Investigating the amino acid profile of the hydrolyzed protein obtained from Anabaena sp. and its antioxidant and antibacterial properties

Subject Areas : Microbiology

mahdieh doraj ¹ , mahnaz sadat sadeghi ² , M. Emtyazjoo ³ , ندا سلطانی ⁴ , fariba زمانی ⁵

1 - Department of marine science and technology, Faculty of Marine Biology, Islamic Azad University, North Tehran Branch, Tehran, Iran.
2 - Islamic Azad University North Tehran Branch
3 - Marine Biology Dept., Faculty of Marine Science and Technology, Islamic Azad University Tehran North Branch
4 - گروه پژوهشی میکروبیولوژی نفت، پژوهشکده علوم پایه کاربردی جهاددانشگاهی
5 - دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات

Received: 2024-02-05 Accepted : 2024-09-27 Published : 2024-12-28

Keywords: Alkalase, hydrolyzed protein, antioxidant properties, antibacterial properties, anabaena ,

Abstract :

Abstract Introduction: Today, cyanobacteria, which are a group of microscopic algae, have been considered as a protein source for the production of hydrolyzed protein. Materials and methods: The protein extracted from Anabena was hydrolyzed by the alcalase enzyme at 55°C and pH 8 for 8 hours. The amino acid profile of the hydrolyzed protein was analyzed using an RP-HPLC system. The antioxidant properties of the obtained samples were evaluated against DPPH and ABTS free radicals, as well as metal ion chelation. Subsequently, the antibacterial properties of the produced hydrolyzed protein against a number of pathogenic bacteria were investigated. Results and discussion: The amino acid profile of the obtained hydrolyzed protein showed that this sample contained higher amounts than the daily amino acid requirement of children and adults and had significant amounts of essential amino acids. The highest neutralization percentage against DPPH and ABTS free radicals was 88.22% and 68.90% respectively. The highest chelating activity of obtained sample 62.69% was observed at the concentration of 2 mg/ml. Also, the results showed that the highest antibacterial properties of the examined sample against the bacteria Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli and Salmonella typhimurium were 6.02, 5.90, 6.30 and 3.80 mm respectively at a concentration of 100 mg/ml liter (P<0.05). Conclusion: Based on the obtained results, it seems that the protein extracted from Anabena can be used to produce hydrolyzed protein with antioxidant and antibacterial properties and has the potential to be used in food and pharmaceutical industries.

References:

