Antimicrobial and antibiofilm potential of biosurfactants isolated from lactobacillus acidophilus and lactobacillus casei against pathogenic bacteria

Subject Areas : Food Microbial Contamination

Fatemeh Noorbakhsh ¹ , alireza varpaei ² , sahar Honarmand Jahromi ³

1 - Islamic Azad University,Varamin-Pishva,Iran
2 - Department of Microbiology, Biological Science College, Varamin-pishva branch, Islamic Azad University,Varamin-Pishva,Iran
3 - Department of Microbiology, Biological Science College, Varamin-pishva branch, Islamic Azad University,Varamin-Pishva,Iran

Received: 2023-02-25 Accepted : 2023-10-19 Published : 2023-09-23

Keywords: ", Lactobacillus acidophilus, ", Lactobacillus casei", , ", biosurfactant", , ", biofilm",

Abstract :

Introduction: One of the characteristics of lactobacilli is their ability to produce biosurfactant compounds. In this research, the biosurfactant of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei was used to evaluate the antimicrobial and anti-biofilm potential against four pathogenic bacteria including Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii. Materials and methods: Biosurfactant extraction was done from Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei, using the method of determining the minimum growth inhibitory concentration (MIC) was used to determine the antimicrobial potential. Also, the micro titer plate method was used to measure the anti-biofilm potential and the type of biofilm of each strain was determined in the presence of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei biosurfactant in different concentrations.Results: Determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) for pathogen strains, the highest percentage was observed at the concentration of 125 and 250 mg/ml. The anti-biofilm effect of biosurfactant has been used in the approximate concentrations of 62.5 mg/ml, 125 mg/ml and 250 mg/ml. Determination of antibiotic sensitivity showed the results of sensitive, semi-sensitive and resistant states, but the results obtained for Acinetobacter baumannii shows resistance to all antibiotic discs.Conclusion: The biosurfactant isolated from Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei had antibacterial properties against pathogenic bacteria, also the biosurfactant of Lactobacilli showed that it has anti-biofilm capability.

Full-Text:



پتانسیل ضد میکروبی و ضد بیوفیلمی بیوسورفکتانت جدا شده از لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسیلوس کازئی بر باکتری های بیماریزا

 

 

چکیده:

هدف: يکي از ويژگي هاي لاکتوباسيلوس ها توانايي آنها در توليد ترکيبات بيوسورفکتانت مي باشد. در این تحقیق از بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس ولاکتوباسیلوس کازئی جهت سنجش پتانسیل ضد میکروبی و ضد بیوفیلمی علیه چهارباکتری بیماریزا شامل اشریشیاکلی، استافیلوکوکوس اورئوس، سودوموناس آئروژینوزا و اسينتوباکتر بوماني استفاده گردید.

مواد و روش: استخراج بیوسورفکتانت از لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس ولاکتوباسیلوس کازئی صورت گرفت، با استفاده از تکنیک آزمایشگاهی تعیین حداقل غلظت ممانعت کننده از رشد (MIC) جهت سنجش پتانسیل ضد میکروبی استفاده شد. همچنین از روش میکرو تیتر پلیت جهت سنجش پتانسیل ضد بیوفیلمی استفاده شد و نوع بیوفیلم هر سویه در حضور بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس ولاکتوباسیلوس کازئی در غلظت های متفاوت مشخص شد.

یافته ها: تعیین حداقل غلظت ممانعت کننده از رشد (MIC) برای سویه های پاتوژن بیشترین درصد بازدارنده از رشد در غلظت 125و250 میکروگرم برمیلی لیتر مشاهده شد. اثر ضد بیوفیلمی بیوسورفکتانت در غلظت های تقریبی5/62 ،125 و 250 میلی گرم بر میلی لیتر مورد استفاده قرار گرفت، تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی بر باکتری ها به صورت حساس، نیمه حساس و مقاوم بود اما سویه های اسینتوباکتربومانی نسبت به تمام آنتی بیوتیک ها مقاوم بودند.

نتیجه گیری: بیوسورفکتانت جدا شده از لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسیلوس کازئی دارای خواص ضد باکتریایی در برابر باکتری های پاتوژن بود، همچنین بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس ها نشان داد که دارای قابلیت ضد بیوفیلمی می باشد.

 

کلمات کلیدی: لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس، لاکتوباسیلوس کازئی ، بیوسورفکتانت، بیوفیلم

 

 

