Identification of epiphytic molds on mulberry leaves and the effect of their secondary metabolites on Staphylococcus aureus and its comparison with vancomycin

Subject Areas : microbiology

fatemehzahra Asadi ¹ , Aqhil tabarmollah hassan ² , Issa Gholampour Azizi ³

1 - Ms Microbiology, Babol Branch, Islamic Azad University, Babol, Iran
2 - Assistant professor, Department of Clinical Science, Babol Branch, Islamic Azad University, Babol, Iran
3 - 3 Assistant professor, Department of Veterinary Science, Babol Branch, Islamic Azad University, Babol, Iran

Received: 2025-01-23 Accepted : 2025-03-05 Published : 2025-04-17

Keywords: Mulberry leaf, Aspergillus, Fusarium, Staphylococcus aureus, epiphyte,

Abstract :

Introduction: Recently, due to the prevalence of antibiotic resistance in bacteria, attention has been growing to biological metabolites as antimicrobial compounds to inhibit them. Therefore, in the present study, epiphytic molds of mulberry leaves and the effect of their secondary metabolites on Staphylococcus aureus were investigated.

Materials and Methods: Fungi were isolated from the mulberry leaf surface, and the effect of their metabolite on Staphylococcus aureus was investigated by determining MIC and MBC and the disk diffusion method.

Results: Aspergillus tereus and Fusarium were identified from mulberry leaves. The average MIC and MBC of Aspergillus tereus metabolite on Staphylococcus aureus was 500 μL/mL, and for Fusarium, it was 250 and 500 μL/mL, respectively.

The values ​​of 20, 40, 60 and 80 microliters metabolite in disk diffusion and 100, 150 and 200 microliters in well diffusion for Aspergillus tereus produced the diameter of the growth inhibition zone of 17, 24, 28 and 30, 31, 35 and 40 mm, respectively, and for Fusarium with the mentioned values, the diameter of the growth inhibition zone was 8, 11, 12 and 15, 16, 18 and 20 mm, respectively. The diameter of the growth inhibition zone of vancomycin was 22 mm.

Conclusion: The diameter of the growth inhibition zone of the metabolite of Aspergillus tereus is higher than that of Fusarium and shows higher effects compared to the antibiotic vancomycin. Therefore, it can be considered as a pharmaceutical combination in future studies.

References:

