ± 72/8 | c 53/0 ± 12/11 | پنی سیلین (10) | |
b 85/0 ± 67/7 | b 31/0 ± 08/10 | a 59/0 ± 60/9 | d 47/0 ± 17/9 | تتراسایکلین (30) | |
b 58/0 ± 93/7 | b 82/0 ± 14/10 | ab 16/0 ± 19/8 | cd 936/0 ± 88/9 | آمپی سیلین (10) | |
*حروف انگلیسی کوچک غیریکسان در هر ستون نشان دهنده اختلاف آماری معنی دار در حد 05/0 P < می باشد.
جدول 3 میزان MIC و MBC باکتری های غذازاد در برابر اسانس اندام هوایی گیاه بادرنجبویه را نشان می دهد. بر طبق نتایج، کمترین میزان MIC و MBC اسانس گیاه بادرنجبویه برای باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (به ترتیب 25/1 و 5/2) بدست آمد. بیشترین میزان MIC و MBC اسانس گیاه بادرنجبویه برای باکتری سالمونلا تیفی موریوم (به ترتیب 10 و 20) بدست آمد.
جدول 3. میزان MIC و MBC باکتری های غذازاد در برابر اسانس گیاه بادرنجبویه.
سالمونلا تیفی موریوم | استافیلوکوکوس اورئوس | اشریشیا کلی | لیستریا مونوسایتوژنز | تیمار ها | ||||
MBC | MIC | MBC | MIC | MBC | MIC | MBC | MIC | اسانس بادرنجوبیه |
20 | 10 | 5/2 | 25/1 | 10 | 5 | 5 | 5/2 | |
بحث
امروزه اغلب باکتری های جدا شده از مواد غذایی، خصوصا مواد غذایی با منشا دامی، مقاومت بالایی نیست به اکثر آنتی بیوتیک ها دارند. شیوع مقاومت در بین این باکتری ها به حدی زیاد است که اغلب داروهای آنتی بیوتیکی معمول مورد استفاده در پزشکی و دامپزشکی، تاثیری روی آن ها ندارند (Van et al., 2007). لذا ضرورت انجام تحقیقات روی منابع طبیعی واجد ترکیبات ضدمیکروبی بیش از پیش مورد توجه قرار می گیرد.
نتایج مطالعه حاضر نشان داد که اسانس اخذ شده از اندام هوایی گیاه بادرنجبویه از فعالیت ضدمیکروبی قابل قبولی برعلیه باکتری های غذازاد، خصوصا استافیلوکوکوس اورئوس و لیستریا مونوسایتوژنز، برخوردار است. بیشترین اثرات ضدمیکروبی اسانس بادرنجبویه در غلظت 4 میلی گرم/میلی لیتر دیده شد. میانگین قطر هاله عدم رشد لیستریا مونوسایتوژنز، اشریشیا کلی، استافیلوکوکوس اورئوس و سالمونلا تیفی موریوم تیمار شده با غلظت 4 میلی گرم/میلی تیر از اسانس بادرنجبویه به ترتیب 94/0 ± 71/13، 29/0 ± 33/10، 27/0 ± 70/14 و 52/0 ± 18/10 میلی متر بود. در مقابل میانگین قطر هاله عدم رشد لیستریا مونوسایتوژنز، اشریشیا کلی، استافیلوکوکوس اورئوس و سالمونلا تیفی موریوم تیمار شده با غلظت 5/0 میلی گرم/میلی تیر از اسانس بادرنجبویه به ترتیب 22/0 ± 34/6، 30/0 ± 58/4، 37/0 ± 01/8 و 42/0 ± 93/3 میلی متر بود. بنابراین اثرات ضدمیکروبی اسانس گیاه بادرنجبویه وابسته به دوز بود (05/0 P <). در بین آنتی بیوتیک های مورد استفاده، بیشترین قطر هاله عدم رشد مربوط به ونکومایسین بود که هیچ رشدی برای باکتری های اشریشیا کلی، استافیلوکوکوس اورئوس و سالمونلا تیفی