مقدمه

لاکتوباسيلوس ها گروه مهمي از باکتري هاي توليد کننده اسيدلاکتيک می باشند. این باکتری ها گرم مثبت، بدون اسپور، کاتالاز منفي، ميکروآئروفيل و به شکل ميله هاي بلند، باريک و گاهي خميده و کوتاه به شکل کوکوباسيل ديده مي شوند(Hall- Stoodley et al 2004). اين باکتری ها انرژي خود را از طريق تخمير کربوهيدرات ها و توليد اسيدلاکتيک به دست مي آورند و مي توان گفت که اين باکتري ها تخميرکننده هاي اجباري مي باشند(Hoang-Dung et al 2004). با توجه به اثرات سلامتی بخش باکتريهاي اسید لاکتیک به عنوان ارگانیسمهاي پروبیوتیک، این باکتريها مورد توجه بسیار زیادي قرار گرفته اند. يکي از ويژگي هاي لاکتوباسيلوس ها توانايي آنها در توليد ترکيبات بيوسورفکتانت مي باشد(Van Hamme et al 2006 Banat et al 2000,). بیوسورفکتانت ها گروه متنوعي از ترکيبات بوده که توسط برخي از باکتري ها، قارچ ها و جلبک ها توليد مي شوند(Besson et al 1992). بیوسورفکتانت ها ترکیبات زیستی آمفی فیلیکی شامل يک بخش قطبي و محلول در آب و يک بخش غیر قطبی ومحلول در چربي مي باشند ( Banat et al 2010). این ترکیبات به صورت خارج سلولی یا بخشی از غشاء هاي سلول به وسیله انواع میگروارگانیسم ها تولید می گردند(Banat et al 2010, Cameotra et al 2010 ). بیوسورفاکتانت ها براي جلوگیري از چسبندگی ارگانیسم هاي بیماري زا به سطوح جامد یا به محل هاي عفونت، تولید می شوند(Mireles et al 2001). بیوسورفاکتانت ها کاربردهاي بسیار گسترده اي در صنایع غذایی دارند(Bodour et al 2004, Kosaric et al 2001 ). اما یکی دیگر از کاربرد هاي بیوسورفکتانت ها فعالیت ضدمیکروبی آنها است، از این رو بیوسورفاکتانت یک جایگزین مناسب براي داروهاي ترکیبی هستند(Singh et al 2004). بیوفیلم به عنوان گروهی از، باکتري هایی است که در یک سطح کلونیزه می شوند(Hood et al 1995). پخش و گسترش بیوفیلم مرحله بسیار مهم و با اهمیت در روند تکامل سلول‌ها و جامعه تشکیل شده در داخل بیوفیلم است(Flemming et al 2016). پخش بیوفیلم در سودوموناس آئروژینوزا وابسته به افزایش غلظت کربن و نیتروژن می باشد (Whitchurch et al 2002, Drenkard et al 2002 ). به منظور بقا در محیط طبیعی و رقابت بر سرمنابع با سایر میکروارگانیسمها، باکتریها ترکیبات ضد میکروبی اي تولید می کنند که منجر به مهار یا کشته شدن سویه های رقیب می شوند. به نظر می رسد که تمام باکتریها توان تولید ترکیبات ضد میکروبی را دارند و ما تنها باید گونه هاي تولید کننده نوع خاصی از این ترکیبات و شرایط رشد باکتري را براي تولید آنها شناسایی کنیم(Shetty et al 2005). باکتريهاي اسید لاکتیک از قابلیت تولید ترکیبات ضد میکروبی نظیر اسیدهاي آلی، دي استیل، استون، پراکسید هیدروژن، پپتیدهاي ضدقارچی، بیوسورفکتانت و باکتریوسینها برخوردارند که در مقابل طیف وسیعی از عوامل بیماريزا و مولد فساد مؤثر می باشند با توجه به اهمیت بیوسورفکتانت ها و اثرات آن بر باکتری ها در این تحقیق پتانسیل ضد میکروبی و ضد بیوفیلمی بیوسورفکتانت جدا شده از لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسیلوس کازئی بر باکتری های بیماریزای تشکیل دهنده بیوفیلم شامل اشریشیاکلی، استافیلوکوکوس اورئوس، سودوموناس آئروژینوزا و اسینتوباکتر بومانی بررسی گردید(Galvez et al 2007).

مواد وروش کار

نمونه برداری

این مطالعه بر روی 40 سویه باکتری شامل10 سویه اشریشیا کلی، 10 سویه اسینتوباکتر بومانی، 10 سویه سودوموناس آئروژینوزا و 10 سویه استافیلوکوکوس اورئوس انجام شد، سویه های باکتریایی از نمونه های بالینی از بیماران بستری در بیمارستان میلاد تهران جدا شد و سپس آزمایشات لازم جهت برسی آن ها انجام گرفت.

تهیه لاکتوباسیلوس ها

لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس  (1643PTCC) و لاکتوباسیلوس کازئی (1608  PTCC) از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران تهیه شد.

توليد و استخراج بيوسورفکتانت

ابتدا لاکتوباسیل ها در یک ارلن حاوي200 ميلي ليتر محيط MRS broth کشت داده شده و به مدت 3 شبانه روز در دماي 37 درجه سلسیوس بر روی شیکر با سرعت150 دور در دقیقه گرمخانه گذاری گردید. سپس محتویات ارلن به مدت 20 دقيقه در دماي 4 درجه سلسیوس و دور rpm 14000 با استفاده از سانتريفيوژ يخچال دار سانتريفيوژ گردید تا سلول هاي باکتريايي کاملا ته نشين شوند. توسط اسید کلریدریک 1 نرمال، pH  مايع رويي بدست آمده را به 2 رسانده و به مدت يک شبانه روز در دماي 4 درجه سلسیوس قرار داده شد تا بيوسورفکتانت رسوب کند. رسوب قهوه ای حاوی بیوسورفکتانت با استفاده از سانتریفیوژ در دماي 4 درجه سلسیوس به مدت 20 دقيقه در  rpm 12000 جداسازی شد. جهت خالص سازي نسبي بيوسورفکتانت، 10 ميلي ليتر مخلوط کلروفرم/ متانول به نسبت 2:1 به رسوب بدست آمده، افزوده شد و به مدت 15 دقيقه بر روي شيکر با سرعت rpm 150 در دماي 30 درجه سلسیوس قرار داده شد. اين ترکيب را دوباره در rpm 12000  به مدت 20 دقيقه در دماي 4 درجه سلسیوس سانتريفيوژ کرده سپس مايع رويي در گرمخانه در دماي 40 درجه سلسیوس قرار داده شد تا کاملا خشک شود. در نهايت بيوسورفکتانت به صورت رسوب سفيد رنگ از مايع رويي بدست آمد(Suresh Chander et al 2012).