1. Ramessar K, Olaniran AO. Antibiogram and molecular characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus recovered from treated wastewater effluent and receiving surface water in Durban, South Africa. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2019 Sep;35(9):142. Doi:10.1007/s11274-019-2715-9
2. Carey RB, Schuster MG, McGowan KL. Medical microbiology for the new curriculum: a case-based approach. John Wiley & Sons; 2011 Aug 16.
3. Wang Z, Liu J, Chen G, Feng X, Deng M, Mu D, Xu Q, Xu H. An integrated system using phenylboronic acid functionalized magnetic beads and colorimetric detection for Staphylococcus aureus. Food Control. 2022 Mar 1; 133:108633. DOI: 10.1016/j.foodcont.2021.108633
4. Ribeiro da Cunha B, Fonseca LP, Calado CR. Antibiotic discovery: where have we come from, where do we go? Antibiotics. 2019 Apr 24;8(2):45. Wang Z, Liu J, Chen G, Feng X, Deng M, Mu D, Xu Q, Xu H. An integrated system using phenylboronic acid functionalized magnetic beads and colorimetric detection for Staphylococcus aureus. Food Control. 2022 Mar 1; 133:108633. Doi:10.1016/j /10.3390/antibiotics8020045
5. Sergelidis D, Angelidis AS. Methicillin‐resistant Staphylococcus aureus: a controversial food‐borne pathogen. Letters in applied microbiology. 2017 Jun 1;64(6):409-18. Wang Z, Liu J, Chen G, Feng X, Deng M, Mu D, Xu Q, Xu H. An integrated system using phenylboronic acid functionalized magnetic beads and colorimetric detection for Staphylococcus aureus. Food Control. 2022 Mar 1; 133:108633. Doi:10.1016/j /10.1111/lam.12735
6. Cox RJ. Polyketides, proteins and genes in fungi: programmed nano-machines begin to reveal their secrets. Organic & biomolecular chemistry. 2007;5(13):2010-26. Wang Z, Liu J, Chen G, Feng X, Deng M, Mu D, Xu Q, Xu H. An integrated system using phenylboronic acid functionalized magnetic beads and colorimetric detection for Staphylococcus aureus. Food Control. 2022 Mar 1; 133:108633. Doi:10.1016/j 10.1039/b704420h
7. Strobel GA. Endophytes as sources of bioactive products. Microbes and infection. 2003 May 1;5(6):535-44. Wang Z, Liu J, Chen G, Feng X, Deng M, Mu D, Xu Q, Xu H. An integrated system using phenylboronic acid functionalized magnetic beads and colorimetric detection for Staphylococcus aureus. Food Control. 2022 Mar 1; 133:108633. Doi:10.1016/j /10.1016/s1286-4579(03)00073-x
8. Anwar J, Iqbal Z. Effect of growth conditions on antibacterial activity of Trichoderma harzianum against selected pathogenic bacteria. Sarhad Journal of Agriculture. 2017 Dec 31;33(4):501-10. Doi: 10.17582/journal.sja/2017/33.4.501.510
9. Khan AA, Bacha N, Ahmad B, Lutfullah G, Farooq U, Cox RJ. Fungi as chemical industries and genetic engineering for the production of biologically active secondary metabolites. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 2014 Nov 1;4(11):859-70. Doi: 10.12980/apjtb.4.2014apjtb-2014-0230
10. Oide S, Turgeon BG. Natural roles of nonribosomal peptide metabolites in fungi. Mycoscience. 2020;61(3):101-10. Doi: 10.1016/j.myc.2020.03.001
11. Bills GF, Stadler M. Editorial comment–discovery, distribution and biosynthesis of fungal secondary metabolites. Mycology. 2014 Jul 3;5(3):99-101. Doi:10.1080/21501203.2014.943929
12. Alavi M. Bacteria and fungi as major bio-sources to fabricate silver nanoparticles with antibacterial activities. Expert Review of Anti-infective Therapy. 2022 Jun 3;20(6):897-906. Doi:10.1080/14787210.2022.2045194
13. Tasdemir D, Scarpato S, Utermann-Thüsing C, Jensen T, Blümel M, Wenzel-Storjohann A, Welsch C, Echelmeyer VA. Epiphytic and endophytic microbiome of the seagrass Zostera marina: Do they contribute to pathogen reduction in seawater? Science of the Total Environment. 2024 Jan 15; 908:168422. Doi: 10.1016/j.scitotenv.2023.168422
14. Zeini F, Mahbod A, Emami M. Medical Mycology. 2th ed, 2004. Tehran University press.
15. Stracquadanio C, Quiles JM, Meca G, Cacciola SO. Antifungal activity of bioactive metabolites produced by Trichoderma asperellum and Trichoderma atroviride in liquid medium. Journal of Fungi. 2020 Nov 1;6(4):263. Doi:10.3390/jof6040263
16. Espinel-Ingroff A, Kerkering TM. Spectrophotometric method of inoculum preparation for the in vitro susceptibility testing of filamentous fungi. Journal of clinical microbiology. 1991 Feb;29(2):393-4. Doi: 10.1128/jcm.29.2.393-394.1991
17. Khoshal Z, Vaziri A, Rahbarian R. Green production of silver nanoparticles from Eryngium planum and its an-tibacterial effect on Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Iranian Journal of Biological Sciences. Iranian Journal of Biological Sciences. 2023;17(4):77-92.
18. Humphries RM, Kircher S, Ferrell A, Krause KM, Malherbe R, Hsiung A, Burnham CA. The continued value of disk diffusion for assessing antimicrobial susceptibility in clinical laboratories: report from the clinical and laboratory standards institute methods development and standardization working group. Journal of clinical microbiology. 2018 Aug;56(8):10-128. Doi:10.1128/jcm.00437-18
19. Ghorbannia Delavar A., Qhasemi N., Onsinezhad M., Hashemi Karoii SM., Gholampour Azizi I. Anti-yeast comparative activities of aqueous and alcoholic extracts of black tea (Camellia sinensis) and grape seed (Vitis vinifera L.) on Malassezia pachydermatis (ATCC 10231) with that of the Clotrimazole. Iranian Journal of Biological Sciences. 2022; 17(1): 49-58. Doi:10.53555/sfs.v10i1.3184
20. Hussein ME, Mohamed OG, El-Fishawy AM, El-Askary HI, El-Senousy AS, El-Beih AA, Nossier ES, Naglah AM, Almehizia AA, Tripathi A, Hamed AA. Identification of antibacterial metabolites from endophytic fungus Aspergillus fumigatus, isolated from Albizia lucidior leaves (Fabaceae), utilizing metabolomic and molecular docking techniques. Molecules. 2022 Feb 8;27(3):1117. Doi:10.3390/molecules27031117

21. Deshmukh R, Mathew A, Purohit HJ. Characterization of antibacterial activity of bikaverin from Fusarium sp. HKF15. Journal of bioscience and bioengineering. 2014 1;117(4):443-8. Doi: 10.1016/j.jbiosc.2013.09.017

22. Bagheri Amrei, S. M., Tajik Ghanbari, M. A. and Ebrahim Ade, M. A. (1400). Isolation and identification of secondary metabolites (Fusarium equiseti) isolated from forest plants of the Alborz Mountains, 7th International Conference on Agriculture, Environment, Urban and Rural Development. [in persion].
23. Rani R, Sharma D, Chaturvedi M, Yadav JP. Antibacterial activity of twenty different endophytic fungi isolated from Calotropis procera and time kill assay. Clin Microbiol. 2017;6(3):280. Doi:10.4172/2327-5073.1000280
24. Xie F, Li XB, Zhou JC, Xu QQ, Wang XN, Yuan HQ, Lou HX. Secondary metabolites from Aspergillus fumigatus, an endophytic fungus from the liverwort Heteroscyphus tener (Steph.) Schiffn. Chem Biodivers. 2015 Sep;12(9):1313-21. Doi: 10.1002/cbdv.201400317

Full-Text:



Identification of epiphytic molds on mulberry leaves and the effect of their secondary metabolites on Staphylococcus aureus and its comparison with vancomycin

 

 

