Hormonal, biometric and histological investigation of testis after allograft transplantation in rams
gholamali moghaddam
1
(
استاد گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران.
)
Aytak Bakhshayesh Khiabani
2
(
MSc Student of Animal Science, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz, Iran.
)
بابک Qassemi Panahi
3
(
Assistant Professor, Department of Animal Science, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz, Iran
)
hossein daghighkia
4
(
Professor, department of animal Science, University of Tabriz, Tabriz, Iran
)
arash javanmard
5
(
department of animal science, university of Tabriz
)
Keywords: Allograft transplantation, Ram, Stem cells , Fat,
Abstract :
Introduction: Stem cells are undifferentiated cells with ability to renew and divide indefinitely to generate specialized cells. The aim of present study is to hormonal, biometric and histological investigation of testis after allograft transplantation in rams. Materials and Methods: In the present study, 5 male lambs (less than 6 months old) were used as recipients, 5 lambs as donors, 5 lambs as to confirm the effectiveness of tamoxifen and 5 lambs as controls. Azoospermia was induced in five lambs by orally administration of tamoxifen. Adipose tissue from 5 lambs was biopsied and cells were isolated and cultured. This followed by a transplantation of mesenchymal stem cells onto recipients. The Blood sampling and measuring of circumference of scrotum and the dimensions of testis were done three stages before and after the induction of azoospermia and after transplantation. 49 days after transplantation, one testicle was removed for histological evaluation. Results and Discussion: The highest and lowest scrotal circumference sizes were related to control at age of 9 months and treatment group at age of 7 months (p<0.05). Effect of applying factor, sampling time and treatment × time on all studied traits was significant. Induction of azoospermia using tamoxifen led to severe destruction of germinal epithelium in seminiferous tubules. Conclusion: Transplantation of stem cells obtained from adipose tissue can induced spermatogenesis in seminiferous tubules of azoospermic sheep. Therefore, this technique can be used for the transfer of stem cells from a superior animal as a donor for production of functional sperm in another.
بررسی هورمونی، بیومتری و بافت شناسی بیضه بعد از پیوند آلوگرافت در قوچ
چكيده
سلولهای بنیادی، سلولهای غیرتمایزیافتهای با قابلیت تبدیل به تمام سلولهای تخصصیافته هستند که وجود آنها برای حیات فرد ضروری هستند. هدف از پژوهش حاضر بررسی هورمونی، بیومتری و بافتشناسی بیضه بعد از پیوند آلوگرافت در قوچ است. در این طرح از 5 راس برهی نر قزل به عنوان دهنده سلول، 5 بره به عنوان گیرنده، 5 بره برای تایید تاثیر تاموکسیفن و 5 بره به عنوان شاهد استفاده شد. آزواسپرمی در هر دو بیضه برههای گیرنده ایجاد شد. سلولهای بنیادی از بافت چربی برههای دهنده استخراج و کشت داده شد. انتقال سلولها در هر دو بیضه صورت گرفت. محیط اسکروتوم و ابعاد بیضه در سه مرحله قبل و بعد از آزواسپرمی و بعد از پیوند اندازهگیری شد. خونگیری در گوسفند در سه مرحله انجام شد. 49 روز بعد از پیوند، یکی از بیضههای گوسفند برداشت شد و برای بافتشناسی به آزمایشگاه منتقل شد. بالاترین و پایینترین اندازه محیط اسکروتوم به ترتیب مربوط به گروه کنترل در 9 ماهگی (32/35 سانتیمتر) و گروه تیمار در 7 ماهگی بود و تفاوت معنیداری داشت (05/0>p). اثر اعمال فاکتور، زمان نمونهبرداری و اثر متقابل تیمار×زمان بر تمامی صفات مورد مطالعه معنیدار بود (05/0>p). القای آزواسپرمی با استفاده از تاموکسیفن منجر به تخریب شدید بافت پوششی زایا در لولههای اسپرمساز شد. پیوند سلولهای بنیادی می‌تواند منجر به القای موفقیتآمیز اسپرم‌زایی در لولههای اسپرمساز گوسفند آزواسپرمی شود. بنابراین، میتوان از این تکنیک برای انتقال سلولهای بنیادی از دام برتر به عنوان پایه دهنده به جهت تولید اسپرم فانگشنال در حیوان دیگری از همان گونه استفاده کرد.
كلیدواژهها: پیوند آلوگرافت، سلولهای بنیادی چربی، گوسفند.
مقدمه
نقایص مادرزادی، ناهنجاریهای ژنتیکی، بیماریهای عفونی، اختلالات غدد درون ریز، و قرار گرفتن در معرض گنادوتوکسین ها از علل مختلف آزواسپرمی است (Berookhim and Schlegel, 2014; Oryan et al., 2008). امروزه، برای درمان ناباروری مردان پیوند سلول معرفی شده است (O'brien et al., 2010). بین روشهای مختلف سلول درمانی، پیوند سلولهای بنیادی برای بازیابی عملکرد و ساختار اندامها یا بافتها به یک استراتژی درمانی جدید تبدیل شده است (Zhang et al., 2014). سلولهای بنیادی به وسیله دو خصوصیات شناسایی میشوند: خود تجدیدکنندگی و توانایی تمایز. انواع مختلف سلولهای بنیادی از جمله سلولهای بنیادی جنینی یا سلولهای بنیادی پرتوان القا شده کاندید درمان سلولهای بنیادی هستند، اما سلولهای بنیادی مزانشیمی ایمنترین روش میباشد و به راحتی نیز در دسترس میباشد (Rahmanifar et al., 2016). سلولهای بنیادی مزانشیمی تقریباً از هر اندامی از جمله چربی، کبد، طحال، لوزالمعده، کلیه، ریه، عضله و مغز جدا میشوند (Lin et al., 2012). با این حال، سلولهای بنیادی مغز استخوان و بافتهای چربی به دلیل توانایی تمایزشان به استخوان، چربی، غضروف، عضله، سلولهای عصبی، سلولهای کبدی، سلولهای تولیدکننده انسولین و پوست در شرایط مناسب داخل بدن، به ترتیب پتانسیل بیشتری برای ترمیم بافت دارند (Zhang et al., 2014, Kazemi et al., 2016). از جمله مزایای استفاده از سلولهای بنیادی بافت چربی، سهولت دسترسی و برداشت آن به وسیله روشهایی است که نسبت به برداشت سلولهای بنیادی مغز استخوان درد بسیار کمتری دارد (Mehrabani et al., 2015).
