Antibacterial Properties of Lactobacillus acidophilus and Bacillus coagulans cell-free Culture Medium Against Resistant Pathogens.

Subject Areas :

Ali Kazemi ¹ , Nader Habibi ²

1 - MS.c Graduated of Food Science and Technology, Sanandaj Branch, Islamic Azad University, Sanandaj, Iran.
2 - Department of Food Science and Technology, Sanandaj Branch, Islamic Azad University, Sanandaj, Iran.

Received: 2022-06-29 Accepted : 2022-10-17 Published : 2025-03-09

Keywords: Lactobacillus acidophilus, Bacillus coagulans, Escherichia coli, Staphylococcus aureus,

Abstract :

Recently, the use of probiotics in controlling pathogenic bacteria has become very important. Inaddition, they have useful properties to maintain the health of the body. The aim of this study was to investigate the antibacterial properties of cell-free culture medium of two probiotic bacteria Lactobacillus acidophilus and Bacillus coagulans against two foodborne pathogens Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Pathogenic bacteria from the samples of raw cow's milk distributed in Sanandaj city using special and differential isolation media, then their antibiotic sensitivity was checked by disk diffusion method and multi-drug resistant isolates were used to perform tests laboratory were selected. After culturing probiotic bacteria, their cell-free liquid was used to check antibacterial properties by MIC and MBC methods. Also, the interaction between two probiotics was investigated using the checkerboard method and determining the FICi index. From 180 samples taken, 15 isolates of Escherichia coli (8.33%) and 19 isolates of Staphylococcus aureus (10.55%) were isolated. Based on the result of the antibiotic sensitivity test, 10 isolates were selected for each of the pathogenic bacteria.he results showed that the culture medium grown by both probiotic bacteria has antibacterial power against both pathogenic bacteria, but the simultaneous examination of these two probiotics showed a synergistic effect. Staphylococcus aureus bacteria was more sensitive than Escherichia coli. MIC and MBC values ranged from 2.5 to 160 μl/ml. Therefore, the cell-free culture medium of Lactobacillus acidophilus and Bacillus coagulans can be introduced as a new biological compound with antibacterial properties.

References:

1. صادقي فرد ن، عزيزي جليليان ف، صيدخاني ن، رستم زاد آ. بررسي آلودگي شير خام از نظر اشريشياكلي و استافيلوكوكوس اورئوس در ايلام. مجله علمي دانشگاه علوم پزشكي ايلام. 1385؛ 14(1): 49-44.
2. میرزایی ح، رضا نهایی م، جوادی ا، احمدی منش مهدی. مطالعه تاثیر برخی پروبیوتیک‌ها بر روی ‌اشریشیاکلیO157: H7 در شرایط رشد توأمان در شیر. مجله تحقیقات دامپزشکی. 1388؛ 64(4): 282-279
3. Bâati L.l, Fabre-Gea C, .Auriol D, Blanc P. J. Study of the cryotolerance of Lactobacillus acidophilus: effect of culture and freezing conditions on the viability and cellular protein levels. International journal of food microbiology. 2000; 59: 241-247.
4. Boirivant M, Strober W. The mechanism of action of probiotics. Current Opinion in Gastroenterology. 2007; 23: 679-692.
5. Bonyadian M, Moshtaghi H, Taheri M. A. Molecular characterization and antibiotic resistance of enterotoxigenic and entero-aggregative Escherichia coli isolated from raw milk and unpasteurized cheeses. Veterinary Research Forum. 2014; 5(1):29-34.
6. Carroll, K. C., Butel, J., Morse, S. 2015. Jawetz Melnick and Adelbergs Medical Microbiology 27 E. McGraw-Hill Education.
7. Dallal M, Moshiri M, Mirshafiey A, Douraghi M, Rezaie F, Gholami M. Evaluation of the effect of probiotic bacteria Lactobacillus acidophilus PTCC1643 and Lactobacillus casei PTCC 1608 on the TLR2 and TLR4expression in HT29 cells infected with Salmonella enteritidis. Tehran University Medical Journal. 2019; 76: 724-730.
8. Dehghani M, Akbarpour B, Salari M, Poursheykhani A, Rasoulzadeh, H. 2016. Assessment of Prevalence and Antibiotic Resistance of Staphylococcus aureus in Raw and Pasteurized Milks of Sari City in the Summer of 2014. Iranian Journal of Health and Environment, 9: 147-154.
9. Ghahfarokhi E. S, Dehkordi M. M. K. Isolation and evaluation of lactic acid production content in native Lactobacillus of Chaharmahal va Bakhtiari province isolated from dairy products. Biological Journal of Microorganism. 2012; 1 (3): 41- 52.
10. Gilliland S, Staley T, Bush L. Importance of bile tolerance of Lactobacillus acidophilus used as a dietary adjunct. Journal of dairy science. 1984; 67: 3045-3051.
11. Griggs J, Jacob J. P. Alternatives to antibiotics for organic poultry production. Journal of Applied Poultry Research. 1984;14: 750-756.
12. Heller KJ. Probiotic bacteria in fermented foods: product characteristics and starter organisms. The American journal of Clinical Nutrition. 2001; 73 (2): 374- 379.
13. Hyronimus B, Le Marrec C, Sassi A. H, Deschamps A. Acid and bile tolerance of spore-forming lactic acid bacteria.International Journal of Food Microbiology. 2000; 61: 193-197.
14. Jankovic I, Sybesma W, Phothirath P, Ananta E, Mercenier A. Application of probiotics in food products-challenges and new approaches.Current Opinion in Biotechnology. 2010; 21: 175-181.
15. Kuete V, Alibert-Franco S, Eyong K, et al. Antibacterial activity of some natural products against bacteria expressing a multidrug-resistant phenotype. International Journal of Antimicrobial Agents. 2011; 37: 156-161.
16. Kumar M, Dhaka P, Vijay D, et al. Antimicrobial effects of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus
acidophilus against multidrug-resistant enteroaggregative Escherichia coli. International Journal of Antimicrobial Agents. 2016; 48: 265-270.
17. Lin S, Hung A, Lu J. Effects of supplement with different level of Bacillus coagulans as probiotics on growth performance and intestinal microflora populations of broiler chickens. Journal of Animal and Veterinary Advances. 2011; 10: 111-114.
18. Momtaz H, Farzan R, Rahimi E, Safarpoor D. F, Souod N. Molecular characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolated from ruminant and donkey raw milk samples and traditional dairy products in Iran. The Scientific World Journal. 2012; Article 231342.
19. Pradhan D, Mallappa R. H, Grover S. Comprehensive approaches for assessing the safety of probiotic bacteria.Food Control. 2020; 108: Article 106872.
20. Rahi A, Kazemeini H, Jafariaskari S, Seif A, Hosseini S, Safarpoor D. F. Genotypic and Phenotypic-Based Assessment of Antibiotic Resistance and Profile of Staphylococcal Cassette Chromosome mec in the Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Recovered from Raw Milk. National library of medicine. 2020;13:273-283.
21. Quinto E. J, Jiménez P, Caro I, Tejero J, Mateo J, Girbés T. Probiotic lactic acid bacteria: a review. Food and Nutrition Sciences. 2014; 5: 1765.
22. Salminen S, Ouwehand A, Isolauri E. Clinical applications of probiotic bacteria. International Dairy Journal. 1998; 8: 563-572.
23. Sanhueza L, Melo R, Montero R, Maisey K, Mendoza L, Wilkens M. Synergistic interactions between phenolic compounds identified in grape pomace extract with antibiotics of different classes against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. PloS one. 2017; 12: e0172273.
24. Soltan Dallal M. M, Zandieh Moradi R, Mazaheri Nezhad Fard R, Rajabi Z. Identification and Diagnosis of Enterohemorrhagic E. Coli by Molecular Method in Boroujerd City Cows' Milk. Journal of Payavard Salamat. 2020; 13: 411-418.
25. Wayne, P. 2011. Clinical and Laboratory Standards Institute: Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: 20th informational supplement. CLSI document M100-S20.
26. Yang Z, Zhang W, Yin Y, Fang W, Xue H. Metal-organic framework-based sensors for the detection of toxins and foodborne pathogens. Food Control. 2022;133:part B. Article 10863.