Fatemeh Zahra Asadi1, Aqeel Tabar Mollahassan2, Issa Gholampour Azizi3*

1 Ms Microbiology, Babol Branch, Islamic Azad University, Babol, Iran

2 Assistant professor, Department of Clinical Science, Babol Branch, Islamic Azad University, Babol, Iran

3 Assistant professor, Department of Veterinary Science, Babol Branch, Islamic Azad University, Babol, Iran

 

Place of Research: Laboratory of Babol Branch, Islamic Azad University

*Corresponding author

E-mail address:[e-mail]

 

Received: 23/ 1/ 2025

Revised: 29/1/ 2025

Accepted: 5/3/2025

 

 

Abstract

Introduction: Recently, due to the prevalence of antibiotic resistance in bacteria, attention has been growing to biological metabolites as antimicrobial compounds to inhibit them. Therefore, in the present study, epiphytic molds of mulberry leaves and the effect of their secondary metabolites on Staphylococcus aureus were investigated.

Materials and Methods: Fungi were isolated from the mulberry leaf surface, and the effect of their metabolite on Staphylococcus aureus was investigated by determining MIC and MBC and the disk diffusion method.

Results: Aspergillus tereus and Fusarium were identified from mulberry leaves. The average MIC and MBC of Aspergillus tereus metabolite on Staphylococcus aureus was 500 μL/mL, and for Fusarium, it was 250 and 500 μL/mL, respectively.

The values ​​of 20, 40, 60 and 80 microliters metabolite in disk diffusion and 100, 150 and 200 microliters in well diffusion for Aspergillus tereus produced the diameter of the growth inhibition zone of 17, 24, 28 and 30, 31, 35 and 40 mm, respectively, and for Fusarium with the mentioned values, the diameter of the growth inhibition zone was 8, 11, 12 and 15, 16, 18 and 20 mm, respectively. The diameter of the growth inhibition zone of vancomycin was 22 mm.

Conclusion: The diameter of the growth inhibition zone of the metabolite of Aspergillus tereus is higher than that of Fusarium and shows higher effects compared to the antibiotic vancomycin. Therefore, it can be considered as a pharmaceutical combination in future studies.

Keywords: Mulberry leaf, Aspergillus, Fusarium, Staphylococcus aureus, epiphyte

 

Cite this article: Asadi FZ, Tabarmollah Hassan A, Gholampour Azizi I. Identification of epiphytic molds on mulberry leaves and the effect of their secondary metabolites on Staphylococcus aureus and its comparison with vancomycin. Iranian Journal of Biological Sciences. 2025; 19 (2): .... 

 

 

شناسایی کپک های اپی فیت برگ توت و اثر متابولیت ثانویه آنها روی استافیلوکوک اورئوس و مقایسه آن با ونکومایسین

فاطمه زهرا  اسدی 1، عقیل تبارملاحسن2، عیسی غلامپور عزیزی*3

1 کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، گروه علوم پایه واحد بابل، دانشگاه آزاد اسلامی، بابل، ایران

2 استادیار ایمنی شناسی، گروه علوم آزمایشگاهی، واحد بابل، دانشگاه آزاد اسلامی، بابل، ایران

3 استادیار قارچ شناسی دامپزشکی، گروه دانشکده دامپزشکی، واحد بابل، دانشگاه آزاد اسلامی، بابل، ایران

محل انجام تحقیق: آزمایشگاه دانشگاه آزاد اسلامی واحد بابل

 

ارسال :1403/11/04

بازنگری: 1403/11/10

 پذیرش: 1403/12/15 

* نویسنده مسؤل:[e-mail] 

چکیده

مقدمه: اخیرا به علت شیوع مقاومت آنتی بیوتیکی در باکتری ها توجه به متابولیت های بیولوژیکی به عنوان ترکیبات ضد میکربی جهت مهار آنها رو به رشد است. لذا در مطالعه حاضر به بررسی کپک های اپی فیت برگ توت و اثر متابولیت ثانویه آنها روی استافیلوکوک اورئوس پرداخته شده است.

مواد و  روش: از سطح برگ توت قارچها جداسازی شده و اثر متابولیت آنها روی استافیلوکوک اورئوس با تعیین MIC و MBC و روش انتشار دیسک و چاهک مورد بررسی قرار گرفتند.

نتایج: از برگ توت آسپرژیلوس ترئوس و فوزاریوم شناسایی شدند. میانگین میزان MIC و MBC متابولیت آسپرژیلوس ترئوس روی استافیلوکوک اورئوس برابر500 میکرولیتر بر میلی لیتر و برای فوزاریوم به ترتیب 250 و 500 میکرولیتر بر میلی لیتر بدست آمد. مقادیر 20، 40 ، 60 و 80 میکرولیتر متابولیت در انتشار دیسک و 100، 150 و 200 لاندا در انتشار چاهک برای آسپرژیلوس ترئوس قطر هاله عدم رشد به ترتیب 17، 24، 28 و 30 ،31، 35 و 40 میلی متر ایجاد کرد و برای فوزاریوم با مقادیر مذکور قطر هاله عدم رشد به ترتیب 8، 11 ، 12 و 15 ،16، 18 و 20 میلی متر بدست آمد. قطر هاله عدم رشد ونکومایسین 22 میلی متر بدست آمد.