تعیین حداقل غلظت ممانعت کننده از رشد (MIC)        

در این روش ۱۰ رقت متوالی از بیوسورفکتانت مورد نظر را ساخته و مورد ارزیابی قرار گرفت. برای این منظور ابتدا یک سری ۱۰ تایی از لوله های  استریل حاوی 1  میلی لیتر آب مقطر استریل، برداشته و شماره گذاری شد. توسط سمپلر ۱ میلی لیتر از استوک اولیه تهیه شده از بیوسورفکتانت (غلظت ۵00 میکروگرم در میلی لیتر) برداشته و به لوله اول اضافه شد. بعد از اینکه محلول داخل لوله توسط شیکر به طور کامل مخلوط شد، ۱ میلی لیتر از محلول لوله اول برداشته و به لوله دوم اضافه شد و به همین ترتیب تا لوله شماره ۱۰ انجام شد. در نهایت ۱ میلی لیتر از محلول لوله شماره ۱۰ برداشته و دور ریخته شد. به این ترتیب تمام لوله ها حاوی ۱ میلی لیتر محلول بوده با این تفاوت که یک شیب غلظت از لوله اول به سمت لوله ۱۰ ایجاد شده که رقت بیوسورفکتانت در آنها رو به کاهش است و هر لوله حاوی نصف رقت بیوسورفکتانت در لوله قبلی است. رقت های تهیه شده از بیوسورفکتانت  به ترتیب ۲۵0، ۱۲5، 5/62، 25/31، 62/15، 81/7، 90/3، 95/1، 97/0، 48/0 میکروگرم در میلی لیتر بود. نتیجه MIC بر اساس کدورت محیط کشت که نشان دهنده رشد باکتری است بررسی می‌گردد. یعنی باکتری اگر رشد نکند باید به شکل لوله شفاف باشد. جهت ارزیابی اثر رقت های مختلف بیوسورفکتانت بر روی باکتری به روش میکرو دایلوشن براث، از میکروپلیت های ۹۶ خانه ای استفاده شد. 100 میکرولیتر سوسپانسیون میکروبی (معادل نیم مک فارلند) از باکتری موردنظر که در محیط کشت تهیه شده بود، در کل چاهک های مربوط به هر ردیف ریخته شد( به جز ۲ چاهک آخر که به عنوان کنترل منفی و کنترل مثبت در نظر گرفته شدند). سپس 100 میکرولیتر از رقت های بیوسورفکتانت در چاهک مربوط به آن رقت ریخته شد. چاهک کنترل مثبت حاوی سوسپانسیون میکروبی مورد نظر و 100 میکرولیتر محیط کشت، چاهک کنترل منفی حاوی استوک اولیه بیوسورفکتانت و 100 میکرولیتر محیط کشت بود. در چاهک کنترل مثبت باید کدورت (رشد باکتری) مشاهده شود و چاهک کنترل منفی باید کاملا شفاف (بدون رشد باکتری) باشد. سپس میکروپلیت ها را به مدت ۳۰  ثانیه روی شیکر قرار داده شد تا مخلوط کاملا یکنواخت شود. میکروپلیت ها را به مدت ۱۸ ساعت در انکوباتور با دمای ۳۵ درجه قرار داده شد. سپس کمترین رقت از بیوسورفکتانت  که در آن کدورتی دیده نمی شود به عنوان حداقل غلظت مهارکنندگی در نظر گرفته شد. کدورت چاهک ها با کدورت چاهک کنترل مثبت و شفافیت و وضوح چاهک ها با چاهک کنترل منفی مقایسه شد.

تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی به روش انتشار در آگار(کربی بایر) 

سوسپانسیون باکتریایی معادل نیم مک فارلند تهیه شد، سپس بر روی محیط مولرهینتون آگار در تمام جهات کشت داده شد، سپس طبق پروتوکل استاندارد CLSI 2020 دیسک های آنتی بیوتیکی  در باکتری های گرم منفی سیپروفلوکساسین (5میکروگرم)، سفتازیدیم(30میکروگرم)،مروپنم(10میکروگرم)،امیکاسین(30میکروگرم)، جنتامایسین(10میکروگرم) و پیپراسیلین(100میکروگرم) و در استافیلوکوکوس اورئوس سیپروفلوکساسین(5 میکروگرم)، اریترومایسین(15میکروگرم)، کلیندامایسین(10 میکروگرم)، پنی سیلین(10 میکروگرم)، جنتامایسین(10 میکروگرم) و نیتروفورانتوئین (300 میکروگرم) در سطح پلیت قرار داده شدند. در انتها پلیت ها به انکوباتور ۳۵ درجه سانتی گراد انتقال داده و نتایج  پس از  18 ساعت مورد بررسی قرار گرفت. 

تولید بیوفیلم با روش میکروتیترپلیت

ابتدا محیط کشت تریپتیکاز سوی براث حاوی 2% گلوکز تهیه و استریل شد. برای تهیه سوسپانسیون باکتری، باکتری مورد مطالعه را در مقداری از همین محیط به کدورت نیم مک فارلند رسانده شد. در انتها در یک پلیت 96 خانه به هر چاهک 200 میکرولیتر از محیط یاد شده و 100 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری اضافه شد. میکروپلیت را در 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت گرمخانه گذاری  شد. پس از24 ساعت، چاهک ها سه بار با  PBS  شستشو شد تا باکتری های نچسبیده جدا شوند. در مرحلۀ بعد، سایر باکتری های چسبیده به چاهک با250 میکرولیتر از اتانول 96 درصد به مدت 15 دقیقه فیکس شدند. سپس هر چاهک با 200 میکرولیتر کریستال ویوله 02/0 درصد رنگ شده و پس از 5 دقیقه رنگ با آب مقطر شسته شد. پس از خشک شدن پلیت ها، آنالیز کمّی بیوفیلم با افزودن  200 میکرولیتر از استیک اسید گلاسیال 33 درصد به هر چاهک و خواندن OD  آنها در طول موج   nm640 توسط دستگاه الیزا محاسبه شد.