Full-Text:



Journal of Innovation in Food Science and Technology , Vol 17, No 1, Spring 2025

 

Homepagr: https://sanad.iau.ir/journal/jfst                                                                                                 E-ISSN: 2676-7155

 

(Original Research Paper)

Antibacterial Properties of Lactobacillus acidophilus and Bacillus coagulans cell-free Culture Medium Against Resistant Pathogens.

 

Ali Kazemi1, Nader Habibi2*

 

1. MS.c Graduated of Food Science and Technology, Sanandaj Branch, Islamic Azad University, Sanandaj, Iran.

2. Department of Food Science and Technology, Sanandaj Branch, Islamic Azad University, Sanandaj, Iran.

 

Received:29/06/2022                          Accepted:27/10/2022

 

 

Abstract

Recently, the use of probiotics in controlling pathogenic bacteria has become very important. Inaddition, they have useful properties to maintain the health of the body. The aim of this study was to investigate the antibacterial properties of cell-free culture medium of two probiotic bacteria Lactobacillus acidophilus and Bacillus coagulans against two foodborne pathogens Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Pathogenic bacteria from the samples of raw cow's milk distributed in Sanandaj city using special and differential isolation media, then their antibiotic sensitivity was checked by disk diffusion method and multi-drug resistant isolates were used to perform tests laboratory were selected. After culturing probiotic bacteria, their cell-free liquid was used to check antibacterial properties by MIC and MBC methods. Also, the interaction between two probiotics was investigated using the checkerboard method and determining the FICi index. From 180 samples taken, 15 isolates of Escherichia coli (8.33%) and 19 isolates of Staphylococcus aureus (10.55%) were isolated. Based on the result of the antibiotic sensitivity test, 10 isolates were selected for each of the pathogenic bacteria.he results showed that the culture medium grown by both probiotic bacteria has antibacterial power against both pathogenic bacteria, but the simultaneous examination of these two probiotics showed a synergistic effect. Staphylococcus aureus bacteria was more sensitive than Escherichia coli. MIC and MBC values ranged from 2.5 to 160 μl/ml. Therefore, the cell-free culture medium of Lactobacillus acidophilus and Bacillus coagulans can be introduced as a new biological compound with antibacterial properties.

 

Keywords:Lactobacillus acidophilus, Bacillus coagulans, Escherichia coli, Staphylococcus aureus

 

 

 

 

 

 

 

* Corresponding Author: [e-mail]

E-ISSN: 2676-7155                                                                                                                    سایت مجله: https://sanad.iau.ir/journal/jfst

 

(مقاله پژوهشی)

خواص ضد باکتریایی لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و باسیلوس کواگولانس علیه پاتوژن های مقاوم

 

علی کاظمی1، نادر حبیبی2*

 

1-دانش­آموخته کارشناسی ارشد علوم و صنایع غذایی، واحد سنندج، دانشگاه آزاد اسلامی، سنندج، ایران.

2- گروه علوم وصنایع غذایی، واحد سنندج، دانشگاه آزاد اسلامی، سنندج، ایران.

 

تاریخ دریافت:08/04/1401   تاریخ پذیرش:25/07/1401

 

چکیده

اخیراً استفاده از پروبیوتیک­ها در مهار باکتری‌­­های بیماری‌زا اهمیت بسیار زیادی پیدا کرده است.علاوه بر آن دارای خواص مفیدی جهت حفظ سلامت بدن می­باشند. هدف از انجام مطالعه حاضر بررسی خواص ضد باکتریایی محیط کشت فاقد سلول دو باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و باسیلوس کواگولانس علیه دو پاتوزن اشریشیا­کلی و استافیلوکوکوس­اورئوسمی­باشد. باکتری­های پاتوژن از نمونه­های شیر خام گاو توزیع شده در شهر سنندج با استفاده از محیط­های اختصاصی و افتراقی جداسازی، سپس با روش دیسک دیفیوژن حساسیت آنتی­بیوتیکی آن ها بررسی و جدایه­های مقاوم به چند دارو جهت ادامه تست­های آزمایشگاهی انتخاب شدند. بعد از کشت باکتری­های پروبیوتیک از مایع بدون سلول آن­ها برای بررسی خواص ضدباکتریایی توسط روش­های MIC و MBC استفاده شد. همچنین میان‌کنش دو پروبیوتیک با استفاده از روش چکربورد و تعین شاخص FICi بررسی شد.از 180 نمونه گرفته ­شده، تعداد 15 جدایه اشریشیا کلی (33/8%) و 19 جدایه استافیلوکوکوس اورئوس(55/10%) جداسازی شد. بر اساس نتیجه تست حساسیت آنتی­بیوتیکی برای هر کدام از باکتری­های پاتوژن10 جدایه انتخاب شد. نتایج نشان داد که محیط کشت رشد کرده هر دو باکتری پروبیوتیک دارای قدرت ضد باکتریایی علیه هر دو باکتری پاتوژن می­باشند، اما بررسی هم زمان این دو پروبیوتیک اثر سینرژیستی را نشان دادند. باکتریاستافیلوکوکوس­اورئوس نسبت به اشریشیاکلی حساس­تر بود. مقادیر MIC و MBC در رنج 5/2 تا 160 میکرولیتر بر میلی­لیتر بود. بنابراین می­توان محیط کشت بدون سلول لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و باسیلوس کواگولانسرا به عنوان یک ترکیب بیولوژیکی جدید با خواص ضدباکتریایی معرفی نمود.

 

واژه‌های کلیدی: لاکتوباسیلوس­اسیدوفیلوس، باسیلوس کواگولانس، اشریشیا کلی، استافیلوکوکوس­اورئوس.