جداسازی سلولهای بنیادی و پیوند آنها به عدم انقراض حیوانات کمک خواهد کرد مخصوصاً اگر حیوانی با ارزش ژنتیکی بالا باشد، اهمیت این مسئله دوچندان خواهد شد. سلولهای بنیادی مشتق از چربی میتوانند برای مدت طولانی و بدون از بین رفتن ظرفیت تمایز آنها در محیط کشت نگهداری شوند و گسترش یابند، و منجر به استفاده فزاینده مقادیر زیادی سلول در اهداف سلول درمانی شوند. هدف این مطالعه بررسی هورمونی، بیومتری و بافت شناسی بیضه بعد از پیوند آلوگرافت در قوچ است.
مواد و روشها
- حیوانات
در این طرح از 20 راس برّه نر نژاد قزل با سن زیر 6 ماه استفاده شد. 5 راس بره به عنوان دهنده سلول، 5 راس بره به عنوان گیرنده سلول ، 5 راس بره برای تایید آزوسپرمی (ارزیابی تاثیر تاموکسیفن) و 5 راس بره به عنوان شاهد استفاده شد. در هنگام انتخاب، برهها دو ماهه بوده و وزن مشابه داشتند و از بین 90 راس به صورت تصادفی انتخاب شدند.
- القای آزواسپرمی
آزواسپرمی در هر دو بیضه ده راس بره با استفاده از تاموکسیفن خوراکی با دوز 670 میلی گرم بر هر کیلوگرم وزن بدن به مدت 40 روز القا شد (Olfati et al., 2018). بیضههای 5 راس برای تایید آزواسپرمی به روش جراحی درآورده و به آزمایشگاه بافتشناسی دانشکده دامپزشکی ارسال گردید. از محلول فرمالین بافر 10 درصد برای تثبیت بافتها استفاده شد. برای رنگآمیزی تمام مقاطع بیضه از رنگآمیزی هماتوکسیلین و ائوزین استفاده شد و تغییرات مورفولوژیکی با بزرگنمایی 10X و 40X بررسی شد. همه تغییرات توسط یک متخصص هیستولوژی ارزیابی شد (Olfati et al., 2018).
- آمادهسازی سلولها برای انتقال
از بافت چربی 5 راس برهی نر قزل کمتر از 6 ماهه ایستگاه تحقیقاتی خلعتپوشان به طریق بیوپسی نمونهگیری شد و جداسازی و کشت گردید. نمونه چندین بار با PBS (Phosphate buffered saline) حاوی 1 درصد پنیسیلین+استرپتومایسین برای حذف سلولهای مرده و گلبول‌های قرمز خون شست‌و‌شو داده شد. در نهایت با قیچی به قطعات ریزی تقسیم شد و با کلاژناز به مدت یک شب هضم شد. مواد رویی دور ریخته شد و پلت سلولی در محیط کشت DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) و 10 درصد FBS (Fetal Bovine Serum) شناور شد. سلولها در فلاسک‌های کشت ریخته و در دمای 37 درجه سانتیگراد و 5 درصد CO2 در انکوباتور مرطوب انکوبه شدند. هر سه روز یکبار محیط کشت تعویض شد و سلولهای نچسبیده حذف شد (Mohebbi et al., 2023). تایید ماهیت سلولهای مزانشیمی مشتق از بافت چربی به وسیله میکروسکوپ نوری معکوس و فلوسیتومتری انجام شد (Mohebbi et al., 2023).
- پیوند سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی به بیضه برههای گیرنده
سلولها با PBS دو بار شستشو داده شدند سپس با استفاده از تریپسین سلولها از کف فلاسک جدا و به مدت 2 دقیقه در انکوباتور نگه داشته شدند. اثر تریپسین بلافاصله با استفاده از FBS خنثی شد و با دور 1800rmp به مدت 8 دقیقه سانتریفیوژ شد. پلت به دست آمده با محلول DMEM مخلوط شد. سلولها با غلظت نهایی 106×46-45 cells/ml برای پیوند به بیضه گوسفند گیرنده آماده شد (Mohebbi et al., 2023). انتقال سلولهای بیضه به رتهتستیس گیرنده ها تحت شرایط بیهوشی و آسپتیک انجام شد. قبل از عمل، در طول شب، غذا و آب داده نشد. بیهوشی موقت با زایلازین (2 mg/kg) انجام شد. پیوند سلولهای بنیادی مشتق از چربی با استفاده از پروب سونوگرافی به رتهتستیس گوسفندان انجام شد. هدایت سوزن CSF (Cerebro-spinal fluid) در بافت بیضه در سونوگرافی با پروب MHz5 مشخص گردید و 106×30 سلولهای بنیادی مزانشیمی چربی در بافت بیضه با سر سوزن نمره 18 به طول 12 سانتیمتر( سوزن CSF) درمدت 5 دقیقه وارد رتهتستیس شد (Mohebbi et al., 2023).