نتیجه گیری: قطر هاله عدم رشد متابولیت آسپرژیلوس ترئوس  بالاتر از فوزاریوم می باشد و در مقایسه با آنتی بیوتیک ونکومایسین اثرات بالاتری نشان داد. بنابراین می تواند به عنوان ترکیب دارویی در مطالعات آینده مد نظر قرار گیرد.

واژه های کلیدی: برگ توت،  آسپرژیلوس، فوزاریوم،  استافیلوکوک اورئوس، اپی فیت، برگ توت

شـــیوه آدرس دهـــی این مقاله : ف ز اسدی، ع تبارملاحسن، ع غلامپور عزیزی. شناسایی کپک های اپی فیت برگ توت و اثر متابولیت ثانویه آنها روی استافیلوکوک اورئوس و مقایسه آن با ونکومایسین. مجله دانش زیســـتی ایـــران. 1403؛19 (2): .....

 

 

 

مقدمه

استافیلوکوکوس اورئوس (S. aureus) پاتوژن خطرناک گرم مثبت بوده و به طور گسترده از طریق غذا توزیع شده و یک تهدید جدی در سلامت انسان است (1). استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به آنتی بیوتیک معمولاً در بیمارستان ها و مراکز مراقبت طولانی مدت مشاهده می شود. این باکتری اغلب بیمارانی را که سیستم ایمنی ضعیفی دارند و کسانی که تحت درمان های تهاجمی پزشکی قرار می گیرند یا کسانی که برای مدت طولانی در بیمارستان بستری شده اند را تحت تاثیر قرار می دهد. اگرچه  استافیلوکوکوس اورئوس یکی از رایج ترین پاتوژن های شناخته شده است که باعث بیماری انسان و حیوان می شود، اما ممکن است بدون ایجاد بیماری هم در بدن وجود داشته باشند. (2 و3). 

متاسفانه مقاومت آنتی بیوتیک اخیراً به عنوان به یک بحران شدید بهداشت جهانی تبدیل شده است، از میزان بالای تجویز ضد میکروبی و سوء مدیریت آنتی بیوتیک (خود درمانی یا قطع درمان) تا آنتی بیوتیک های وسیع الطیف که به عنوان محرک رشد در دامداری استفاده می شوند. بنابراین، نیاز فزاینده ای به تحقیقات مستمر برای کشف آنتی بیوتیک های جدید وجود دارد (4 و 5).

قارچ های اپی فیت از گروه های مختلف قارچی هستند که در سطح گیاهان بخصوص روی برگ وجود داشته و گسترش جهانی دارند و عمدتا در شاخه آسکومیست قرار دارند. قارچ ها منبع خوبی برای تولید متابولیت های ثانویه فعال بیولوژیکی هستند. از قارچ ها به عنوان ابزاری برای تولید استفاده می شود. قارچ ها در محدوده وسیعی از زیستگاه ها مانند آب، زمین/خاک، هوا و همچنین در روی حیوانات و گیاهان زنده می مانند، که به سادگی شامل محیط های خشکی و دریایی می شود. با این حال، اکثر آنها زمینی هستند، در روی خاک زندگی می کنند یا روی اجساد مرده موجودات چند سلولی از جمله گیاهان و حیوانات زنده می مانند و در بازیافت طبیعی اجساد مرده به ترکیبات آلی کمک می کنند (6). در گذشته گیاهان به عنوان تنها منبع درمان بیماری های مختلف در نظر گرفته می شدند. اما تولید متابولیت های زیست فعال متنوع از قارچ ها، روند را تغییر داد (7). برخی از قارچ ها پتانسیل تولید آنتی بیوتیک ها، که می تواند میکروب های دیگر را حتی در غلظت کم از بین می برد را دارند. تنوع این مواد ضد میکروبی، فعالیت های مختلفی را علیه هر دو پروکاریوت و یوکاریوت ها دارد (8). محصولات طبیعی از هر منبعی به عنوان آلکالوئیدها، ایزوپرنوئیدها، پپتیدهای غیر ریبوزومی و پلی کتیدها طبقه بندی شده اند (9). پپتیدهای غیر ریبوزومی شامل ترکیبات زیست فعال مفید برای کاربردهای دارویی (مانند آنتی بیوتیک ها، ترکیبات ضد تومور و سرکوب کننده های ایمنی) هستند و توسط باکتری ها و قارچ ها تولید می شوند (10). تعدادی از گروه های تحقیقاتی برای کشف محیط های زمینی و دریایی برای ترکیبات ضد باکتری جدید اقدام نمودند. قارچ های رشته ای نشان دهنده گروه مهمی از میکروارگانیسم های شناخته شده برای سنتز تنوع گسترده ای از مولکول های زیست فعال هستند که به طور سنتی متابولیت های ثانویه یا محصولات طبیعی نامیده می شوند (11). در تحقیق  Alaviو همکاران (2022) عنوان شده که متابولیت کپک ها یکی از منابع خوب آنتی بیوتیکی است و می توان از آن به عنوان ترکیبات ضد میکروبی و ضد قارچی استفاده کرد (12). با توجه به مقاومت دارویی، پیگیری و شناخت داروهای ضد باکتری جدید و طبیعی از کپک ها، در این پژوهش اقدام به بررسی اثر متابولیت ثانویه کپک های جدا شده از اپی فیت برگ توت روی استافیلوکوک اورئوس و مقایسه آنها با ونکومایسین شد.