 

 

 

 

*مسئول مکاتبات:[e-mail]

 

1-مقدمه

امروزه به دلیل وجود عوامل مختلف ایجادکننده فساد مواد غذایی یافتن ترکیبات نگهدارنده جدید به موضوع مورد بررسی بسیاری از پژوهشگران این زمینه تبدیل شده است. ترکیبات نگهدارنده موجود ممکن است دارای معایبی باشند که استفاده از آن­ها محدود شده باشد. از طرف دیگر پاتوژن­های غذا زاد کم کم به آنتی­بیوتیک­ها و نگهدارنده مقاوم شده و باعث ایجاد فساد در مواد غذایی می شوند. همچنین استفاده از نگهدارنده­های شیمیایی روی میزان سلامت مصرف­کننده اثرات منفی بر جای می­گذارد. بر همین اساس تمایل به استفاده از ترکیبات افزودنی با منشاء طبیعی و یا  زیستی  روز  به  روز  افزایش  پیدا  می­کند(22).

آلودگی سموم و پاتوژن­های غذایی اثرات نامطلوبی بر سلامت انسان وارد می کند و خسارات اقتصادی هنگفتی را به همراه دارد(26). آلودگی و مقاومت آنتی­بیوتیکی استافیلوکوکوس ­اورئوس جدا شده از شیر خام به ثبات رسیده است(23). میزان بیان دو ژن TLR2 و  TLR4 در سلول‌های آلوده به سالمونلا انتریتیدیس، با هر یک از باکتری ‌های پروبیوتیک لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسیلوس کازئی به صورت معناداری کاهش یافته است)7).امروزه پروبیوتیک‌ها و پره­بیوتیک­ها بسیار مورد مطالعه محققان می­باشند. پروبیوتیک­ها، میکروارگانیسم­های زنده و فعالی هستند که خوردن آنها، باعث تغییر میکروبیوم دستگاه گوارشی ما در جهت سلامتی بیشتر می‌شود. وجود این باکتری‌های خوب، از رشد و تکثیر باکتری‌های بیماری‌زا جلوگیری می‌کند و باعث گوارش بهتر غذا و کمک به کارکرد سیستم ایمنی بدن می‌شود.پروبیوتیک‌ها این مزایا را برای سلامتی ما به همراه دارند: پیشگیری و درمان اسهال ناشی از عفونت‌ها یا آنتی‌بیوتیک‌ها، بهبود و کاهش علائم سندروم روده تحریک‌پذیر ( اسهال یایبوست  در پی استرس زیاد)، تقویت سیستم ایمنی، کاهش التهاب و آلرژی‌ها، بهبود خلق و کاهش اضطراب (15 ،20). پروبیوتیک­ها به عنوان افزودنی به مواد غذایی مطرح         می­باشند. پروبيوتيك­ها معمولاًبه جنس­هاى باکتریایی­لاكتوباسيلوس¹،باسیلوس²،رومینوکوکوس³،انتروكوكوس⁴،­کلستریدیوم⁵و بيفيدوباكتريوم⁶تعلق دارند.این باكترى­های اسيد­لاكتيکی به طورمشخص كموارگانوتروفيك⁷ بوده و كربوهيدرات­ها را تخميركرده و درنهایت محصول اصلی آن­ها اسيدلاكتيك است که با افزایش میزان نفوذ­پذیری غشای بیرونی باکتری­های گرم­ منفی، باعث ورود ترکیبات ضد­ میکروبی به داخل باکتری­های بیماری ­زا شده و       باعث مرگ آن­ها می­شوند (23،20،10). لاکتوباسیلوس­اسیدوفیلوس⁸ یک باکتری گرم ­مثبت و متعلق به خانواده لاکتوباسیلاسه و جنس لاکتوباسیلوس می­باشد.این باکتری به صورت هموفرمانتاتیو (تبدیل­کننده قند به لاکتیک ­اسید) و میکروآئروفیلیک می باشد. در مجاری گوارشی و همچین دهان انسان و حیوانات یافت   می­شود. برخی  از  سویه­های این باکتری به عنوان پروبیوتیک شناخته می­شوند.        سویه­هایی که به عنوان پروبیوتیک شناخته می­شوند در ترکیب با استرپتوکوکوس­ترموفیلوس⁹ و لاکتوباسیلوس­بولگاریکوس¹⁰ در تولید فرآورده­هایی مانند ماست و پنیر کاربرد دارد. مطالعات  مختلف خواص پروبیوتیکی متفاوتی را از این باکتری نشان داده­اند. با توجه به توانایی بالایی     این باکتری در تولید فرآورده­های ضد میکروبی  مانند اسیدهای­آلی، امروزه بسیار مورد  مطالعه  قرار  می­گیرد (3).

سویه­­های باسیلوس­ در مقایسه با سایر سویه­های پروبیوتیک دارای  سلول­های اسپوردار هستند­ که باعث افزایش قابلیت

---

[1] -Lactobacillus

[2]  - Bacillus

[3]  - Ruminococcus

[4] - Enterococcus

[5] - Clostridium

[6] 6 -Bifidobacterium

[7] - Chemoorganotrophic

[8]  -Lactobacillus acidophilus

[9]  - Streptococcus thermophilus

[10] -Lactobacillus bulgaricus

زنده­مانی آن­ها جهت تحمل حرارت در فرآیندهای زیستی و همچنین  مقاومت در مقابل نمک­های صفراوی در حین عبور از معده می­شود (10).  باسیلوس­ کواگولانس¹ نیز   علاوه بر ویژگی­های مذکور، باکتریوسینی  تحت  عنوان کواگولین² ترشح می­کند که بر علیه طیف وسیعی از میکروارگانیسم­های مضر روده عمل می­کند. نتایج  مطالعات نشان داد که استفاده طولانی مدت از این سویه فاقد اثرات جهش­زایی و ژنوتوکسیک در انسان است. همچنین در یک مطالعه­ی آزمایشگاهی به منظور بررسی میزان ماندگاری و فعالیت این سویه در دستگاه­گوارش، مشخص شد که بقاء باکتری حدود70% و تبدیل اسپور به فرم رویشی در شرایط آزمایش شده حدود10% است. علاوه بر این میزان ماندگاری با حضور لاکتوز و فروکتوز  بررسی و در نهایت نشان داده شد که سویه مذکور به هضم لاکتوز و فروکتوز کمک کرده و از بروزعلائم گوارشی در افراد حساس به کربوهیدرات­ها پیشگیری می­کند(14). مطالعات آزمایشگاهی نشان  داده­اند عامل ضد میکروبی تولیدشده توسط برخی سویه­های باسیلوس قادر به مهار  گونه­های کلستریدیوم، کمپیلوباکتر واسترپتوکوکوس  می­باشد (18). اشریشیاکلی