موریوم در مقابل آن گزارش نشد و قطر هاله عدم رشد برای باکتری لیستریا مونوسایتوژنز، 17/1 ± 23/15 میلی متر بود. همچنین هیچ گونه رشدی برای باکتری لیستریا مونوسایتوژنز تیمار شده با سفتازیدیم دیده نشد. بیشترین قطر هاله عدم رشد (که نشان دهنده بیشترین اثرات ضد میکروبی آنتی بیوتیک ها است) باکتری های لیستریا مونوسایتوژنز، اشریشیا کلی، استافیلوکوکوس اورئوس و سالمونلا تیفی موریوم به ترتیب در مقابل آنتی بیوتیک های ونکومایسین (17/1 ± 23/15 میلی متر)، جنتامایسین (29/0 ± 08/10 میلی متر)، سفتازیدیم (71/0 ± 54/13 میلی متر) و جنتامایسین (32/0 ± 15/10 میلی متر) گزارش شد. اثرات ضدمیکروبی اسانس گیاه بادرنجبویه از بسیاری از آنتی بیوتیک ها به شکل معنی دار بیشتر اما در مقایسه با آنتی بیوتیک های ونکومایسین (برای لیستریا مونوسایتوژنز به شکل معنی دار) و جنتامایسین (برای سالمونلا تیفی موریوم به شکل غیر معنی دار)، کمتر بود. بر طبق نتایج، Citronellal و Caryophyllene oxide اصلی ترین ترکیبات شناسایی شده در اسانس بادرنجبویه بودند. اثرات ضدمیکروبی Citronellal و Caryophyllene oxide در اسانس گیاه بادرنجبویه توسط سیار محققان از کشور های مراکش (Jalal et al., 2015)، ایران (Ehsani et al., 2017)، الجزایر (Abdellatif et al., 2014)، و پرتقال (Carvalho et al., 2021) گزارش شده است.
اثرات ضدمیکروبی اسانس گیاه بادرنجبویه روی باکتری های اشریشیا کلی و سالمونلا تیفی موریوم به مراتب کمتر بود. دلیل این یافته احتمالا وجود لایه لیپوپلی ساکاریدی در غشاي بیرونی و نیز فضاي پري پلاسمیک باکتري هاي گرم منفی است که منجر به مقاومت بالای آن ها در برابر ترکیبات ضدمیکروبی می شود (Masoumian and Zandi, 2017). هرچند نتایج این تحقیق نشان دهنده وجود اثرات ضدمیکروبی اسانس اخذ شده از اندام هوایی گیاه بادرنجبویه روی باکتری های گرم منفی نیز بود که دارای اثرات معنی دار (05/0 > P) در مقایسه با آنتی بیوتیک های پنی سیلین، تتراسایکلین و آمپی سیلین بود.دلیل این یافته وجود ترکیباتی همچون کاریوفیلن اکسیاد، لینالول، تیمول، کامفور، سیترونلا، نرول، دکانال، بتا-بوربونن، آلفا-کوپائن، بتا-پینن و ... در اسانس گیاه بادرنجبویه است که همگی جز ترکیبات فعال با خصوصیات ضدمیکروبی قوی می باشند (Alizadeh Behbahani and Shahidi, 2019). در این ارتباط، ترکیبات ضدمیکروبی موجود در عصاره ها و اسانس های گیاهی معمولا از طریق هدف‌گیری مناطق خاصی از میکروب‌ها، اثرات ضدمیکروبی خود را اعمال می کنند. از جمله مهم ترین مکانیسم‌های عمل ترکیبات ضدمیکروبی می توان به مهار سنتز پروتئین، تداخل با سنتز دیواره سلولی، مهار مسیرهای متابولیکی واسطه، تداخل با سنتز اسیدنوکلئیک، و اختلال در غشای سیتوپلاسمی سلول، اشاره نمود (Maurya et al., 2021).