روش کار

با استفاده از محیط کشت محیط کشت سابورودکستروز آگار(SDA) کپک های اپی فیت سطح برگ توت جدا سازی شدند و در داخل انکوباتور در در دمای25-28 درجه سانتی گراد به مدت ۳ تا ۵ روز قرار گرفت (13). در مرحله بعد کلنی هاي قارچ از نظر ماکروسکوپی و میکروسکوپی مورد بررسی قرار گرفت (14).

تهیه متابولیت کپک ها

 از کلنی کپک ها در مرحله بعد به منظور تهیه متابولیت ثانویه کپک با فیلدوپلاتین استریل نمونه گیری شده و به محیط کشت پتیتو دکستروز براث (PDB) منتقل شده و با انکوبه کردن در انکوباتور تکان دهنده به مدت10تا 14 روز در دمای 28 درجه متابولیت تهیه شد. هفت روز اول این فرایند بصورت هوازی انجام شد و برای 7 روز بعدی بر روی درب ارلن ها پارافیلم زده شده تا شرایط جهت تخمیر بی هوازی گردید. در مرحله بعد یک لیتر اتیل استات 96% به آن اضافه کرده و بعد 3 دقیقه فیلتراسیون محلول حاوي هر نمونه با استفاده از فیلتر هاي سر سرنگی انجام شده و جهت استخراج محیط کشت در دمای 45 درجه فور، تبخیر و سپس خشک شد (15). 

تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی (MIC) استافیلوکوک اورئوس

جهت این کار، ابتدا رقت هاي متوالی متابولیت هاي ثانویه از کپک در ابتدا ۱۱ لوله آزمایش استریل در نظر گرفته و به لوله های مورد نظر۱ سی سی از محیط کشت تریپتیک سوی براث افزوده و اتوکلاو شده، سپس بعد از آماده شدن محیط کشت، براي تهیه رقت هاي یک دوم با سمپلر  μl ۱۰۰۰ از متابولیت تهیه شده به لوله شماره ۱ که حاوی محیط تریپتیک سوی براث افزوده شده و آن را کاملا شیک کرده و به این طریق رقت یک دوم از متابولیت مورد نظر در لوله 1 تهیه شده و بر همین اساس مقدار متابولیت در لوله اول μl/ml  ۵۰۰ بدست آمد. سپس مقدار ۱۰ میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری به لوله هاي شماره یک تا یازده افزوده شد. لوله شماره ۱۱ نیز به عنوان لوله کنترل یا شاهد که حاوي محیط کشت و سوسپانسیون باکتری می باشد در نظر گرفته شد. سپس تمام لوله ها در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت انکوبه شده و پس از آن، لوله ها براي تعیین MIC بررسی شدند. لوله اي که داراي کمترین غلظت از متابولیت کپک بوده و در آن کدورتی دیده نشد به عنوان حداقل غلظت مهارکنندگی تعیین شد (16).

تعیین حداقل غلظت کشندکی (MBC) استافیلوکوک اورئوس

 جهت تعیین MBC، پلیت تریپتیک سوی آگار تقسیم بندی شده و از لوله MIC و لوله های قبل از آن توسط سمپلر به میزان ۱۰ لاندا نمونه گرفته شده و به پلیت ها منتقل و از آن کشت خطی تهیه شد. سپس این پلیت ها در انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت انکوبه می شود و پس از آن  MBCمحاسبه شد که بر اساس اینکه تعداد باکتری کشت داده شده بر روي پلیت به میزان 108 باکتری بود (نیم مک فارلند)(17)، آن دسته از مواردي که تعداد کلنی باکتری کمتر از 10 عدد بود به عنوان MBC تعیین گردید (16).

مطالعه ضد میکروبی متابولیت به روش انتشار دیسک و چاهک

 4 دیسک كاغذی استریل (حدود 6 ميلي متر در قطر) با مقادیر 20، 40، 60 و 80 میکرولیتر متابولیت قارچ در نظر گرفته شد. 10 میکرولیتر سوسپانسیون باکتری را به صورت سفره ای با سوآپ استریل در محیط کشت تریپتیک سوی آگار کشت داده سپس این دیسک ها روی سطح این محیط قرار داده شده و توسط‌ پنس‌ فیکس‌ شد. سپس‌ پلیت‌ها در انکوباتور ٣٧ درجه‌ سانتی‌ گراد به‌ مدت‌ 24 ساعت‌ انکوبه‌ شدند. جهت مقایسه دیسک محتوی آنتی بیوتیک ونکومایسین در وسط این محیط گذاشته شد (18). برای انتشار چاهک سه چاهک ایجاد شد و 10 میکرولیتر سوسپانسیون باکتری را به صورت سفره ای با سوآپ استریل کشت داده و سپس متابولیت ها به میزان100، 150و 200 میکرولیتر داخل چاهک های پلیت اضافه شدند. سپس در انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. در مرحله بعد قطر هاله هاي ممانعت از رشد متابولیت ها اندازه گیري شد (18و19).

