ارتباط بین تولید بیوفیلم و فاکتورهای حدت در سویه های یرسینیا انتروکولیتیکا جدا شده از گوشت قرمز در شهرستان شهرکرد
محورهای موضوعی : میکروبیولوژی غذایی
نجمه مولوی
1
*
,
منوچهر مومنی شهرکی
2
,
حسین خدابنده شهرکی
3
1 - آزاد اسلامی شهرکرد
2 - گروه بهداشت مواد غذایی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه آزاد شهرکرد، ایران.
3 -
کلید واژه: ژن¬های حدت, گوشت قرمز, یرسینیا انتروکولیتیکا ,
چکیده مقاله :
یرسینیا انتروکولیتیکا یک باکتری گرم منفی میباشد که متعلق به خانواده انتروباکتریاسه است. این باکتری یک باکتری پاتوژن غذایی است که به طور عمده توسط گوشت، شیر و آب آلوده منتقل میشود. گوشت قرمز به شکل غیر بهداشتی از منابع عمده انتقال عفونت به یرسینیا انتروکولیتیکا به انسان میباشد. تحقیق حاضر با هدف بررسی فراوانی ژنهای حدت و ارتباط بین تولید بیوفیلم و فاکتورهای حدت در ایزوله های یرسینیا انتروکولیتیکا جدا شده از گوشت قرمز عرضه شده به بازار شهرکرد انجام شد. تعداد 384 نمونه از گوشت قرمز به شکل تصادفی از فروشگاه های عرضه گوشت در شهرستان شهرکرد اخذ و به منظور شناسایی یرسینیا انتروکولیتیکا به روشهای بیوشیمیایی و مولکولی بررسی شدند. سویه‌های میکروبی جدا شده به منظور بررسی توانایی تولید بیوفیلم به روش میکروتیتر پلیت بررسی شدند و ژنهای حدت با آزمون PCR مورد بررسی قرار گرفتند. از مجموع 384 نمونه گوشت قرمز از در 65 نمونه (92/16%) یرسینیا انتروکولیتیکا جداسازی شد. آلودگی در گوشت گاو (69/27 درصد)، در گوشت گوسفند (84/33 درصد) و در گوشت گوساله (64/38 درصد) گزارش گردید. 35 ایزوله (85/53 درصد) واکنش بیوفیلم قوی، 20 ایزوله (77/30 درصد) واکنش بیوفیلم متوسط و 10 ایزوله (38/15 درصد) واکنش بیوفیلم ضعیف را نشان دادند. فراوانی ژنهای inv،ail ، A yadA, yst و vir F به ترتیب: 83 درصد، 53/41 درصد، 43% 84/33 درصد و 23/29 درصد گزارش شد. در تجزیه و تحلیل آماری با آزمون مربع کای بین ژنهای حدت و واکنش بیوفیلم قوی مشاهده گردید. با توجه به اهمیت گوشت قرمز در انتقال یرسینیا انتروکولیتیکا به انسان رعایت اصول بهداشتی و عدم مصرف گوشت آلوده، به کارگیری آزمون PCR به منظور شناسایی دقیق آلودگی در مواد غذایی توصیه میشود.
Yersinia enterocolitica is a gram-negative bacterium that belongs to the Enterobacteriaceae family. This bacterium is a food pathogenic bacterium that is mainly transmitted by contaminated meat, milk and water. Unsanitary meat is one of the main sources of Yersinia enterocolitica infection to humans. The present study was conducted with the aim of investigating the frequency of virulence genes and the relationship between biofilm production and virulence factors in Yersinia enterocolitica isolates isolated from meat supplied to Shahrekord market. 384 samples of red meat were randomly collected from meat supply stores in Shahrekord city and analyzed by biochemical and molecular methods in order to identify Yersinia enterocolitica. The isolated microbial strains were investigated in order to investigate the biofilm production ability by microtiter plate method and the virulence genes were investigated by PCR test. From a total of 384 red meat samples, Yersinia enterocolitica was isolated from 65 samples (16.92%). Contamination was reported in beef (27.69%), mutton (33.84%) and veal (38.64%). 35 isolates (53.85%) showed strong biofilm reaction, 20 isolates (30.77%) showed moderate biofilm reaction and 10 isolates (15.38%) showed weak biofilm reaction. The frequencies of inv, ail, yadA, ystA and virF genes were reported as: 83%, 41.53%, 43% 33.84% and 29.23%, respectively. In the statistical analysis with Chi-square test, a significant relationship was observed between virulence genes and strong biofilm reaction.
