Investigating the phytochemical changes of Thymus vulgaris L. essential oil under the influence of ultrasound waves
Asma Amoozegaran
1
(
Department of Applied Chemistry, Faculty of Science, Islamic Azad University, South Tehran Branch, Tehran, Iran
)
حسین دهقان
2
(
هیئت علمی
)
Seyed Saeid Homami
3
(
Department of Applied Chemistry, Faculty of Science, Islamic Azad University, South Tehran Branch, Tehran, Iran
)
Seyed Abdollah Hashemi
4
(
Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, Shahed University, Tehran, Iran
)
Keywords: p-Cymene, Essential oil, &gamma, -Terpinene, Thymol, Thyme, Ultrasound,
Abstract :
Many researches have been conducted to introduce ultrasound as an auxiliary factor to increase the efficiency of extraction of essential oils from medicinal plants. But few researchers have studied the role of ultrasound waves in stimulating chemical reactions on the essential compounds of plants. This research was conducted with the aim of investigating the effect of ultrasound on the components of essential oil of Thymus vulgaris L., after extracting the essential oil and without the presence of plant tissue. For this purpose, the aerial parts of the plant were harvested in June 2021 from the south of Tehran at the flowering stage. The essential oil of the plant was extracted using a distillation apparatus (Clevenger) and its compounds were determined by GC and GC/MS. Subsequently, ultrasonic waves were applied to the extracted essential oil by a titanium probe (400 w) and with three variable factors: temperature, time and ratio of essential oil/ water at three levels. Finally, 27 treated essential oils were prepared and their chemical compounds were quantified by GC. The primary essential oil contained 44.37% thymol, 29.80% p-cymene and 21.24% γ-terpinene. The results showed that the application of ultrasound to the essential oil increased the amount of thymol and decreased the amount of γ-terpinene and p-cymene. By optimizing the conditions (1:0 ratio of thyme essential oil and water, 20˚C and 10 min), we succeeded in reducing the active ingredient thymol from 44.37% to 70.18%. Ultrasonic waves in the presence of water and oxygen cause the production of hydroproxyl radical (HOO˙) and then carry out oxidation reactions to produce thymol from γ-terpinene and p-cymene. The results show that, in addition to helping to increase the efficiency of extraction, ultrasound can cause a change in the chemistry and ratio of phytochemical compounds in the essential oil by stimulating radical reactions.
1748-3th revise 20.10.1402
اصلاحات کامل اعمال نشده لطفا دقت بفرمایید و با هایلایت روی همین فایل مشخص نمایید
بررسی تغییرات فیتوشیمیایی اسانس گیاه دارویی Thymus vulgaris L. تحت تاثیر امواج فراصوت
چکیده
تا کنون تحقیقات بسیاری در راستای معرفی امواج فراصوت به عنوان یک عامل کمکی جهت افزایش راندمان استخراج اسانس گیاهان دارویی صورت گرفته است. اما کمتر محققی به نقش امواج فراصوت در تحریک واکنشهای شیمیایی بر روی ترکیبات اسانس گیاهان پرداخته است. این پژوهش، با هدف بررسی اثر امواج بر روی ترکیبات اصلی اسانس آویشن باغی (Thymus vulgaris L.)، پس از استخراج اسانس و عدم حضور بافت گیاهی انجام شد. بدین منظور، اندام هوایی گیاه آویشن باغی در خرداد 1400 از منطقه جنوب تهران و در مرحله گل دهی برداشت شد. اسانس گیاه به روش توسط دستگاه تقطیر با آب (طرح کلونجر) استخراج و ترکیبات آن توسط روشهای GC و GC/MS شناسایی و اندازهگیری شد. در ادامه امواج فراصوت توسط پراب تیتانیومی (400 وات) و با سه متغیر دما، زمان و نسبت اسانس به آب در سه سطح، بر اسانس مستخرج اعمال شد. در نهایت 27 نمونه اسانس تیمار شده تهیه و ترکیبات شیمیایی تمامی آنها توسط دستگاه کروماتوگرافی گازی اندازهگیری شد. اسانس اولیه شامل 37/44 درصد تیمول، 80/29 درصد پارا-سیمن و 24/21 درصد گاما-ترپینن بود. نتایج حاصل نشان داد که اعمال امواج فراصوت به اسانس آویشن سبب افزایش میزان تیمول و به همان نسبت کاهش میزان گاما-ترپینن و پارا-سیمن شده است. با بهینه سازی شرایط (نسبت 0:1 از اسانس به آب، دمای 20 درجه سانتیگراد و زمان 10 دقیقه) موفق شدیم ماده موثره تیمول را از 37/44 درصد به 18/70 درصد افزایش دهیم. امواج فراصوت در حضور آب و اکسیژن سبب تولید رادیکال هیدروپروکسیل (HOO˙) و در ادامه انجام واکنشهای اکسایشی در راستای تولید تیمول از گاما-ترپینن و پارا-سیمن میگردد. نتایج این پژوهش نشان میدهد که امواج فراصوت علاوه بر کمک به افزایش راندمان استخراج اسانس از بافت گیاهی میتواند با تحریک واکنشهای رادیکالی سبب تغییر در ماهیت و نسبت ترکیبات فیتوشیمیایی در اسانس گردد.
واژههای كليدي: آویشن، اسانس، امواج فراصوت، پارا-سیمن، تیمول، گاما-ترپینن
Investigating the phytochemical changes of Thymus vulgaris L. essential oil under the influence of ultrasound waves
Abstract:
Many researches have been conducted to introduce ultrasound as an auxiliary factor to increase the efficiency of extraction of essential oils from medicinal plants. But few researchers have studied the role of ultrasound waves in stimulating chemical reactions on the essential compounds of plants. This research was conducted with the aim of investigating the effect of ultrasound on the components of essential oil of Thymus vulgaris L., after extracting the essential oil and without the presence of plant tissue. For this purpose, the aerial parts of the plant were harvested in June 2021 from the south of Tehran at the flowering stage. The essential oil of the plant was extracted using a distillation apparatus (Clevenger) and its compounds were determined by GC and GC/MS. Subsequently, ultrasonic waves were applied to the extracted essential oil by a titanium probe (400 w) and with three variable factors: temperature, time and ratio of essential oil/ water at three levels. Finally, 27 treated essential oils were prepared and their chemical compounds were quantified by GC. The primary essential oil contained 44.37% thymol, 29.80% p-cymene and 21.24% γ-terpinene. The results showed that the application of ultrasound to the essential oil increased the amount of thymol and decreased the amount of γ-terpinene and p-cymene. By optimizing the conditions (1:0 ratio of thyme essential oil and water, 20˚C and 10 min), we succeeded in reducing the active ingredient thymol from 44.37% to 70.18%. Ultrasonic waves in the presence of water and oxygen cause the production of hydroproxyl radical (HOO˙) and then carry out oxidation reactions to produce thymol from γ-terpinene and p-cymene. The results show that, in addition to helping to increase the efficiency of extraction, ultrasound can cause a change in the chemistry and ratio of phytochemical compounds in the essential oil by stimulating radical reactions.