نتایج

در این مطالعه از برگ توت دو قارچ آسپرژیلوس ترئوس و فوزاریوم جداسازی و شناسایی شدند. متابولیت تخمیری آنها تهیه و روی استافیلوکوک اورئوس اثر داده شدند.

نتایج MIC و MBC اثر متابولیت آسپرژیلوس ترئوس و فوزاریوم روی استافیلوکوک اورئوس

در این پژوهش اثر متابولیت آسپرژیلوس ترئوس و فوزاریوم روی استافیلوکوک اورئوس با تعیین MIC و MBC و روش دیسک و چاهک مورد بررسی قرار گرفتند که میانگین میزان MIC اثر متابولیت آن روی استافیلوکوک اورئوس به روش ماکرودایلوشن برابر500 میکرولیتر بر میلی لیتر و میانگین میزان MBC آن 500 میکرولیتر بر میلی لیتر در محیط کشت تریپتیک سوی آگار بدست آمد و برای فوزاریوم به ترتیب 250 و 500 میکرولیتر بر میلی لیتر بدست آمد ( شکل ۱).

 

نمودار1. مقایسه نتایج MIC و MBC متابولیت های آسپرژیلوس ترئوس  و فوزاریوم روی استافیلوکوک اورئوس

نتایج انتشار دیسک و چاهک متابولیت آسپرژیلوس ترئوس و فوزاریوم روی استافیلوکوک اورئوس

مقادیر 20، 40 ، 60 و 80 میکرولیتر متابولیت آسپرژیلوس ترئوس روی دیسک در محیط کشت تریپتیک سوی آگار قرار گرفت و بعد انکوباسیون، قطر هاله عدم رشد به ترتیب 17، 24 ، 28 و 30 میلی متر ایجاد کرد و قطر هاله عدم رشد آنتی بیوتیک ونکومایسین 22 میلی متر بدست آمد. مقادیر 100، 150 و 200 میکرولیتر متابولیت آسپرژیلوس ترئوس در روش چاهک بعد انکوباسیون، قطر هاله عدم رشد به ترتیب 31، 35 و 40 میلی متر ایجاد کرد. در انتشار دیسک برای فوزاریوم با مقادیر مذکور قطر هاله عدم رشد به ترتیب 8، 11 ، 12 و 15 میلی متر ایجاد کرد. در روش چاهک برای فوزاریوم، قطر هاله عدم رشد به ترتیب 16، 18 و 20 میلی متر بدست آمد (شکل ۲). نتایج آماری نشان داد که مقادیر مختلف متابولیت تاثیر متفاوتی بر قطر هاله عدم رشد داشتند و با افزایش غلظت متابولیت، قطر هاله عدم رشد نیز افزایش یافت و معنی دار شد (05/0 ≥P).

 

نمودار ۲. مقایسه نتایج قطر هاله عدم رشد اثر متابولیت های آسپرژیلوس ترئوس  و فوزاریوم روی استافیلوکوک اورئوس

بحث

قارچ ها از مهمترین تولید کنندگان ترکیبات ضد میکروبی بالقوه هستند و بررسی متابولیت های ثانویه در مورد شناسایی، بیوسنتز و فعالیت بیولوژیکی آنها ضروری است (12).

اخیرا مطالعه ای فعالیت ضد میکروبی متابولیت های قارچ اندوفیت آسپرژیلوس فومیگاتوس جدا شده از برگهای آلبیزیا لوسیدیور را گزارش کردند. از 42 متابولیت جدا شده 8 متابولیت فعالیت ضد باکتریایی بر علیه استافیلوکوکوس اورئوس داشتند. ترکیبات ارگوسترول، هلولیک اسید و مونو متیل سولوکرین-4-سولفات حداقل غلظت مهاری(MIC به ترتیب 15.63، 1.95 و 3.90 میکروگرم در میلی لیتر نشان دادند (20) در صورتی که در مطالعه حاضر میانگین میزان MIC و MBC متابولیت آسپرژیلوس ترئوس روی استافیلوکوک اورئوس برابر500میکرولیتر بر میلی لیتر بود. Tasdemir و همکاران (۲۰۲۴) از علف‌های دریایی، 88 باکتری و قارچ، مرتبط با سطوح و بافت‌های داخلی برگ‌های مارماهی و ریشه‌ها را جدا کردند (13) و در مطالعه حاضر از برگ توت آسپرژیلوس ترئوس و فوزاریوم شناسایی شدند. نتایج تحقیق Deshmukh و همکاران (2023) نشان داد که متابولیت‌های استخراج شده از کپک فوزاریوم به ‌دلیل داشتن ترکیبات مختلف بر روی طیف وسیعی از باکتری‌های گرم منفی و گرم مثبت و حتی قارچ‌ها اثر ضد میکروبی داشتند (21). در تحقیقی که توسط باقری و همکاران (1400) متابولیت های ثانویه Fusarium equiseti  جدا شده از گیاهان جنگلی دامنه کوه های البرز انجام شد، ترکیباتی با فعالیت ضد میکروبی مشاهده گردید (22). در تحقیق Rani و همکاران (2017) از یک گیاه دارویی بیش از 22 قارچ مختلف به‌دست آمد، در این تحقیق 20 جنس میکروبی در معرض متابولیت قارچ‌ها قرار گرفتند و مشخص شد که بیشترین هاله عدم رشد مربوط به متابولیت ناشی از جنس آسپرژیلوس بود که حدودا 17.33 میلی‌متر بود که در برابر باکتری‌های سالمونلا تیفی و شیگلا فلکسنری ایجاد شده بود. همچنین مقدار MIC به‌دست آمده بین 15.6 الی 250 میکرولیتر در میلی‌لیتر بود که باکتری‌های گرم مثبت حساسیت بیشتری از خود نشان داده بودند. در این تحقیق قطر هاله عدم رشد ناشی از متابولیت آسپرژیلوس نایجر علیه باکتری اشریشیاکولی 12.66 میلی‌متر بود و مقدار MIC حدود 62.5 میکرولیتر در میلی‌لیتر گزارش شد (23). با توجه به مطالعات ذکر شده، میکروارگانیسم‌ها می‌توانند مجموعه‌ای از متابولیت‌های ثانویه تولید کنند و نقشی اساسی در کشف و توسعه داروهای جدید داشته باشند. محصولات طبیعی میکروبی به دلیل تنوع ساختاری و عملکردی به عنوان یکی از برجسته ترین منابع دارویی بسیار مورد توجه قرار گرفته اند. عصر طلایی آنتی بیوتیک ها شاهد موفقیت یک سری آنتی بیوتیک های طبیعی بوده است. تعدادی از داروهای تجاری موجود را می توان به محصولات طبیعی میکروبی ردیابی کرد. با این حال، سرعت کشف محصولات طبیعی با داربست‌های جدید از میکروب‌های زمینی به‌طور چشمگیری در چند دهه گذشته کاهش یافته است که حاکی از تقاضای فوری برای اکتشاف منابع میکروبی جدید است(24).