تحلیل آماری:

در این مطالعه نرم افزار SPSS ver-22 برای آنالیز آماری اطلاعات به دست آمده مورد استفاده قرار گرفت. ارتباط اطلاعات با استفاده از آزمون فیشر بررسی و مقدار P-value کمتر از 05/0 معنی‌دار در نظر گرفته شد.

نتایج

تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی به روش دیسک دیفیوژن در اشریشیا کلی

در این مطالعه مقاوم ترین انتی بیوتیک سفتازیدیم با 80% مقاومت  و حساس ترین انتی بیوتیک جنتامایسین با 80% حساسیت در سویه های اشریشیاکلی مشاهده شد(نمودار1).

 

نمودار 1: فراوانی حساسیت آنتی بیوتیکی در اشریشیا کلی 

بررسی اثرضد میکروبی بیوسورفکتانت لاکتوباسیل ها بر اشریشیاکلی به روش تعیین رقت های متوالی

حداقل غلظت مهار کنندگی برای لاکتوباسیلوس کازئی در غلظت 250 میلی گرم بر میلی لیتر مشاهده شد و برای لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس 90 درصد در غلظت 125 میلی گرم بر میلی لیتر و 10 درصد نیز در غلظت 250 میلی گرم بر میلی لیتر مشاهده شد ( نمودار2 ).

 

نمودار2: فراوانی نسبی اثربیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس ولاکتوباسیلوس کازئی برباکتری اشریشیا کلی

بررسی اثر ضد بیوفیلمی بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس ها بر باکتری اشریشیاکلی

نتایج نشان داد در هر دو غلظت در حضور بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس ها 70% بیوفیلم ضعیف تشکیل شد، همچنین در غلظت 250 میلی گرم بر میلی لیتر بیوفیلم قوی در حضور بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس ها  تشکیل نشد( نمودار3 ). 

 

نمودار3: فراوانی نسبی تشکیل بیوفیلم باکتری اشریشیا کلی درحضوربیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس ولاکتوباسیلوس کازئی در دو غلظت 250 و 125 میلی گرم بر میلی لیتر

تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی به روش دیسک دیفیوژن در باکتری سودوموناس آئروژینوزا        

در این مطالعه مقاوم ترین انتی بیوتیک مروپنم با 50% مقاومت و حساس ترین انتی بیوتیک امیکاسین و سیپروفلوکساسین با 60% حساسیت در سویه های سودوموناس آئروژینوزا مشاهده شد( در نمودار4 ).

 

نمودار 4: فراوانی حساسیت آنتی بیوتیکی در سودوموناس آئروژینوزا

بررسی اثر ضد میکروبی بیوسورفکتانت لاکتوباسیل ها بر سودوموناس آئروژینوزا به روش تعیین رقت های متوالی

حداقل غلظت مهار کنندگی برای لاکتوباسیلوس کازئی 60% در غلظت 125 میلی گرم بر میلی لیتر و40% در غلظت 5/62 میلی گرم بر میلی لیتر مشاهده شد و برای لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس 60% در غلظت 5/62 میلی گرم بر میلی لیتر و 40% درصد نیز در غلظت 125 میلی گرم بر میلی لیتر مشاهده شد( نمودار 5).

 

نمودار5: فراوانی نسبی اثر بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس ولاکتوباسیلوس کازئی برباکتری سودوموناس آئروژینوزا

بررسی اثرضد بیوفیلمی بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس ها برباکتری سودوموناس آئروژینوزا

در غلظت 125 میلی گرم بر میلی لیتر 80% بیوفیلم ضعیف در حضور بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس کازئی تشکیل شد. در این غلظت بیوفیلم قوی در حضور بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس ها تشکیل نشد( نمودار 6).

 

نمودار6: فراوانی نسبی تشکیل بیوفیلم باکتری سودوموناس آئروژینوزا درحضوربیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس ولاکتوباسیلوس کازئی در دو غلظت 125 و 5/62 میلی گرم بر میلی لیتر

تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی به روش دیسک دیفیوژن در استافیلوکوکوس اورئوس

در این مطالعه مقاوم ترین انتی بیوتیک، پنی سیلین با 100% مقاومت و حساس ترین انتی بیوتیک جنتامایسین با 90% حساسیت  در سویه های استافیلوکوکوس اورئوس مشاهده شد( در نمودار7 ). 

 

نمودار 7: فراوانی حساسیت آنتی بیوتیکی در استافیلوکوکوس اورئوس

بررسی اثرضد میکروبی بیوسورفکتانت لاکتوباسیل ها بر استافیلوکوکوس اورئوس به روش تعیین رقت های متوالی

حداقل غلظت مهار کنندگی برای لاکتوباسیلوس کازئی در غلظت های 31 میلی گرم بر میلی لیتر10 درصد، 5/62 میلی گرم بر میلی لیتر 30 درصد و250  میلی گرم بر میلی لیتر 60 درصد مشاهده شد و برای لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در غلظت های15 میلی گرم بر میلی لیتر10 درصد، 5/62 میلی گرم بر میلی لیتر30 درصد، 125 میلی گرم بر میلی لیتر 20 درصد و 250 میلی گرم بر میلی لیتر 40 درصد مشاهده شد(نمودار8). 