Considering the importance of red meat in the transmission of Yersinia enterocolitica to humans, it is recommended to follow the hygiene principles and not to consume contaminated meat, to use the PCR test in order to accurately identify the contamination in food.
1- Alenizi, D., Ringwood, T., Redhwan, A., Bouraha, B., Wren, B. W., Prentice, M. (2016). All Yersinia enterocolitica are pathogenic: Virulence of phylogroup 1 Y. enterocolitica in a Galleria mellonella infection model. Microbiology (Reading(: 162 (8): 1379-1387.
2- Altrock, A., Seinige, D., Kehrenberg, C. (2015). Yersinia enterocolitica isolates from wild boars hunted in lower saxony, Germany. Applied and Environmental Microbiology, 81(14), 4835–4840.
3- Bancerz-Kisiel, A., and Lipczynska-Ilczuk, K. (2021). Evaluation of the correlation between the mRNA expression Levels of ystA and ymoA genes in Y. enterocolitica strains with different enterotoxic properties. Pathogens. 10 (9): 1136. 1150.
4- Bancerz-Kisiel, A., Szczerba-Turek, A., Platt-Samoraj, A., Michalczyk, M., Szweda, W. (2018). Characterisation of ail-positive Yersinia enterocolitica of different biotypes using HRMA. International Journal of Food Microbiology. 269: 46–51.
5- Bari, M. L., Hossain, M. A., Isshiki, K. Ukuku, D. (2011). Behavior of Yersinia enterocolitica in foods. Journal of Pathogens. 54 (2): 1-12.
6- Bernardino-Varo, L., Quinones-Ramírez, E. I., Fernandez, F.J.V azquez-Salinas, C. (2013). Prevalence of Yersinia enterocolitica in raw cow’s milk collected from stables of Mexico City. Journal of Food Protection. 76(4): 694–698.
7- Bhagat, N. and Virdi, J.S. (2011). The enigma of Yersinia enterocolitica biovar 1A. Critical Reviews in Microbiology. 37(1): 25–39.
8- Bonardi, S., Bruini, I., D’Incau, M., Van Damme, I., Carniel, E., Br´emont, S. (2016). Detection, seroprevalence and antimicrobial resistance of Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis in pig tonsils in Northern Italy. International Journal of Food Microbiology. 235 (5): 125–132.
9- Bonardi, S., Paris, A., Bassi, L., Salmi, F., Bacci, C., Riboldi, E., et al. (2010). Detection, semiquantitative enumeration, and antimicrobial susceptibility of Yersinia enterocolitica in pork and chicken meats in Italy. Journal of Food Protection. 73(10): 1785–1792.
10- Bottone, E. J. (2015). Yersinia enterocolitica: Revisitation of an enduring human pathogen. Clinical Microbiology Newsletter. 37(1): 387-405.
11- رحیم زاده، زراسوندی، ع.، 1382، جستجوی یرسینیا انتروکولیتیکا در شیرخام و پاستوریزه در استان چهارمحال و بختیاری ،دانشکده دامپزشکی، پایان نامه برای دریافت درجه دکترای حرفه‌ای دامپزشکی از دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرکرد، ص. 48-8.
12- شریف زاده، ع و اخوان، م.، 1383، جداسازی یرسینیا انتروکولیتیکا و لیستریا مونوسایتوژنز از شیرهای خام پاستوریزه عرضه شده در سطح فروشگاه‌های استان چهارمحال و بختیاری، فصلنامه علوم صنایع غذایی ایران، دوره 1، شماره 1.
13- سالک مقدم، ع.، فروهش، هـ.، انصاری، ج.، 1380، بررسی آلودگی میکروبی در نمونههای پنیر غیر پاستوریزه در مقایسه با پنیرهای پاستوریزه و تأثیر مقادیر مختلف نمک اضافه شده به پنیر بر روی باکتریهای بیماریزای آلوده کننده، مجله دانشگاه علوم پزشکی ایران، سال ششم، شماره 25.