- مطالعه بیومتریک بیضه و خونگیری
جهت مطالعه بیومتریک بیضه برهها، محیط اسکروتوم و ابعاد بیضه در طی سه مرحله قبل از ایجاد آزواسپرمی (روز اول دادن قرص تاموکسیفن)، بعد از ایجاد آزواسپرمی (چهل روز بعد از دادن تاموکسیفن) و بعد از پیوند (چهل و نه روز بعد از پیوند) اندازهگیری شد. اندازهگیری محیط اسکروتوم با استفاده از یک متر نواری و در پهنترین نقطه انجام شد. اندازهگیری ابعاد بیضه از جمله طول بیضه (محور پشتی-شکمی)، بیضه بهاضافه اپیدیدیم، طول بیضه و سر اپیدیدیم، ضخامت (محور قدامی-خلفی) و پهنا (محور میانی_جانبی) با استفاده از وسیله کولیس اندازهگیری شد (Rozenberger, 1992) خونگیری در گوسفند نیز در طی سه مرحله قبل و بعد از ایجاد آزوسپرمی و بعد از پیوند انجام شد. قبل از خونگیری مشخصات هر راس دام اخذ و ثبت شد و بعد از ثبت مشخصات از ورید وداج هر راس 5 سی‌سی خون بوسیله لوله های خلا دار حاوی ماده‌ی ضدانعقاد جمعآوری شد. لوله های حاوی خون به مدت 10 دقیقه با دور 3000 - 3500 rpm سانتریفوژ گردید (Geneus 20 - امریکا) و پلاسما برای انجام آزمایش جداسازی و در فریزر 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد. اندازهگیری هورمون های LH (Luteinizing hormone)، FSH (Follicle-Stimulating Hormone) (پیشتاز طب) و تستسترون به کمک دستگاه الایزا (Stat-fax 2100 امریکا) و کیت (ایده ال تشخیص آتیه) انجام گرفت.
- بررسی هیستولوژیکی بافت بیضه
با توجه به این که سیکل اسپرماتوژنز در گوسفند 49 روز میباشد، 49 روز بعد از پیوند، یکی از بیضههای گوسفند به روش جراحی باز برداشته شد و پس از تثبیت در فرمالین 10 درصد و طی مراحل برش بافتی با رنگآمیزی هماتوکسلین-ائوزین بررسی گردید (Kaffashi Elahi et al., 2011).
- تحلیل آماری دادهها
دادهها پس از بررسی همگنی واریانس و نرمالیته باقیماندهها از طرح کاملا تصادفی در قالب فاکتوریل (2×3) مورد آنالیز قرار گرفتند.
یافتهها
- تاثیر تاموکسیفن و پیوند آلوگرافت سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از چربی در بیومتری بیضه
در این طرح محیط اسکروتوم و ابعاد بیضه در طی سه مرحله قبل از ایجاد آزواسپرمی (روز اول دادن قرص تاموکسیفن)، بعد از ایجاد آزواسپرمی (چهل روز بعد از دادن تاموکسیفن) و بعد از پیوند (چهل و نه روز بعد از پیوند) اندازهگیری شد. شکل 1 الف و ب به ترتیب نشاندهنده اندازه بیضه بعد از مصرف تاموکسیفن و بعد از پیوند آلوگرافت و اندازه بیضه نرمال (کنترل) می باشد. همانطور که در شکل 1 مشاهده میشود، تزریق تاموکسیفن (الف) منجر به کاهش انداره بیضه (مساحت: 297/29 سانتیمتر مربع، محیط 902/22 سانتیمتر و ارتفاع 452/9 سانتیمتر) نسبت به بیضه نرمال (ج) با مساحت 852/66 سانتیمتر مربع، محیط 696/31 سانتیمتر و ارتفاع 379/12 سانتیمتر شده است. از طرفی مشاهده میشود که پیوند سلولهای بنیادی مشتق از چربی باعث افزایش اندازه بیضه گوسفند آزواسپرمی شده (ب) نسبت به بیضه آزواسپرمی (الف) شده است. به طوریکه مساحت، محیط و ارتفاع بیضه گوسفند آزواسپرمی شده (ب) به ترتیب 600/63 سانتیمتر مربع، 951/30 سانتیمتر و 571/12 سانتیمتر اندازهگیری شد.
ب |
ج |
الف |
شکل 1- الف) اندازه بیضه بعد از مصرف تاموکسیفن ب) اندازه بیضه بعد از پیوند آلوگرافت ج) اندازه بیضه نرمال (کنترل)
جدول 1- اثر تیمار، زمان نمونهبرداری و اثر متقابل تیمار × زمان روی صفات بیومتریک بیضه (سانتی متر)
| محیط اسکروتوم
| بیضه راست با اپیدیدیم | بیضه راست بدون اپیدیدیم | محور قدامی-خلفی بیضه راست | محور داخل به خارج بیضه راست | بیضه چپ با اپیدیدیم | بیضه چپ بدون اپیدیدیم | محور قدامی-خلفی بیضه چپ | محور داخل به خارج بیضه چپ | |
تیمار | کنترل | a1/28 | a67/12 | a18/11 | a57/6 | a83/6 | a89/11 | a43/10 | a67/5 | a62/5 |
تیمار | b55/23 | b69/9 | b 87/6 | b68/4 | b36/4 | b63/8 | b71/6 | b61/4 | b65/4 | |
SEM | 621/0 | 435/0 | 394/0 | 226/0 | 247/0 | 383/0 | 556/0 | 217/0 | 239/0 | |
p-value | 0001/0> | 0001/0> | 0001/0> | 0001/0> | 0001/0> | 0001/0> | 0001/0> | 0019/0 | 0082/0 | |
زمان | 5 ماهگی | b 36/22 | b4/9 | b57/7 | b58/4 | b56/4 | b45/8 | b02/7 | b53/4 | b68/4 |
7 ماهگی | b56/20 | b16/9 | b19/7 | b36/4 | b64/4 | b40/8 | b96/6 | b26/4 | b92/3 | |