منابع Abd El-Aty, A.M., Mohamed, A.A. and Samhan, F.A. (2014). In vitro antioxidant and antibacterial activities of two fresh water Cyanobacterial species, Oscillatoria agardhii and Anabaena sphaerica. Journal of Applied Pharmaceutical Science, 4(7), pp.069-075. http://dx.doi.org/10.7324/JAPS.2014.40712
Akbarbaglu, Z., Ayaseh, A., Ghanbarzadeh, B. and Sarabandi, K. (2022). Techno-functional, biological and structural properties of Spirulina platensis peptides from different proteases. Algal Research, 66, p.102755. https://doi.org/10.1016/j.algal.2022.102755
do Amaral, S.C., Santos, A.V., da Cruz Schneider, M.P., da Silva, J.K.R. and Xavier, L.P. (2020). Determination of volatile organic compounds and antibacterial activity of the amazonian cyanobacterium Synechococcus sp. strain GFB01. Molecules, 25(20), p.4744. https://doi.org/10.3390/molecules25204744
Baharuddin, N.A., Halim, N.R.A. and Sarbon, N.M. (2015). Effect of degree of hydrolysis (DH) on the functional properties and angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity of eel (Monopterus sp.) protein hydrolysate.
Bezerra, M.A., Santelli, R.E., Oliveira, E.P., Villar, L.S. and Escaleira, L.A. (2008). Response surface methodology (RSM) as a tool for optimization in analytical chemistry. Talanta, 76(5), pp.965-977. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2008.05.019
Bilanovic, D., Andargatchew, A., Kroeger, T. and Shelef, G. (2009). Freshwater and marine microalgae sequestering of CO2 at different C and N concentrations–response surface methodology analysis. Energy Conversion and Management, 50(2), pp.262-267. https://doi.org/10.1016/j.enconman.2008.09.024
Chai, H.J., Chan, Y.L., Li, T.L., Chen, Y.C., Wu, C.H., Shiau, C.Y. and Wu, C.J. (2012). Composition characterization of Myctophids (Benthosema pterotum): Antioxidation and safety evaluations for Myctophids protein hydrolysates. Food Research International, 46(1), pp.118-126. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2011.12.008
Costa, M.M., Spínola, M.P. and Prates, J.A. (2023). Combination of Mechanical/Physical Pretreatments with Trypsin or Pancreatin on Arthrospira platensis Protein Degradation. Agriculture, 13(1), p.198. https://doi.org/10.3390/agriculture13010198
Doraj, M., Emtyazjoo, M., Sadeghi, M.S., Soltani, N. and Hargelani, F.Z. (2023). Protein hydrolysate from Anabaena sp. cultured in an optimized condition designed by RSM; insight into bioactive attributes. Algal Research, 70, p.103026. https://doi.org/10.1016/j.algal.2023.103026
Fadl, S.E., Elsadany, A.Y., El-Shenawy, A.M., Sakr, O.A., El Gammal, G.A., Gad, D.M., Norag, M.A.A. and Eissa, I. (2020). Efficacy of cyanobacterium Anabaena sp. as a feed supplement on productive performance and immune status in cultured Nile tilapia. Aquaculture Reports, 17, p.100406. https://doi.org/10.1016/j.aqrep.2020.100406
Garcia-Moscoso, J.L., Teymouri, A. and Kumar, S. (2015). Kinetics of peptides and arginine production from microalgae (Scenedesmus sp.) by flash hydrolysis. Industrial & Engineering Chemistry Research, 54(7), pp.2048-2058. https://doi.org/10.1021/ie5047279
Guillén, G., López Caballero, M.E., Alemán, A., Lacey, A.L.D., Giménez, B. and Montero García, P. (2010). Antioxidant and antimicrobial peptide fractions from squid and tuna skin gelatin.
Heffernan, S., Giblin, L. and O'Brien, N. (2021). Assessment of the biological activity of fish muscle protein hydrolysates using in vitro model systems. Food chemistry, 359, p.129852. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2021.129852
Johnson, E.M., Kumar, K. and Das, D. (2014). Physicochemical parameters optimization, and purification of phycobiliproteins from the isolated Nostoc sp. Bioresource technology, 166, pp.541-547. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2014.05.097
Kini, S., Divyashree, M., Mani, M.K. and Mamatha, B.S. (2020). Algae and cyanobacteria as a source of novel bioactive compounds for biomedical applications. In Advances in cyanobacterial biology (pp. 173-194). Academic Press. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-819311-2.00012-7
Klompong, V., Benjakul, S., Yachai, M., Visessanguan, W., Shahidi, F. and Hayes, K.D. (2009). Amino acid composition and antioxidative peptides from protein hydrolysates of yellow stripe trevally (Selaroides leptolepis). Journal of food science, 74(2), pp.C126-C133. https://doi.org/10.1111/j.1750-3841.2009.01047.x
Ktari, N., Fakhfakh, N., Balti, R., Ben Khaled, H., Nasri, M. and Bougatef, A. (2013). Effect of degree of hydrolysis and protease type on the antioxidant activity of protein hydrolysates from cuttlefish (Sepia officinalis) by-products. Journal of Aquatic Food Product Technology, 22(5), pp.436-448. https://doi.org/10.1080/10498850.2012.658961
Latorres, J.M., Rios, D.G., Saggiomo, G., Wasielesky, W. and Prentice-Hernandez, C. (2018). Functional and antioxidant properties of protein hydrolysates obtained from white shrimp (Litopenaeus vannamei). Journal of Food Science and Technology, 55, pp.721-729. https://doi.org/10.1007/s13197-017-2983-z
Bennett, G. (1992). Lowry's handbook of right-to-know emergency planning. Journal of Hazardous Materials, 30(3), pp.361-362. https://doi.org/10.1016/0304-3894(92)87011-4
Mahakhant, A., Khanthasopa, S., Jaisai, N. and Wongsing, N. (2011). Screening of biological activities from Nostoc spp.(Cyanophyta). In International Symposium on Medicinal and Aromatic Plants 1023 (pp. 271-277). https://doi.org/10.17660/ActaHortic.2014.1023.39
Mendiola León, J.A., Rodríguez Meizoso, I., Señorans, F.J., Reglero, G., Cifuentes, A. and Ibáñez, E. (2008). Antioxidants in plant foods and microalgae extracted using compressed fluids. Electronic Journal of Environmental, Agricultural and Food Chemistry.
Mirzapour-Kouhdasht, A., Moosavi-Nasab, M., Kim, Y.M. and Eun, J.B. (2021). Antioxidant mechanism, antibacterial activity, and functional characterization of peptide fractions obtained from barred mackerel gelatin with a focus on application in carbonated beverages. Food Chemistry, 342, p.128339. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2020.128339
Moreno, J., Vargas, M.Á., Rodrıguez, H., Rivas, J. and Guerrero, M.G. (2003). Outdoor cultivation of a nitrogen-fixing marine cyanobacterium, Anabaena sp. ATCC 33047. Biomolecular engineering, 20(4-6), pp.191-197. https://doi.org/10.1016/S1389-0344(03)00051-0
Morris, H.J., Almarales, A., Carrillo, O. and Bermúdez, R.C. (2008). Utilization of Chlorella vulgaris cell biomass for the production of enzymatic protein hydrolysates. Bioresource technology, 99(16), pp.7723-7729. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2008.01.080
Mousaie, M., Khodadadi, M. and Tadayoni, M. (2022). Hydrolysate protein from brown macroalgae (Sargassum ilicifolium): Antioxidant, antitumor, antibacterial, and ACE inhibitory activities. Journal of Food Processing and Preservation, 46(11), p.e17020. https://doi.org/10.1111/jfpp.17020
Naghdi, S., Lorenzo, J.M., Mirnejad, R., Ahmadvand, M. and Moosazadeh Moghaddam, M. (2023). Bioactivity evaluation of peptide fractions from bighead carp (Hypophthalmichthys nobilis) using alcalase and hydrolytic enzymes extracted from Oncorhynchus mykiss and their potential to develop the edible coats. Food and Bioprocess Technology, 16(5), pp.1128-1148. https://doi.org/10.1007/s11947-022-02986-y
Naghdi, S., Rezaei, M., Tabarsa, M. and Abdollahi, M., (2023). Fish Protein Hydrolysate from Sulfated Polysaccharides Extraction Residue of Tuna Processing By‐Products with Bioactive and Functional Properties. Global Challenges, 7(4), p.2200214. https://doi.org/10.1002/gch2.202200214
Naghdi, S., Rezaei, M., Tabarsa, M. and Abdollahi, M. (2023). Parallel Extraction of Sulfated polysaccharides and Protein Hydrolysate from Skipjack Tuna Head and Their Bioactive and Functional Properties. Food and Bioprocess Technology, pp.1-22. https://doi.org/10.1007/s11947-022-02988-w
Nikoo, M., Benjakul, S., Yasemi, M., Gavlighi, H.A. and Xu, X. (2019). Hydrolysates from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) processing by-product with different pretreatments: Antioxidant activity and their effect on lipid and protein oxidation of raw fish emulsion. Lwt, 108, pp.120-128. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2019.03.049
Noman, A., Ali, A.H., Wedad, Q.B. and Wenshui, X. (2020). Effect of enzyme type on the properties of Chinese sturgeon (Acipenser sinensis) protein hydrolysates produced by enzymatic hydrolysis process. American Journal of Food Science and Nutrition Research, 6(1), pp.10-16. http://dx.doi.org/10.1016/j.procbio.2018.01.009
Paliwal, C., Rehmanji, M., Shaikh, K.M., Zafar, S.U. and Jutur, P.P. (2022). Green extraction processing of lutein from Chlorella saccharophila in water-based ionic liquids as a sustainable innovation in algal biorefineries. Algal Research, 66, p.102809. https://doi.org/10.1016/j.algal.2022.102809
Park, S.Y., Ahn, C.B. and Je, J.Y. (2014). Antioxidant and anti‐inflammatory activities of protein hydrolysates from Mytilus edulis and ultrafiltration membrane fractions. Journal of Food Biochemistry, 38(5), pp.460-468. https://doi.org/10.1111/jfbc.12070
Pezeshk, S., Ojagh, S.M., Rezaei, M. and Shabanpour, B. (2019). Fractionation of protein hydrolysates of fish waste using membrane ultrafiltration: investigation of antibacterial and antioxidant activities. Probiotics and antimicrobial proteins, 11, pp.1015-1022. https://doi.org/10.1007/s12602-018-9483-y
De Quadros, C.D.C., Lima, K.O., Bueno, C.H.L., Fogaça, F.H.D.S., Da Rocha, M. and Prentice, C. (2019). Evaluation of the antioxidant and antimicrobial activity of protein hydrolysates and peptide fractions derived from Colossoma macropomum and their effect on ground beef lipid oxidation. Journal of Aquatic Food Product Technology, 28(6), pp.677-688. https://doi.org/10.1080/10498850.2019.162815 2
Ranathunga, S., Rajapakse, N. and Kim, S.K. (2006). Purification and characterization of antioxidative peptide derived from muscle of conger eel (Conger myriaster). European Food Research and Technology, 222, pp.310-315. https://doi.org/10.1007/s00217-005-0079-x
Ruthu, Murthy, P.S., Rai, A.K. and Bhaskar, N., 2014. Fermentative recovery of lipids and proteins from freshwater fish head waste with reference to antimicrobial and antioxidant properties of protein hydrolysate. Journal of food science and technology, 51, pp.1884-1892. https://doi.org/10.1007/s13197-012-0730-z
Sadeghi, S., Jalili, H., Ranaei Siadat, S.O. and Sedighi, M. (2018). Anticancer and antibacterial properties in peptide fractions from hydrolyzed spirulina protein. Journal of Agricultural Science and Technology, 20(4), pp.673-683. http://dorl.net/dor/20.1001.1.16807073.2018.20.4.4.2
Safari, M., Ahmady-Asbchin, S. and Zamanifar, P. (2019). In vitro evaluation of antimicrobial activities from aqueous and methanolic extracts of cyanobacteria. European Journal of Biological Research, 9(3), pp.184-192. http://dx.doi.org/10.5281/zenodo.3463632
Samarakoon, K.W., O-Nam, K., Ko, J.Y., Lee, J.H., Kang, M.C., Kim, D., Lee, J.B., Lee, J.S. and Jeon, Y.J. (2013). Purification and identification of novel angiotensin-I converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from cultured marine microalgae (Nannochloropsis oculata) protein hydrolysate. Journal of Applied Phycology, 25, pp.1595-1606. https://doi.org/10.1007/s10811-013-9994-6
Senadheera, T.R., Dave, D. and Shahidi, F. (2021). Antioxidant potential and physicochemical properties of protein hydrolysates from body parts of North Atlantic sea cucumber (Cucumaria frondosa). Food Production, Processing and Nutrition, 3(1), pp.1-22. https://doi.org/10.1186/s43014-020-00049-3
Song, W., Kong, X., Hua, Y., Li, X., Zhang, C. and Chen, Y. (2020). Antioxidant and antibacterial activity and in vitro digestion stability of cottonseed protein hydrolysates. Lwt, 118, p.108724. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2019.108724
Tkaczewska, J., 2020. Peptides and protein hydrolysates as food preservatives and bioactive components of edible films and coatings-A review. Trends in Food Science & Technology, 106, pp.298-311. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2020.10.022
Wahyuningtyas, W.S., Santoso, U., Wagiman, F.X. and Ningrum, A. (2023). Functional properties of Oryctes rhinoceros larvae protein hydrolysates affected by different enzyme concentration and hydrolysis time. Journal of Insects as Food and Feed, 9(3), pp.339-351. https://doi.org/10.3920/JIFF2021.0146
Zamora-Sillero, J., Gharsallaoui, A. and Prentice, C. (2018). Peptides from fish by-product protein hydrolysates and its functional properties: An overview. Marine Biotechnology, 20, pp.118-130. https://doi.org/10.1007/s10126-018-9799-3

Full-Text:



علوم غذايي و تغذيه/ پاییز 1403 / سال بیست و یکم / شماره 4                                                                                                                                  Food Technology & Nutrition / Fall 2024 / Vol. 21 / No. 4

 مهدیه دراج و همكاران

 

بررسی پروفایل اسید آمینه پروتئین هیدرولیز شده بدست آمده از آنابنا و خواص ضداکسیدانی و ضدباکتریایی آن 

 

مهدیه دراجa، مهناز سادات صادقی b*، مژگان امتیازجوc، ندا سلطانیd، فریبا زمانی هرگلانیe

 

a دانشجوی دکتری دانشکده علوم و فنون دریایی، گروه زیست شناسی دریا، واحد تهران شمال، دانشگاه آزاداسلامی، تهران، ایران

b استادیار دانشکده علوم و فنون دریایی، گروه زیست شناسی دریا، واحد تهران شمال، دانشگاه آزاداسلامی، تهران، ایران

c استاد دانشکده علوم و فنون دریایی، گروه زیست شناسی دریا، واحد تهران شمال، دانشگاه آزاداسلامی، تهران، ایران

 dاستاد گروه علوم پایه - کاربردی، پژوهشکده جهاد دانشگاهی، ایران. ACECR، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران

e استادیاردانشکده منابع طبیعی و محیط زیست، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

 

 

 

 

تاریخ دریافت مقاله: 16/11/1402                        تاریخ پذیرش مقاله: 06/07/1403

 

چکيده

مقدمه: امروزه سیانوباکتری‌ها که گروهی از جلبک‌های میکروسکوپی هستند بعنوان منبع پروتئینی برای تولید پروتئین هیدرولیز شده مورد توجه قرار گرفته‏اند. لذا هدف از مطالعه حاضر تولید پروتئین هیدرولیز شده از آنابنا و بررسی خواص ضداکسیدانی و ضدباکتریایی آن بود.