14- سلطان دلان، م.م.، ایزدپور، ف.، خلیفه قلی، م.، خاتمی مقدم، م. و حجازی، س.ح.، 1382، بررسی یرسینیا در گوشتهای ماهی قرمز و مرغ عرضه شده در قصابی‌ها و مرغ فروشی‌های تحت نظارت دانشگاه علوم پزشکی تهران، ص18-10.
15- سلطان دلال، م.، خرمی زاده، م.، متین، ف. 1385، بررسی روشهای تشخیصی یرسینیا انتروکولیتیکا، مجله دانشگاه علوم پزشکی تهران،ص. 10-5.
16- سلطان دلال، م.، اخی، م.ت.، پرتوآذر، ع. 1387، مطالعه یرسینیا انتروکولیتیکا در اسهال‌های حاد کودکان زیر چهارده سال در مرکز طبی اطفال بیمارستان امام خمینی تهران، مجله پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، دوره 30، شماره 4، صفحه 52.-49.
17- فرشچیان، م.، مهدوی، س.، سروش، م.، 1388، بررسی میزان آلودگی گوشتهای قرمز توزیع شده در شهر تبریز به یرسینیا انتروکولیتیکا، مجله دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی، شماره 11، سال چهارم.
18- قیاسیان، م، قندهاری ،ف.، 1388، باکتری شناسی تشخیصی، انتشارات کنکاش، چاپ اول، ص.50-4.
19- کرمانشاهی، ک.، 1381، مکانیسم مولکولی بیماریزایی باکتریها، انتشارات جهاد دانشگاهی، واحد اصفهان، چاپ اول. ص. 50-30.
20- مکفرسون، ج.، گیرمولر، س.، 1390، PCR (واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز)، ترجمه زینی، غ.، میرزایی،ع.، الهیان، ف.، انتشارات آییژ، ص.50-5.
21- ملک زاده، ف.، 1381، میکروب‌شناسی، انتشارات دانشگاه تهران، ص 217 و 325-322.
22- ملنیک و آدلیرک، 2007، میکروبیولوژی پزشکی، ترجمه خزعلی، م. و ضیایی، م.، ویراست بیست و چهارم، انتشارات حیان، جلد اول، ص.361-303.
23- یادمان، ر.، 1375، بررسی میزان آلودگی شیرخام و پاستوریزه به یرسینیا انتروکولیتیکا در منطقه اهواز و حومه، دانشکده دامپزشکی، پایان نامه برای دریافت درجه‌ی دکترای حرفه‌ای دامپزشکی از دانشگاه شهید چمران، پایان نامه دکترای حرفه‌ای، صفحه 90تا50.
24- هاریسون، 1375، اصول طب داخلی هاریسون، ترجمه ابراهیمی، ر. و داداش زاده، چاپ دوم، انتشارات حیان، صفحه 528 تا 534
25-Aulisiso, C.C, Hi11, W.E., Stanfield, J.T., 1983, Evaluation of virulence factor testing and Characteristics of pathogenicity in Yersinia enterocolitica infect, Immun, 40:300-335
.26-Bancerz, A., Szczerba, A., platt – samoraj, A., 2010, Application of multiplex PCR for the evaluation of the occurrence of yestA, yestB, ystC and ymoA genes in Yersinia enterocolitica,1,55:33-37.
27-Bancerz, A., Szczreba, A., platt, A., 2011, Isolation, Biotyping and serotping of Yersinia entercoliica, Bull Vet Inst pulawy.55: 39-43.
28-Bhagat, N., vird:, J.S, 2007, Distribution of virulrnce. Associated in Yersinia enterocolitica biovar 1A correlates with clonal groups and not the source of isolation, FEMS Microbiology letters, 226: 83-183.
29-Biase, A.M., Petrone, G., Conte, M.P., 2000, Infection of human entrocyte-like cells with rotaviruse enhances in vasiveness of Yersinia enterocolitia and Y.pseudotuber culosic, J. Med. Microbial, P. 49: 897-904.
30- Blais, B. W. and Phillippe, L., N., 1995, Compavative analysis of yadA and ail polymerase chain reaction- methods for virulent Yersinia enterocolitica, Food control, 6: 211-214.
31-Bottone, E.J., 1999, Yersina enterocolitica overview and epidemiologic correlates, Microbes infect, 1(4): 323-30.
32-Bottone, E.J., 1997, Yersinia enterocolitica the charismacotinuses clinical microbiolog Reviews, 10: 257-276.