Key words: p-Cymene, Essential oil, γ-Terpinene, Thymol, Thyme, Ultrasound
مقدمه
دستیابی به مواد طبیعی با استفاده از روشهای ایمن و سریع می تواند باعث تحول در صنایع وابسته به ترکیبات موثر بیولوژیک، از جمله صنعت داروسازی شود (Noce et al., 2021; Badrkhani et al., 2013). ترکیب فنولی تیمول یکی از این ترکیبات ارزشمند با اثرات متنوع دارویی علیه دیابت، سرماخوردگی، سرفه، تشنج، روماتيسم و عفونتهای مختلف میباشد (Ekoh et al., 2014; Amoozegaran et al., 2022; Khaje Nouri and Haghighiye Asl, 2016). اسانس گیاه آویشن باغی (Thymus vulgaris) یکی از مهمترین منابع طبیعی تیمول میباشد. حداقل میزان اسانس این گیاه 5/0 درصد یا معادل 5 میلیلیتر در هر کیلوگرم از اندام هوایی خشک شده است و معمولاً ترکیب تیمول 35 تا 55 درصد از این اسانس را تشکیل داده است (Prasanth Reddy et al., 2014). عمده اثرات این اسانس نیز مربوط به همین ترکیب میباشد (British pharmacopoeia, 2009). ترکیبات گاما-ترپینن و پارا-سیمن نیز که در واقع پیش ساز ترکیب تیمول در مسیر بیوسنتزی گیاه آویشن هستند. همانطور که در شکل 1 مشخص است، مسیر بیوسنتزی این سه ترکیب در گیاه آویشن نشان میدهد که بیوسنتز تیمول بسته به حضور گاما-ترپینن و پارا-سیمن دارد (Poulose and Croteau, 1978).
شکل 1: مسیر بیوسنتز سه ترکیب تیمول، پارا-سیمن و گاما-ترپینن در گیاه آویشن
معمولاً سنتز ترکیبات طبیعی مانند تیمول به روشهای شیمیایی دارای معایبی از جمله پیچیدگی و هزینه بر بودن فرآیند سنتز و جداسازی و همچنین استفاده از حلال و یا ترکیبات سمی میباشد (Escobar et al., 2020). از این رو در سالهای اخیر، استفاده از منایع طبیعی و گیاهی در اولویت بسیاری از محققان و صنایع میباشد. لذا اخیراً مطالعات متعددی بر روی روشهای مختلف استخراج اسانس با اولویت افزایش ماده موثره تیمول انجام شده است (Villanueva Bermejo et al., 2015). روشهاي مرسوم استخراج ترکیبات اسانسی مانند تقطیر آبی یا بخار آب و استخراج با حلال آلی معایبی مانند اتلاف ترکیبات فرار، بازدهی کم، زمان استخراج طولانی، تخریب ترکیبات حساس به دما و باقی ماندن حلال سمی را به دنبال دارد. طی سالهای اخیر روشهاي نوینی براي استخراج اسانس گیاهان دارویی ابداع گردیدهاند. انتخاب یک روش مؤثر در استخراج ترکیبات فعال به شاخصهاي مختلفی از جمله نوع گیاه، حلال مورد استفاده، سازگاري با محیط زیست، محدودیت در دما، زمان، هزینه و سایر عوامل می تواند بستگی داشته باشد (Hoseini and Yousefi, 2019; Hammoudi Halat et al., 2020). یکی از روشهایی که اخیرا جهت افزایش راندمان اسانس گیری از گیاهان استفاده میشود خیساندن در حضور امواج فراصوت است. در این روش امواج فراصوت با ایجاد حفرات ریز در مایع و سپس انفجار آنها باعث ایجاد انرژی فراوان و شوک به بافت گیاهی شده و از این رو سبب افزایش انتقال ترکیبات اسانسی از بافت گیاه به خارج از آن و به طبع آن افزایش راندمان اسانس گیری میشود. برای مثال، در یک پژوهش اثبات شد که خیساندن گیاه آویشن به همراه اعمال امواج فرا صوت پیش از استخراج اسانس به روش تقطیر، باعث افزایش بازدهی اسانس از 2/2 درصد به 4/2 درصد میشود (Kowalski and Wawrzykowski, 2009). مطالعات دیگر نشان از تغییرات اندکی در درصد ترکیبات مختلف در اسانس، در اثر اعمال امواج فراصوت میدهند. برخی پژوهشگران این امر را یک امر فیزیکی دانسته و به افزایش نفوذ پذیری برخی ترکیبات در حضور امواج فراصوت نسبت میدادند (Darabad et al., 2020). طبق بررسیهای ما، تا کنون مطالعهای بر روی تاثیر امواج فراصوت بر روی ترکیبات شیمیایی اسانس گیاه آویشن، به جهت بررسی احتمال انجام واکنش شیمیایی در اثر این امواج، انجام نشده است. لذا هدف از انجام این پژوهش بررسی اثر امواج فراصوت بر روی ترکیبات اصلی اسانس آویشن، خارج از بافت گیاهی و پس از استخراج به روش تقطیر میباشد. در این فرآیند، متغیرهای اثرگذار نظیر نسبت آب به اسانس آویشن، زمان اعمال امواج فراصوت و دما بر روی میزان ترکیبات تیمول، گاما-ترپینن و پارا-سیمن مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
مواد و دستگاهها: در این پژوهش از آب دو بار تقطیر با pH برابر با 3/6 و رسانایی الکتریکی 7/0 میکروزیمنس بر سانیه استفاده شد. از دستگاه تقطیر کلونجر 1 لیتری جهت استخراج اسانس آویشن استفاده شد. از دستگاه TopSonic متعلق به شرکت توسعه فناوری مافوق صوت (حداکثر توان: 400 وات) جهت اعمال امواج مافوق صوت استفاده شد. همچنین از دستگاههای کروماتوگرافی گازی- طیف سنج جرمی (GC-MS Agilent 5977A) و کروماتوگرافی گازی (Varian cp-3800) برای تجزیه ترکیبات اسانس آویشن استفاده شد.