با وجود اثرات ضدمیکروبی قابل توجه گیاه بادرنجبویه، مطالعات اندکی روی آن انجام پذیرفته است. Ehsani و همکاران (2015) (Ehsani et al., 2015) قطر هاله عدم رشد استافیلوکوکوس اورئوس، لیستریا مونوسیاتوژنز و اشریشیا کلی تیمار شده با اسانس گیاه بادرنجبویه (15 میلی گرم/میلی لیتر) را به ترتیب 16/0 ± 00/15، 22/0 ± 10/15 و 14/0 ± 17/11 میلی متر گزارش نمودند که با نتایج مطالعه حاضر از نظر مقاومت بالاتر باکتری اشریشیا کلی مشابهت دارد. نام بردگان بیشترین و کمترین میزان MIC را به ترتیب برای باکتری های اشریشیا کلی (20 میلی گرم/میلی لیتر) و استافیلوکوکوس اورئوس (25/1 میلی گرم/میلی لیتر) گزارش نمودند. مطالعه Arzhang و همکاران (2015) (Arzhang et al., 2015) نیز نشان داد که اسانس گیاه بادرنجبویه در غلظت 22 میکروگرم بر میلی لیتر، اثر مهارکنندگی بر استافیلوکوکوس اورئوس، اشریشیا کلی و سودوموناس آئروژینوزا داشت، ولی روی کاندیدا آلبیکنز مؤثر نبود. نتایج مشابه مبنی بر اثرات ضدمیکروبی گیاه بادرنجبویه از سایر نقاط جهان شامل لهستان (Klūga et al., 2017)، پرتقال (Pedrosa et al., 2020)، صربستان (Mimica-Dukic et al., 2004)، ایران (Rabbani et al., 2016)، مالزی (Swamy et al., 2016) و مصر (Abdel-Naime et al., 2019)، گزارش شده است. دلیل احتمالی وجود تفاوت در اثرات ضدمیکروبی گیاه بادرنجبویه در مطالعات مختلف می تواند اختلاف در منطقه جغرافیایی، آب و هوا، پارامترهاي دما، ارتفاع از سطح دریا، طول مدت زمان سایه، جنس خاک، استفاده از انواع کودها و در نهایت نوع عصاره یا اسانس استفاده شده، باشد. هرچند تمام مطالعات تایید کننده اثرات ضدمیکروبی گیاه بادرنجبویه روی باکتری ها می باشند.
از جمله محدودیت های این تحقیق می توان به عدم استفاده از آنتی بیوتیک ها به صورت پودری به منظور اعمال غلظت بندی دقیق و عدم بررسی تاثیرات ضد میکروبی اسانس استحصال شده از سایر قسمت های گیاه بادرنجبویه و اسانس آن روی باکتری های مورد نظر، اشاره نمود. همچنین عدم ارزیابی اثرات ضدمیکروبی اسانس بادرنجبویه روی سایر انواع باکتری های غذازاد از جمله گونه های کمپیلوباکتر و کلستریدیوم ها، می تواند محدودیت دیگر این تحقیق باشد.
نتیچه گیری
نتایج این مطالعه نشان داد اسانس اخذ شده از اندام هوایی گیاه بادرنجبویه خصوصا در غلظت 4 میلی گرم/میلی لیتر، اثرات ضدمیکروبی مناسبی برعلیه باکتری های لیستریا مونوسایتوژنز، سالمونلا تیفی موریوم، اشریشیا کلی و استافیلوکوکوس اورئوس دارد. هرچند اسانس گیاه بادرنجبویه اثرات ضد میکروبی کمتری نسبت به برخی از انواع دیسک های آنتی بیوتیکی داشت اما قطر هاله عدم رشد باکتری های تیمار شده با این گیاه از بسیاری از دیسک های آنتی بیوتیکی، بیشتر بود. میزان MIC و MBC پایین اسانس گیاه بادرنجبویه می تواند نشان دهنده اثرات ضد میکروبی مشخص گیاه در غلظت های پایین خصوصا روی استافیلوکوکوس اورئوس و لیستریا مونوسایتوژنز باشد که استفاده از آن را به صرفه و اقتصادی می کند. با توجه به نتایج بدست آمده و در نظر گرفتم ماهیت خوراکی و سنتی گیاه بادرنجبویه، پیشنهاد می شود از اسانس گیاه بادرنجبویه به عنوان یک ترکیب ضدمیکروبی خوراکی در مواد غذایی (به صورت فیلم خوراکی یا به عنوان چاشنی)، استفاده شود. هرچند، مطالعات تکمیلی دیگری نیز بایستی در این زمینه صورت پذیرد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان این تحقیق کمال تشکر و قدردانی را از پرسنل مرکز تحقیقات گیاهان دارویی و معطر دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد و همچنین مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی استان چهارمحال و بختیاری، دارند.
منابع
Abdellatif, F., Boudjella, H., Zitouni, A., and Hassani, A. 2014. Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil from leaves of Algerian Melissa officinalis L. Excli. J. 13: 772.
Abebe, E., Gugsa, G., and Ahmed, M. 2020. Review on major food-borne zoonotic bacterial pathogens. J. Trop. Med. 2020: 4674235.
Carvalho, F., Duarte, A.P., and Ferreira, S., 2021. Antimicrobial activity of Melissa officinalis and its potential use in food preservation. Food. Biosci. 44: 101437.