9 ماهگی | a56/34 | a98/14 | a32/12 | a93/7 | a58/7 | a92/13 | a73/11 | a63/6 | a80/6 | |
SEM | 761/0 | 533/0 | 483/0 | 277/0 | 302/0 | 469/0 | 681/0 | 265/0 | 293/0 | |
p-value/***/ | 0001/0> | 0001/0> | 0001/0> | 0001/0> | 0001/0> | 0001/0> | 0001/0> | 0001/0> | 0001/0> | |
تیمار×زمان | کنترل-5 ماهگی | b26/22 | c42/9 | bc08/8 | c70/4 | c66/4 | cd38/8 | bc26/7 | b68/4 | b80/4 |
کنترل -7 ماهگی | b72/26 | bc50/12 | b92/10 | b46/6 | b92/6 | b26/11 | ab04/10 | ab66/5 | ab40/5 | |
کنترل-9 ماهگی | a32/35 | a08/16 | a54/14 | a54/8 | a9/8 | a02/16 | a00/14 | a68/6 | a66/6 | |
تیمار-5 ماهگی (قبل از مصرف تاموکسیفن) | b46/22 | c38/9 | c06/7 | c46/4 | c46/4 | c52/8 | bc78/6 | bc38/4 | b56/4 | |
تیمار -7 ماهگی (بعد از مصرف تاموکسیفن) | c4/14 | d82/5 | d46/3 | d26/2 | d36/2 | d54/5 | c88/3 | c86/2 | c44/2 | |
تیمار-9 ماهگی (بعد از پیوند آلوگرافت) | a8/33 | ab88/13 | b10/10 | ab32/7 | bc26/6 | cd82/11 | b46/9 | a58/6 | a94/6 | |
SEM | 076/1 | 754/0 | 683/0 | 392/0 | 427/0 | 663/0 | 963/0 | 375/0 | 414/0 | |
p-value | 0001/0> | 0007/0 | 0004/0 | 0001/0 | 0001/0 | 005/0 | 020/0 | 0021/0 | 0013/0 | |
c,b,a: وجود حروف نامشابه در هر ستون نشان دهنده اختالاف آماری معنیدار بین گروههای مختلف میباشد (05/0>p).
- اثر تیمار و زمان نمونهگیری روی بیومتریک بیضه
نتایج نشان داد که تفاوتی بین عملکرد گروه تیمار و کنترل برای تمام صفات مشاهده شد. آنالیز دادهها نشان داد اثر زمان نمونهگیری بر روی تجمیع گروهها (کنترل و تیمار) برای 5 ماهگی و 7 ماهگی تفاوت معنیداری نداشت این در حالی بود که به لحاظ مقداری، عملکرد تمامی صفات مورد مطالعه برای زمان 9 ماهگی بالاتر از زمان 5 و 7 ماهگی بود و تفاوت معنیداری مشاهده شد (001/0>p).
- اثر متقابل تیمار در زمان
بالاترین و پایینترین میزان اندازه محیط اسکروتوم به ترتیب برای گروه کنترل در 9 ماهگی (32/35) و گروه تیمار در 7 ماهگی مشاهده شد و تفاوت معنیداری داشت (05/0>p). در ماه 7 تفاوت معنیداری بین اندازه محیط اسکروتوم گروه کنترل با تیمار مشاهده شد (05/0>p). در ماههای 5 و 9 تفاوت معنیداری بین گروه کنترل و تیمار از نظر اندازه محیط اسکروتوم مشاهده نشد (05/0<p). در ماه 7 و 9 تفاوت معنیداری بین اندازه بیضه راست با اپیدیدیم گروه کنترل با تیمار مشاهده شد (05/0>p). در ماه 7 و 9 تفاوت معنیداری بین اندازه بیضه راست بدون اپیدیدیم گروه کنترل با تیمار مشاهده شد (05/0>p). بطوریکه بیشترین اختلاف عملکردی بین تیمار کنترل و تیمار در ماه 7 بود.
در ماه 7 و 9 تفاوت معنیداری بین محور قدامی-خلفی بیضه راست گروه کنترل با تیمار مشاهده شد (05/0>p). بطوری که بیشترین اختلاف عملکردی بین تیمار کنترل و تیمار در ماه 7 بود. در ماه 7 و 9 تفاوت معنیداری بین محور داخل به خارج بیضه راست گروه کنترل با تیمار مشاهده شد (05/0>p). بطوریکه بیشترین اختلاف عملکردی بین تیمار کنترل و تیمار در ماه 7 بود. در ماه 7 و 9 تفاوت معنیداری بین صفت بیضه چپ با اپیدیدیم گروه کنترل با تیمار مشاهده شد (005/0>p). بطوریکه بیشترین اختلاف عملکردی بین تیمار کنترل و تیمار در ماه 7 بود. در ماه 7 و 9 تفاوت معنیداری بین بیضه چپ بدون اپیدیدیم گروه کنترل با تیمار مشاهده شد (05/0>p). بیشترین اختلاف عملکردی بین تیمار کنترل و تیمار در ماه 7 بود. بالاترین و پایینترین میزان محور قدامی-خلفی بیضه چپ به ترتیب برای گروه کنترل در ماه 9 (68/6) و گروه تیمار (86/2) در ماه 7 مشاهده شد و تفاوت معنیداری داشت (05/0>p). در ماه 7 تفاوت معنیداری بین محور قدامی-خلفی بیضه چپ گروه کنترل با تیمار مشاهده شد (05/0>p). در ماههای 5 و 9 تفاوت معنیداری بین گروه کنترل و تیمار از نظر محور قدامی-خلفی بیضه چپ مشاهده نشد (05/0<p).
در ماه 7 تفاوت معنیداری بین محور داخل به خارج بیضه چپ گروه کنترل (4/5) با تیمار (44/2) مشاهده شد (05/0>p). این در حالی بود در ماه های 5 و 9 تفاوت معنیداری بین گروه کنترل و تیمار از نظر محور داخل به خارج بیضه چپ مشاهده نشد (05/0<p). برای این صفت علی رغم عملکرد بهتر گروه تیمار با گروه کنترل اما تفاوت معنیداری بین این دو گروه مشاهده نشد (05/0<p).