نتیجه گیری

در مطالعه حاضر از برگ توت قارچهای آسپرژیلوس ترئوس و فوزاریوم شناسایی شدند.  پس از تهیه متابولیت آنها اثر ضد میکربی آن روی باکتری استافیلوکوک اورئوس با روش های  MIC و MBC و  انتشار دیسک بررسی شد. نتایج نشان داد قطر هاله عدم رشد متابولیت آسپرژیلوس ترئوس بالاتر از فوزاریوم می باشد و در مقایسه با آنتی بیوتیک ونکومایسین اثرات بالاتری نشان داد.

تعارض منافع:

نویسندگان تعارض منافعی را گزارش نکردند.

Reference

1. Ramessar K, Olaniran AO. Antibiogram and molecular characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus recovered from treated wastewater effluent and receiving surface water in Durban, South Africa. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2019 Sep;35(9):142. Doi:10.1007/s11274-019-2715-9

2. Carey RB, Schuster MG, McGowan KL. Medical microbiology for the new curriculum: a case-based approach. John Wiley & Sons; 2011 Aug 16.

3. Wang Z, Liu J, Chen G, Feng X, Deng M, Mu D, Xu Q, Xu H. An integrated system using phenylboronic acid functionalized magnetic beads and colorimetric detection for Staphylococcus aureus. Food Control. 2022 Mar 1; 133:108633. DOI: 10.1016/j.foodcont.2021.108633

4. Ribeiro da Cunha B, Fonseca LP, Calado CR. Antibiotic discovery: where have we come from, where do we go? Antibiotics. 2019 Apr 24;8(2):45. Wang Z, Liu J, Chen G, Feng X, Deng M, Mu D, Xu Q, Xu H. An integrated system using phenylboronic acid functionalized magnetic beads and colorimetric detection for Staphylococcus aureus. Food Control. 2022 Mar 1; 133:108633. Doi:10.1016/j /10.3390/antibiotics8020045

5. Sergelidis D, Angelidis AS. Methicillin‐resistant Staphylococcus aureus: a controversial food‐borne pathogen. Letters in applied microbiology. 2017 Jun 1;64(6):409-18. Wang Z, Liu J, Chen G, Feng X, Deng M, Mu D, Xu Q, Xu H. An integrated system using phenylboronic acid functionalized magnetic beads and colorimetric detection for Staphylococcus aureus. Food Control. 2022 Mar 1; 133:108633. Doi:10.1016/j /10.1111/lam.12735

6. Cox RJ. Polyketides, proteins and genes in fungi: programmed nano-machines begin to reveal their secrets. Organic & biomolecular chemistry. 2007;5(13):2010-26. Wang Z, Liu J, Chen G, Feng X, Deng M, Mu D, Xu Q, Xu H. An integrated system using phenylboronic acid functionalized magnetic beads and colorimetric detection for Staphylococcus aureus. Food Control. 2022 Mar 1; 133:108633. Doi:10.1016/j 10.1039/b704420h

7. Strobel GA. Endophytes as sources of bioactive products. Microbes and infection. 2003 May 1;5(6):535-44. Wang Z, Liu J, Chen G, Feng X, Deng M, Mu D, Xu Q, Xu H. An integrated system using phenylboronic acid functionalized magnetic beads and colorimetric detection for Staphylococcus aureus. Food Control. 2022 Mar 1; 133:108633. Doi:10.1016/j /10.1016/s1286-4579(03)00073-x