33-Brham, E.P., 1981, The betalactam a antibiotics, Jour. Scientific A merican,.37, (4):76-86
34-Bronfine, D.R, Kroli, L.R., 2003, Yersinia entercolitica fection, 18(1):1-10
35-Capita, R., 2002, Incidence and pathogencity of Yersina Spp. From poultry in spain, food Microbiol, 19: 295-301.
36-Carter, G.R., 1994. Clinical Veterinary Microbiology, Wolfe pub: 234-5.
37-Cheyne, B., Van Dayke, M., An evaluation of methods for the isolation of Yersinia enterocolitica from surface waters in the Grand River watershed, to the university of waterloo in fulfillment of the thesis requirement.
38-Collee, J.G., Duguw, J.P., Fraser, A.G., 1998, Paractical Medical Microbiology, 3th edition, Longman Singapore publisher (LTD), pp. 226-6, 536-7.
39-Cumpansion. C.E,. 2009., Characterization of some Yersina Spp using the AP1 20E system, Medicin Veterinara, Vol 12 (1):275-282
40-Dwight, C., Hirch, M., 1999, Veterinary Microbiology, Black Cell Pup, pp. 28-3, 102-103.
41-Fredksson-Ahoma, M., Korkeala, H., 2003, Low occurrence of pathogenic Yersinia enterocolitica clinical food and environmental samples, climicro Rev : 220-229.
42- Fukushima, H., Shimizu, S. and Inatsu, Y. 2011, Yersinia enterocolitica and Yersina pseudotuberculosis detection in food, Journal of pathogens, Article 10735308, doi: 10. 4061-2011/735308.
43-Havens, J., Monthgomery, M., greecnon, E., 2003, Pathogenic Yersinia.entercolitca DNA is detected in gastrointestional malakplakia, Modern pathology, 14:1200a.
44- Ibraham, A., Rea, M., 1991, isolation of Yersinia enterocolitica and related species from red meat and milk, J. Food.Sci, 56:1524-1526.
.45- Johnson, J., 1998, Isolation and Identification of pathogene Yersinia enterocolitica from meat and pultry products, microbiology laboratory Guid book, 3 Edition.
46-Juliana P. Falcao, Deise P. Falcao, Andre Pitondo-Silva, Ana Carolina Malaspina and Marcelo Brocchi,2006,Molecular typing and virulence markers of Yersinia enterocolitica strains from human, animal and food origins isolated between 1968 and 2000 in Brazil ,Journal of Medical Microbiology, 55, 1539–1548.
47- Kapperud, G., Vardund, T., skyerve, E. Hornes, E., 1993, Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica in foods and water by immunogenettic sepayation, nested polymerase chain reaction, and colorimetric detection of amplified DNA, Appi Environ Microbiol, 59 (9): 2938-2977.
48-Khorramizadeh, solta – Dallal, M., Savifor, F.,2007, Assessment of ail gene marker amplicon for molecular characteri2ation of pathogenic Yersinai enterocolitica in food samples collected in Iran, Iranian. J. publ. Health.:8-15.
49-LambertZ, S.T., Nilsson, C., Hallanoun, S., Lindblad,M.,2008, Real – time PCR method for detection of pathogenic Yersinia enterocolitica in food, Applied and Environmental Microbiology, 74(19):6060-6067
50-Lamps, L.W., Madhusudhan, K.T., Greenson, J.K.,. pierce, R.H., Massol, N.A., 2001, The Role of Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis in granulomatousappendicitis, American. Journal .Surgical .Pathology, 25: 508-515.
51-Lewin. A., Strauch, E., Hertwig., S., Hoffmann, B., Nattrmann, H., Apple, B., 1996, Comparison of plasmid of strains of Yersinia enterocolitica biovar 1A with the virulence plasmid of a pathogenic strain, 285: 52-630.
52-Macdonald, E., Heier, B.T., 2011, Yersinia enterocolitica O:9 infections associated with bagged salad mix in Norway, Ferbrury to April 2011, Euro sarve: 11, 16(19): 19866.
53-Mauro, A., Lagana, P., Brouno, G., Micali, M., 2008, Isolation of Yersinai enterocolitica biotype 1A from raw meat products, J.PREV. VED .HYG, 49: 75-18.