- تاثیر تاموکسیفن و پیوند آلوگرافت بر میزان هورمونهای خونی
دادهها پس از بررسی همگنی واریانس و نرمالیته باقیمانده ها از طرح کاملا تصادفی در قالب فاکتوریل (2×3) مورد آنالیز قرار گرفتند. نتایج آنالیز آماری نشان داد اثر اعمال فاکتور، زمان نمونه برداری و اثر متقابل تیمار × زمان بر تمامی صفات مورد مطالعه معنیدار بود. همانگونه که در جدول 2 نشان داده شده است اثر اعمال تیمار بر صفات LH، FH و تستسترون معنیدار بود (05/0>p). بطوریکه در هر سه صفت مقدار تیمار شاهد بیشتر از گروه تیمار بود. اثر اعمال زمان نمونهگیری بر صفات LH، FH و تستسترون معنیدار بود (05/0>p). مقادیر این پارامترها در 9 ماهگی بطور معنیداری بیشتر از 5 و 7 ماهگی بود. اثر متقابل تیمار در زمان برای صفات LH و تستسترون معنیدار بود (05/0>p). این در حالی بود که اثر متقابل تیمار در زمان برای صفت FH معنیدار نبود. تفاوت معنیداری بین میزان LH تیمار کنترل و شاهد در ماههای 7 و 9 مشاهده شد (05/0>p). این در حالی بود که در ماه 5 تفاوت معنیداری مشاهده نشده است. تفاوت معنیداری بین میزان تستسترون تیمار کنترل و شاهد در ماه 7 مشاهده شد (05/0>p). این در حالی بود که در ماههای 5 و 9 تفاوت معنیداری مشاهده نشد.
جدول 2- اثر تیمار، زمان نمونهبرداری و اثر متقابل تیمار × زمان روی هورمون های تولیدمثلی
| هورمون لوتئینی )ng/ml( | هورمون محرکه فولیکولی (ng/ml) | تستسترون (ng/ml) | |
تیمار | کنترل | 7945/0a | 355/1a | 551/3a |
تیمار | 749/0a | 027/1b | 0368/3a | |
SEM | 0072/0 | 0959/0 | 1104/0 | |
p-value | 0002/0 | 0236/0 | 0031/0 | |
زمان | 5 ماهگی | 7562/0b | 744/0b | 2953/2b |
7 ماهگی | 753/0b | 0109/1b | 6665/2b | |
9 ماهگی | 807/0a | 8176/1a | 9202/4a | |
SEM | 0088/0 | 1175/0 | 13528/0 | |
p-value | 0003/0 | 0001/0> | 0001/0> | |
تیمار×زمان | کنترل-5 ماهگی | 7412/0c | 7758/0 | 2375/2c |
کنترل -7 ماهگی | 7914/0b | 3096/1 | 1204/3b | |
کنترل-9 ماهگی | 851/0a | 9792/1 | 2956/5a | |
تیمار-5 ماهگی | 7712/0b | 7122/0 | 3532/2bc | |
تیمار -7 ماهگی | 7146/0c | 7122/0 | 2126/2c | |
تیمار-9 ماهگی | 7632/0bc | 656/1 | 5448/4a | |
SEM | 0125/0 | 1661/0 | 1913/0 | |
p-value | 0001/0 | 2937/0 | 0283/0 | |
c,b,a: وجود حروف نامشابه در هر ستون نشان دهنده اختالاف آماری معنیدار بین گروههای مختلف میباشد (05/0>p).
- بررسی هیستولوژیکی بافت بیضه از نظر تاثیر تاموکسیفن
نتایج بررسی هیستولوژیکی نمونههای بافتی تهیه شده از بافت بیضه بعد از القای آزواسپرمی در آزمایشگاه در شکل 2 نشان داده شده است.
همانطور که در شکل 2 مشاهده میشود، القای آزواسپرمی با استفاده از تاموکسیفن و به مدت 40 روز منجر به تخریب شدید بافت پوششی زایا در لولههای اسپرمساز شده است به نحوی که جمعیت سلول های اسپرماتوگونی به شدت کاهش یافته است و اثری از ردههای اسپرماتید (کروی و کشیده) در اغلب لولهها مشاهده نمیشود. کاهش ارتفاع بافت پوششی زایا و واکوئله شدن آن در اکثر لوله مشهود است و افزایش فضای لومن و وجود سلولهای بزرگ کنده شده در لولهها مشاهده میشود. کاهش حجم لولهها و چروکیده شدن دیواره آنها به همراه ادم در بافت بینابینی منجر به افزایش فضای بینابینی شده است.
شکل 2- بررسی هیستولوژیکی نمونههای بافتی تهیه شده از بافت بیضه بعد از القای آزواسپرمی (فلش توپر: کاهش ارتفاع بافت پوششی زایا، فلش توخالی: واکوئله شدن، دایره توپر: افزایش فضای لومن، سرفلش توپر: سلولهای بزرگ کنده شده، سرفلش توخالی: چروکیده شدن دیواره لولهها، ستاره: ادم در بافت بینابینی) (رنگ آمیزی هماتوکسلین – ائوزین)
- بررسی هیستولوژیکی بافت بیضه بعداز پیوند آلوگرافت سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از چربی
نتایج بررسی هیستولوژیکی نمونههای بافتی تهیه شده از بافت بیضه بعد پیوند آلوگرافت سلولهای بنیادی در آزمایشگاه در شکل 3 نشان داده شده است.همانطور که در شکل 3 مشاهده میکنید، پس از پیوند آلوگرافت سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از چربی به بیضه آزواسپرمی شده، ساختار لولههای اسپرم ساز کاملا به شکل نرمال است و تمامی جمعیتهای سلولهای رده اسپرماتوژنیک در اکثر لولهها قابل مشاهده است.