مواد و روش‏ها: پروتئین استخراج شده از آنابنا توسط آنزیم آلکالاز در دمای 55 درجه سانتی‏گراد و pH  8 به مدت 8 ساعت هیدرولیز شد. پروفایل اسید آمینه پروتئین هیدرولیز شده توسط یک سیستم RP-HPLC مورد بررسی قرار گرفت. خواص ضداکسیدانی نمونه­های بدست آمده با روش سرکوب کنندگی رادیکال­های آزاد DPPH، ABTS و شلاته کنندگی یون‏های فلزی سنجیده شد. در ادامه خواص ضدباکتریایی پروتئین هیدرولیز شده تولید شده در برابر تعدادی از پاتوژن‏های بیماریزا بررسی شد.

یافته‏ها: پروفایل اسید آمینه پروتئین هیدرولیز شده بدست آمده نشان داد که این نمونه حاوی مقادیر 75/2، 19/4، 42/5، 43/5، 65/5، 67/5، 63/5 و 63/6 درصد هیستیدین، ترونین، متیونین، والینريال فنیل‏آلانین، ایزولویسن، لوسین و لیسین بود که مقادیر بالاتری نسبت به نیاز روزانه آمینواسیدی کودکان و بزرگسالان می‏باشد و همچنین مقادیر مناسبی از اسیدهای آمینه ضروری را نیز دارد. بالاترین درصد خنثی کنندگی در برابر رادیکال های آزاد DPPH و ABTS به ترتیب 22/88% و 90/68% بود. بالاترین فعالیت شلاته کنندگی نمونه بدست آمده 69/62% در غلظت 2 میلی‏گرم/میلی لیتر مشاهده شد. همچنین نتایج نشان داد بالاترین خواص ضدباکتریایی نمونه مورد بررسی در برابر باکتریهای استافیلوکوکوس اورئوس، لیستریا مونوسیتوژنز،  اشریشیا کلی و سالمونلا تیفی موریوم براساس قطر هاله عدم رشد به ترتیب 02/6، 90/5، 30/6 و 80/3 میلی متر در غلظت 100 میلی­گرم / میلی­لیتر بود (P< 0.05).

نتیجه‏گیری: بر اساس نتایج بدست آمده مشخص گردید که پروتئین استخراج شده از آنابنا قابلیت استفاده برای تولید پروتئین هیدرولیز شده با ویژگی های ضداکسیدانی، ضدباکتریایی را دارد و پتانسیل استفاده در صنایع غذایی و دارویی را دارد.

 

واژه‌های کلیدی: آنابنا، آلکالاز، پروتئین هیدرولیز شده، خواص ضداکسیدانی، خواص ضدباکتریایی

 

* نويسنده مسئول مكاتبات                                                                                                    email: [e-mail]

 

مقدمه

امروزه پروتئین حیوانی به عنوان پروتئین اصلی در صنایع مختلف از جمله صنایع غذایی و دارویی شناخته می‌شود، در حالی که استفاده بیش از حد از این نوع پروتئین منجر به مشکلات زیست محیطی خطرناکی نظیر بالا رفتن نرخ انتشار گازهای گلخانه‌ای، تغییرات آب و هوا، انقراض برخی از گونه‌های وحشی و کمبود تنوع زیستی شده است (Costa et al., 2023; Osanlou et al., 2022). در سال‏های اخیر به سبب افزایش سطح آگاهی عمومی درباره این چالش‌های جهانی، منابع گیاهی زمینی و دریایی بطورگسترده‏ای توسط بسیاری از دانشمندان به عنوان منابع پروتئین جایگزین با هزینه کم مورد بررسی قرار گرفته‏اند (Akbarbaglu et al., 2022; Costa et al., 2023). از همین رو، میکروجلبک‏ها و سیانوباکتری‌ها به دلیل غنی بودن از ترکیبات زیستی ارزشمند نظیر پروتئین، کربوهیدرات، اسیدهای چرب اشباع نشده و رنگدانه به عنوان منبع با کیفیت برتر شناخته شده اند (Mendiola et al., 2008; Paliwal et al., 2022; Vejdani nia et al., 2022(. در این راستا، سیانوباکتری‌ها به عنوان یک گروه متنوع از پروکاریوت‌ها هستند که به دلیل مقاومت عالی در مقابل غلظت نمک بالا و تنش خشکی همراه با توانایی منحصر به فرد در فتوسنتز در شرایط نوری نامناسب دارای مزیت‌هایی هستند Abd El-Aty et al., 2014;) (Kini et al., 2020. آنابنا به دلیل تولید رنگدانه‏های خاص به‏عنوان جلبک سبز آبی شناخته می‏شود. این سیانوباکتری رشته‏ای¹ چند سلولی را می‏توان به طور گسترده در محیط آب شیرین یافت و نقش زیادی در تثبیت نیتروژن کمپلکس نیتروژنیزه کننده حساس به اکسیژن دارد (Fadl et al., 2020). این گونه دارای سرعت رشد مناسب و مقاومت در برابر شوری و تابش نور زیاد در شرایط آزمایشگاهی بوده که فرآیند کشت آن مقرون به صرفه است. کشت در فضای باز آنابنا مرتبط با برخی از عوامل از جمله نور، دما، pH، شوری و تامین مواد مغذی است که تأثیر مستقیمی بر عملکرد رشد این گونه دارد (Moreno et al., 2003(. علاوه‏ براین، عوامل زیادی در فرآیند کشت دخیل هستند و با توجه به اینکه هر یک از عوامل می‌تواند بر عوامل دیگر تأثیر بگذارد، ارزیابی این عوامل برای بهینه‌سازی شرایط کشت نیازمند زمان و معرف‌های شیمیایی بسیار زیادی است (Amaral et al., 2020). از اینرو، در نظر گرفتن یک مدل بهینه‌سازی می‌تواند راه‌حلی مناسب برای کاهش چالش‌های موجود مرتبط با کشت این سیانوباکتری در شرایط آزمایشگاهی باشد (Safari et al., (2019. در این بین انواع مختلف مدل‌های بهینه‌سازی برای اهداف تحقیقاتی مختلف توسعه داده شده‌اند. روش سطح پاسخ 1(RSM²) یکی از این مدل‏ها است که می‌تواند حجم عظیمی از اطلاعات را در تعداد محدودی آزمایش خلاصه کند که منجر به صرفه‌جویی در زمان و هزینه می‏شود (Bezerra et al., 2008). همچنین طرح های مرکب مرکزی 2(CCD) به دلیل توانایی تشخیص آنها به طرح‏های Box-Behnken (BBD) به عنوان یکی دیگر از طراحی‏های سطح پاسخ مورد توجه هستند Bilanovic) (et al., 2009.

مانند بسیاری از سویه های سیانوباکتری، آنابنا حاوی ترکیبات متعددی از جمله لیپیدها، کلروفیل و پروتئین است که اثرات ضد باکتریایی و ضد‏اکسیدانی را نشان می‏دهند. علاوه بر این، سه نوع خاص از فیکوبیلی‏پروتئین‏ها به نام‏های فیکواریترین‏ها، فیکوسیانین‏ها و آلوفیکوسیانین‏ها در آنابنا وجود دارد که به طور گسترده در مکمل‏های غذایی و لوازم آرایشی به عنوان ردیاب‏های فلورسنت و ضد‏ اکسیدان‏های طبیعی استفاده می‏شوند Johnson et al.,) (2014. آنابنا همچنین به دلیل دارا بودن پپتیدهای فعال زیستی و مزایای سلامتی بخشی نظیر خواص ضد‏باکتری، ضد‏اکسیدان، ضدفشارخون و ضدسرطان شناخته شده است (Kini et al., 2020). پپتیدهای فعال زیستی در شکل اصلی خود غیر‏فعال هستند و برای نشان دادن فعالیت فیزیولوژیک باید هیدرولیز شوند (Kini et al., 2020). روش‌های متداولی برای هیدرولیز پروتئین از سیانوباکتری‌ها وجود دارد که شامل استفاده از حلال‌های آبی و آلی برای به دست آوردن عصاره پودری وجود دارد. در عین حال، این روش‏های سنتی می توانند بازده استخراج عصاره نهایی را کاهش دهند (Garcia-Moscoso et al., 2015). در حالی که هیدرولیز آنزیمی می‏تواند خلوص و عملکرد پروتئین بازیافت شده را در مقایسه با روش‏های سنتی بهبود ببخشد (Wahyuningtyas et al., 2022). این فرآیند به طور کلی با استفاده از آنزیم‏های پروتئاز انجام می‌شود و شرایط استخراج می‌تواند با تغییر برخی پارامترها از جمله دما، pH، غلظت آنزیم، نسبت آنزیم به سوبسترا و حتی مدت زمان فرایند متفاوت باشد (Morris et al., 2008). از این رو، استخراج آنزیمی یک روش انتخابی برای دستیابی به پروتئین هیدرولیز شده از جلبک‏ها و سیانوباکتری‏ها در نظر گرفته می‏شود (Samarakoon et al., 2013(.

در مطالعه حاضر بر اساس نتایج مطالعات قبلی در زمینه بهینه سازی شرایط کشت آنابنا، این سیانوباکتر در شرایط محیطی که بالاترین محتوای پروتئین را تولید کرده بود کشت داده شد و برای تولید پروتئین هیدرولیز شده استفاده شد. در ادامه خواص زیست فعالی نظیر ضداکسیدانی و ضدباکتریایی این پروتئین هیدرولیز شده مورد ارزیابی قرار گرفت.