 

نمودار8: فراوانی نسبی اثربیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس ولاکتوباسیلوس کازئی برباکتری استافیلوکوکوس اورئوس

بررسی اثرضد بیوفیلمی بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس ها بر باکتری استافیلوکوکوس اورئوس

در غلظت 250 میلی گرم برمیلی لیتر در حضور بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس ها درصد بیوفیلم قوی کمتری نسبت به غلظت 5/62 میلی گرم بر میلی لیتر حاصل شد، در غلظت 250 میلی گرم بر میلی لیتر توانایی تشکیل بیوفیلم در حضور بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس 50% بیوفیلم ضعیف، و در حضور بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس کازئی 50% بیوفیلم متوسط تشکیل شد. در غلظت 5/62میلی گرم بر میلی لیتر توانایی تشکیل بیوفیلم در حضور بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس 70% بیوفیلم قوی و در حضور بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس کازئی 60% بیوفیلم متوسط تشکیل شد ( نمودار9 ).

 

نمودار9: فراوانی نسبی تشکیل بیوفیلم باکتری استافیلوکوکوس اورئوس درحضوربیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس ولاکتوباسیلوس کازئی در دو غلظت 250 و 5/62 میلی گرم بر میلی لیتر

تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی به روش دیسک دیفیوژن در اسینتوباکتربومانی

سیپروفلوکساسین(5میکروگرم)، سفتازیدیم(30میکروگرم)،         مروپنم(10میکروگرم)،امیکاسین(30میکروگرم)، جنتامایسین(10میکروگرم) و پیپراسیلین(100میکروگرم) استفاده شد، نتایج نشان داد که سویه های اسینتوباکتر بومانی به تمام داروهای ضد میکروبی مقاوم است.

بررسی اثرضد میکروبی بیوسورفکتانت لاکتوباسیل ها بر اسینتوباکتربومانی به روش تعیین رقت های متوالی

حداقل غلظت مهار کنندگی برای لاکتوباسیلوس کازئی 90% در غلظت 125 میلی گرم بر میلی لیتر و 10% در غلظت 5/62 میلی گرم بر میلی لیتر مشاهده شد و برای لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس 80% در غلظت 5/62 میلی گرم بر میلی لیتر و 20% نیز در غلظت 125 میلی گرم بر میلی لیتر مشاهده شد(نمودار10).

 

نمودار10: فراوانی نسبی اثربیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس ولاکتوباسیلوس کازئی برباکتری اسینتوباکتربومانی

بررسی اثرضد بیوفیلمی بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس ها بر باکتری اسینتوباکتربومانی

شاخص کنترل در هر دو غلظت 100% بیوفیلم قوی را نشان می دهد، همچنین در غلظت 5/62 میلی گرم برمیلی لیتر در حضور بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس ها60% بیوفیلم قوی تشکیل شد، در صورتیکه در حضور بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس کازئی 40% بیوفیلم قوی تشکیل شد ودر حضور بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بیوفیلم قوی تشکیل نشد،60% بیوفیلم ضعیف و40% بیوفیلم متوسط تشکیل شد (نمودار11).

 

نمودار11: فراوانی نسبی تشکیل بیوفیلم باکتری اسینتوباکتربومانی درحضوربیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس ولاکتوباسیلوس کازئی در دو غلظت 125 و 5/62 میلی گرم بر میلی لیتر

بحث

پروبیوتیک ها میکروارگانیسم هاي غیر پاتوژن و مفیدي هستند که عمدتاً از جنس لاکتوباسیلوس ها و برخی بیفیدوباکتریوم ها می باشند و به عنوان مکمل هاي غذایی با اثرات مفید بر سلامتی مصرف کنندگان شناخته شده اند (Fernández et al 2013). بیوسورفکتانت ها خواص سطحی باکتریایی را تغییر می دهد که باعث می شود سلول ها و خواص چسبندگی آنها را کاهش دهد، این ترکیبات همچنین با برهم زدن مستقیم یکپارچگی غشای پلاسمایی یا دیواره سلولی، سلول های میکروبی را از بین می برند. بزرگی چنین آسیبی ایجاد مقاومت در برابر بیوسورفکتانت را برای هر ارگانیسم هدف دشوار می کند( Banat et al 2014, Satpute et al 2015 ) به عنوان مثال، لیپوپپتیدها منافذی را در غشای سلولی ارگانیسم هدف ایجاد می‌کنند و عدم تعادل در حرکت یون‌ها به داخل و خارج از سلول میکروبی ایجاد می‌کنند که برای سلول آسیب‌دیده کشنده است(Gudiña et al 2016).

در این تحقیق اثر ضد میکروبی بیوسورفکتانت لاکتوباسیل ها بر اشریشیاکلی به روش تعیین رقت های متوالی صورت گرفت، در حضور بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس کازئی اثر ضد میکروبی در غلظت  mg/ml250 مشاهده شد، همچنین در حضور بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس 90% در غلظت  mg/ml 125و 10% در غلظت mg/ml 250 اثر ضد میکروبی حاصل شد، گودینا و همکارانش در سال 2010 با بررسی خواص ضد میکروبی بیوسورفکتانت جدا شده از لاکتوباسیلوس پاراکازئی حداقل غلظت باکتری کش  بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس پاراکازئی علیه باکتری اشریشیاکلی را بین mg/ml 25 و mg/ml 50 نشان داد(Gudiña et al 2010). نوع لاکتوباسیلوس به کار رفته در ازمایش متفاوت است، بنابراین نتایج به دست امده با این تحقیق تفاوت دارد. مصطفی پوررمی و همکارانش در سال 1393 حداقل غلظت ممانعت کننده از رشد بیوسورفکتانت جدا شده از سودوموناس آئروژینوزا بر روی باکتری اشریشیا کلی را در رقت های  mg/ml 63 و mg/ml 125 ارزیابی کردند(Mostafapour-Rami et al 2013). این نتایج با نتایج این تحقیق تا حدودی شباهت دارد.