شکل 3- بررسی هیستولوژیکی نمونههای بافتی تهیه شده از بافت بیضه بعد پیوند آلوگرافت سلولهای بنیادی (رنگ آمیزی هماتوکسلین – ائوزین)
بحث و نتیجهگیری
تاموکسیفن یک آنتاگونیست استروژن غیراستروئیدی است که به طور رقابتی گیرندههای استروژن را مسدود کرده و عملکرد آگونیستها را مهار میکند، اما به دلیل خاصیت آگونیستی خاص خود، برخی از پاسخهای استروژنی را نیز القا میکند (Hoffmann and Schuler, 2000). تجلی این اقدامات مختلف به گونه، اندام و نوع بافت و سلول بستگی دارد (Motrich et al., 2007). مکانیسمهای دقیق این دوگانگی کاملاً درک نشده است، اما ممکن است مربوط به تحریک گیرنده های استروژنی متنوع در سلولهای گوناگون باشد (Hoffmann and Schuler, 2000). بسیاری از محققین معتقدند که، تاموکسیفن اثراتی بر عملکرد نهایی غدد جنسی، شمارش اسپرم و نتایج حاملگی دارد (Parker et al., 1986). باتوجه به احتمال نقش استروژن در اسپرماتوژنز و موقعیت گیرندههای استروژنی در بیضه (Pagano et al., 2001) و با علم به اینکه تاموکسیفن یک داروی آنتی استروژنی است، که اثرات خود را از طریق اتصال به گیرندههای استروژنی اعمال میکند، این احتمال وجود دارد که تاموکیسفن باعث ایجاد اختلال در اسپرماتوژنز و کاهش بارورری اسپرم گردد (Chen et al., 2007). پیوتر و همکاران در سال 2007 اثرات تخریبی تاموکسیفن را بر روی مجاری تناسلی موشهای نر نژاد NMRI مورد بررسی قرار دادند که نتایج پژوهش حاضر در خصوص تاثیر تاموکسیفن در ایجاد آزواسپرمی در قوچ با نتایج این مطالعه مطابقت دارد (Piotr et al., 2007).
دانل و همکاران در سال 2001، تاثیرات تاموکسیفن را بر کیفیت و میزان باروری اسپرم، بررسی کردند. طبق نتایج حاصله، تزریق داروی تاموکسیفن با دوز 4 mg/kg به رتهای نر، تعداد اسپرم و میزان تحرک آنها را تغییر داد و باعث اثرات منفی بر اسپرماتوژنز و تخریب اسپرماتیدها گردید (Donnell et al., 2001). در مطالعه عریان و همکاران در سال 2008، سه گروه از رتها به مدت 30 روز متوالي به ترتیب 200 ،400 و 600 ميكروگرم تاموكسيفن بر كيلوگرم وزن بدن در حلال (شامل اتانول 60 درصد و سرم فيزيولوژی) دریافت نمودند. نتايج نشان دادند كه غلظت تستوسترون خون و تعداد اسپرم اپيديديم در گروههاي دريافتكنندهي تاموكسيفن، كاهش چشمگيري در مقايسه با گروه كنترل داشت (Oryan et al., 2008). این نتایج با نتایج مطالعه ما مطابقت داشت.
پیوند آلوگرافت به معنی انتقال بافت از یک موجود به موجود دیگری از همان گونه است. در پیوند آلوژنیک، بیمار بافت پیوندی را از فردی غیر از خود یا دوقلوی مشابه خود دریافت میکند. سلولهای بنیادی مزانشیمی بخاطر قابلیتهای تعدیل سیستم ایمنی بسیار مشهور هستند. به طور خاص، اعتقاد بر این است که خاصیت سرکوبکننده سیستم ایمنی آنها اجازه پیوند آلوژنیک یا حتی ژنوژنیک آنها را به گیرندههای توانایی ایمنی بدون استفاده از داروهای سرکوبکننده سیستم ایمنی میدهد (Lin et al., 2012). سلول بنیادی مشتق از چربی، به دلیل سهولت جدا شدن از یک منبع بافت فراوان، یک سلول بنیادی مزانشیمی امیدوارکننده برای درمان طیف وسیعی از بیماریها است. نشان داده شده است که سلول بنیادی مشتق از چربی فاقد بیان عمده سازگاری بافتی-II است و اثرات سرکوبکننده سیستم ایمنی آن با واسطه پروستاگلاندین E2 انجام میشود. پیوند آلوژنیک سلولهای ژرم از بیضه اهداکنندگان به گیرندهها منجر به تولید فرزندان مشتق از اهداکننده به دنبال جفتگیری طبیعی در موش و رت شده است (Brinster and Avarbock, 1994, Jiang and Short, 1995). از روش پیوند سلولهای زایای مردانه برای مطالعه کنترل اسپرماتوژنز بسیار استفاده شده است. اخیراً، این روش برای خوکها (Honaramooz et al., 2002)، بزها (Honaramooz et al., 2003) و گاوها (Izadyar et al., 2003, Stockwell et al., 2009) استفاده شده است. در سال 2003، اولین حیوان تولید شده توسط پیوند سلولهای زایا یک بز بود (Honaramooz et al., 2003). پیوند سلولهای زایای نر به دلیل استفاده بالقوه از آن برای تولید حیوانات تراریخته (Honaramooz et al., 2008)، تکثیر پدران برتر (Herrid et al., 2009) و حفظ مواد ژنتیکی، در گونههای دام مورد توجه قرار میگیرد. پاسخ ایمونولوژیک به پیوند سلولهای زایا با توجه به نتایج متضادی که برای پیوندهای آلوژنیک در گونههای جوندگان (Brinster and Avarbock, 1994, Kanatsu-Shinohara et al., 2003) و غیر جوندگان (Honaramooz et al., 2003) ارائه شده است، بسیار مورد توجه قرار گرفته است. در مقابل، پیوند موفقیت آمیز سلولهای زایای آلوژنیک در بزها بدون استفاده از گیرندههای نابارور یا سرکوب سیستم ایمنی انجام شد (Honaramooz et al., 2003). نتایج مطالعات هرید و همکاران در سال 2009 بعد از پیوند سلولهای زایای هترولوگ در گاوها نیز مفهوم تحمل ایمنی در بیضه گونههای دام را پشتیبانی میکند (Herrid et al., 2009, Stockwell et al., 2009). ما نشان دادیم که پیوند سلولهای بنیادی مشتق از چربی در خوکچه‌های هندی آزواسپرمی می‌تواند با موفقیت باروری را بازیابی کند و اسپرم‌زایی را القا کند. یافتههای مشابه نشان داد که سلولهای بنیادی مشتق از چربی میتوانند باروری را در آزواسپرمی ناشی از بوسولفان در موش صحرایی (Cakici et al., 2013, Lue et al., 2007)، همستر (Tamadon et al., 2015) و موش (Lue et al., 2007) بازیابی کنند. کاکیچی و همکاران در سال 2013 گزارش کردند که پیوند سلولهای بنیادی مشتق از چربی پس از 12 هفته می تواند موش های صحرایی نر نابارور تحت درمان با بوسولفان را بهبود بخشد و باعث تولید اسپرم شود (Cakici et al., 2013). لو و همکاران در سال 2007 نشان داد که انجام پیوند سلولهای بنیادی مشتق از چربی در مدل موش نابارور تحت درمان با بوسولفان ممکن است به سلول های سرتولی، و لایدیگ تمایز یابد (Lue et al., 2007). این نتایج با نتایج پژوهش حاضر همخوانی داشت.