Dehkordi, F.S., Gandomi, H., Basti, A.A., Misaghi, A., and Rahimi, E. 2017. Phenotypic and genotypic characterization of antibiotic resistance of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated from hospital food. Antimicrob. Res. Infect. Control. 6: 1-11.
Dehkordi, F.S., Yazdani, F., Mozafari, J., and Valizadeh, Y. 2014. Virulence factors, serogroups and antimicrobial resistance properties of Escherichia coli strains in fermented dairy products. BMC. Res. Note. 7: 1-8.
Ehsani, A., Alizadeh, O., Hashemi, M., Afshari, A., and Aminzare, M. 2017. Phytochemical, antioxidant and antibacterial properties of Melissa officinalis and Dracocephalum moldavica essential oils. Vet. Res. Forum. 8: 223.
Ehuwa, O., Jaiswal, A.K., and Jaiswal, S. 2021. Salmonella, Food Safety and Food Handling Practices. Foods, 10: 907.
Etame, R.E., Mouokeu, R.S., Pouaha, C.L.C., Kenfack, I.V., Tchientcheu, R., Assam, J.P.A., Poundeu, F.S.M., Tiabou, A.T., Etoa, F.X.,, and Kuiate, J.R. 2018. Effect of Fractioning on Antibacterial Activity of Enantia chlorantha Oliver (Annonaceae) Methanol Extract and Mode of Action. Evid-Based Compl. Altern. Med. 2018: 1-13.
Hashempour-Baltork, F., Hosseini, H., Shojaee-Aliabadi, S., Torbati, M., Alizadeh, A.M., and Alizadeh, M. 2019. Drug resistance and the prevention strategies in food borne bacteria: An update review. Adv. Pharm. Bull. 9: 335.
Heredia, N., and García, S. 2018. Animals as sources of food-borne pathogens: A review. Anim Nutr. 4: 250-255.
Jalal, Z., El Atki, Y., Lyoussi, B., and Abdellaoui, A. 2015. Phytochemistry of the essential oil of Melissa officinalis L. growing wild in Morocco: Preventive approach against nosocomial infections. Asian. Pacific. J. Trop. Biomed. 5(6): 458-61.
Li, W., Bai, L., Fu, P., Han, H., Liu, J., and Guo, Y. 2018. The epidemiology of Listeria monocytogenes in China. Foodbone. Pathog. Dis. 15: 459-466.
Momeni Shahraki, M., Shakerian, A., Rahimi, E., and Safarpoor Dehkordi, F. 2020. Study the frequency of enterotoxin encoding genes and antibiotic resistance pattern of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated from vegetable and salad samples in Chaharmahal Va Bakhtiari province. J. Food. Microbiol. 7: 55-69.
Momtaz, H., Farzan, R., Rahimi, E., Safarpoor Dehkordi, F., and Souod, N. 2012. Molecular characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolated from ruminant and donkey raw milk samples and traditional dairy products in Iran. Sci. World. J. 2012: 231342.
Pires, S.M., Desta, B.N., Mughini-Gras, L., Mmbaga, B.T., Fayemi, O.E., Salvador, E.M., Gobena, T., Majowicz, S.E., Hald, T., Hoejskov, P.S., and Minato, Y. 2021. Burden of foodborne diseases: think global, act local. Curr. Opin. Food. Sci. 39: 152-9.
Shakeri, A., Sahebkar, A., and Javadi, B. 2016. Melissa officinalis L.–A review of its traditional uses, phytochemistry and pharmacology. J. Ethnopharmacol. 188: 204-228.
Yu, Z., Tang, J., Khare, T., and Kumar, V. 2020. The alarming antimicrobial resistance in ESKAPEE pathogens: Can essential oils come to the rescue?. Fitoterapia. 140: 104433.
Zarei, A., Changizi-Ashtiyani, S., Taheri, S., and Hosseini, N. 2015. A brief overview of the effects of Melissa officinalis L. extract on the function of various body organs. Zahedan. J. Res. Med. Sci. 17: e1007.
Van, T.T.H., Moutafis, G., Tran, L.T., and Coloe, P.J. 2007. Antibiotic resistance in food-borne bacterial contaminants in Vietnam. Appl. Environ. Microbiol. 73: 7906-11.
Alizadeh Behbahani, B., and Shahidi, F. 2019. Melissa officinalis essential oil: Chemical compositions, antioxidant potential, total phenolic content and antimicrobial activity. Nutr. Food. Sci. Res. 6: 17-25.