54-Murry, p., 1998, Medical Microbiology. 3 th wishington DC Asempres pub, pp: 240-315.
55-Najdanski, H.,Iteman, I., Carnile, E, 1994, Efficienet subyping of pathogenic Yersinia enterocolitica strains by pulshed – fleid gel electero phoresis, Journal .Clinical. Micro :2913-20.
56-Nesbakken, T., Iversen, T., Lium, ., 2007, Pig herds free from human pathogenic Yersinai enterocolitica, Emery.Infect. Dis, 13 (12): 186-40
57-Niskanen, T., waldnstrom, J., Fredriksson – ahomaa, M., 2003, Vir F positive Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia enterocolitica found in migratory birds in Sweden, Applied and environmental Microbiology, 69: 4670-4675.
58- Okwori, A.E., Agina, S.E., Olabode, A.O., 2005, Feacal carriage of Yesrina species in pigs sheep and poultry on display for sale in Vom and Bukuru aresas of jos south local Government Area (LGA). Plateau stat, J.Microbiol:387-230.
59- Ostroff, S.,1995,Yersiniaas an emerging infection Epidemiologic aspects of yersiniosis,Microbiol.Immunol,13:5-10.
60-Pham, J.N. Bell, S.M. Martin, L., Camiel, E., 2000, The beta – lactamases and beta-lactam antibiotic susceptibility of Yesinia enterocolitica, Antimicrob Chemother, 46(6): 951-1.
61-Quinn, P., Carter, M., Markey, B., Catrert, S., 1994, Clinical veterinary Microbiology wolf, pp. 234-236.
62-Robert, F., Hore, G., 1991, Basic medical microbiology 4th edition, Robert F. Body and Brayan G. Hoert pub, pp. 493-7.
63-Sabina, Y., Rahman, A., Chandra, R., Montet, D., 2011, Yersinia enterocolitica: mode of Transmission, Molecular insights of virulence, and pathogensis of Infection, Journal of pathogens, ID 429069, dio: 10. 4061/2011/4290069.
64-Salmah, A.A. and Makki, S., 1991, Insidence of Yersinai enterocolitica in some food environmental samples in Saudi Arabic, J .king. Saud. Univ, 3(2): 91-100
65-Sedgwick, A., Tilt, N.C., 1970, biochemical and serological charactenstics of a Yersinia enterocolitica isolate, Appled Microbiology: 383-384.
66-Sharifi, M., Soltan-Dellal, 2011, incidence and antibiotins suseptibilites of Yersinia enterocolitica and other Yersinia Species recovers from meat and chiken in Tehran, Iran, African Journal of Microbiology Research 5(18): 2649-2653.
67-Simonova., J. Valzerova, M., Stenhauserova, I., 2007, Detection of pathogenic Yersinai enterocolitica serotype O:3 by biochemical, serological, and PCR methods, Czech J food SCi, 25: 214-220.
68-Sirkem, B., 2002, The presence of Yersinia enterocolitica and other Yersina species in ground beef in Aydil Turkey.Turk.J vet.Anim sci.28:489-495
69-Soltan-Dallal, M., Chita2, M., 1996., Prevalence of Yersinai enterocolitica in peariatric dysentery, Facalty .Mesi. J, 1996:1: 4246.
70-Stock, I., Wiedemann, B., 1999, An invitrostudy of the antimicrobial susceptibilities of Yersinai enterocolitica and definition of a database, The journal of antimicrobial Chemotherapy, 43: 37-45.
71-Thisted lambertz, S., Danielsson – Them, N., 2005, Idenrification and characterization of pathogenic Yersinia enterocolitica isolates by PCR , Applies and Environmental Microbiology, 71: 3674-3681.
72-Thoemer, P., Kingombe, C., Eissig-Choisa, B., 2003, PCR Detection of virulence genes in Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberclosis and investingation of virulence gene distribution, applied and Enviromental Microbiology, 69: 1810-1816.
73-Velin, D., 1984, Enterotoxin production by Yersinia enterocolitica in food samples, Acta Microbiol Hung, 31(1): 43-8.
74-Vidon, D., Delmas. , C., 1981. Incidence of Yersinia enterocolitica in raw milk in eastern france, Appl. Environ. Microbial, 1981: 41(2): 355-9.