یک باکتری میله­ای گرم منفی، بی­هوازی اختیاری و جزو کلی­فرم­ها محسوب می­شود.این باکتری به وفور در روده حیوانات خونگرم یافت می­شود. بیشتر سویه­های این باکتری بی­خطر هستند و به عنوان فلور نرمال روده محسوب       می­شوند. اما برخی از سویه­های اشریشیاکلی به واسطه داشتن فاکتورهای حدت یا پاتوژنسیته مختلف توانایی ایجاد بیماری­های مختلفی مانند بیماری­های گوارشی، عفونت کلیه مجاری ادراری بخصوص در خانم­ها، عفونت خون، عفونت استخوان و مفاصل، مننژیت و ... را دارند. برخی از سویه­های این باکتری با تولید توکسین در مواد غذایی به عنوان غذا زاد شناخته می­شوند. توکسین­های تولید شده توسط این سویه ها عامل ایجاد مسمومیت ­غذایی می­باشد؛ به همین دلیل مطالعات مختلفی برای مبارزه با این باکتری و به خصوص سویه­های پاتوژن انجام می­شود(5).

باکتری استافیلوکوکوس­اورئوس³ یک باکتری گرم­ مثبت، گرد، کاتالاز­ مثبت و اکسیداز منفی و بی­هوازی ­اختیاری است. جنس استافیلوکوکوس‌ها، ۳۳ گونه مهم دارند. بیشتر آن‌ها بی‌خطرند و به صورت طبیعی روی پوست اکثر افراد وجود دارند و در خاک نیز زندگی می‌کنند اما گونه‌های بیماری‌زا نیز در بین استافیلوکوکوس‌ها وجود دارند که می‌توانند عامل ایجاد بیماری­هایی مانند آبسه های پوستی، عفونت خون، عفونت زخم، باکتریمی، استئومیلیت و ... شوند. باکتری استافیلوکوکوس اورئوس قادراست با تولید انتروتوکسین­ها در مواد غذایی ایجادکننده مسمومیت   غذایی باشد که با اسهال و استفراغ همراه است. حضور این    باکتری در مواد غذایی و تولید توکسین یکی از مشکلات تولیدکنندگان مواد غذایی است (5). بر این اساس هدف    از انجام مطالعه حاضر، بررسی  اثر  سینرژیسمی  ناشی از ترکیبات ترشحی دو پروبیوتیک لاکتوباسیلوس­اسیدوفیلوس و باسیلوس کواگولانس علیه دو باکتری استافیلوکوکوس اورئوس و اشریشیاکلیمقاوم به دارو جدا شده از مواد غذایی می­باشد. لازم به ذکر است در صورت وجود نتایج قابل قبول برای این دو باکتری می­توان نتایج را به سایر باکتری های غذازاد نسبت داد.

 

2- مواد و روش ها

2-1-  نمونه گیری و جداسازی  باکتری­های  غذازاد

در مجموع 180 نمونه شیرخام گاو مورد بررسی قرار گرفت. نمونه­گیری در شرایط استریل بااستفاده از ظروف و وسایلی که از قبل استریل شده بودند از شیرهای خام مراکز لبنی سطح شهر سنندج صورت گرفت. مقدار نمونه 100 میلی ­لیتر بود که در ظروف استریل از قبل تهیه شده اخذ گردید. نمونه­ها سریعاً و در مجاورت یخ به آزمایشگاه منتقل گردید. نمونه­های­ شیر روی محیط­های مکانکی­آگار⁴(برای بررسی­ حضور اشریشیا­کلی) و بردپارکر­آگار⁵ (برای بررسی حضور استافیلوکوکوس­اورئوس) منتقل شدند. پس از 24  

---

[1]  -Bacillus coagulans

[2] - Coagulin

[3] 3-Staphylococcus aureus

[4] - MacConkey agar

[5] -Baird-Parker agar

ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی­گراد، با توجه به الگوی رشد باکتریایی و مشخصات کلنی، کلنی­های مشکوک به محیط­های دیگر جهت تایید منتقل شدند. کلنی­های مشکوک به اشریشیاکلی به محیط ائوزین ­متیلن­بلو­آگار¹و کلنی­های مشکوک به استافیلوکوکوس اورئوس به محیط مانیتول­ سالت­آگار² منتقل شدند. سپس پلیت­های کشت داده ­شده به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی­گراد انکوبه شدند (6). در مطالعه حاضر از سویه استاندارد استافیلوکوکوس ­اورئوسATCC 25923  و سویه  استاندارد  اشریشیاکلی ATCC 25922 استفاده شد. سویه‌های مذکوراز مرکز کلکسيون میکروارگانیسم­های صنعتی³ تهیه شدند.

 

2-2- تعیین تست حساسیت میکروبی

ابتدا بررسی مقاومت آنتی­بیوتیکی با روش آگار دیسک­دیفیوژن (Kirby-Bauer) روی محیط مولرهینتون­آگار(Merck, Germany) طبق دستورالعمل انستیتوی استانداردهای  بالینی و آزمایشگاهی⁴ انجام شد (25). از بین جدایه ­ها طبق CLSI تعداد 10 جدایه استافیلوکوکوس­اورئوس و 10 جدایه اشریشیاکلی مقاوم به چند دارو انتخاب شدند.آنتی­بیوتیک­های مورد بررسی شامل تتراسایکلین،   پنی­ سیلین، آزیترومایسین، کلیندامایسین، کلوگزاسیلین، انروفلوکساسین،سیپروفلوکساسین، ونکومایسین، جنتامایسین و کلرام فنیکل بودند )شرکت پادتن طب، ایران).

 

2-3-تعیین MIC و MBC حاصل از محیط کشت     دو باکتری لاکتوباسیلوس  اسیدوفیلوس  و باسیلوس کواگولانس

تعیین مقادیر کمترین غلظت مهارکنندگی رشد⁵ و کمترین غلظت کشندگی⁶حاصل از محیط کشت رشد دو باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوسATCC 4356 و باسیلوس کواگولانسATCC 23498  انجام شد. این باکتری­ها      از مرکز کلکسيون میکروارگانیسم­های صنعتی خریداری شد. سپس ویال­ها طبق دستورالعمل با حجم مناسب سرم فیزیولوژی  استریل به مدت نیم ساعت در دمای اتاق احیا شد. پس از احیا شدن آن­ها روی محیط کشت De Man, Rogosa and Sharpe (MRS) Agar کشت داده شدند تا کلنی خالص آن­ها برای مراحل بعدی مورد استفاده قرار گیرد. تعیین مقادر MIC با استفاده از روش میکرو دایلوشن ­براث⁷ و در میکروپلیت های 96 خانه­ای ته صاف انجام شد. برای این منظور باکتری های پروبیوتیک در محیط کشت MRS Broth  و در جار بی­هوازی کشت داده شد. سپس با استفاده از فیلترهای باکتریولوژیک باکتری­های محیط کشت حذف شده و محیط کشت حاصله به عنوان ماده مؤثر مورد بررسی قرار گرفت. انجام این تست برای دو باکتری به صورت جداگانه و همچنین به صورت ترکیب با هم مورد استفاده قرار گرفتند. برای انجام میکرودایلوشن براث ماده حاصله به صورت سریال دایلوشن رقت سازی شد. برای انجام تست میکرودایلوشن براث از غلظت 625/ 0μl/ml تا 320 μl/ml انجام شد. در نهایت میزان کمترین غلظت مهارکنندگی رشد با مشاهده عدم وجود کدورت تعیین شد (شکل 1).از تمام گوده­هایی که فاقد رشد بوده­اند  مقدار 10 میکرولیتر، روی محیط عصاره مغز و قلب⁸ آگار کشت داده می­شود و کاهش 9/99% تعداد باکتری اولیه به عنوان MBC در نظر گرفته شد(5).