استخراج اسانس به روش تقطیر با آب: اندام هوایی آویشن باغی (T. vulgaris L.) از مزرعه تحقیقاتی مرکز تحقیقات گیاهان دارویی دانشگاه شاهد، در مرحله گل دهی و در خرداد ماه سال 1400 جمع آوری شد. پس از شستشوی اندام هوایی گیاه، 3 کیلوگرم از آن در سایه و دمای اتاق خشک و توسط آسیاب خرد شد. اسانس آویشن از نمونه خرد شده توسط تقطیر با دستگاه کلونجر استخراج شد. برای این امر، ابتدا 50 گرم از گیاه خرد شده به بالن 1 لیتری دستگاه منتقل و سپس به میزان 500 میلیلیتر آب مقطر به آن اضافه گردید. بالن بر روی منتل قرار داده شد و پس از اتصال بخش فوقانی کلونجر که شامل لوله بخار و کندانسور میباشد، دمای منتل جهت شروع فرآیند تقطیر تنظیم شد. دمای کندانسور توسط یک سیرکولاتور بر روی 5 درجه سانتیگراد تنظیم شد. پس از گذشت 3 ساعت از فرآیند تقطیر، اسانس از قسمت مخصوص خود در دستگاه کلونجر جمع آوری و جهت آزمونهای بعدی در دمای 4 درجه سانتیگراد و در تاریکی نگهداری شد (Dehghan et al., 2015).
اعمال امواج فراصوت بر اسانس آویشن باغی: نسبتهای مختلف 0:1، 1:1 و 2:1 از اسانس آویشن و آب مقطر، در حجم نهایی 1 میلیلیتر به لولههای آزمایش منتقل شدند. در ادامه امواج فراصوت توسط پروب التراسونیک (نام دستگاه: توسعه فناوری مافوق صوت، با 20 درصد از توان 400 وات) طی زمانهای مختلف 5، 10 و 15 دقیقه و در 3 دمای مختلف 20، 30 و 40 درجه سانتی گراد اعمال شد (شکل 2).
شکل 2: اعمال امواج فراصوت با توان 400 وات توسط پراب فراصوت
بنابراین با توجه به اعمال متغیرهای ذکر شده، تعداد 27 نمونه اسانس حاصل شد (جدول 1). در ادامه نمونهها جهت انجام آنالیز GC و بررسی تغییرات اعمال شده در میزان ترکیبات موثره آنها، در دمای 4 درجه سانتیگراد و در تاریکی نگهداری شدند (Kowalski et al., 2019).
جدول 1: متغیرهای اعمال شده برای هر نمونه از اسانس حین اعمال امواج فراصوت
شماره نمونه اسانس تیمار شده | دما (˚C) | زمان (دقیقه) | نسبت آب: اسانس |
1 | 20 | 5 | 1:0 |
2 | 20 | 10 | 1:0 |
3 | 20 | 15 | 1:0 |
4 | 20 | 5 | 1:1 |
5 | 20 | 10 | 1:1 |
6 | 20 | 15 | 1:1 |
7 | 20 | 5 | 1:2 |
8 | 20 | 10 | 1:2 |
9 | 20 | 15 | 1:2 |
10 | 30 | 5 | 1:0 |
11 | 30 | 10 | 1:0 |
12 | 30 | 15 | 1:0 |
13 | 30 | 5 | 1:1 |
14 | 30 | 10 | 1:1 |
15 | 30 | 15 | 1:1 |
16 | 30 | 5 | 1:2 |
17 | 30 | 10 | 1:2 |
18 | 30 | 15 | 1:2 |
19 | 40 | 5 | 1:0 |
20 | 40 | 10 | 1:0 |
21 | 40 | 15 | 1:0 |
22 | 40 | 5 | 1:1 |
23 | 40 | 10 | 1:1 |
24 | 40 | 15 | 1:1 |
25 | 40 | 5 | 1:2 |
26 | 40 | 10 | 1:2 |
27 | 40 | 15 | 1:2 |
شناسایی ترکیبات اسانس به روش کروماتوگرافی گازی- طیف سنج جرمی: جهت شناسایی ترکیبات اسانسها از دستگاه GC-MS (Agilent 5977A) با سیستم مجهز به ستون HP-5MS (طول 30 متر، قطر 32/0 میلی متر و ضخامت لایه داخلی 25/0 میکرون) استفاده شد. گاز حامل هلیم با جریان 1/1 میلی متر بر دقیقه و نسبت تزریق نمونه 1 به 100 انجام شد. برنامة دمايي ستون از60 تا 250 درجة سانتي گراد با سرعت4 درجه در دقيقه تنظيم شد و سپس دما به مدت10 دقیقه در 250 درجه سانتیگراد ثابت ماند. طيفهاي جرمي در 70 الكترون ولت تهيه شدند. ضرايب بازداري با استفاده از زمانهاي بازداري آلكان های نرمال كه با همان دستگاه و تحت همان شرايط تزريق شد، محاسبه شدند. مقادير نسبي اجزا از روي سطح كل پيكها توسط نرم افزار دستگاه محاسبه شد. برای شناسایی ترکیبات، از مقایسه طیف جرمی آنها با طیف‌های موجود در داده‌های کتاب خانه Wiley و موسسه‌ی ملی استانداردها و تکنولوژی آمریکا استفاده شد (Saeed Masoum, 2016; Khanjani et al., 2021).
اندازه گیری کمّی ترکیبات اسانس به روش کروماتوگرافی گازی: جهت اندازهگیری کمّی ترکیبات موثره اسانسها از دستگاه کروماتوگرافی گازی (cp-3800 (GC Varian که مجهز به آشکارساز یونی FID و ستون HP-5MS (به طول 30متر، به قطر 32/0 میلی متر و ضخامت لایه داخلی 25/0 میکرومتر) استفاده شد. گاز حامل نیتروژن با جریان 1/1 میلی متر بر دقیقه بود. برنامه دمایی ستون از60 تا 250 درجه سانتیگراد با سرعت 4 درجه سانتیگراد بر دقیقه تنظیم شد. دمای آشکارساز و اینجکتور روی 250-240 سانتیگراد ثابت نگه داشته شد در نهایت با انطباق کروماتوگرام و نتایج بدست آمده با نتایج حاصل از دستگاه GC-MS، درصد ترکیبات موثره در اسانسها بدست آمد (Sonboli et al., 2013).