 

-       مواد و روش‏ها

-       تهیه‏ سیانوباکتری آنابنا

سیانوباکتری مورد مطالعه با استفاده از نتایج مطالعه قبلی کشت داده شد (Doraj et al., 2023). بر اساس مطالعات قبلی مشخص گردیده بود که در شرایط pH 5/5، محتوای ازت 50 میلی‏گرم/ لیتر، محتوای فسفر 50 میلی گرم/ لیتر و شدت نور 3000 لوکس بالاترین مقدار تولید پروتئین بدست آمده است. لذا از این نمونه برای این تحقیق استفاده شد. سپس نمونه‏ها پودر و خشک گردید.

 

-       استخراج پروتئین

استخراج پروتئین از آنابنا بر اساس روش Doraj و همکاران (2023) با کمی تغییرات انجام شد. نمونه‏های پودر بدست آمده ابتدا با آب مقطر به نسبت 1:20 مخلوط شدند. روش انجماد - ذوب (90 دقیقه انجماد، 30 دقیقه ذوب: 3 بار) برای شکستن دیواره سلولی و تهیه عصاره سیانوباکتر انجام شد. برای استخراج بهتر پروتئین بعداز فرایند انجماد-ذوب از یک مرحله فرایند التراسونیکیش به مدت 5 دقیقه در kHz 20 و W 100 استفاده شد. پس از فراصوت، نمونه‏ها با سرعت 8000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‏گراد به مدت 40 دقیقه سانتریفیوژ شدند و مایع رویی جمع آوری شد. تری‏کلرواستیک اسیدTCA,) (Sigma-Aldrich 25% سرد با نسبت 2/5 : 1 به مایع رویی اضافه شد و به مدت 30 دقیقه در حالیکه با یخ پوشانده شده بود باقی ماند. سپس نمونه‏ها به مدت 20 دقیقه در 8000 دور در ساعت و دمای 4 درجه سانتی‏گراد سانتریفیوژ شدند. رسوبات باقیمانده جدا شده و با استفاده از 5% TCA شسته و در همان شرایط سانتریفیوژ شدند. رسوب حاصل به عنوان عصاره پروتئینی جمع آوری شد. محتوای پروتئین محلول بر اساس روش Lowry (1951) (Lowry et al., 1951) و با استفاده از آلبومین سرم گاوی (BSA, Sigma-Aldrich) به عنوان استاندارد اندازه‏گیری شد. نمونه‏های پروتئین قبل از استفاده برای هیدرولیز در دمای یخچال نگهداری شدند.

 

- هیدرولیز پروتئین استخراج شده از آنابنا

هیدرولیز پروتئین با استفاده از آنزیم آلکالاز (ALCALASE® Enzyme| 126741, Merck) انجام شد. به این منظور، پس از تنظیم 8=pH، آنزیم به نمونه ها اضافه شد. سپس مخلوط حاضر به مدت 8 ساعت در دمای 55 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد. پس از هضم آنزیمی، نمونه‏ با استفاده از TCA 20% رسوب داده شد; سپس درجه هیدرولیز تعیین شد. همچنین، پس از سانتریفیوژ، مایع رویی جدا شده و محتوای پروتئین آن بر اساس روش Lowry و همکاران (1951) اندازه‏گیری شد.

 

-       آنالیز پروفایل اسیدهای آمینه پروتئین هیدرولیز شده بدست آمده

به منظور تعیین پروفایل اسیدهای آمینه، ابتدا هر نمونه به مدت 24 ساعت با اسید کلریدریک 6 نرمال در دمای 110 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت با فنل 1 درصد (v/v) هیدرولیز شدند هیدرولیز گردید و پس از سانتریفیوژ در g×12000  در دمای محیط به مدت 3 دقیقه مشتق سازی با افتادی آلدئید (OPA) (سیگما) بر اساس آنالیز اسیدهای آمینه به روش فلوئورومتری انجام شد. پس از مشتق سازی اسیدهای آمینه با دستگاه  RP-HPLC (Agilent 1200, US) با ستون 18C-RP  با ابعاد 46 میلی متر ×15 سانتی متر به قطر 5 میکرومتر (Teknokroma، اسپانیا) با جریان 3/1 میلی لیتر بر دقیقه و دیتکتور فلئورسانس (کانادا،Lab Alliance LC305) (ex.:330/em.:480) آنالیز گردید. مقدار هر اسید آمینه در مقایسه با استاندارد اسیدهای آمینه تعیین گردید. آزمایشها در 3 تکرار انجام گرفتNaghdi)  (et al., 2023a.

 

-       فعالیت مهارکنندگی کنندگی رادیکال‏های آزاد 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)

فعالیت مهارکنندگی رادیکال‏های آزاد DPPH (مرک) توسط پروتئین هیدرولیز شده با استفاده از روشMahakhant  و همکاران (2014) مورد بررسی قرار گرفت. محلول 16/0 میلی مولار DPPH تهیه شده و با استفاده از اتانول 96 درصد رقیق شد. محلول DPPH تا زمان استفاده در جای تاریک نگهداری شد. در ادامه محلول DPPH با نمونه در نسبت 1:1 مخلوط شده و به مدت 30 دقیقه در یک مکان تاریک نگهداری شد. پس از واکنش، جذب نمونه با استفاده از دستگاه الایزا (BioTec ELx 800, US) در طول موج 517 نانومتر خوانده شد. همان نسبت DPPH و اتانول به عنوان شاهد در نظر گرفته شد و BHA در غلظت 100 میکروگرم بر میلی‏متر به عنوان استاندارد استفاده شد. مهار رادیکال DPPH پروتئین هیدرولیز شده به شرح زیر اندازه گیری شد:

DPPH (%) = ((Ac-As))/((Ac)) × 100

 

Ac و As بترتیب میزان جذب کنترل و نمونه‏های پروتئین هیدرولیز شده هستند.

 

-       فعالیت مهار‏کنندگی رادیکال‏های آزاد 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) (ABTS)

فعالیت مهار رادیکال ABTS (مرک) نمونه بدست آمده طبق روشNaghdi  و همکاران (a2023) انجام شد. محلول استوک کاتیونی ABTS تهیه و به مدت 16 ساعت در مکانی تاریک در دمای محیط نگهداری شد. محلول رادیکال ABTS با بافر فسفات (100 میلی‏مولار، pH 7.4) تا جذب 002 ± 70/0 در 734 نانومتر رقیق شد. سپس غلظت‏های 5/0 تا 2 میلی‏گرم نمونه به 5/1 میلی‏لیتر محلول ABTS اضافه شد. پس از 30 دقیقه انکوباسیون در تاریکی در دمای محیط، جذب در طول موج 734 نانومتر اندازه‌گیری شد. فعالیت مهار رادیکال های ABTS با استفاده از رابطه زیر محاسبه شد:

ABTS (%) = [AC- AS/ Ac] × 100

 

که در آن Ac جذب کنترل و AS جذب نمونه بود.

 

-       توانایی شلاته کنندگی یونهای آهن

نمونه مورد بررسی با استفاده از روشی که توسط Naghdi و همکاران (2023) شرح داده شد، از نظر فعالیت شلاته کنندگی یون‏های آهن مورد آزمایش قرار گرفت. به طور خلاصه، 100 میکرولیتر از پروتئین هیدرولیز شده در غلظت‏های مختلف با 450 میکرولیتر آب مقطر و 50 میکرولیتر FeCl2 (2 میلی‏مولار) مخلوط شده و به مدت پنج دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. در مرحله بعد، 200 میکرولیتر از محلول فروزین به مخلوط اضافه شده و به مدت 10 دقیقه به شدت تکان داده شد. همزمان در تیمار شاهد، از آب مقطر استفاده شد. در نهایت، اندازه‏گیری جذب نمونه‏ها در طول موج 562 نانومتر انجام شد.

 

-       سویه‏های باکتریایی و شرایط کشت

دو سویه باکتری گرم مثبت (استافیلوکوکوس اورئوس و لیستریا مونوسیتوژنز) و دو سویه باکتری گرم منفی (اشریشیا کلی و سالمونلا تیفی‏موریوم) برای تعیین خواص ضد باکتریایی پروتئین هیدرولیز شده بدست آمده استفاده شد؛ لیستریا مونوسیتوژنز (CMCC 5407)، استافیلوکوس اورئوس (CMCC 26001)، اشرشیا کلی (O157:H7)، و سالمونلا تیفی‏موریوم (ATCC 13311). قبل از آزمایش دو بار به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد رشد داده شدند.

 

-       سنجش فعالیت ضد باکتریایی پروتئین هیدرولیز شده

فعالیت ضد باکتریایی پروتئین هیدرولیز شده در غلظت‏های 50 و 100 میلی‏گرم در میلی‏لیتر با استفاده از روش انتشار در آگار بررسی شد (Sadeghi et al., 2018). سوسپانسیون‏های کشت باکتری که دارای جذب 08/0 در طول موج 600 نانومتر بود تهیه شدند. سپس یک سوآپ استریل برای توزیع 200 میکرولیتر از سوسپانسیون‏های تهیه شده روی محیط کشت تریپتیک سوی آگار استفاده شد. در مرحله بعد، 50 میکرولیتر از محلول‌های نمونه در صفحات پانچ شده استریل شده (قطر 6 میلی‌متر) بارگذاری و روی ظروف پتری‏دیش حاوی محیط کشت تریپتیک سوی آگار قرار داده شد. پس از آن، پتری دیش‏ها در انکوباتور قرار گرفتند و در دمای 37 درجه سانتی‏گراد به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. فعالیت ضد‏میکروبی نمونه‏ بر اساس ناحیه مهارکنندگی رشد اطراف آنها (قطر هاله عدم رشد بر حسب میلی متر) ارزیابی شد. تمام آزمایشات در سه تکرار انجام شد.