 

شکل1-میکروپلیت 96 خانهای مربوط به تست میکرودایلوشن­ براث

برای تعیین مقادیر MIC و MBC (مستطیل مشخص شده گوده­های معادل MIC را نشان می­دهد).

---

[1] - Eosin Methylene Blue (EMB) Agar

[2]  - Mannitol Salt Agar (MSA) Agar

[3]  - Persian Type Culture Collection (PTCC)

[4]  - Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI)

[5] - Minimum Inhibitory Concentration (MIC)

[6] - Minimum Bactericidal Concentration (MBC)

[7] - Broth Microdilution

[8] - Brain Heart Infusion (BHI)

2-4- بررسی اثر سینرژیسمی دو باکتری لاکتوباسیلوس ­اسیدوفیلوس و باسیلوس ­کواگولانس به روش تعیین FICi با استفاده از میکروپلیت 96 خانه­ای

تست تعیین Fraction inhibitory concentration index (FICI) به روش چکربورد¹ انجام شد. در این تست خواص سینرژیستی دو ترکیب با هم سنجیده می­شود. در یک میکروپلیت MIC حاصل از محیط کشت دو باکتری پروبیوتیک به صورت جداگانه اندازه­گیری شد. سپس در یک میکروپلیت دیگر MIC دو باکتری پروبیوتیک به صورت سینرژیسمی محاسبه شد و طبق رابطه1اثر سینرژیمی یا هم­افزایی بررسی شد(23).

رابطه(1)

 

در فرمول فوق اگر 5/0FICI ≤ باشد به عنوان سینرژیسمی کامل، 75/0< FICI≤5/0 نسبتاً سینرژیسم، 2< FICI≤75/0 بدون اثر و 2FICI> به صورت آنتاگونیست در نظر گرفته شد (16).

2-5-تجزیه و تحلیل داده­ها

تحلیل آماری داده ها با استفاده از نرم افزار  SSPSصورت گرفته و گروه­های مورد مطالعه به کمک آزمون­های Paired t-tests و آزمون chi-square ارزیابی شدند. سطح معنی داری نیز کمتر از 05/0 در نظر گرفته شد.

 

3- نتایج و بحث

3-1- باکتری های استافیلوکوکوس  ­اورئوس و اشریشیاکلی   جدا شده 

نوع باکتری	مواردمثبت		موارد منفی		جمع
	تعداد	درصد	تعداد	درصد	تعداد	درصد
اشریشیاکلی	15	33/8	165	67/91	180	100
استافیلوکوکوس­اورئوس	19	55/10	161	45/89	180	100

در مطالعه  حاضر ابتدا به بررسی آلودگی نمونه های شیر خام گاو عرضه شده در سطح شهر سنندج با دو باکتری استافیلوکوکوس ­اورئوس و اشریشیا کلی پرداخته شد. بر اساس نتایج کشت و تست های بیوشیمیایی از 180 نمونه گرفته شده، تعداد 15 جدایه  باکتریاشریشیاکلی (33/8%) و 19 جدایه (55/10%) باکتریاستافیلوکوکوس­اورئوس از شیرخام توزیع ­شده در مراکز لبنی سطح شهر سنندج جدا شد (جدول 1).

 

---

[1] 1-Checkerboard

بررسی مطالعات گذشته صورت گرفته در ایران نشان     می­دهد که شیر­های توزیع ­شده در کشور دارای آلودگی    با اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس اورئوس هستند. این آلودگی  می تواند منشا دامی و یا حتی انسانی داشته باشد. در مطالعه سلطان­ دلال و همکاران (1398)، از تعداد 150 نمونه شیر جمع­شده از شهرستان بروجرد ( استان­لرستان) 31 جدایه (آلودگی 66/20%) باکتری اشرشیاکلی جدا شد. براساس فعالیت بتاگلیکوزیدازی منفی و واکنش با آنتی­سرم اختصاصی 5 جدایه به عنوان O157: H7 تشخیص داده شد (24). بنیادیانو همکاران (2014)، در یک مطالعه بر روی 200  نمونه شیر خام تولیدی در استان چهارمحال و بختیاری به منظور تعیین میزان آلودگی به باکتری اشریشیاکلی O157: H7 با استفاده از محیط غنی‌کننده و محیط کشت افتراقی و روش سرولوژی پرداختند. از 200 نمونه شیر خام مورد آزمایش 83  مورد(5/41%) مشکوک به سروتیپ O157: H7 شناسایی شد (5).  در مطالعه دیگری که در ایران انجام شد در زمان های مختلف نمونه­گیری و به بررسی حضور دو باکتری اشرشیاکلی و استافیلوکوکوس­اورئوس پرداخته شد. از ۳۲۰ نمونه شیر در زمان     شیردوشی حدود ۶۳  نمونه (۷/۱۹%) آلوده به  اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس ­اورئوس، در ۶۲ نمونه (۴/۱۹%) فقط اشریشیاکلی و ۳۰ نمونه (۳/۹%) فقط  استافیلوکوکوس­اورئوس بودند، در ۱۶۵ نمونه (۶/۵۱%) آلودگی به هیچ کدام از این دو باکتری دیده نشد (1). آلودگی به اشیریشیاکلی می­تواند به علل مختلف در شیر اتفاق بیفتد از جمله عدم استفاده از ماشین یخچال ­دار در هنگام حمل شیرخام به مراکز فرآوری، عدم شستشو و ضدعفونی مناسب سطح پستان گاو( به علت آلوده بودن پستان گاو با مدفوع خود گاو در هنگام شیردوشی)، عدم رعایت بهداشت فردی کارگران و عدم استفاده از آب پاکیزه برای شستشوی ظروف نگهداری و حمل و نقل شیر. همچنین آلودگی شیرخام به استافیلوکوکوس ­اورئوس می تواند منجر به ترشح آنتروتوکسین توسط این باکتری گردیده که حتی با اعمال حرارت ازبین نمی­رود و می­تواند ایجاد مسمومیت کند.