نتایج
شکل 3: کروماتوگرام اسانس T. vulgaris، استخراج شده به روش تقطیر
نتایج آنالیز دادهها نشان داد که اسانس بدست آمده شامل 37/44 درصد تیمول، 80/29 درصد پارا-سیمن و 24/21 درصد گاما-ترپینن میباشد (جدول 2).
جدول 2: ترکیبات شناسایی شده در اسانس T. vulgaris، استخراج شده به روش تقطیر
| نام ترکیب | زمان بازداری (RT) | شاخص بازداری (RI) | درصد (%)* |
1 | α-Thujene | 62/4 | 926 | 19/0 |
2 | α-Pinene | 76/4 | 933 | 30/0 |
3 | Camphene | 05/5 | 948 | 05/0 |
4 | β-Pinene | 61/5 | 977 | 29/1 |
5 | β-Myrcene | 83/5 | 988 | 56/0 |
6 | δ-3-Carene | 31/6 | 1010 | 05/0 |
7 | α-Terpinene | 45/6 | 1016 | 16/0 |
8 | p-Cymene | 70/6 | 1026 | 80/29 |
9 | β-Phellandrene | 77/6 | 1029 | 43/0 |
10 | γ-Terpinene | 50/7 | 1060 | 24/21 |
11 | α-Terpinolene | 16/8 | 1087 | 01/0 |
12 | cis-4-Thujanol | 39/8 | 1097 | 08/0 |
13 | Camphor | 67/9 | 1146 | 05/0 |
14 | Isomenthone | 85/9 | 1153 | 07/0 |
15 | Menthol | 36/10 | 1172 | 11/0 |
16 | 4-Terpineol | 46/10 | 1176 | 47/0 |
17 | α-Terpineol | 84/10 | 1190 | 07/0 |
18 | m-Thymol | 24/13 | 1282 | 04/0 |
19 | Thymol | 56/13 | 1294 | 37/44 |
20 | Carvacrol | 60/13 | 1295 | 08/0 |
21 | p-Thymol | 70/13 | 1299 | 23/0 |
22 | Apiol | 61/21 | 1622 | 03/0 |
| مجموع |
|
| 61/99 |
* درصد ترکیبات مربوط به اسانس اولیه، استخراج شده به روش تقطیر با آب، میباشد.
اثر امواج فراصوت بر اسانس استخراجی: در ادامه اثر امواج فراصوت بر روی اسانس استخراج شده بررسی شد. در این بخش امواج فراصوت توسط پراب تیتانیومی (20درصد توان از قدرت 400 وات) و تعیین سه متغیر دما، زمان و نسبت اسانس به آب در سه سطح، بر اسانس مستخرج اعمال شد. در نهایت 27 نمونه اسانس تیمار شده تهیه و ترکیبات شیمیایی تمامی آنها توسط دستگاه کروماتوگرافی گازی شناسایی کمّی شد. به طور کلی، نتایج حاصل نشان میدهند که امواج فراصوت سبب ایجاد تغییرات قابل توجهی در درصد ترکیبات تیمول، گاما-ترپینن و پارا-سیمن موجود در اسانس آویشن اولیه شد. از آنجایی که هر سه ترکیب دارای اهمیت زیادی در حوزه شیمی گیاهان دارویی هستند، ابتدا به صورت مجزا به بررسی و معرفی متغیرهای اثرگذار بر میزان این سه ترکیب میپردازیم.
متغیرهای اثرگذار در میزان تیمول موجود در اسانس: میزان تیمول در تمامی نمونهها افزایش پیدا کرده است و بیشترین میزان ترکیب تیمول با 18/70 درصد، در اعمال امواج فراصوت در دمای 20 درجه سانتیگراد، زمان 10 دقیقه و نسبت اسانس به آب 0:1 بدست آمد (شکل 4). همچنین کمترین میزان این ترکیب در دمای 20 درجه سانتیگراد، زمان 15 دقیقه با نسبت اسانس به آب 1:1، 63/44 درصد حاصل شد. لذا میتوان نتیجه گرفت در دمای 20 درجه سانتیگراد پارامتر نسبت اسانس به آب بیشترین اثرگذاری را در میزان ترکیب تیمول دارا میباشد. در دمای 30 درجه سانتیگراد بالاترین میزان تیمول 43/48 درصد مربوط به نسبت اسانس به آب 1:1 و در دمای 40 درجه سانتیگراد بالاترین میزان تیمول 55/49 درصد مربوط به نسبت اسانس به آب 1:2 می باشد. در اینجا به نظر میآید دما عامل کلیدی بر میزان تولید تیمول میباشد. دما می تواند خواص فیزیکی و شیمیایی آب و اسانس را به طور قابل ملاحظه ای تحت تاثیر قرار دهد. باید توجه داشت که افزایش دما به بالاتر از میزان خاصی امکان تخریب ترکیبات اسانس را به همراه دارد. بر اساس نتایج حاصل، هر چه دما بالاتر میرود میزان تولید تیمول کاهش مییابد. این امر میتواند ناشی از کاهش گرانروی آب و همچنین اسانس در دمای بالاتر و در نتیجه آن، کاهش شوک ناشی از انفجار حبابها بر ترکیبات اسانسی باشد. چراکه امواج فراصوت با ایجاد حبابهای ریز و انفجار آنها در مایعات تاثیر خود را اعمال میکنند و کاهش گرانروی آب و اسانس 
سبب کاهش تولید حباب میشود.