 

-       تجزیه و تحلیل آماری

نسخه SPSS 22 برای تجزیه و تحلیل داده‏ها استفاده شد. تفاوت معنی‌داری بین متغیرها با استفاده از آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه و آزمون چند دامنه‌ای دانکن ارزیابی شد. سطح معنی‏داری 05/0 < p معنی‏دار در نظر گرفته شد.

 

یافته‏ها

-       درجه هیدرولیز

بر اساس نتایج بدست آمده مشخص گردید که درجه هیدرولیز پروتئین هیدرولیز شده بدست آمده برابر با 92/0 ± 63/22 بود.

 

-       پروفایل اسید آمینه

نتایج بررسی پروفایل اسید آمینه پروتئین هیدرولیز شده بدست آمده در جدول 1 گزارش شده است. همانطوری که از نتایج پیداست اسید آمینه‏های اسید آسپارتیک و اسید گلوتامیک با درصدهای 0/28 ± 11/23 و0/22  ± 12/48 بالاترین درصد را در بین آمینو‏اسیدهای تشکیل دهنده پروتئین هیدرولیز شده داشتند. همچنین محتوای اسید آمینه‏های ضروری و آبگریز به ترتیب ±0/08 50/03 و ±0/08 73/43 بود.

 

---

[1] 2 Central Composite Design

[2] 1 Response Surface Methodology

 

جدول 1- پروفایل اسید آمینه پروتئین هیدرولیز شده. Table 1- Amino acid profile of the hydrolyzed protein.
Amino acid	Average (Percent)	Daily requirement according to WHO report
Aspartic acid	11/23 ± 0/28	Adults	Children
Glutamic acid	12/48 ± 0/22
Serine	4/73 ± 0/08
Histidine	2/75 ± 0/06	1/6	1/5
Glycine	5/48 ± 0/25
Threonine	5/43 ± 0/07	2/8	0/9
Arginine	5/57 ± 0/27
Alanine	6/54 ± 0/07
Tyrosine	6/11 ± 0/28
Methionine	4/19 ± 0/16	2/2	1/7
Valine	5/65 ± 0/10	2/5	1/3
Phenylalanine	5/67 ± 0/15	2/2	1/9
Isoleucine	5/63 ± 0/08	3/1	3/1
Leucine	6/63 ± 0/17	6/1	5/9
Lysine	5/42 ± 0/15	4/8	4/5
Cysteine	2/55 ± 0/06
Proline	3/94 ± 0/04
Hydrophobic amino acid	43/73 ± 0/08
Essential amino acid	50/03 ± 0/08
Results are reported based on the average of three replicates ± SD.

 

 

-       نتایج سرکوب کنندگی رادیکال آزاد DPPH پروتئین هیدرولیز شده بدست آمده

نتایج خواص ضداکسیدانی نمونه بدست آمده در غلظت‏های مختلف در مقایسه با ضد‏‏اکسیدان صنعتی BHA در برابر رادیکال آزاد DPPH  مورد بررسی قرار گرفت و نتایج آن در شکل 1 نشان داده شده است. همانطور که از نتایج پیداست با افزایش غلظت خواص ضد‏اکسیدانی آنها نیز افزایش یافت که مشابه با یافته های گزارش شده توسط محققین دیگر بود (Naghdi et al., 2023 a,b). از طرفی در غلظت 2 میلی‏گرم در میلی لیتر پروتئین هیدرولیز شده توانست 22/88 % سرکوب کنندگی از خود نشان دهد که اختلاف نسبتا کمی در مقایسه با BHA داشت (P< 0.05).

 

-       نتایج سرکوب کنندگی رادیکال آزاد ABTS پروتئین هیدرولیز شده بدست آمده

درصدهای سرکوب کنندگی رادیکال آزاد ABTS پروتئین هیدرولیز شده بدست آمده در غلظت‏های 5/0، 1، 5/1 و 2 به ترتیب 52/55، 38/61، 49/65 و 90/68 % بود. نتایج این بخش نشان داد که اختلاف معنی‏داری بین غلظت‏های مختلف نمونه پروتئین هیدرولیز شده در این آزمون وجود داشت و مشخص گردید که بالاترین غلظت مورد بررسی بالاترین ویژگی سرکوب کنندگی (90/68 %) بر علیه رادیکال‏های آزاد ABTS نشان داد (P< 0.05). بین غلظت‏های 2 میلی‏گرم / میلی‏لیتر و 5/1 میلی‏گرم/ میلی‏لیتر نمونه اختلاف معنی‏داری مشاهده نشد در حالی‏که این دو غلظت با سایر غلظت‏ها اختلاف معنی‏داری نشان دادند.

 

-       نتایج شلاته کنندگی یونهای فروزین توسط پروتئین هیدرولیز شده بدست آمده

با افزایش غلظت نمونه درصد شلاته کنندگی یون‏های فروزین افزایش معنی‏داری نشان داد (P< 0.05). درصد شلاته کنندگی پروتئین هیدرولیز شده در تمام غلظت‏های بررسی شده در برابر BHA کمتر بود. همچنین بین غلظت‏های 5/1 و 2 میلی‏گرم/میلی‏لیتر نمونه پروتئین هیدرولیز شده و غلظت‏های 5/0 و 1 میلی‏گرم/ میلی‏لیتر نمونه اختلاف معنی‏داری مشاهده نشد (P> 0.05). 

 

Figure 1- DPPH free radical suppressing properties of hydrolyzed protein obtained.

شکل 1- خواص سرکوب کنندگی رادیکال های آزاد DPPH پروتئین هیدرولیز شده

 

Figure 2- ABTS free radical suppressing properties of the obtained hydrolyzed protein.

شکل 2- خواص سرکوب کنندگی رادیکال های آزاد ABTS پروتئین هیدرولیز شده.

 

Figure 3- Chelating properties of ferrozine ions of the hydrolyzed protein. شکل 3 - خواص شلاته کنندگی یونهای فروزین پروتئین هیدرولیز شده.

 

 

-       نتایج خواص ضدباکتریایی پروتئین هیدرولیز شده بدست آمده

خواص ضدباکتریایی پروتئین هیدرولیز شده بدست آمده در برابر باکتری‏های گرم مثبت (استافیلوکوکوس اورئوس و لیستریا مونوسیتوژنز) و گرم منفی (اشریشیا کلی و سالمونلا تیفی‏موریوم) در غلظت 100 میلی‏گرم/ میلی‏لیتر نمونه بالاترین مقادیر را نشان داد. همانطور که از نتایج پیداست هاله عدم رشد بدست آمده در باکتری‏های استافیلوکوکوس اورئوس، لیستریا مونوسیتوژنز، اشریشیا کلی و سالمونلا تیفی موریوم به ترتیب 02/6، 90/5، 30/6 و 80/3 میلی‏متر بود (P< 0.05).

 

بحث

از عوامل تاثیرگذار بر خواص زیست فعالی پروتئین‏های هیدرولیز شده درجه هیدورلیز می‏باشد (Akbarbaglu et (al., 2022. نتایج درجه هیدرولیز کمتر از نتایج بدست آمده توسط Akbarbaglu و همکاران (2022) بود که آنها به بررسی خواص زیست فعالی و کارکردی پروتئین‏های هیدرولیز شده بدست آمده توسط پروتئازهای مختلف از اسپیرولینا پرداختند. به طور کلی، درجه هیدرولیز برای ارزیابی سرعت تجزیه (هیدرولیز) پروتئین‏‏ها و ارزیابی سینتیک واکنش استفاده می‏شود (Noman et al., 2020). این شاخص تاحد زیادی مسئول تعیین فعالیت عملکردی و زیستی هیدرولیزها است (Akbarbaglu et al., 2022). همچنین مقدار آن بدلیل عملکرد متفاوت آنزیم‏ها با سوبستراها مختلف می‏تواند متفاوت باشد (Noman et al., 2020). هیدرولیز آنزیمی نیز تحت تأثیر عوامل متعددی از جمله ویژگی آنزیمی است که ممکن است این تفاوت را توجیه کند (Baharuddin et al., (2016. علاوه بر این دما، غلظت آنزیم و pH بر سرعت واکنش تأثیر می‌گذارد و بنابراین به نحوی بر درجه هیدرولیز تأثیر می‌گذارند (Naghdi et al., 2023a). به طور کلی، مقدار بالای این شاخص نشان می‏دهد که فرآیند هیدرولیز آنزیمی پیوندهای پپتیدی بیشتری را شکسته است (Noman et al., 2020). در حال حاضر، پروتئازها برای هیدرولیز پروتئین‏ها به منظور تولید پپتیدهایی که حاوی توالی اسید آمینه‏‏ای و اندازه های مختلف 2 تا 20 اسید آمینه، بکار می‏روند (De Quadros et al., 2019). همچنین عملکرد پپتیدها با ترکیب اسید آمینه و سطح آنها تعیین می‏شود. منابع مختلف، پروتئین‌های هیدرولیز شده متفاوتی با پروفایل‌های اسید آمینه متنوع تولید می‌کنند، که می‌توان این واقعیت را توضیح دهد که نوع سوبسترای مورد

 

 

Figure 4- Antibacterial properties of hydrolyzed protein obtained against a number of food pathogens.