Masoumian, M., and Zandi, M. 2017. Antimicrobial activity of some medicinal plant extracts against multidrug resistant bacteria. Zahedan. J. Res. Med. Sci. 19: 1-8.
Maurya, A., Prasad, J., Das, S., and Dwivedy, A.K. 2021. Essential oils and their application in food safety. Front. Sustain. Food. Systems. 5: 133.
Ehsani, A., Alizade, O., Hashemi, M., Mohamadi, S., and Khalili, S. 2015. Comparative antibacterial effects of essential oils of Melissa officinalis and Deracocephalum moldavica L. against some pathogenic bacteria in food in vitro. J. Shahrekord. Univ. Med. Sci. 17: 80-87.
Arzhang, M., Dakhili, M., and Farahani, F. 2015. Investigation of chemical compounds and anti-microbial activity of essential oil of Melissa officinalis L. Qom. Univ. Med. Sci. J. 9: 7-13.
Klūga, A., Terentjeva, M., Kántor, A., Kluz, M., Puchalski, C., and Kačániová, M. 2017. Antibacterial activity of Melissa officinalis L., Mentha piperita L., Origanum vulgare L. and Malva mauritiana against bacterial microflora isolated from fish. Adv. Res. Life. Sci. 1: 75-80.
Pedrosa, M.C., Ueda, J.M., Heleno, S., Melgar, B., Ivanov, M., Soković, M., Carocho, M., Ferreira, I.C., and Barros, L. 2020. Antimicrobial Activity of Aqueous Plant Extracts as Potential Natural Additives. Proceedings. 70: 79.
Mimica-Dukic, N., Bozin, B., Sokovic, M., and Simin, N. 2004. Antimicrobial and antioxidant activities of Melissa officinalis L.(Lamiaceae) essential oil. J. Agric. Food. Chem. 52: 2485-2489.
Rabbani, M., Etemadifar, Z., Karamifard, F., and Borhani, M.S. 2016. Assessment of the antimicrobial activity of Melissa officinalis and Lawsonia inermis extracts against some bacterial pathogens. Comp. Clin. Pathol. 25: 59-65.
Swamy, M.K., Akhtar, M.S., and Sinniah, U.R. 2016. Antimicrobial properties of plant essential oils against human pathogens and their mode of action: an updated review. Evid-Based. Compl. Alt. Med. 2016: 3012462.
Abdel-Naime, W.A., Fahim, J.R., Fouad, M.A., and Kamel, M.S. 2019. Antibacterial, antifungal, and GC–MS studies of Melissa officinalis. South. Afr. J. Botany. 124: 228-234.
Evaluation of the antimicrobial activity of Melissa officinalis essential oil on foodborne bacteria
Running title: Antimicrobial effects of Melissa officinalis essential oil on foodborne bacteria.
Abstract
Melissa officinalis is a medicinal plant with high antimicrobial properties. The present study was performed to evaluate the antimicrobial effects of Melissa officinalis essential oil on food-borne bacteria. Melissa officinalis aerial parts were prepared and after approval by experts used to prepare essential oils. The diameter of the growth inhibition zone of Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Escherichia coli and Staphylococcus aureus was assessed using disk diffusion and compared with antibiotics. The minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum bacterial concentration (MBC) of Melissa officinalis essential oil were evaluated on the target bacteria. Citronellal (14.4%) and Caryophyllene oxide (11%) were the most important compounds identified in Melissa officinalis essential oil. The diameter of the growth inhibition zone of the bacteria against Melissa officinalis essential oil ranged from 3.93±0.42 to 15.23±1.17 mm. Application of 4 mg/ml concentration of Melissa officinalis essential oil caused the largest diameter of the growth inhibition zone of Staphylococcus aureus (14.70±0.27 mm), Escherichia coli (10.33±0.29 mm) and Salmonella typhimurium (10.18±0.52 mm). The antimicrobial effects of Melissa officinalis essential oil were dose-dependent (P <0.05). The lowest and highest levels of MIC and MBC of Melissa officinalis essential oil were obtained for Staphylococcus aureus (1.25 and 2.5, respectively) and Salmonella typhimurium (10 and 20, respectively). The diameter of the growth inhibition zone of bacteria treated with Melissa officinalis essential oil was higher than that of many antibiotics, but lower than that of vancomycin. Melissa officinalis essential oil can be used as a substance with antimicrobial properties, especially in food films.
Keywords: Melissa officinalis, Essential oils, Antimicrobial effects, Food-borne bacteria.