شکل 4: اثر نسبت آب به اسانس و زمان اعمال امواج فراصوت در دماهای الف) 20، ب) 30 و پ) 40 درجه سانتیگراد بر میزان تیمول
شکل 5: اثر نسبت آب به اسانس و زمان اعمال امواج فراصوت در دماهای الف) 20، ب) 30 و پ) 40 درجه سانتیگراد بر میزان پارا-سیمن
متغیرهای اثرگذار در میزان گاما-ترپینن موجود در اسانس: میزان گاما-ترپینن در نمونه اولیه اسانس (زمان 0) برابر با 24/21 درصد میباشد. با توجه به نتایج بدست آمده، در همه شرایط میزان این ترکیب در طول اعمال امواج فراصوت نسبت به کنترل کاهش یافته و یا ثابت مانده است (شکل 6). بر اساس نتایج حاصل بیشترین میزان گاما-ترپینن در دمای 20 درجه سانتیگراد، زمان 15 دقیقه و نسبت اسانس به آب 1:1 با مقدار 32/21 درصد ثبت شد. همچنین کمترین میزان گاما-ترپینن (46/8 درصد) در دمای 20 درجه سانتیگراد، زمان 10 دقیقه و نسبت اسانس به آب 0:1 بدست آمد. نتایج بدست آمده نشان میدهند که با کاهش نسبت آب به اسانس درصد گاما-ترپینن بیشتر کاهش پیدا میکند.
شکل 6: اثر نسبت آب به اسانس و زمان اعمال امواج فراصوت در دماهای الف) 20، ب) 30 و پ) 40 درجه سانتیگراد بر میزان گاما-ترپینن
به طور کلی نتایج نشان میدهد که اعمال امواج فراصوت باعث کاهش میزان درصد دو ترکیب پارا-سیمن و گاما-ترپینن و به همان میزان افزایش درصد تیمول در مخلوط اسانس میشود (جدول 3). بهینهترین شرایط جهت رسیدن به بیشترین میزان تیمول مربوط به اسانس شماره 2 (18/70 درصد)، دمای 20 درجه سانتیگراد، نسبت اسانس به آب 0:1 و زمان اعمال امواج فراصوت به مدت 10 دقیقه میباشد.
جدول 3: میزان درصد ترکیبات تیمول، پارا-سیمن و گاما-ترپینن پس از اعمال امواج فراصوت و شرایط مختلف در مقایسه با نمونه اسانس اولیه
پارا-سیمن | گاما-ترپینن | تیمول | شماره اسانس | پارا-سیمن | گاما-ترپینن | تیمول | شماره اسانس |
15/28 | 26/19 | 29/48 | 14 | 80/29 | 24/21 | 37/44 | کنترل |
06/28 | 06/19 | 44/48 | 15 | 59/26 | 02/14 | 46/55 | 1 |
47/29 | 17/20 | 33/46 | 16 | 33/17 | 46/8 | 18/70 | 2 |
60/28 | 37/19 | 94/47 | 17 | 68/21 | 87/12 | 47/60 | 3 |
94/28 | 21/20 | 37/46 | 18 | 36/26 | 50/16 | 36/53 | 4 |
84/28 | 85/19 | 67/46 | 19 | 27/27 | 93/17 | 18/51 | 5 |
95/28 | 14/20 | 85/46 | 20 | 66/29 | 33/21 | 63/44 | 6 |
80/28 | 40/20 | 59/45 | 21 | 39/24 | 46/16 | 18/52 | 7 |
50/29 | 03/20 | 92/45 | 22 | 65/24 | 70/17 | 94/52 | 8 |
55/27 | 89/19 | 81/45 | 23 | 33/28 | 18/20 | 32/47 | 9 |
90/28 | 38/20 | 46/46 | 24 | 85/28 | 62/19 | 95/46 | 10 |
80/29 | 89/20 | 91/44 | 25 | 04/29 | 23/20 | 67/46 | 11 |
97/24 | 09/18 | 56/49 | 26 | 41/28 | 28/20 | 80/45 | 12 |
10/29 | 28/20 | 09/46 | 27 | 59/27 | 47/19 | 33/47 | 13 |
جدول 4 به مقایسه 22 ترکیب شناسایی شده در نمونه اسانسهایی که بیشترین تغییر در میزان تمیول را داشتهاند (1 الی 5، 7 و 8) پرداخته است.
جدول 4: مقایسه ترکیبات اسانسهایی که بیشترین تغییر در میزان تمیول را داشتهاند با نمونه کنترل
| نام ترکیب | شاخص بازداری (RI) | درصد (%)* | |||||||
کنترل | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 7 | 8 | |||
1 | α-Thujene | 926 | 19/0 | 12/0 | 07/0 | 12/0 | 16/0 | 16/0 | 16/0 | 14/0 |
2 | α-Pinene | 933 | 30/0 | 20/0 | 12/0 | 20/0 | 26/0 | 25/0 | 26/0 | 24/0 |
3 | Camphene | 948 | 05/0 | 04/0 | 02/0 | 04/0 | 05/0 | 04/0 | 05/0 | 04/0 |
4 | β-Pinene | 977 | 29/1 | 95/0 | 61/0 | 01/1 | 17/1 | 16/1 | 20/1 | 10/1 |
5 | β-Myrcene | 988 | 56/0 | 35/0 | 21/0 | 34/0 | 45/0 | 47/0 | 47/0 | 45/0 |
6 | δ-3-Carene | 1010 | 05/0 | tr | tr | 03/0 | tr | tr | 04/0 | 04/0 |
7 | α-Terpinene | 1016 | 16/0 | tr | 07/0 | 10/0 | tr | tr | 12/0 | 12/0 |
8 | p-Cymene | 1026 | 80/29 | 59/26 | 33/17 | 68/21 | 36/26 | 27/27 | 39/24 | 65/24 |
9 | β-Phellandrene | 1029 | 43/0 | tr | 04/0 | 02/0 | tr | 01/0 | tr | tr |
10 | γ-Terpinene | 1060 | 24/21 | 02/14 | 46/8 | 87/12 | 50/16 | 93/17 | 46/16 | 70/17 |
11 | α-Terpinolene | 1087 | 01/0 | 01/0 | 02/0 | 02/0 | tr | tr | 01/0 | 01/0 |
12 | cis-4-Thujanol | 1097 | 08/0 | 05/0 | 04/0 | 05/0 | 06/0 | 07/0 | 07/0 | 07/0 |
13 | Camphor | 1146 | 05/0 | 01/0 | 03/0 | 03/0 | tr | tr | tr | 01/0 |
14 | Isomenthone | 1153 | 07/0 | tr | tr | tr | tr | tr | 01/0 | 01/0 |
15 | Menthol | 1172 | 11/0 | 12/0 | 06/0 | 04/0 | 07/0 | 07/0 | 06/0 | 10/0 |
16 | 4-Terpineol | 1176 | 47/0 | tr | 49/0 | tr | 39/0 | 37/0 | 14/0 | 07/0 |