شکل 4- خواص ضدباکتریایی پروتئین هیدرولیز شده بدست آمده بر علیه تعدادی از پاتوژنهای غذایی.

 

استفاده برای تولید پروتئین‌های هیدرولیز شده نقش عمده‌ای در تعیین پروفایل‌ها و محتوای اسید آمینه آن‌ها دارد (Baharuddin et al., 2016). علاوه بر این، به خوبی ثابت شده است که عواملی مانند نوع آنزیم، نسبت آنزیم به سوبسترا، دما، pH و غیره بر محتوای اسید آمینه پروتئین‏های هیدرولیز شده تأثیرگذار است Noman et al.,) 2020(. بر اساس تحقیقات قبلی، گزارش شده است که برخی اسیدهای آمینه از جمله تیروزین، هیستیدین، متیونین و لیزین دارای توانایی مهار رادیکال قوی هستند (Akbarbaglu et al., 2022)، که محتوای این اسیدهای آمینه در تحقیق حاضر به ترتیب 28/0 ± 11/6، 06/0 ± 75/2، 16/0 ± 19/4 و 15/0 ± 42/5 % بود. همچنین گزارش شده است که آمینو اسیدهایی از قبیل گلیسین، آلانین، متیونین، والین، فنیل‏آلانین، ایزولوسین و پرولین با مهار رادیکال‌های دولایه‌های لیپیدی غشایی خاصیت ضد‌اکسیدانی از خود نشان می‏دهند (Naghdi et al., 2023b). علاوه بر این، حضور درصدهای بالای آمینو اسیدهای آروماتیک نظیر تیروزین، فنیل‏آلانین و تریپتوفان در نمونه‏های پروتئین هیدرولیز شده پتانسیل ضد‏ اکسیدانی بسیار خوبی در فعالیت شلاته کنندگی یونهای فروزین از خود نشان داده اند (Naghdi et al., 2023b). با این حال، علاوه بر حضور آمینو اسیدهای خاص در پپتیدها، توالی آرایش اسید آمینه و ترکیب کلی پپتید می‏تواند به طور قابل توجهی بر پتانسیل  ضداکسیدانی  آنها تأثیر بگذارد (Akbarbaglu et al., 2022). جالب توجه است، برخی از اسیدهای آمینه آبگریز مانند Val و Leu می‏توانند نقش مهمی در فعالیت ضد‏اکسیدانی با واکنش با سیستم‏های لیپیدی در بدن و مواد غذایی ایفا کنند (Ruthu et al., 2014(. همانطور که از جدول 1 پیداست محتوای هیستیدین، ترونین، والین، فنیل ‏آلانین، ایزولوسین، لوسین و لیزین پروتئین هیدرولیز شده بدست آمده بیشتر از مقادیر مورد نیاز مصرف روزانه کودکان و بزرگسالان است. از همین رو پروتئین هیدرولیز شده تولید شده بخوبی می‏تواند نیازهای روزانه آنها را برطرف سازد و مورد توجه صنعت غذایی و دارویی قرار بگیرد.

تعیین خواص ضد‏اکسیدانی ترکیبات زیست فعال با استفاده از روش سرکوب‏کنندگی رادیکال‌های آزاد DPPH یک روش پیشرفته و موثر در سنجش قدرت ضداکسیدانی ترکیبات است. این نشان می دهد که این نمونه پتانسیل کاربرد بعنوان ترکیب ضداکسیدان را در صنایع مختلف دارد. ویژگی سرکوب کنندگی رادیکال های آزاد توسط پروتئین های هیدرولیز شده به عوامل مختلفی نظیر وزن مولکولی، پروفایل اسید آمینه، درجه هیدرولیز و... بستگی دارد (Ktari et al., 2013; Akbarbaglu et al., 2022). از طرفی دیگر محتوای بالای اسید آمینه های هیدروفوبیک که شامل گلایسین، آلانین، متیونین، والین، فنیل آلانین، ایزولوسین، لوسین و پرولین است می‏تواند دلیل دیگر بالا بودن درصد سرکوب کنندگی در این مطالعه بوده باشد (Naghdi et al., 2023b). چندین مطالعه گزارش کرد‏ه‏اند که چگونه فرآیند هیدرولیز با آنزیم‏ها بر خواص ضد‏اکسیدانی هیدرولیزهای پروتئینی تأثیر می گذارد. این فرآیند منجر به تغییراتی در اتصالات بین مولکولی در کمپلکس‌های مختلف، مانند پروتئین-پلی ساکاریدها و پروتئین-لیپیدها می‌شود که منجر به ایجاد محلول‌های هیدرولیز پروتئین متنوع می‌شود (Chai et al., 2012; Noman et al., 2020). علاوه بر این، می‏توان از کارآیی پروتئن‏های هیدرولیز شده در برابر رادیکال های DPPH استنباط کرد که مخلوط پپتیدی از اسیدهای آمینه به طور موثری رادیکال های DPPH را از طریق تشکیل جفت الکترون سرکوب می‏کنند (Ktari et al., 2013; Akbarbaglu et al., 2022). Akbarbaglu و همکاران (2022) پیشنهاد کردند که تأثیر هیدرولیزها بر مهار رادیکال‏های آزاد را می توان به وجود بارهای مثبت روی پپتیدها و در نتیجه آزادسازی اسیدهای آمینه ضد‏اکسیدانی نسبت داد. به طور خاص، اسیدهای آمینه آبگریز در DPPH عوامل مرتبط در این زمینه تلقی شدند.

گزارش شده است که پپتیدهای فعال زیستی با وزن مولکولی کم ویژگی‏های فیزیولوژیکی مناسب نظیر نفوذپذیری بالای غشاء و سازگاری ساختاری را از خود نشان داده‏اند (Naghdi et al., 2023b). با این وجود، بزرگی پپتیدها عامل مهمی در قدرت زیستی آنها است. فعالیت زیستی ممکن است تحت تأثیر ترکیب و توالی اسیدهای آمینه قرار گیرد. سنجش رادیکال ABTS برای ارزیابی فعالیت ضداکسیدانی هیدرولیزهای پروتئینی به دست آمده از منابع مختلف مورد استفاده قرار می گیرد (Pezeshk et al., 2019). در حال حاضر، به طور گسترده پذیرفته شده است که ترکیبات خاصی از آنزیم ها و سوبستراها می توانند چندین پروتئین هیدرولیز شده با سطوح مختلفی از اسیدهای آمینه متمایز را تولید کنند، که ویژگی های ضداکسیدانی متمایزی را در نمونه های حاصل ایجاد می‏کنند (Sadeghi et al., 2018; Heffernan et al., 2021; Mousaie et al., 2022). علاوه بر این، به طور گسترده شناخته شده است که عوامل مختلفی از جمله ترکیب و توالی اسید آمینه، وزن مولکولی پپتیدهای تولید شده و درجه هیدرولیز، عوامل مهمی در ایجاد فعالیت ضد رادیکال‏های آزاد مانند ABTS هستند (Gómez-Guillén et al., 2010; Pezeshk et al., 2019; Naghdi, Lorenzo, et al., 2023). با این حال، باید توجه داشت که هر یک از عوامل ذکر شده به طور بالقوه می‌تواند نتایج متفاوتی را در بین نمونه‌های مختلف به همراه داشته باشد (Noman et al., 2020). همانطور که توسط مطالعات مختلف گزارش شده است، به نظر می رسد نتایج متفاوتی در رابطه بین درجه هیدرولیز و افزایش ظرفیت جذب رادیکال آزاد وجود داشته باشد (Latorres et al., 2018). به‏عنوان مثال برخی از تحقیقات افزایش ظرفیت فوق‌الذکر را با افزایش سطوح هیدرولیز نشان داده‌اند (Latorres et al., 2018)، در حالی که برخی از تحقیقات نتایج مخالفی را گزارش کرده‏اند (Park et al., 2014). همچنین نشان داده شده است که تری‏پپتیدهایی که دارای تریپتوفان یا تیروزین در C-پایانه خود هستند، فعالیت مهار رادیکال قابل توجهی از خود نشان می‏دهند (Senadheera et al., 2021). یافته‌های تحقیقاتی Song و همکاران (2020) نشان دادند که پپتیدهای خاصی مانند Lys، Arg، His و Pro، فعالیت ضد‌اکسیدانی برجسته‌ای از خود بروز دادند، در حالی که فراکسیون‌های پپتیدی حاوی اسیدهای آمینه اساسی قابل‌توجهی، کارآیی بیشتری در مهار کاتیون‌های رادیکال ABTS نشان دادند. تولید رادیکال‌های هیدروکسیل [OH] در سیستم‏های زیستی می‌تواند با حضور بیش از حد یون‌های فلزی، عمدتاً Fe(II)، از طریق واکنش‌های شبه فنتون ایجاد شود (Tkaczewska, 2020). زنجیره‌های جانبی شامل کربوکسیل (Glu، Asp) و گروه‌های آمینه (Lys، His، Arg)، با ممانعت از دسترسی به فلزات واسطه، به عنوان شلات‌کننده فلز عمل می‌کنند و در نتیجه واکنش‌های زنجیره‌ای اکسیداتیو با واسطه رادیکال را مهار می‌کنند (Ranathunga et al., 2006; Klompong et al., 2009).