یافتههای این پژوهش حاکی از بهبود تغییرات پاتولوژیک در لولههای اسپرمساز پس از پیوند سلول بود. پیوند سلولهای بنیادی مشتق از چربی می توانند تولید انواع سلول های ژرمینال را در لولههای اسپرمساز بیضه القاء کنند و منبع موثری برای درمان آزواسپرمی هستند. بنابراین، سلولهای بنیادی مشتق از چربی می توانند کاندید مناسبی برای بهبود آزواسپرمی و بازیابی ناباروری باشند.
سپاسگزاری
نویسندگان از معاونت پژوهشی دانشگاه تبریز به خاطر فراهم نمودن منابع مالی آن و از مهندسين و کارکنان محترم بخش علوم دامی ایستگاه تحقیقاتی خلعتپوشان به خاطر فراهم نمودن امكانات موردنياز و نيز پشتيباني‌هاي همه جانبه در انجام اين تحقيق سپاسگزارند.
تعرض منافع
نویسندگان اعلام میدارند که هیچگونه تضاد منافعی ندارند.
منابع
· Berookhim, B.M., and Schlegel, P.N. (2014). Azoospermia due to spermatogenic failure. Urologic Clinics, 41(1): 97-113.
· Brinster, R.L., and Avarbock, M.R. (1994). Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences, 91(24): 11303-11307.
· Cakici, C., Buyrukcu, B., Duruksu, G., Haliloglu, A.H., Aksoy, A., Isık, A., et al. (2013). Recovery of fertility in azoospermia rats after injection of adipose-tissue-derived mesenchymal stem cells: the sperm generation. BioMed research international, 1-18.
· Chen, Y., Jefferson, W.N., Newbold, R.R., Padilla-banks, E. and Pepling, M.E. (2007). Estradiol, progesterone, and genistein inhibit oocyte nest breakdown and primordial follicle assembly in the neonatal mouse ovary in vitro and in vivo. Endocrinology, 148(8): 3580-3590.
· Donnell, L.O., Robertson, K., Jones, M., Simpson, E. and Henry, P. (2001). Estrogen and spermatogenesis. Endocrine reviews, 22(3): 289-318.3.
· Rosenberger, G. (1992). Clinical examination of cattle. Verlog Paul Parey/W.B. Saunders Company.
· Herrid, M., Olejnik, J., Jackson, M., Suchowerska, N., Stockwell, S., Davey, R., et al. (2009). Irradiation enhances the efficiency of testicular germ cell transplantation in sheep. Biology of reproduction, 81(5): 898-905.
· Hoffmann, B., and Schuler, G. (2000). Receptor blockers—general aspects with respect to their use in domestic animal reproduction. Animal reproduction science, 60(2): 295-312.
· Honaramooz, A., Behboodi, E., Blash, S., Megee, S.O. and Dobrinski, I. (2003). Germ cell transplantation in goats. Molecular Reproduction and Development: Incorporating Gamete Research, 64(4): 422-428.
· Honaramooz, A., Megee, S., Zeng, W., Destrempes, M.., Overton, S.A., Luo, J., et al. (2008). Adeno‐associated virus (AAV)‐mediated transduction of male germ line stem cells results in transgene transmission after germ cell transplantation. The FASEB Journal, 22(2): 374-382.
· Honaramooz, A., Megee, S.O. and Dobrinski, I. (2002). Germ cell transplantation in pigs. Biology of reproduction, 66(1): 21-28.
· Izadyar, F., Den Ouden, K., stout, T., Stout, J., Coret, J., Lankveld, D., et al. (2003). Autologous and homologous transplantation of bovine spermatogonial stem cells. Reproduction, 126(6): 765-774.
· Jiang, F.X. and Short, R. (1995). Male germ cell transplantation in rats: apparent synchronization of spermatogenesis between host and donor seminiferous epithelia. International journal of andrology, 18(6): 326-330.
· Kaffashi elahi, R., Mouasvi, G., Hejazi, S., Nouri, K. and Kalantari, S. (2011). Effects of Tribulus tertesris extract on body weight, testis histopathology and size in rats. Veterinary Clinical Pathology c Journal, 5(1): 1043-1049. [In Persian]
· Kanatsu-shinohara, M., Ogonuki, N., Inoue, K., Ogura, A., Toyokuni, S., Honjo, T., et al. (2003). Allogeneic offspring produced by male germ line stem cell transplantation into infertile mouse testis. Biology of reproduction, 68(1): 167-173.