8. Anwar J, Iqbal Z. Effect of growth conditions on antibacterial activity of Trichoderma harzianum against selected pathogenic bacteria. Sarhad Journal of Agriculture. 2017 Dec 31;33(4):501-10. Doi: 10.17582/journal.sja/2017/33.4.501.510

9. Khan AA, Bacha N, Ahmad B, Lutfullah G, Farooq U, Cox RJ. Fungi as chemical industries and genetic engineering for the production of biologically active secondary metabolites. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 2014 Nov 1;4(11):859-70. Doi: 10.12980/apjtb.4.2014apjtb-2014-0230

10. Oide S, Turgeon BG. Natural roles of nonribosomal peptide metabolites in fungi. Mycoscience. 2020;61(3):101-10. Doi: 10.1016/j.myc.2020.03.001

11. Bills GF, Stadler M. Editorial comment–discovery, distribution and biosynthesis of fungal secondary metabolites. Mycology. 2014 Jul 3;5(3):99-101. Doi:10.1080/21501203.2014.943929

12. Alavi M. Bacteria and fungi as major bio-sources to fabricate silver nanoparticles with antibacterial activities. Expert Review of Anti-infective Therapy. 2022 Jun 3;20(6):897-906. Doi:10.1080/14787210.2022.2045194

13. Tasdemir D, Scarpato S, Utermann-Thüsing C, Jensen T, Blümel M, Wenzel-Storjohann A, Welsch C, Echelmeyer VA. Epiphytic and endophytic microbiome of the seagrass Zostera marina: Do they contribute to pathogen reduction in seawater? Science of the Total Environment. 2024 Jan 15; 908:168422. Doi: 10.1016/j.scitotenv.2023.168422

14. Zeini F, Mahbod A, Emami M. Medical Mycology. 2th ed, 2004. Tehran University press. 

15. Stracquadanio C, Quiles JM, Meca G, Cacciola SO. Antifungal activity of bioactive metabolites produced by Trichoderma asperellum and Trichoderma atroviride in liquid medium. Journal of Fungi. 2020 Nov 1;6(4):263. Doi:10.3390/jof6040263

16. Espinel-Ingroff A, Kerkering TM. Spectrophotometric method of inoculum preparation for the in vitro susceptibility testing of filamentous fungi. Journal of clinical microbiology. 1991 Feb;29(2):393-4. Doi: 10.1128/jcm.29.2.393-394.1991

17. Khoshal Z, Vaziri A, Rahbarian R. Green production of silver nanoparticles from Eryngium planum and its an-tibacterial effect on Escherichia coli and Staphylococcus aureus.  Iranian Journal of Biological Sciences. Iranian Journal of Biological Sciences. 2023;17(4):77-92. 

18. Humphries RM, Kircher S, Ferrell A, Krause KM, Malherbe R, Hsiung A, Burnham CA. The continued value of disk diffusion for assessing antimicrobial susceptibility in clinical laboratories: report from the clinical and laboratory standards institute methods development and standardization working group. Journal of clinical microbiology. 2018 Aug;56(8):10-128. Doi:10.1128/jcm.00437-18

19. Ghorbannia Delavar A., Qhasemi N., Onsinezhad M., Hashemi Karoii SM., Gholampour Azizi I. Anti-yeast comparative activities of aqueous and alcoholic extracts of black tea (Camellia sinensis) and grape seed (Vitis vinifera L.) on Malassezia pachydermatis (ATCC 10231) with that of the Clotrimazole. Iranian Journal of Biological Sciences. 2022; 17(1): 49-58. Doi:10.53555/sfs.v10i1.3184

20. Hussein ME, Mohamed OG, El-Fishawy AM, El-Askary HI, El-Senousy AS, El-Beih AA, Nossier ES, Naglah AM, Almehizia AA, Tripathi A, Hamed AA. Identification of antibacterial metabolites from endophytic fungus Aspergillus fumigatus, isolated from Albizia lucidior leaves (Fabaceae), utilizing metabolomic and molecular docking techniques. Molecules. 2022 Feb 8;27(3):1117. Doi:10.3390/molecules27031117

 

21. Deshmukh R, Mathew A, Purohit HJ. Characterization of antibacterial activity of bikaverin from Fusarium sp. HKF15. Journal of bioscience and bioengineering. 2014 1;117(4):443-8. Doi: 10.1016/j.jbiosc.2013.09.017

 

22. Bagheri Amrei, S. M., Tajik Ghanbari, M. A. and Ebrahim Ade, M. A. (1400). Isolation and identification of secondary metabolites (Fusarium equiseti) isolated from forest plants of the Alborz Mountains, 7th International Conference on Agriculture, Environment, Urban and Rural Development. [in persion]. 

23. Rani R, Sharma D, Chaturvedi M, Yadav JP. Antibacterial activity of twenty different endophytic fungi isolated from Calotropis procera and time kill assay. Clin Microbiol. 2017;6(3):280. Doi:10.4172/2327-5073.1000280

24. Xie F, Li XB, Zhou JC, Xu QQ, Wang XN, Yuan HQ, Lou HX. Secondary metabolites from Aspergillus fumigatus, an endophytic fungus from the liverwort Heteroscyphus tener (Steph.) Schiffn. Chem Biodivers. 2015 Sep;12(9):1313-21. Doi: 10.1002/cbdv.201400317

 

 

 

 

 

3

 

---