17 | α-Terpineol | 1190 | 07/0 | 03/0 | 12/0 | 02/0 | 10/0 | 08/0 | tr | 03/0 |
18 | m-Thymol | 1282 | 04/0 | tr | tr | tr | tr | tr | tr | tr |
19 | Thymol | 1294 | 37/44 | 46/55 | 18/70 | 47/60 | 36/53 | 18/51 | 18/52 | 94/52 |
20 | Carvacrol | 1295 | 08/0 | 52/0 | 01/0 | 75/0 | 12/0 | 10/0 | 62/0 | 01/0 |
21 | p-Thymol | 1299 | 23/0 | tr | 15/0 | 01/0 | tr | tr | 01/0 | 09/0 |
22 | Apiol | 1622 | 03/0 | 03/0 | 05/0 | 04/0 | 04/0 | 03/0 | 04/0 | 04/0 |
همانطور که در بخش مقدمه و شکل 1 بیان شد، بیوسنتز تیمول در گیاه آویشن بسته به حضور گاما-ترپین و پارا-سیمن دارد (Poulose and Croteau, 1978). بنابراین، گاما-ترپینن از ژرانیل دیفسفات و طی مراحل مختلف و در نهایت توسط آنزیم tvTPS1 تولید و طی واکنش آروماتیزاسیون به پارا-سیمن و در نهایت با هیدروکسیلاسیون به تیمول تبدیل میشود (Crocoll, 2011). لذا با توجه به نتایج بدست آمده در این پژوهش، به نظر میرسد با اعمال امواج فراصوت در شرایط بهینه، توانستهایم مشابه مسیر بیوسنتزی گیاه، در مخلوط پیچیده ترکیبات اسانسی و در شرایط آزمایشگاهی، ترکیب ارزشمند تیمول را از گاما-ترپینن بدست آوریم و مقدار این ترکیب را در اسانس آویشن از حدود 44 درصد به بیش از 70 درصد افزایش دهیم. بنابراین نتایج این مطالعه نشان میدهد که بر خلاف ادعای برخی مطالعات قبلی، اعمال امواج اولتراسونیک بعد از استخراج اسانس، میتواند طی واکنشهای شیمیایی، درصد ترکیبات اسانسی را تغییر دهد.
بحث
در طول تاریخ از گیاه آویشن باغی به عنوان دارویی موثر در درمان بیماریهای تنفسی، به ویژه سرفه مزمن، برونشیت و آسم و همچنین مشکلات عروقی، بیماریهای دستگاه ادراری، دندان درد، سوء هاضمه و عفونتهای مزمن استفاده شده است (Hossain et al., 2022). تیمول به عنوان اصلیترین ماده موثره آویشن میباشد و مطالعات متعددی نقش مستقیم ترکیب تیمول را در اکثر اثرات دارویی این گیاه به اثبات رساندهاند (Escobar et al., 2020). در صنعت داروسازی از اسانس آویشن جهت تولید محصولات متنوعی که اکثراً مرتبط با درمان بیماریهای عفونی و تنفسی هستند تولید میشوند (Hossain et al., 2022). لذا درصد ماده موثره تیمول در اسانس آویشن یکی از شاخصهای اصلی کیفیت آن در صنعت داروسازی میباشد و طبق مطالعات صورت گرفته هر چه میزان آن بالاتر باشد اثرات درمانی بهتری بدست میآید (Kachur and Suntres, 2020). مطالعات متعددی اثرات ضد میکروبی، ضداسایشی، ضد برونشیت و ضد انگل این ترکیب را اثبات کردهاند. همچنین داروها و مکملهای بسیاری در جهان تولید میشوند که حاوی این ترکیب با ارزش هستند. طبق مطالعات صورت گرفته، افزایش میزان آن در اسانس، سبب افزایش اثرات دارویی مذکور میشود (Kowalczyk et al., 2020). لذا افزایش عملکرد تولید تیمول در گیاه و یا در فرآیند استخراج اسانس آویشن حائز اهمیت فراوانی است.
تا کنون تحقیقات بسیاری جهت معرفی روشهای جدید استخراج اسانس گیاهان دارویی، با هدف افزایش بازده استخراج، عدم تخریب ترکیبات حساس و بخصوص افزایش میزان مواد موثره، انجام شده است (Jafarazad et al., 2019; Ramak et al., 2019).
اخیراً استفاده از تکنیک امواج فراصوت جهت افزایش بازده اسانس گیری رایج شده است. در مطالعات قبلی، مشخص شد که ترکیب اسانس تقطیر شده به کمک فراصوت با ترکیب اسانس تقطیر شده با روشهای معمول متفاوت است. نویسندگان این مطالعات علت این تغییرات را اثر فیزیکی امواج فراصوت بر فرآیند استخراج و افزایش تراوایی برخی ترکیبات از ساختارهای ترشحی گیاهان نسبت دادند (Pingret et al. 2013). اما امواج فراصوت میتوانند باعث انجام واکنشهایی نظیر ایزومریزاسیون، اکسیداسیون و پلیمریزاسیون شوند (McKenzie et al. 2019). در سال 2019 مطالعه ای در راستای بررسی اثر امواج التراسونیک بر روی ترکیب درصد اسانس برخی گیاهان دارویی، نظیر بادرنجبویه، ریحان، بابونه، زوفا، رزماری، نعناع فلفلی و مرزنجوش در حلال هگزان و متانول صورت گرفت (Kowalski et al. 2019). نتایج این مطالعه نشان داد که اعمل امواج فراصوت بر اسانسهای مذکور در محیط هگزان و متانول اثر قابل ملاحضهای بر روی ترکیب درصد ترکیبات موثره این اسانسها نداشته است. اما نتایج پژوهش حاضر نشان داد که اعمال امواج فراصوت به اسانس گیاه آویشن باغی، در محیط آبی و همچنین به صورت خالص، سبب تغییر ترکیب درصد اسانس میشود. به طوری که در شرایط بهینه شاهد افزایش میزان تیمول به عنوان ماده موثره اصلی و کاهش دو ترکیب پارا-سیمن و گاما-ترپینن هستیم. لذا در ادامه به بحث در رابطه با چگونگی اثر امواج بر روی ترکیبات اسانس آویشن و مکانیزم آن میپردازیم.