 

3-2- مقاومت آنتی­بیوتیکی جدایه­های اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس اورئوس

نتایج تست حساسیت آنتی­بیوتیکی در جدول2 آورده شده است. در مورد باکتری اشرشیاکلی بیشترین و کمترین مقاومت به ترتیب مربوط به آنتی بیوتیک­های پنی سیلین 11(33/73%) و جنتا مایسن 2(33/13%) بود. همچنین در مورد باکتری استافیلوکوکوس ­اورئوس بیشترین مقاومت مربوط به آنتی­بیوتیک پنی­سیلین 16(21/84%) بود. لازم به ذکراست همه جدایه­های استافیلوکوکوس­اورئوس نسبت به ونکومایسین حساس 19(100%) بودند. نکته مهم و قابل توجه، مقاومت آنتی­بیوتیکی بالای باکتری­های اشریشیا کلی و استافیلوکوکوس­اورئوس جدا شده از نمونه­های لبنی    می­باشدکه می­تواند یک زنگ خطر برای مصرف بی­رویه تجویز آنتی­بیوتیک باشد و انتشـار و انتقـال این باکتری، با توجه به این که درصد بالایی از افراد جامعه سالم ناقل آن هستند، در اثر انتقال بین افراد و انتقـال ژن­های مقـاومتی، به ایزولـه­های دارای مقاومت چندگانه یاMullty Drug Resistant Isolates تبدیل می­شوند. شیرخام دام‌های شیری می‌تواند منبع باکتری­های مقاوم به چند دارو باشد که تهدیدی بهداشتی برای مصرف شیرخام در ایراناست. با    این وجود، تحقیقات بیشتر برای درک ویژگی­های اپیدمیولوژیک تکمیلی در شیرخام ضروری است(18,8). بنابراین اگر این باکتری­ها از طریق غذا وارد بدن انسان شوند ممکن است باعث ایجاد عفونت­های مقاوم به درمان گردند.

 

 

 

جدول 2- نتایج تست حساسیت آنتی بیوتیکی جدایه­های اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس ­اورئوس

آنتی­بیوتیک	باکتری	تعدادجدایه حساس (%)	تعدادجدایه نیمه­حساس (%)	تعدادجدایه مقاوم (%)
­تتراسایکلین	اشریشیاکلی(15 جدایه) استافیلوکوکوس اورئوس(19جدایه)	5 (33/33) 3 (8/15)	3 (20) 2 (5/10)	7 (66/46) 12 (15/63)
پنی­سیلین	اشریشیاکلی استافیلوکوکوس اورئوس	2 (33/13) 3 (8/15)	2 (33/13) 0 (0)	11 (33/73) 16 (21/84)
آزیترومایسین	اشریشیاکلی استافیلوکوکوس اورئوس	6 (40) 9(36/47)	1 (66/6) 2 (5/10)	8 (33/53) 8 (1/42)
کلیندامایسین	اشریشیاکلی استافیلوکوکوس اورئوس	6 (40) 12 (15/63)	2 (33/13) 1 (26/5)	7 (66/46) 6 (57/31)
کلوگزاسیلین	اشریشیاکلی استافیلوکوکوس اورئوس	4 (66/26) 6 (57/31)	3 (20) 1 (26/5)	8 (33/53) 12 (15/63)
انروفلوکساسین	اشریشیاکلی استافیلوکوکوس اورئوس	8 (33/53) 12 (15/63)	2 (33/13) 1 (26/5)	5 (33/33) 6 (57/31)
سیپرفلوکساسین	اشریشیاکلی استافیلوکوکوس اورئوس	8 (33/53) 12 (60)	3 (20) 2 (66/6)	4 (66/26) 5 (31/26)
وانکومایسین	اشریشیاکلی استافیلوکوکوس اورئوس	7 (66/46) 19 (100)	4 (66/26) 0 (0)	4 (66/26) 0 (0)
جنتامایسین	اشریشیاکلی استافیلوکوکوس اورئوس	11 (33/73) 5 (31/26)	2 (33/13) 2 (66/6)	2 (33/13) 12 (60)
کلرام‌فنیکل	اشریشیاکلی استافیلوکوکوس اورئوس	9 (60) 6 (57/31)	2 (33/13) 4 (21)	4 (66/26) 9 (36/47)

 

 

3-3- مقادیرMIC و MBC دو باکتریلاکتوباسیلوس­اسیدوفیلوس و باسیلوس کواگولانس علیه باکتری­های اشریشیا­کلی و استافیلوکوکوس­اورئوس

نتایج حاصل از تست میکرو دایلوشن ­براث برای دو باکتریلاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و باسیلوس­کواگولانس در جدول1 قابل مشاهده است. نتایج این تست نشان داد که محیط کشت رشد کرده هر دو باکتری دارای قدرت ضد میکروبی علیه هر دو باکتری استافیلوکوکوس ­اورئوس و اشریشیاکلی می باشند. لازم به ذکر است که باکتری استافیلوکوکوس­اورئوس نسبت به اشریشیاکلی حساس­تر می­باشد. هم مقادیر MIC و هم MBC لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس علیه دو باکتری اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس  اورئوس معنی­دار بود(جدول2).

 

 

 

جدول3- نتایجMIC و MBC حاصل از محیط کشت دو باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و باسیلوس­کواگولانس علیه باکتری­های استافیلوکوکوس ­اورئوس و اشریشیاکلی

باکتری پروبیوتیک

اشریشیاکلی

استافیلوکوکوس­اورئوس

10 جدایه مقاوم

سویه استاندارد

10 جدایه مقاوم

سویه استاندارد

MBC (μl/ml)

MIC (μl/ml)

MBC (μl/ml)

MIC (μl/ml)

MBC (μl/ml)

MIC(μl/ml)

MBC (μl/ml) 5

MIC (μl/ml)

لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس

مقادیر

40-20

10-4

20

10

20-10

20- 5

5/2

P value

*032/0

*0033/0

غیرقابل آنالیز(یک سویه

*032/.0

*0033/0

غیرقابل آنالیز(یک سویه

باسیلوس کواگولانس

مقادیر

160-40

160-40

80

80

80-40

40-20

20

10

P value

059/0

*024/0

غیرقابل آنالیز(یک سویه

059/0

*024/0

غیرقابل آنالیز(یک سویه

* : معنی دار در سطح 05/0

 