75-Warren, S.M., Young, G.X., 2005,An amino ytermila secretion signal is requires for YPLA export by the Yas, YSC, and flagellar type III secrection systems of Yersinai enterocolitica biovar 1B, J.Bacteriol, 187 (17): 6075-83.
76-Wannet, W.J., Ressinj, M., 2001, Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica by a rapid and sensitive duplex PCR assay, Journal of Clinical Microbiology, 39(2): 4483-7786.
77-Wauters, G., kansol, K., and Janssens, M., 1987. Revised biogroply scheme of Yersinia enterocolitica , contrib. Microbiol. Immunol, 9: 14-21.
78-Weunats, V., Jadot. V., Denoel, P.A, Tibor., A., Letesson, J.J., 1996, Detection of Yersinia enterocolitica sergoup O: 3 by a PCR methos, J. Clin. Microbial, 1996 34(5): 1224-7.
79-Yerma, N.k. and Misra, 1984, Characterization of enterotoxin produced by four Yersinia enterocolitica strains of pig origin, Mesival Microbiology, 50(4), Dol: 10. 1007/BF00399650.
80-Zheng, H., Sun, Y., 2008, Investigation of virulence gence in slinical isolates of Yersinia enterocolitica, Medical Microbiology 53: 368-374.
81- رحیم زاده، زراسوندی، ع.، 1382، جستجوی یرسینیا انتروکولیتیکا در شیرخام و پاستوریزه در استان چهارمحال و بختیاری ،دانشکده دامپزشکی، پایان نامه برای دریافت درجه دکترای حرفه‌ای دامپزشکی از دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرکرد، ص. 48-8.
82- Sharifi Yazdi, M. and Soltan-Dellal. (2011). Incidence and antibiotins suseptibilites of Yersinia enterocolitica and other Yersinia Species recovers from meat and chiken in Tehran, Iran, African Journal of Microbiology Research. 5(18): 2649-2653.
83- Thoemer, P., Kingombe, C., Eissig-Choisa, B. (2003). PCR Detection of virulence genes in Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberclosis and investingation of virulence gene distribution, applied and Enviromental Microbiology. 69: 1810-1816.
84- Thisted lambertz, S., Danielsson – Them, N. (2005). Idenrification and characterization of pathogenic Yersinia enterocolitica isolates by PCR. Applies and Environmental Microbiology. 71: 3674-3681.
85- Zexun L, Xiumin S, Jin Ch, Mingqian Qa, Huanjing Sh, Qian Zh, Jinlei Zh, Jun Y, Shenghui C, Fengqin L, Chengqian F, Zixin P, Baowei Y. (2022). Prevalence, bio-serotype, antibiotic susceptibility and genotype of Yersinia enterocolitica and other Yersinia species isolated from retail and processed meats in Shaanxi Province, China. Food Science and Technology. 168 ;113962
85- Piotr Ł., Klaudia K.K., Agata BK. 2023. Isolation, characterization and antimicrobial resistance of Yersinia enterocolitica from Polish cattle and their carcasses. BMC Veterinary Research. 19:143-152.
86- Thisted Lambert S, Danielsson-Tham ML. Identification and characterization of pathogenic Yersinia enterocolitica isolates by PCR and pulsed-field gel electrophoresis.
Applied and Environmental Microbiology. 2005: 71(7): 3674-3681
87- Sirkem, B., 2002, The presence of Yersinia enterocolitica and other Yersina species in ground beef in Aydil Turkey.Turk.J vet.Anim sci.28:489-495.
88- Naves P., Del Prado G., Huelves L., Gracia M., Ruiz V., Blanco J. Soriano F. (2008). Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method‐dependent. Journal of Applied Microbiology. 105 (2); 585-590.
رهیاف های نوین در علوم سلولی و مولکولی JNACMS دوره 2 شماره 3 پاییز 1403 Journal homepage: https://sanad.iau.ir/journal/nacms |
|
ارتباط بین تولید بیوفیلم و فاکتورهای حدت در سویه های یرسینیا انتروکولیتیکا
جدا شده از گوشت قرمز در شهرستان شهرکرد
نجمه مولوی*1، منوچهر مومنی شهرکی 2، حسین خدابنده ی شهرکی 1
1. گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران
2. گروه بهداشت و کنترل کیفی مواد غذایی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرکرد، شهرکرد، ایران.