مطالعات پیشین اثبات میکنند که امواج فراصوت در محیطهایی که دارای آب و اکسیژن هستند سبب تولید رادیکال آزاد هیدروکسیل (OH˙) میشود (Miyaji et al., 2017). رادیکال هیدروکسیل میتواند در حضور اکسیژن به رادیکال هیدروپروکسیل (HOO˙) تبدیل و در ادامه سبب انجام واکنشهای اکسایشی نظیر آروماتیک شدن 1،4-سیکلودیان و هیدروکسیلاسیون حلقه بنزن شود (Yamada et al., 2016; Baschieri et al., 2019).بنابراین به طور خلاصه مکانیزم پیشنهادی میتواند شامل تولید رادیکال هیدروکسیل و رادیکال هیدروپروکسیل در حضور اکسیژن، سپس اکسایش گاما-ترپینن در حضور رادیکال هیدروپروکسیل و تبدیل آن به پارا-سیمن و در نهایت هیدروکسیلاسیون پارا-سیمن به تیمول در حضور رادیکال هیدروپروکسیل باشد (شکل 7). با توجه به اینکه اسانس مورد استفاده در این پژوهش دارای رطوبت (5 درصد) بوده است. لذا میزان کمی آب در نمونههای با نسبت 0:1 از اسانس و آب وجود داشته است و مکانیسم تولید رادیکال آزاد هیدروکسیل (OH˙) از آب و اکسیژن و بر اثر امواج فراصوت در این موارد نیز پیشنهاد میشود. البته با توجه به نقش پارامترهای مختلف، از جمله وجود سایر ترکیبات در اسانس، انجام مطالعات بیشتر و بررسی واکنش تبدیل گاما-ترپینن و پارا-سیمن به تیمول، خارج از مخلوط پیچیده اسانسی، در دستور مطالعات بعدی میباشد.
شکل 7: مکانیزم پیشنهادی تبدیل گاما-ترپینن و پارا-سیمن به تیمول در اثر اعمال امواج فراصوت
در رابطه با واکنشهای مشابه، که با هدف سنتز تیمول از پارا-سیمن و گاما-ترپینن طراحی شدند، میتوان به چند مورد محدود اشاره کرد. برای مثال، در سال 2011 آشمن و همکارانش طی یک واکنش رادیکالی، ترکیب پارا-سیمن را از افزودن رادیکال هیدروکسیل (˙OH) به ترکیب گاما-ترپینن و پس از حذف اتم هیدروژن از گروههای CH2 حلقه سیکلوهگزادی ان، با راندمان مولی 6/13 درصد، سنتز کرد (Aschmann et al., 2011). فیلیپس و گیبس در سال 1920 ترکیب تیمول را طی چند مرحله (نیتراسیون، احیای گروه نیترو، سولفوناسیون، هیدرولیز و ذوب قلیایی) از پارا-سیمن سنتز کردند (Phillips and Gibbs, 1920). در صورتی که ما در این مطالعه موفق شدیم تنها با اعمال امواج فراصوت به مخلوط پیچیده اسانس آویشن ترکیب تیمول را از پیش سازهای بیوسنتتیک خود، یعنی گاما-ترپینن و پارا-سیمن تولید کنیم و مقدار آن را از حدود 44 درصد به بیش از 70 درصد افزایش دهیم.
طبق مطالعات قبلی افزایش ماده موثره تیمول در اسانس آویشن تاثیر مستقیم در افزایش میزان اثرات دارویی این اسانس دارد (Kowalczyk et al., 2020). به طوری که طبق گزارش گان و همکارانش، اثر آنتیبیوتیکی تیمول با افزایش دوز و میزانش در اسانس افزایش مییابد (Gan et al., 2023). همچنین در مطالعهای دیگر اثبات شد که اثر ضد سرطانی تیمول علیه سلولهای سرطانی گلیوبلاستومای بدخیم انسانی U-87 وابسته به دوز و غلظت تیمول است (Qoorchi Moheb Seraj, et al., 2022). لذا با توجه به دستاورد این پژوهش مبنی بر افزایش بیش از 25 درصدی میزان این ترکیب در اسانس آویشن میتوان انتظار داشت که اثرات بیولوژیک و دارویی به طبع آن ارزش این اسانس به مراتب بیشتر شده است.
نتیجه گیری نهایی
نتایج بدست آمده نشان میدهد که امواج فراصوت در محیط دارای آب، اکسیژن و اسانس آویشن باغی، سبب تولید رادیکال آزاد هیدروکسیل و در ادامه سبب واکنشهایی در راستای تولید ترکیب تیمول از پیش سازهای بیوسنتتیک خود، یعنی گاما-ترپینن و پارا-سیمن میشود. با بهینه سازی شرایط دمایی، زمانی و نسبتهای مختلف آب به اسانس، مشخص شد که میزان تیمول در همه شرایط افزایش پیدا میکند و البته بیشترین میزان ترکیب تیمول با 18/70 درصد، در اعمال امواج فراصوت در دمای 20 درجه سانتیگراد، زمان 10 دقیقه و نسبت اسانس به آب 0:1 بدست آمد. بنابراین ما در این مطالعه موفق شدیم تنها با اعمال امواج فراصوت به مخلوط پیچیده اسانس آویشن، ماده موثره تیمول را از حدود 44 درصد به بیش از 70 درصد افزایش دهیم. نتایج این پژوهش نشان میدهد که امواج فراصوت علاوه بر کمک به افزایش راندمان استخراج اسانس از بافت گیاهی میتواند با تحریک واکنشهای رادیکالی و اکسایشی، سبب تغییر در ماهیت و نسبت ترکیبات فیتوشیمیایی در اسانس گردد.
سپاسگزاری
بدین وسیله از همکاری و حمایتهای دانشگاه آزاد اسلامی و دانشگاه شاهد تقدیر و تشکر میگردد.
References
Amoozegaran, A., Dehghan, H., Homami, S.S., and Hashemi, S.A. 2022. Efficacy of an edible coating, containing thyme essential oil, to control Fusarium oxysporum and the quality of tomato fruits. Journal of Food Measurement and Characterization, 16(5): 3760-3767.
Aschmann, S.M., Arey, J., and Atkinson, R. 2011. Formation of p-cymene from OH+ γ-terpinene: H-atom abstraction from the cyclohexadiene ring structure. Atmospheric Environment, 45(26): 4408-4411.
Badrkhani, N., Khajenoori, M., and Haghighi Asl, A. 2013. Subcritical water extraction of thymol from ajowan seeds by Taguchi experimental design. Applied Chemistry, 7(25): 51-58.