طبق یافته‌های Nikoo و همکاران (2019) پپتیدهایی با وزن مولکولی پایین نسبت بار منفی بیشتری نسبت به جرم خود، به ویژه از طریق حضور گروه‌های کربوکسیل نشان می‌دهند. این خاصیت آن‌ها را قادر می‌سازد تا کمپلکس‌های یون فلزی مؤثرتری را در مقایسه با پپتیدهای بزرگ‌تر تشکیل دهند، در نتیجه حساسیت آن‌ها به واکنش‌های شیمیایی، به‌ویژه اکسیداسیون لیپید را کاهش می‌دهد. Sadeghi و همکاران (2018) گزارش کردند که پروتئین‏های هیدرولیز شده و فراکشن به دست آمده از اسپیرولینا در برابر استافیلوکوکوس اورئوس فعالیت ضد باکتریایی بالاتری را نسبت به باکتری اشرشیا کلی نشان دادند که با نتایج ما همسو بود (Sadeghi et al., 2018(. فعالیت ضد میکروبی هیدرولیزهای پروتئینی تابع مجموعه‌ای از عوامل است که شامل ترکیب اسید آمینه، وزن مولکولی، توالی، ویژگی‌های ساختاری، آبگریزی، بار و نوع گونه‌های باکتری موجود است (Naghdi et al., 2023). تحقیقات نشان داده است که پپتیدهای ضد میکروبی معمولاً از 50 تا 100 اسید آمینه تشکیل شده‌اند که حدود 50 درصد از این اسیدهای آمینه آبگریز هستند و دارای جرم مولکولی کمتر از 10 کیلو دالتون هستند (Zamora-Sillero et al., 2018). مکانیسم دقیقی که فعالیت ضد‏باکتریایی پروتئین‏های هیدرولیز شده را به‏طور کامل توضیح دهد مشخص نشده است. در این راستا بیان شده است که پپتیدها ممکن است متابولیسم سلولی باکتری را مختل کنند و در نهایت منجر به مرگ باکتری شوند Ruthu et al., 2014; Mirzapour-Kouhdasht et) al., 2021(. بر اساس یافته‏های Akbarbaglu و همکاران (2022)، فعالیت ضد میکروبی پپتیدها و هیدرولیزه‏ها به حضور اسیدهای آمینه آبگریز خاص یعنی هیستیدین، آرژنین، پرولین و گلیسین نسبت داده شد است. همچنین اثرات باکتریواستاتیک پپتیدهای با بار مثبت و اسیدهای آمینه آبگریز به توانایی آنها در نفوذ و واکنش با غشای سلولی باکتری نسبت داده می‏شود. بطورکلی بر اساس نتایج بدست آمده میتوان اذعان کرد که پروتئین هیدرولیز شده بدست آمده از سیانوباکتری آنابنا دارای پتانسیل کاربرد بعنوان مکمل تغذیه‏ای و یا افزودنی در صنایع غذایی می‏باشد.

 

نتیجه‏‏گیری

در مطالعه حاضر آنابنای کشت داده شده با بیشترین محتوای پروتئین برای تولید پروتئین هیدرولیز شده استفاده شد. پروتئین هیدرولیز شده بدست آمده از نظر پروفایل اسید آمینه دارای محتوای مناسبی از اسیدهای آمینه ضروری بود. این نمونه خواص ضداکسیدانی مناسبی در برابر رایکال‏های آزاد DPPH، ABTS و شلاته کنندگی یونه‏ای فروزین در مقایسه با BHA از خود نشان داد. علاوه بر این خواص ضدباکتریایی مناسبی در برابر تعدادی از عوامل بیماریزای غذایی مشاهده شد. بر اساس نتایج بدست آمده می‏توان اذعان کرد که پروتئین هیدرولیز شده بدست آمده از سیانوباکتری آنابنا دارای پتانسیل کاربرد بعنوان مکمل تغذیه‏ای و یا افزودنی در صنایع غذایی می‏باشد.

 

سپاسگزاری

نویسندگان از دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال کمال تشکر را دارند.

 

منابع

Abd El-Aty, A.M., Mohamed, A.A. & Samhan, F.A. (2014). In vitro antioxidant and antibacterial activities of two fresh water Cyanobacterial species, Oscillatoria agardhii and Anabaena sphaerica. Journal of Applied Pharmaceutical Science, 4(7), 069-075. http://dx.doi.org/10.7324/JAPS.2014.40712

Akbarbaglu, Z., Ayaseh, A., Ghanbarzadeh, B. & Sarabandi, K. (2022). Techno-functional, biological and structural properties of Spirulina platensis peptides from different proteases. Algal Research, 66, 102755. https://doi.org/10.1016/j.algal.2022.102755

do Amaral, S.C., Santos, A.V., da Cruz Schneider, M.P., da Silva, J.K.R. & Xavier, L.P. (2020). Determination of volatile organic compounds and antibacterial activity of the amazonian cyanobacterium Synechococcus sp. strain GFB01. Molecules, 25(20), 4744. https://doi.org/10.3390/molecules25204744

Baharuddin, N.A., Halim, N.R.A. & Sarbon, N.M. (2015). Effect of degree of hydrolysis (DH) on the functional properties and angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity of eel (Monopterus sp.) protein hydrolysate.

Bezerra, M.A., Santelli, R.E., Oliveira, E.P., Villar, L.S. & Escaleira, L.A. (2008). Response surface methodology (RSM) as a tool for optimization in analytical chemistry. Talanta, 76(5), 965-977. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2008.05.019

Bilanovic, D., Andargatchew, A., Kroeger, T. & Shelef, G. (2009). Freshwater and marine microalgae sequestering of CO2 at different C and N concentrations–response surface methodology analysis. Energy Conversion and Management, 50(2), 262-267. https://doi.org/10.1016/j.enconman.2008.09.024

Chai, H.J., Chan, Y.L., Li, T.L., Chen, Y.C., Wu, C.H., Shiau, C.Y. & Wu, C.J. (2012). Composition characterization of Myctophids (Benthosema pterotum): Antioxidation and safety evaluations for Myctophids protein hydrolysates. Food Research International, 46(1), 118-126. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2011.12.008

Costa, M.M., Spínola, M.P. & Prates, J.A. (2023). Combination of Mechanical/Physical Pretreatments with Trypsin or Pancreatin on Arthrospira platensis Protein Degradation. Agriculture, 13(1), 198. https://doi.org/10.3390/agriculture13010198

Doraj, M., Emtyazjoo, M., Sadeghi, M.S., Soltani, N. & Hargelani, F.Z. (2023). Protein hydrolysate from Anabaena sp. cultured in an optimized condition designed by RSM; insight into bioactive attributes. Algal Research, 70, 103026. https://doi.org/10.1016/j.algal.2023.103026

Fadl, S.E., Elsadany, A.Y., El-Shenawy, A.M., Sakr, O.A., El Gammal, G.A., Gad, D.M., Norag, M.A.A. & Eissa, I. (2020). Efficacy of cyanobacterium Anabaena sp. as a feed supplement on productive performance and immune status in cultured Nile tilapia. Aquaculture Reports, 17, 100406. https://doi.org/10.1016/j.aqrep.2020.100406

Garcia-Moscoso, J.L., Teymouri, A. & Kumar, S. (2015). Kinetics of peptides and arginine production from microalgae (Scenedesmus sp.) by flash hydrolysis. Industrial & Engineering Chemistry Research, 54(7), 2048-2058. https://doi.org/10.1021/ie5047279

Guillén, G., López Caballero, M.E., Alemán, A., Lacey, A.L.D., Giménez, B. &

Montero García, P. (2010). Antioxidant and antimicrobial peptide fractions from squid and tuna skin gelatin.

Heffernan, S., Giblin, L. & O'Brien, N. (2021). Assessment of the biological activity of fish muscle protein hydrolysates using in vitro model systems. Food chemistry, 359, 129852. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2021.129852

Johnson, E.M., Kumar, K. & Das, D. (2014). Physicochemical parameters optimization, and purification of phycobiliproteins from the isolated Nostoc sp. Bioresource technology, 166, 541-547. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2014.05.097

Kini, S., Divyashree, M., Mani, M.K. & Mamatha, B.S. (2020). Algae and cyanobacteria as a source of novel bioactive compounds for biomedical applications. In Advances in cyanobacterial biology, 173-194. Academic Press. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-819311-2.00012-7

Klompong, V., Benjakul, S., Yachai, M., Visessanguan, W., Shahidi, F. & Hayes, K.D. (2009). Amino acid composition and antioxidative peptides from protein hydrolysates of yellow stripe trevally (Selaroides leptolepis). Journal of food science, 74(2), C126-C133. https://doi.org/10.1111/j.1750-3841.2009.01047.x

Ktari, N., Fakhfakh, N., Balti, R., Ben Khaled, H., Nasri, M. & Bougatef, A. (2013). Effect of degree of hydrolysis and protease type on the antioxidant activity of protein hydrolysates from cuttlefish (Sepia officinalis) by-products. Journal of Aquatic Food Product Technology, 22(5), 436-448. https://doi.org/10.1080/10498850.2012.658961

Latorres, J.M., Rios, D.G., Saggiomo, G., Wasielesky, W. & Prentice-Hernandez, C. (2018). Functional and antioxidant properties of protein hydrolysates obtained from white shrimp (Litopenaeus vannamei). Journal of Food Science and Technology, 55, 721-729. https://doi.org/10.1007/s13197-017-2983-z

Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. & Randall, R.J. (1951). Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent.