در دو دهه گذشته استفاده از پروبيوتيک­ها در مهار  باکتري­هاي بيماري­زا اهميت بسياري پيدا کرد. به عنوان مثال در مطالعه میرزایی­ و همکاران (1388)، تأثير پروبيوتيک­هاي بيفيدو باکتريوم آنگولاتوم، بيفيدوباکتريوم­بيفيدوم، لاکتوباسيلوس ­اسيدوفيلوس و لاکتوباسيلوس­کازئي  بر سرعت رشد  اشريشياکليO157: H7  در شرايط رشد همراه در شير مورد بررسي قرار گرفت. بر اساس نتايج حاصله رشد توامان هر کدام از پروبيوتيک­ها در طول 48 ساعت گرمخانه­گذاري به طور معني­دار رشد  اشريشياکلي O157: H7 مهار نمود. بر اساس نتایج این مطالعه pH  نمونه شير حاوي کشت E.coli+L. casei  بعد از 48 ساعت گرمخانه‌ گذاري از pH  نمونه شير حاوی اشریشیاکلی به طور معني­دار کمتر بود (p<0.01).در مجموع نتايج اين مطالعه نشان داد که مصرف طولاني مدت محصولات لبنی حاوی پروبیوتیک ­های مذکور مي­تواند در جلوگيري از بروز عفونت با اشريشياکليO157: H7  و درمان آن مفيد واقع شود(2). در یک مطالعه مشابه که توسط کومار و همکاران (2016)، انجام شد خواص ضد باکتریایی لاکتوباسیلوس پلانتاروم و لاکتوباسیلوس­اسیدوفیلوس علیه سویه­های انترواگرگیتیو اشریشیاکلی¹ بررسی شد. نتایج این مطالعه نشان داد که در کشت همراه یا Co-cultured این دو پروبیوتیک در غلظت cfu 1010 باعث مهار رشد باکتری اشریشیاکلی در 72 ساعت می شود. همچنین در غلظت­های  cfu 108 و 109 مدت زمان مهار رشد به 96 ساعتمی­رسد(16). نتایج مطالعه حاضر نشان داد که محیط کشت رشدکرده هر دو باکتری دارای قدرت ضد میکروبی علیه هر دو باکتری استافیلوکوکوس ­اورئوس       و اشریشیاکلی می­باشند.نتایج مطالعه حاضر نشان داد که باکتری استافیلوکوکوس ­اورئوس نسبت به اشریشیاکلی حساس­تر بود. مقادیر MIC برای لاکتوباسیلوس­اسیدوفیلوس  علیه اشریشیاکلی بین 10 تا 40  μl/ml و علیه استافیلوکوکوس ­اورئوس بین 5/2 تا 20 μl/ml و همچنین برای باسیلوس کواگولانس این مقادیر به ترتیب بین 40 تا 160 μl/ml و 10 تا 40 μl/ml به دست آمد. نکته قابل توجه این که مقادیر MBC در مطالعه حاضر خیلی نزدیک به رنج های MIC می­باشد که این نشان می دهد که دو پروبیوتیک مورد مطالعه غیر از خواص مهارکنندگی رشد

---

[1] - Enteroaggregative Escherichia  coli

دارای اثر کشندگی روی باکتری­های پاتوژن نیز می باشند. پروبیوتیک ها به واسطه تولید مواد پیشگیری­کننده از جمله باکتریوسین اسید لاکتیک و ... همچنین  با ممانعت از اتصال و رشد و کلونیزه­ شدن موضعی اجرام بیماری زا در مخاط روده و نیز با مجادله و غلبه بر تصاحب غذا از رخداد بسیاری از عفونت­ها پیشگیری می­کنند. اثر ضدمیکروبی حاصل از فعالیت­های متابولیکی باکتری‏های ‏پروبیوتیک را می‏توان به تولید اسیدلاکتیک نسبت داد زیرا در طی رشد باکتری‏های پروبیوتیک، ‏اسیدیته محیط به شدت اسیدی شده و باکتری‏های بیماری‏زا به ‏طور طبیعی به شرایط اسیدی حساس بوده و در ‏اسیدیته پایین از بین می‌روند(12,9).

3-4- اثر سینرژیسمی دو باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و باسیلوس کواگولانس علیه دو باکتری اشریشیاکلی  و  استافیلوکوکوس ­اورئوس

با استفاده از تست چکربورد میان­ کنش بین دو باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و باسیلوس­کواگولانس علیه دو باکتری اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس ­اورئوس بررسی شد. نتایج نشان داد که اثر دو باکتری لاکتوباسیلوس­اسیدوفیلوس و باسیلوس­کواگولانس علیه اشریشیاکلی نسبتاً سینرژیسم و علیه استافیلوکوکوس ­اورئوس کاملاً سینرژیسم بود. اعداد مربوط به FICI در جدول4 آورده شده است.

 

 

جدول4- نتایج برهم­کنش لاکتوباسیلوس­اسیدوفیلوس و باسیلوس­کواگولانسعلیه دو باکتری اشریشیا­کلی و استافیلوکوکوس­اورئوس

اشریشیاکلی				استافیلوکوکوس اورئوس
تست­چکربورد	10 جدایه مقاوم	سویه استاندارد	10 جدایه مقاوم		سویه استاندارد
FICI نتیجه اینتراکشن	725/0 نسبتاً سینرژیسم	725/0 نسبتاً سینرژیسم	388/0 سینرژیسم کامل		388/0 سینرژیسم کامل

 

 

در همین راستا، بویریوانت  و همکاران(2007)، با بررسی اثر مهاری مایع رویی چندین جدایه لاکتوباسیلوس بر برخی از سویه‌های بیماریزا مثل لیستریا مونوسیتوژنز، استافیلوکوکوس ­اورئوس، اشریشیاکلی و سالمونلاتیفی ‌موریوم نشان دادند که  لاکتوباسیلوس ­روتری دارای فعالیت ضد میکروبی قوی­تری نسبت به بقیه لاکتوباسیلوس‌ها بود. در این بررسی توانایی رشد لاکتوباسیلوس فرمنتوم و لاکتوباسیلوس پلانتاروم جدا شده از مدفوع در شرایط مختلف مانند pH پایین، غلظت زیاد اکسیژن، بهتر از بقیه لاکتوباسیلوس‌ها بود. همچنین بیشتر سویه‌های جداشده از این دو نوع لاکتوباسیلوس بودند(4) .با توجه به  تفسیری که از شاخص  FICiبیان می­گردد، اگر5/0FICI ≤ باشد       به عنوان سینرژیسمی کامل، 75/0< FICI ≤5/0 نسبتاً سینرژیسم، 2< FICI ≤75/0 بدون ­اثر و 2FICI >         به صورت آنتاگونیست در نظر گرفته می­شود. بنابراین شاخص مذکور برای اشریشیاکلی (75/0<FICI≤5/0) نسبتاً سینرژیسم و برای استافیلوکوکوس ­اورئوس (5/0FICI≤) سینرژیسمی کامل می­باشد (4).  بررسی اثرات سینرژیسمی ناشی از دو پروبیوتیک مورد مطالعه نشان     می­دهد که این پروبیوتیک­ها اثر همدیگر را تقویت          می نمایند (مشاهده  مقادیر FICi). با توجه به نتایج مذکور، این پتانسیل وجود دارد که در آینده بتوان ترکیب این دو باکتری را علیه سایر باکتری­های مقاوم  هم به کار برد.