در این تحقیق بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس کازئی با غلظت  mg/ml125،60 درصد و در غلظت mg/ml5/62 ، 40 درصد اثر ضد میکروبی بر باکتری سودوموناس ائروژینوزا داشت.  همچنین بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس با غلظت mg/ml 5/62 بر باکتری سودوموناس ائروژینوزا 60% و در غلظت mg/ml 125، 40% اثر ضد میکروبی داشت، Satpute و همکارانش در سال 2018 فعالیت ضد میکروبی بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس پاراکازئی را در غلظت 625 میکروگرم بر میلی لیتر علیه باکتری  سودوموناس آئروژینوزا  نشان دادند(Satpute et al 2018 ). Kadhum و همکارانش در سال 2020 ارزیابی فعالیت ضد میکروبی بیوسورفکتانت تولید شده از لاکتوباسیلوس هلویتیکوس را علیه باکتری  سودوموناس آئروژینوزا  بررسی کردند، فعالیت ضد میکروبی بیوسورفکتانت این باکتری در غلظت mg/ml 50 علیه  سودوموناس آئروژینوزا  مشاهده شد. تفاوت در نوع لاکتوباسیلوس ها نتایج را کمی با این تحقیق متفاوت کرده است(Kadhum et al 2020).

در این تحقیق در حضور بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس کازئی با غلظت mg/ml250 بر باکتری  استافیلوکوکوس اورئوس 60% و در غلظت mg/ml 5/62، 30% و در غلظت  mg/ml31، 10%  اثر ضد میکروبی مشاهده شد. همچنین بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس با غلظت mg/ml 250 بر باکتری  استافیلوکوکوس اورئوس 40%، در غلظت mg/ml 5/62، 30% همچنین در غلظت mg/ml 125، 20% و در غلظت  mg/ml15، 10% اثر ضد میکروبی نشان داد، Sambanthamoorthy و همکارانش در سال 2014 با بررسی پتانسیل ضد میکروبی بیوسورفکتانت های جدا شده از لاکتوباسیلوس جانسونی و لاکتوباسیلوس رامنوسوس علیه استافیلوکوکوس اورئوس نتایج را در غلظت mg/ml 50-25 به دست اوردند(Sambanthamoorthy et al 2014).  Sharma و همکارانش در سال 2016 با بررسی عملکردی پتانسیل زیست پزشکی بیوسورفکتانت تولید شده توسط لاکتوباسیلوس هلوتیکوس علیه باکتری استافیلوکوکوس اورئوس فعالیت ضد میکروبی را در غلظت mg/ml 25/6-25 نشان دادند(Sharma et al 2016).

در این تحقیق اثر ضد میکروبی بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس کازئی با غلظت  mg/ml125 بر باکتری اسينتوباکتر بوماني 90% و در غلظت mg/ml 5/62، 10% مشاهده شد، همچنین بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس با غلظت  mg/ml 5/62 بر باکتری اسينتوباکتر بوماني 80% و در غلظت mg/ml 125، 20% اثر ضد میکروبی داشت، Sambanthamoorthy و همکارانش در سال 2014 توانایی‌های ضد میکروبی و ضد بیوفیلمی بیوسورفکتانت تولید شده توسط لاکتوباسیلوس جانسونی و لاکتوباسیلوس رامنوسوس در برابر اسينتوباکتر بوماني  در غلظت های mg/ml 50-25 نشان دادند(Sambanthamoorthy et al 2014).  , Pontapan و همکارانش در سال 2016 فعالیت ضد میکروبی بیوسورفکتانت باسیلوس آمیلولیکوئیفاسینس علیه اسینتوباکتر بومانی  در غلظت های  mg/ml 150 و  mg/ml 200 مشاهده کردند(Pontapan et al 2016). نوع بیوسورفکتانت به کار رفته در ازمایش متفاوت است، بنابراین نتایج به دست امده با این تحقیق تفاوت دارد.  

در این تحقیق اثر ضد بیوفیلمی بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس ها بر باکتری اشریشیا کلی در حضور بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسیلوس کازئی در دو غلظت متفاوت از انها (250میلی گرم بر میلی لیتر و125میلی گرم بر میلی لیتر) بررسی شد، در حضور بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسیلوس کازئی در هر دو غلظت  70% بیوفیلم ضعیف، 20% بیوفیلم متوسط، 10% بیوفیلم منفی تشکیل شد، همچنین 10% بیوفیلم منفی، 70% بیوفیلم ضعیف، 10% بیوفیلم قوی و 10% بیوفیلم متوسط در حضور بیوسورفکتانت  لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در غلظت 125 میلی گرم بر میلی لیتر تشکیل شد، اما در کار تحقیقاتی سلمان و همکارانش در سال 2015 با بررسی بیوسورفکتانت تولید شده توسط لوکونوستوک مزنتروئیدس در غلظت mg/ml 256 تشکیل بیوفیلم را در اشریشیاکلی 54 درصد مهار می کند (Salman et al 2015).  