اطلاعات مقاله |
| چکیده |
تاریخچه مقاله: دریافت:1/11/1403 پذیرش:22/11/1403 چاپ:23/11/1403 DOI: |
| یرسینیا انتروکولیتیکا یک باکتری گرم منفی میباشد که متعلق به خانواده انتروباکتریاسه است. این باکتری یک باکتری پاتوژن غذایی است که به طور عمده توسط گوشت، شیر و آب آلوده منتقل میشود. گوشت قرمز به شکل غیر بهداشتی از منابع عمده انتقال عفونت به یرسینیا انتروکولیتیکا به انسان میباشد. تحقیق حاضر با هدف بررسی فراوانی ژنهای حدت و ارتباط بین تولید بیوفیلم و فاکتورهای حدت در ایزوله های یرسینیا انتروکولیتیکا جدا شده از گوشت قرمز عرضه شده به بازار شهرکرد انجام شد. تعداد 384 نمونه از گوشت قرمز به شکل تصادفی از فروشگاه های عرضه گوشت در شهرستان شهرکرد اخذ و به منظور شناسایی یرسینیا انتروکولیتیکا به روشهای بیوشیمیایی و مولکولی بررسی شدند. سویه‌های میکروبی جدا شده به منظور بررسی توانایی تولید بیوفیلم به روش میکروتیتر پلیت بررسی شدند و ژنهای حدت با آزمون PCR مورد بررسی قرار گرفتند. از مجموع 384 نمونه گوشت قرمز از در 65 نمونه (92/16 درصد) یرسینیا انتروکولیتیکا جداسازی شد. آلودگی در گوشت گاو (69/27 درصد)، در گوشت گوسفند (84/33 درصد) و در گوشت گوساله (64/38 درصد) گزارش گردید. 35 ایزوله (85/53 درصد) واکنش بیوفیلم قوی، 20 ایزوله (77/30 درصد) واکنش بیوفیلم متوسط و 10 ایزوله (38/15 درصد) واکنش بیوفیلم ضعیف را نشان دادند. فراوانی ژنهای inv،ail، A yadA, yst و vir F به ترتیب: 83 درصد، 53/41 درصد، 43 درصد، 84/33 درصد و 23/29 درصد گزارش شد. در تجزیه و تحلیل آماری با آزمون مربع کای بین ژنهای حدت و واکنش بیوفیلم قوی مشاهده گردید. با توجه به اهمیت گوشت قرمز در انتقال یرسینیا انتروکولیتیکا به انسان رعایت اصول بهداشتی و عدم مصرف گوشت آلوده، به کارگیری آزمون PCR به منظور شناسایی دقیق آلودگی در مواد غذایی توصیه میشود. |
کلمات کلیدی: ژنهای حدت، گوشت قرمز، یرسینیا انتروکولیتیکا |
| |
* نویسنده مسئول: Email Molavinajmeh15@gmail.com
|
مقدمه
جنس یرسینیا در خانواده انتروباکتریاسه طبقه بندی شده است. باکتریهای این جنس بی‌هوازی اختیاری میله ای شکل و گرم منفی هستند و ممکن است متحرک یا غیر متحرک باشند. در این جنس 11 گونه و 5 بیوواریته تشخیص داده شده است. گونه یرسینیا انتروکولیتیکا از بیشترین اهمیت در مواد غذایی بر خوردار است. این باکتری سومین عامل ایجاد کننده اسهال بعد از سالمونلا و کمپیلو باکتر در انسان میباشد. این ارگانیسم در دمای کمتر از 25 درجه سانتیگراد متحرک و در دمای 37 درجه سانتیگراد غیر متحرک می باشد. این ارگانیسم یکی از باکتریهای بیماری زای سرمادوست میباشد. رشد یرسینیاها در دامنه حرارتی 2 تا 45 درجه سانتیگراد مشاهده شده است و درجه حرارت اپتیمم رشد آنها بین 42 تا 49 درجه سانتیگراد میباشد.. رشد این باکتریها در شیر دردمای 2-0 درجه سانتیگراد پس از 20 روز و همچنین در گوشت خوک و جوجه در دمای 1-0 درجه سانتیگراد مشاهده گردیده است. یرسینیا انتروکولیتیکا پس از 3-1 دقیقه در دمای 60 درجه سانتیگراد از بین میرود. این ارگانیسم در مقابل انجماد نسبتا مقاوم است. سویه یرسینیا