 

4- نتیجه‌گیری

نتایج مطالعه حاضر نشان داد که دو باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و باسیلوس کواگولانس دارای خواص ضد باکتریایی علیه دو باکتری پاتوژن غذازاد اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس­اورئوس هستند. همچنین در بررسی همزمان این دو پروبیوتیک اثر همدیگر را تقویت

نموده و دارای اثر سینرژیستی بودند. بر اسانس نتایج مطالعه حاضر می توان محیط کشت بدون سلول لاکتوباسیلوس­اسیدوفیلوس و باسیلوس کواگولانس به عنوان یک ترکیب بیولوژیکی با خواص ضد باکتریایی معرفی نمود.

 

5-منابع

1.       صادقي فرد ن، عزيزي جليليان ف، صيدخاني ن، رستم زاد آ. بررسي آلودگي شير خام از نظر اشريشياكلي و استافيلوكوكوس اورئوس در ايلام. مجله علمي دانشگاه علوم پزشكي ايلام. 1385؛ 14(1): 49-44.

2.       میرزایی ح،  رضا نهایی م، جوادی ا، احمدی منش مهدی. مطالعه تاثیر برخی پروبیوتیک‌ها بر روی ‌اشریشیاکلیO157: H7 در شرایط رشد توأمان در شیر. مجله تحقیقات دامپزشکی. 1388؛ 64(4): 282-279

3.       Bâati L.l, Fabre-Gea C, .Auriol D, Blanc P. J. Study of the cryotolerance of Lactobacillus acidophilus: effect of culture and freezing conditions on the viability and cellular protein levels. International journal of food microbiology. 2000; 59: 241-247.

4.       Boirivant M, Strober W. The mechanism of action of probiotics. Current Opinion in Gastroenterology. 2007; 23: 679-692.

5.       Bonyadian M, Moshtaghi H, Taheri M. A. Molecular characterization and antibiotic resistance of enterotoxigenic and entero-aggregative Escherichia coli isolated from raw milk and unpasteurized cheeses. Veterinary Research Forum. 2014; 5(1):29-34.

6.       Carroll, K. C., Butel, J., Morse, S. 2015. Jawetz Melnick and Adelbergs Medical Microbiology 27 E. McGraw-Hill Education.

7.       Dallal  M, Moshiri M, Mirshafiey A, Douraghi  M, Rezaie F, Gholami M. Evaluation of the effect of probiotic bacteria Lactobacillus acidophilus PTCC1643 and Lactobacillus casei PTCC 1608 on the TLR2 and TLR4expression in HT29 cells infected with Salmonella enteritidis. Tehran University Medical Journal. 2019; 76: 724-730.

8.       Dehghani M, Akbarpour B, Salari M, Poursheykhani A, Rasoulzadeh, H. 2016. Assessment of Prevalence and Antibiotic Resistance of Staphylococcus aureus in Raw and Pasteurized Milks of Sari City in the Summer of 2014. Iranian Journal of Health and Environment, 9: 147-154.

9.       Ghahfarokhi E. S,  Dehkordi M. M. K. Isolation and evaluation of lactic acid production content in native Lactobacillus of Chaharmahal va Bakhtiari province isolated from dairy products. Biological Journal of Microorganism. 2012; 1 (3): 41- 52.

10.       Gilliland S, Staley T, Bush L. Importance of bile tolerance of Lactobacillus acidophilus used as a dietary adjunct. Journal of dairy science. 1984; 67: 3045-3051.

11.       Griggs J, Jacob J. P. Alternatives to antibiotics for organic poultry production. Journal of Applied Poultry Research. 1984;14: 750-756.

12.       Heller KJ. Probiotic bacteria in fermented foods: product characteristics and starter organisms. The American journal of Clinical Nutrition. 2001; 73 (2): 374- 379.

13.       Hyronimus B, Le Marrec C, Sassi A. H, Deschamps A. Acid and bile tolerance of spore-forming lactic acid bacteria.International Journal of Food Microbiology. 2000; 61: 193-197.

14.       Jankovic I, Sybesma W, Phothirath P, Ananta E, Mercenier A. Application of probiotics in food products-challenges and new approaches.Current Opinion in Biotechnology. 2010; 21: 175-181.

15.       Kuete V, Alibert-Franco S, Eyong K,  et al. Antibacterial activity of some natural products against bacteria expressing a multidrug-resistant phenotype. International Journal of Antimicrobial Agents. 2011; 37: 156-161.

16.       Kumar M, Dhaka P, Vijay D,  et al. Antimicrobial effects of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus

 acidophilus  against multidrug-resistant enteroaggregative Escherichia coli. International Journal of Antimicrobial Agents. 2016; 48: 265-270.

17.       Lin S, Hung A, Lu J. Effects of supplement with different level of Bacillus coagulans as probiotics on growth performance and intestinal microflora populations of broiler chickens. Journal of Animal and Veterinary Advances. 2011; 10: 111-114.

18.       Momtaz H, Farzan R, Rahimi E, Safarpoor D. F, Souod N. Molecular characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolated from ruminant and donkey raw milk samples and traditional dairy products in Iran. The Scientific World Journal. 2012; Article 231342.

19.       Pradhan D, Mallappa R. H, Grover S. Comprehensive approaches for assessing the safety of probiotic bacteria.Food Control. 2020; 108: Article 106872.

20.       Rahi A,  Kazemeini H,  Jafariaskari S,  Seif A,  Hosseini S,  Safarpoor D. F. Genotypic and Phenotypic-Based Assessment of Antibiotic Resistance and Profile of Staphylococcal Cassette Chromosome mec in the Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Recovered from Raw Milk. National library of medicine. 2020;13:273-283.

21.       Quinto E. J, Jiménez P, Caro I, Tejero J, Mateo J, Girbés T. Probiotic lactic acid bacteria: a review. Food and Nutrition Sciences. 2014; 5: 1765.

22.       Salminen S, Ouwehand A, Isolauri E. Clinical applications of probiotic bacteria. International Dairy Journal. 1998; 8: 563-572.

23.       Sanhueza L, Melo R, Montero R, Maisey  K, Mendoza L, Wilkens M. Synergistic interactions between phenolic compounds identified in grape pomace extract with antibiotics of different classes against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. PloS one. 2017; 12: e0172273.

24.       Soltan  Dallal M. M, Zandieh Moradi R, Mazaheri Nezhad Fard R, Rajabi Z. Identification and Diagnosis of Enterohemorrhagic E. Coli by Molecular Method in Boroujerd City Cows' Milk. Journal of Payavard Salamat. 2020; 13: 411-418.

25.       Wayne, P. 2011. Clinical and Laboratory Standards Institute: Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: 20th informational supplement. CLSI document M100-S20.

26.       Yang Z, Zhang W, Yin Y, Fang W, Xue H. Metal-organic framework-based sensors for the detection of toxins and foodborne pathogens. Food Control. 2022;133:part B. Article 10863.