در این تحقیق اثر ضد بیوفیلمی بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس ها بر باکتری سودوموناس آئروژینوزا در غلظت mg/ml 5/62 بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس کازئی، 40% بیوفیلم ضعیف، 20% بیوفیلم متوسط و 40% بیوفیلم قوی تشکیل شد، همچنین در غلظت mg/ml 5/62 از بیوسورفکتانت  لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس 30% بیوفیلم ضعیف، 40% بیوفیلم قوی و 30% بیوفیلم متوسط تشکیل شد، در حضور بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در غلظت mg/ml 125، 40% بیوفیلم منفی، 10% بیوفیلم متوسط و 50% بیوفیلم ضعیف تشکیل شد، همچنین در غلظت mg/ml 125 بیوسورفکتانت  لاکتوباسیلوس کازئی 80% بیوفیلم ضعیف و 20% بیوفیلم متوسط تشکیل شد، اوحدی و همکارانش در سال 2020 فعالیت ضد بیوفیلمی  بیوسورفکتانت استخراجی از اسینتوباکتر جونی علیه باکتری سودوموناس آئروژینوزا بررسی کردند و مشاهده کردند در غلظت های 1250 میکروگرم بر میلی لیتر و 2500 میکروگرم بر میلی لیتر  از تشکیل بیوفیلم سودوموناس آئروژینوزا جلوگیری کرده است(Ohadi et al 2020).

در غلظت mg/ml 5/62 از بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس کازئی، استافیلوکوکوس اورئوس 10% بیوفیلم ضعیف، 60% بیوفیلم متوسط و 30% بیوفیلم قوی تشکیل شد، همچنین در غلظت  mg/ml 5/62  بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس 10% بیوفیلم ضعیف، 70% بیوفیلم قوی و 20% بیوفیلم متوسط تشکیل شد، در حضور بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در غلظت mg/ml 250، استافیلوکوکوس اورئوس 20% بیوفیلم قوی، 30% بیوفیلم متوسط و50% بیوفیلم ضعیف تشکیل شد، همچنین در غلظت  mg/ml 250 بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس کازئی 20% بیوفیلم ضعیف، 50% بیوفیلم متوسط و 30% بیوفیلم قوی تشکیل شد، مرگانی و همکارانش در سال 2017 بیوسورفکتانت جدا شده از لاکتوباسیلوس کازئی و اثر ضد بیوفیلمی آن در سویه استافیلوکوکوس اورئوس ‌ در غلظت 5 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر فعالیت ضد بیوفیلمی را 80 تا  86  درصد نشان داد(Merghni et al 2017). کریشنا و همکارانش در سال 2018 اثر ضد باکتریایی و ضد بیوفیلمی بیوسورفکتانت استخراجی از اسینتوباکتر ایندیکوس در برابر بیوفیلم استافیلوکوکوس اورئوس را بررسی کردند و نشان دادند بیوسورفکتانت در غلظت 2 میکروگرم در میلی لیتر مانع از تکثیر باکتري میگردد(Krishna et al 2018).

 

نتیجه گیری

بیوسورفکتانت استخراجی از لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسیلوس کازئی نشان داد که دارای خواص ضد باکتریایی در برابر باکتری های پاتوژن مانند اشریشیاکلی، استافیلوکوکوس اورئوس، سودوموناس آئروژینوزا و اسینتوباکتربومانی می باشد، همچنین بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس ها دارای قابلیت ضد بیوفیلمی است، بنابراین با توجه به قابلیت های ذکرشده از بیوسورفکتانت لاکتوباسیلوس ها می توان برای رویکرد درمانی جایگزین جهت پیشگیری و یا درمان عفونت استفاده نمود.  

References

Banat IM, Makkar RS, Cametora SS .Potential commercial application of microbial surfactants.ApplMicrobiolBiotechnol, 2000; 53:495-508.

Banat IM, Franzetti A, Gandolfi I,Bestetti G, Martinotti MG, Fracchia L, et al. Microbial biosurfactants production,applications and future potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 2010;87(2):427-44.

Banat, I.M.; De Rienzo, M.A.; Quinn, G.A. Microbial biofilms: Biosurfactants as antibiofilm agents. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014, 98: 9915–9929.

Besson F, Michel G .Biosynthesis of iturin and surfactin by Bacillus subtilis: Evidence for aminoacid activating enzymes .BiotechnolLett, 1992; 14 (11):1013-1018.

Bodour AA, Guerrero-Barajas C, Jiorle BV, Malcomson ME, Paull AK, Somogyi A, et al. Structure and characterization of flavolipids, a novel class of biosurfactants produced by Flavobacterium sp. Strain MTN11. Applied and environmental microbiology, 2004;70(1):114-20.

Cameotra SS, Makkar RS, Kaur J,Mehta SK. Synthesis of biosurfactants and their advantages to microorganisms and mankind. Journal of bacteriology. 2010;261-80.

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). CLSI M100 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing .2020.

Drenkard, E. and F.M. Ausubel, Pseudomonas biofilm formation and antibiotic resistance are linked to phenotypicvariation. Nature, 2002. 416(6882):740-743.

Fernández, L., S . Langa, V. Martín, A. Maldonado, E. Jiménez, R. Martín and J. M. Rodríguez. The human milk microbiota, origin and potential roles in health and dis eas e Pharmacological Res earch, 2013,69(1): 1-10.

Flemming, H.-C., et al., Biofilms:an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology,2016, 14,(9):563-575.

Galvez A, Abriouel H, Lucas Lopez R, Ben Omar N. Bacteriocin-based strategies for food biopreservation. Inter J Food Microbiol 2007; 120(1-2): 51-70.

Gudiña, Eduardo J., et al. "Antimicrobial and antiadhesive properties of a biosurfactant isolated from Lactobacillus paracasei ssp. paracasei A20." Letters in applied microbiology. 2010, 4,(50): 419-424.‏

 Hall- Stoodley L., Costerton J.W., and Stoodley P, Bacterial biofilms: from the natural word to disease. Nauret Review Journal of Microbiology, 2004. 2 : 95-108.