Bennett, G. (1992). Lowry's handbook of right-to-know emergency planning. Journal of Hazardous Materials, 30(3), 361-362. https://doi.org/10.1016/0304-3894(92)87011-4

Mahakhant, A., Khanthasopa, S., Jaisai, N. & Wongsing, N. (2011). Screening of biological activities from Nostoc spp.(Cyanophyta). In International Symposium on Medicinal and Aromatic Plants, 1023, 271-277. https://doi.org/10.17660/ActaHortic.2014.1023.39

Mendiola León, J.A., Rodríguez Meizoso, I., Señorans, F.J., Reglero, G., Cifuentes, A. & Ibáñez, E. (2008). Antioxidants in plant foods and microalgae extracted using compressed fluids. Electronic Journal of Environmental, Agricultural and Food Chemistry.

Mirzapour-Kouhdasht, A., Moosavi-Nasab, M., Kim, Y.M. & Eun, J.B. (2021). Antioxidant mechanism, antibacterial activity, and functional characterization of peptide fractions obtained from barred mackerel gelatin with a focus on application in carbonated beverages. Food Chemistry, 342, 128339. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2020.128339

Moreno, J., Vargas, M.Á., Rodrıguez, H., Rivas, J. & Guerrero, M.G. (2003). Outdoor cultivation of a nitrogen-fixing marine cyanobacterium, Anabaena sp. ATCC 33047. Biomolecular engineering, 20(4-6), 191-197. https://doi.org/10.1016/S1389-0344(03)00051-0

Morris, H.J., Almarales, A., Carrillo, O. & Bermúdez, R.C. (2008). Utilization of Chlorella vulgaris cell biomass for the production of enzymatic protein hydrolysates. Bioresource technology, 99(16), 7723-7729. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2008.01.080

Mousaie, M., Khodadadi, M. & Tadayoni, M. (2022). Hydrolysate protein from brown macroalgae (Sargassum ilicifolium): Antioxidant, antitumor, antibacterial, and ACE inhibitory activities. Journal of Food Processing and Preservation, 46(11), e17020. https://doi.org/10.1111/jfpp.17020

Naghdi, S., Lorenzo, J.M., Mirnejad, R., Ahmadvand, M. & Moosazadeh Moghaddam, M. (2023). Bioactivity evaluation of peptide fractions from bighead carp (Hypophthalmichthys nobilis) using alcalase and hydrolytic enzymes extracted from Oncorhynchus mykiss and their potential to develop the edible coats. Food and Bioprocess Technology, 16(5), 1128-1148. https://doi.org/10.1007/s11947-022-02986-y

Naghdi, S., Rezaei, M., Tabarsa, M. & Abdollahi, M., (2023). Fish Protein Hydrolysate from Sulfated Polysaccharides Extraction Residue of Tuna Processing By‐Products with Bioactive and Functional Properties. Global Challenges, 7(4), 2200214. https://doi.org/10.1002/gch2.202200214

Naghdi, S., Rezaei, M., Tabarsa, M. & Abdollahi, M. (2023). Parallel Extraction of Sulfated polysaccharides and Protein Hydrolysate from Skipjack Tuna Head and Their Bioactive and Functional Properties. Food and Bioprocess Technology, 1-22. https://doi.org/10.1007/s11947-022-02988-w

Nikoo, M., Benjakul, S., Yasemi, M., Gavlighi, H.A. & Xu, X. (2019). Hydrolysates from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) processing by-product with different pretreatments: Antioxidant activity and their effect on lipid and protein oxidation of raw fish emulsion. Lwt, 108, 120-128. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2019.03.049

Noman, A., Ali, A.H., Wedad, Q.B. & Wenshui, X. (2020). Effect of enzyme type on the properties of Chinese sturgeon (Acipenser sinensis) protein hydrolysates produced by enzymatic hydrolysis process. American Journal of Food Science and Nutrition Research, 6(1), 10-16. http://dx.doi.org/10.1016/j.procbio.2018.01.009

Paliwal, C., Rehmanji, M., Shaikh, K.M., Zafar, S.U. & Jutur, P.P. (2022). Green extraction processing of lutein from Chlorella saccharophila in water-based ionic liquids as a sustainable innovation in algal biorefineries. Algal Research, 66, 102809. https://doi.org/10.1016/j.algal.2022.102809

Park, S.Y., Ahn, C.B. & Je, J.Y. (2014). Antioxidant and anti‐inflammatory activities of protein hydrolysates from Mytilus edulis and ultrafiltration membrane fractions. Journal of Food Biochemistry, 38(5), 460-468. https://doi.org/10.1111/jfbc.12070

Pezeshk, S., Ojagh, S.M., Rezaei, M. & Shabanpour, B. (2019). Fractionation of protein hydrolysates of fish waste using membrane ultrafiltration: investigation of antibacterial and antioxidant activities. Probiotics and antimicrobial proteins, 11, 1015-1022. https://doi.org/10.1007/s12602-018-9483-y

De Quadros, C.D.C., Lima, K.O., Bueno, C.H.L., Fogaça, F.H.D.S., Da Rocha, M. & Prentice, C. (2019). Evaluation of the antioxidant and antimicrobial activity of protein hydrolysates and peptide fractions derived from Colossoma macropomum and their effect on ground beef lipid oxidation. Journal of Aquatic Food Product Technology, 28(6), 677-688. https://doi.org/10.1080/10498850.2019.1628152

Ranathunga, S., Rajapakse, N. & Kim, S.K. (2006). Purification and characterization of antioxidative peptide derived from muscle of conger eel (Conger myriaster). European Food Research and Technology, 222, 310-315. https://doi.org/10.1007/s00217-005-0079-x

Ruthu, Murthy, P.S., Rai, A.K. & Bhaskar, N., 2014. Fermentative recovery of lipids and proteins from freshwater fish head waste with reference to antimicrobial and antioxidant properties of protein hydrolysate. Journal of food science and technology, 51, 1884-1892. https://doi.org/10.1007/s13197-012-0730-z

Sadeghi, S., Jalili, H., Ranaei Siadat, S.O. & Sedighi, M. (2018). Anticancer and antibacterial properties in peptide fractions from hydrolyzed spirulina protein. Journal of Agricultural Science and Technology, 20(4), 673-683. http://dorl.net/dor/20.1001.1.16807073.2018.20.4.4.2

Safari, M., Ahmady-Asbchin, S. & Zamanifar, P. (2019). In vitro evaluation of antimicrobial activities from aqueous and methanolic extracts of cyanobacteria. European Journal of Biological Research, 9(3), 184-192. http://dx.doi.org/10.5281/zenodo.3463632

Samarakoon, K.W., O-Nam, K., Ko, J.Y., Lee, J.H., Kang, M.C., Kim, D., Lee, J.B., Lee, J.S. & Jeon, Y.J. (2013). Purification and identification of novel angiotensin-I converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from cultured marine microalgae (Nannochloropsis oculata) protein hydrolysate. Journal of Applied Phycology, 25, 1595-1606. https://doi.org/10.1007/s10811-013-9994-6

Senadheera, T.R., Dave, D. & Shahidi, F. (2021). Antioxidant potential and physicochemical properties of protein hydrolysates from body parts of North Atlantic sea cucumber (Cucumaria frondosa). Food Production, Processing and Nutrition, 3(1), 1-22. https://doi.org/10.1186/s43014-020-00049-3

Song, W., Kong, X., Hua, Y., Li, X., Zhang, C. & Chen, Y. (2020). Antioxidant and antibacterial activity and in vitro digestion stability of cottonseed protein hydrolysates. Lwt, 118, 108724. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2019.108724

Tkaczewska, J. (2020). Peptides and protein hydrolysates as food preservatives and bioactive components of edible films and coatings-A review. Trends in Food Science & Technology, 106, 298-311. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2020.10.022

Wahyuningtyas, W.S., Santoso, U., Wagiman, F.X. & Ningrum, A. (2023). Functional properties of Oryctes rhinoceros larvae protein hydrolysates affected by different enzyme concentration and hydrolysis time. Journal of Insects as Food and Feed, 9(3), 339-351. https://doi.org/10.3920/JIFF2021.0146

Zamora-Sillero, J., Gharsallaoui, A. & Prentice, C. (2018). Peptides from fish by-product protein hydrolysates and its functional properties: An overview. Marine Biotechnology, 20, 118-130. https://doi.org/10.1007/s10126-018-9799-3

 

 

 

 

 

 

9