Baschieri, A., Amorati, R., Valgimigli, L., and Sambri, L. 2019. 1-methyl-1, 4-cyclohexadiene as a traceless reducing agent for the synthesis of catechols and hydroquinones. The Journal of Organic Chemistry, 84(21): 13655-13664.
Commission, B. P. 2008. British pharmacopoeia 2009: Stationery Office (UK).
Crocoll, C. 2011. Biosynthesis of the phenolic monoterpenes, thymol and carvacrol, by terpene synthases and cytochrome P450s in oregano and thyme. Jena, Friedrich-Schiller-Universität Jena, Diss., 2011.
Darabad, A. H., Rahimi, M., and Rafati, H. 2022. Continuous hydrodistillation-ultrasonication flow batch-mode operation system to enhance essential oil extraction from Satureja khuzistanica and evaluation of in vitro anti-inflammatory activity. Industrial Crops and Products, 188: 115540.
Dehghan, H., Sarrafi, Y., and Salehi, P. 2015. Chemical composition of the essential oil of Convolvulus persicus L. Journal of Essential Oil Bearing Plants, 18(3): 592-595.
Ekoh, S. N., Akubugwo, E. I., Ude, V. C., and Edwin, N. 2014. Anti-hyperglycemic and anti-hyperlipidemic effect of spices (Thymus vulgaris, Murraya koenigii, Ocimum gratissimum and Piper guineense) in alloxan-induced diabetic rats. International Journal of Biosciences, 4(2): 179-187.
Escobar, A., Perez, M., Romanelli, G., and Blustein, G. 2020. Thymol bioactivity: a review focusing on practical applications. Arabian Journal of Chemistry, 13(12): 9243-9269.
Hammoudi Halat, D., Krayem, M., Khaled, S., and Younes, S. 2022. A focused insight into thyme: Biological, chemical, and therapeutic properties of an indigenous Mediterranean herb. Nutrients, 14(10): 2104.
Hoseini, S. M., and Yousefi, M. 2019. Beneficial effects of thyme (Thymus vulgaris) extract on oxytetracycline‐induced stress response, immunosuppression, oxidative stress and enzymatic changes in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture Nutrition, 25(2): 298-309.
Kachur, K., and Suntres, Z. 2020. The antibacterial properties of phenolic isomers, carvacrol and thymol. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 60(18), 3042-3053.
Khaje Nouri, M., and Haghighiye Asl, A. 2016. Review of effective parameters on extraction of thymol from Trachyspermum ammi (T. ammi) seeds. Applied Chemistry, 11(38): 151-164.
Khanjani, R., Dehghan, H., and Sarrafi, Y. 2021. Antifungal edible tomato coatings containing ajwain, neroli, and Rosemary essential oils. Journal of Food Measurement and Characterization, 15(6): 5139-5148.
Kowalczyk, A., Przychodna, M., Sopata, S., Bodalska, A., and Fecka, I. 2020. Thymol and thyme essential oil—new insights into selected therapeutic applications. Molecules, 25(18), 4125.
Kowalski, R., Gagoś, M., Kowalska, G., Pankiewicz, U., Sujka, M., Mazurek, A., and Nawrocka, A. 2019. Effects of ultrasound technique on the composition of different essential oils. Journal of Analytical Methods in Chemistry, 6782495.
Kowalski, R., and Wawrzykowski, J. 2009. Effect of ultrasound-assisted maceration on the quality of oil from the leaves of thyme Thymus vulgaris L. Flavour and Fragrance Journal, 24(2): 69-74.
Miyaji, A., Kohno, M., Inoue, Y., and Baba, T. 2017. Hydroxyl radical generation by dissociation of water molecules during 1.65 MHz frequency ultrasound irradiation under aerobic conditions. Biochemical and Biophysical Research Communications, 483(1): 178-182.
Noce, A., Di Lauro, M., Di Daniele, F., Pietroboni Zaitseva, A., Marrone, G., Borboni, P., and Di Daniele, N. 2021. Natural bioactive compounds useful in clinical management of metabolic syndrome. Nutrients, 13(2), 630.
Phillips, M., and Gibbs, H. 1920. A Synthesis of thymol from p-cymene. Industrial & Engineering Chemistry, 12(8): 733-734.
Pingret, D., Fabiano-Tixier, A.S. and Chemat, F. 2013. Degradation during application of ultrasound in food processing: a review. Food Control, 31(2): 593-606.
Poulose, A., and Croteau, R. 1978. Biosynthesis of aromatic monoterpenes: Conversion of γ-terpinene to p-cymene and thymol in Thymus vulgaris L. Archives of Biochemistry and Biophysics, 187(2): 307-314.
Prasanth Reddy, V., Ravi Vital, K., Varsha, P.V., and Satyam, S. 2014. Review on Thymus vulgaris traditional uses and pharmacological properties. Medicinal and Aromatic Plants, 3(164): 2167-0412.
Ramak, P., Karimian, V., Sepahvand A. 2019. Effects of supercritical fluid and distillation extraction methods on the yield, antioxidant and antifungal activities of Artemisia persica Boiss essential oil. Ecophytochemistry journal of Medicinal Plants, 7(2): 26-39.
Saeed Masoum, N.G. 2016. Potentiality of multivariate calibration methods in assessment of the components responsible for antioxidant activity of medicinal herbs using gas chromatography-mass spectrometry technique. Applied Chemistry, 11(39): 165-186.
Sonboli, A., Bahadori, M.B., Dehghan, H., Aarabi, L., Savehdroudi, P., Nekuei, M., Pournaghi N., and Mirzania, F. 2013. Chemotaxonomic importance of the essential-oil composition in two subspecies of Teucrium stocksianum Boiss. From Iran. Chemistry & Biodiversity, 10(4): 687-694.
Villanueva Bermejo, D., Angelov, I., Vicente, G., Stateva, R.P., Rodriguez García‐Risco, M., Reglero, G., Ibañez, E., and Fornari, T. 2015. Extraction of thymol from different varieties of thyme plants using green solvents. Journal of the Science of Food and Agriculture, 95(14): 2901-2907.
Yamada, M., Karlin, K.D., and Fukuzumi, S. 2016. One-step selective hydroxylation of benzene to phenol with hydrogen peroxide catalysed by copper complexes incorporated into mesoporous silica–alumina. Chemical Science, 7(4): 2856-2863.