Hoang-Dung T ,Fennema O ,HuiY ,Walstra P ,Karel M, et al. Lactic Acid Bacteria: Classification and Physiology. In, Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional Aspects, 3th ed.New York, USA, Marcel Dekker Inc, 2004; 18-85.

Hood S, Zottola E. Biofilms in food processing. Food control. 1995;6(1):9-18.

Kadhum, M. K. H., and N. H. Haydar. "Production and characterization of biosurfactant (glycolipid) from lactobacillus helviticus m5 and evaluate its antimicrobial and antiadhesive activity." The Iraqi Journal of Agricultural Science, 2020,51(6): 1543-1558.

Karlapudi A P, Venkateswarulu T C, Srirama, Krishna K, Kota R, Mikkili I,Kodali V P. Evaluation of anticancer, anti-microbial andanti-biofilm potential of biosurfactant extracted, from King SaudUniv Sci, 2018, 7: 4-10.

Kosaric N. Biosurfactants and their application for soil bioremediation. Food Technology and Biotechnology. 2001;39(4):295-304.

Merghni, Abderrahmen, et al. "Antioxidant and antiproliferative potential of biosurfactants isolated from Lactobacillus casei and their anti-biofilm effect in oral Staphylococcus aureus strains." Microbial Pathogenesis , 2017,104: 84-89.

Mireles JR, Toguchi A, Harshey RM. Salmonella enterica serovar Typhimurium swarming mutants with altered biofilmforming abilities: surfactin inhibits biofilm formation. Journal of bacteriology. 2001;183(20):584854.

Mostafapour-Rami M.J, Ahmady-Asbchin S, Isolation and identification of biosurfactant-producing strains from the genus Pseudomonas aeruginosa and antibacterial effects of
biosurfactant production in vitro. Biological Journal of Microorganism,2013, 6, 41-58

Ohadi, Mandana, et al. "Antimicrobial, anti-biofilm, and anti-proliferative activities of lipopeptide biosurfactant produced by Acinetobacter junii B6." Microbial pathogenesis , 2020,138 (36): 1-8.‏

Pontapan P, et al. "Antimicrobial and antiadhesive activities of the crude biosurfactant from Bacillus sp. against clinical isolates of Acinetobacter baumannii from Srinagarind hospital." Srinagarind Medical Journal ,2016,31,(2): 222-227.

Salman, J., and A. Khudair. "Antibacterial and anti-biofilm effect of biosurfactant produced from Leuconos-toc mesenteroides ssp. cremoris against bacteria from catheters." World Journal of Pharmaceutical Research , 2015,4990, (10): 320-333.

Sambanthamoorthy K,  Feng X,  Patel R,  Patel S&  Paranavitan. "Antimicrobial and antibiofilm potential of biosurfactants isolated from lactobacilli against multi-drug-resistant pathogens." BMC microbiology, 2014,14.(1): 1-9.‏

Satpute, S.K.; Banpurkar, A.G.; Banat, I.M.; Sangshetti, J.N.; Patil, R.H.; Gade, W.N. Multiple roles of biosurfactants in biofilms. Curr. Pharm. Des. 2016, 22:1429–1448.

Satpute S, Nishigandha S. Mone P.D, et al. "Lactobacillus acidophilus derived biosurfactant as a biofilminhibitor:a promising investigation using microfluidic approach." Applied Sciences 2018,8,(9): 1555.

Sharma D, and Saharan B.S. "Functional characterization of biomedical potential of biosurfactant produced by Lactobacillus helveticus." Biotechnology Reports, 2016,11: 27-35.

 

Singh P, Cameotra SS. Potential applications of microbial surfactants in biomedical sciences. Trends in Biotechnology. 2004;22(3):142-6.

Suresh Chander CR, Lohitnath T, Mukesh Kumar D J, Kalaichelvan PT .Production and characterization of biosurfactant from bacillus subtilis MTCC441 and its evaluation to use as bioemulsifier for food bio – preservative .Adv App Sci Res, 2012; 3 (3):1827-1831.

Van Hamme JD, Singh A, Ward OP .Devoted to surfactants in microbiology and biotechnology.Biotechnol Advances, 2006; 24 (6):604-620.

Whitchurch, C.B., et al., Extracellular DNA required for bacterial biofilm formation. Science, 2002.295(5559):1487-1487.

 

 

Antimicrobial and antibiofilm potential of biosurfactants isolated from lactobacillus acidophilus and lactobacillus casei against pathogenic bacteria

 

Abstract

 Introduction: One of the characteristics of lactobacilli is their ability to produce biosurfactant compounds. In this research, the biosurfactant of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei was used to evaluate the antimicrobial and anti-biofilm potential against four pathogenic bacteria including Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii.

Materials and methods: Biosurfactant extraction was done from Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei, using the method of determining the minimum growth inhibitory concentration (MIC) was used to determine the antimicrobial potential. Also, the micro titer plate method was used to measure the anti-biofilm potential and the type of biofilm of each strain was determined in the presence of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei biosurfactant in different concentrations.

Results: Determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) for pathogen strains, the highest percentage was observed at the concentration of 125 and 250 mg/ml. The anti-biofilm effect of biosurfactant has been used in the approximate concentrations of 62.5 mg/ml, 125 mg/ml and 250 mg/ml. Determination of antibiotic sensitivity showed the results of sensitive, semi-sensitive and resistant states, but the results obtained for Acinetobacter baumannii shows resistance to all antibiotic discs.

Conclusion: The biosurfactant isolated from Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei had antibacterial properties against pathogenic bacteria, also the biosurfactant of Lactobacilli showed that it has anti-biofilm capability.

 Key words: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, biosurfactant, biofilm

---