· Kazemi, D., Shams asenjan, K., Dehdilani, N., Parsa, H., Movassagh pour akbari, A. and Akbarzadeh, P. (2016). Isolation, culture expansion and characterization of canine bone marrow derived mesenchymal stem cells. Veterinary Clinical Pathology, 10(2): 127-142. [In Persian].
· Lin, C.S., Lin, G. and Lue, T.F. (2012). Allogeneic and xenogeneic transplantation of adipose-derived stem cells in immunocompetent recipients without immunosuppressants. Stem cells and development, 21(15): 2770-2778.
· Lue, Y., Erkkila, K., Liu, P.Y., Ma, K., Wang, C., Hikim, A.S. and Swerdloff, R.S. (2007). Fate of bone marrow stem cells transplanted into the testis: potential implication for men with testicular failure. The American journal of pathology, 170(3): 899-908.
· Mehrabani, D., Hassanshahi, M.A., Tamadon, A., Zare, S., Keshavarz, S., Rahmanifar, F., et al. (2015). Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells repair germinal cells of seminiferous tubules of busulfan-induced azoospermic rats. Journal of human reproductive sciences, 8(2): 103-110.
· Mohebbi, M., Moghaddam, G., Qasemi Panahi, B., Nouri, M. (2023). Isolation and Morphological Characterization of Ovine Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells in Scanning Electron Microscopy (SEM). Iranian Journal of Applied Animal Science, 13(1): 89-95.
· Motrich, R.D., Ponce, A.A. and Rivero, V.E. (2007). Effect of tamoxifen treatment on the semen quality and fertility of the male rat. Fertility and sterility, 88(2): 452-461.
· O'brien, K.L.F., Varghese, A.C. and Agarwal, A. (2010). The genetic causes of male factor infertility: a review. Fertility and sterility, 93(1): 1-12.
· Olfati, A., Moghaddam, G.h., Khafar, K.R., Mojtahedin, A., Abdolahzadeh, A. (2018). Role of follicle-stimulating hormone and estradiol benzoate in recovering spermatogenesis in tamoxifen-injured rats. Asian Pacific Journal of Reproduction, 7(6): 248-253.
· Oryan, S., Parivar, K. and Asle rousta, M. (2008). Effect of tamoxifen on histological structure of testis in adult male Wistar rats. Medical Sciences Journal, 18(2): 81-84.
· Pagano, G., De biase, A., Deeva, I. B., Degan, P., Doronin, Y.K., Iaccarino, M., et al. (2001). The role of oxidative stress in developmental and reproductive toxicity of tamoxifen. Life sciences, 68(15): 1735-1749.
· Parker, L.N., Gray, D.R., Lai, M.K. and Levin, E.R. (1986). Treatment of gynecomastia with tamoxifen: a double-blind crossover study. Metabolism, 35(8): 705-708.
· Piotr, B., Wrona, Z., Krakowski, L. & Brodzki, A. (2007). Influnce of tamoxifen on sexual impulse and semen biologica values in male dug. Bull Vet Inst Pulawy, 51(3): 383-91.
· Rahmanifar, F., Tamadon, A., Mehrabani, D., Zare, S., Abasi, S., Keshavarz, S.,et al. (2016). Histomorphometric evaluation of treatment of rat azoosper-mic seminiferous tubules by allotransplantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Iranian Journal of Basic Medical Sciences, 19(6): 653-661.
· Stockwell, S., Herrid, M., Davey, R., Brownlee, A., Hutton, K. and Hill., J.R. (2009). Microsatellite detection of donor-derived sperm DNA following germ cell transplantation in cattle. Reproduction, Fertility and Development, 21(3): 462-468.
· Tamadon, A., Mehrabani, D., Rahmanifar, F., Jahromi, A.R., Panahi, M., Zare, S., et al. (2015). Induction of spermatogenesis by bone marrow-derived mesenchymal stem cells in busulfan-induced azoospermia in hamster. International journal of stem cells, 8(2): 134-145.
· Zhang, D., Liu, X., Peng, J., He, D., Lin, T., Zhu, J., Li, X., Zhang, Y., et al (2014). Potential spermatogenesis recovery with bone marrow mesenchymal stem cells in an azoospermic rat model. International journal of molecular sciences, 15(8): 13151-13165.
Hormonal, biometric and histological investigation of testis after allograft transplantation in rams
Abstract
Stem cells are undifferentiated cells with the ability to renew and divide indefinitely to generate specialized cells. Therefore, the aim of the present study is to hormonal, biometric and histological investigation of testis after allograft transplantation in rams. In the present study, 5 male lambs (less than 6 months old) were used as recipients, 5 lambs were as donors, 5 lambs as to confirm the effectiveness of tamoxifen sand 5 lambs as controls. Azoospermia was induced in both testes of five lambs by orally administration of tamoxifen. Adipose tissue from 5 male lambs was biopsied and the cells isolated and cultured according to recommended routine laboratory guidelines. This was followed by a transplantation of mesenchymal stem cells from adipose tissue onto the male recipients. The circumference of the scrotum and the dimensions of the testis were measured during three stages before and after the induction of azoospermia and after transplantation. Blood sampling in sheep was also done in three stages. 49 days after transplantation, one of the testicles was removed and sent to the laboratory for histological evaluation. The highest and lowest scrotal circumference sizes were respectively related to the control group at the age of 9 months (32.35 cm) and the treatment group at the age of 7 months, and there was a significant difference (p<0.05). The effect of applying the factor, sampling time and interaction effect of treatment × time on all studied traits was significant. Induction of azoospermia using tamoxifen led to severe destruction of the germinal epithelium in seminiferous tubules. Transplantation of stem cells obtained from adipose tissue can lead to successful induction of spermatogenesis in the seminiferous tubules of azoospermic sheep. Therefore, this technique can be used for the transfer of stem cells from a superior animal as a donor for the production of functional sperm in another animal of the same species.
Conflict of interest: None declared
Keywords: Allograft transplantation, Ram, Stem cells.