انتروکولیتیکا در دمای 8/62 درجه سانتیگراد در شیر به مدت 17-1 ثانیه مقاومت می نمایند. این گونه بهطور گسترده ای درخاک، دریاچه های اب شیرین، چاه و رودخانه ها وجود دارد.. این باکتری در دمای 25 درجه سانتیگراد یک انتروتوکسین پایدار در مقابل حرارت تولید میکند. که در دمای 100 درجه سانتیگراد را به مدت 10 دقیقه تحمل میکند (1). در سال 1894 الکساندر یرسین باکتری شناس فرانسوی، این باکتری را در یک بیماری همه گیر شده در هنگ کنگ جدا نمود و به احترام پاستور آن را پاستورلا پستیس نامید. هم زمان با این کشف، دانشمند ژاپنی کیتازاتو نیز به این باکتری دست یافت ولی یرسین قبل از او به انتشار کشف خود دست زد و این افتخار را نصیب خود کرد (2). بعدها به علت داشتن خواص بیوشیمیایی مشترک مانند تخمیر قند گلوکز، نیترات مثبت بودن، متحرک بودن، تحمل املاح صفراوی و شباهت ژنتیکی با خانوادهی انتروباکتریاسه این جنس در خانوادهی انتروباکتریاسه طبقه بندی شد. یرسینیاها باکتریهای کاتالاز مثبت، اکسیداز منفی، هوازی و بی‌هوازی اختیاری میلهای گرم منفی، هستند. بنابراین طبقه‌بندی آنها در خانواده انتروباکتریاسه تائید میگردد. در ابتدا این باکتری را باکتریوم انتروکولیتیکوم نامیدند. علت انتخاب نام انتروکولیتیکا به این دلیل است که اینگونه در رابطه با روده و کولون میباشد (2). یرسینیا انتروکولیتیکا از جوندگان و حیواناتی مانند گاو، گوسفند، خوک، سگ و گربه و آبهای آلوده توسط آنها، به دست آمده است. این باکتری احتمالاً از طریق خوردن غذا، آب و تماس با وسایل آلوده به انسان منتقل میشود. ارتباط بیماری در نتیجه خوردن غذای آلوده به یرسینیا انتروکولیتیکا کاملاً مشخص شده است. تمام مواد غذایی نگهداری شده در محل سرد (یخچال)، در محل تولید یا در منزل امکان ایجاد بیماری را دارا میباشد (4). یرسینیا انتروکولیتیکا از گوشت خوک، گاو، مرغ، ماهی، صدف و هم چنین سبزیجات (از جمله کاهو، اسفناج، شاهی و کاسنی) جدا شده است. یرسینیا انتروکولیتیکا در ارتباط با گوشت خوک میباشد. سروتیپ o:3 در خوک معمول میباشد (8-5).
فاکتورهای بیماریزای یرسینیا پروتئینهایی هستند که موجب اتصال و داخل شدن این باکتری به سلولهای اپیتلیال میشوند. یرسینیا انتروکولیتیکا پروتئین 108 کیلو دالتونی را بیان میکند که موجب میشود یرسینیا انتروکولیتیکا توانایی تهاجم به سلولهای میزبان را داشته باشد (2). این پروتئین در دمای 28 درجه سانتیگراد به تعداد زیاد بیان میشود و احتمالا مهمترین فاکتور تهاجم به پلاک های پیر میباشد. این باکتری هم چنین پروتئینهای 15 کیلو دالتونی را بیان میکند. که به باکتری اجازه ورود به سلولهای میزبان را میدهد. پروتئینهای تولید شده توسط این باکتری از جنس فیبریل هستند که توسط پلاسمید کد میشوند و با اتصال به فیبرونکتین وکلاژن به یرسینیا انتروکولیتیکا امکان تهاجم به اپیتلیوم روده را میدهد. این باکتری از مواد غذایی مانند: شیر، سبزیجات، گوشتهای بسته بندی شده در خلاء و فراوردهای دریایی جدا شده است. در نمونههای ترشحات عفونی (رنگآمیزی به روش وایسون) این باکتری بیماریزا به صورت باکتری دو قطبی به رنگ آبی پررنگ و مرکز آن به رنگ آبی روشن دیده میشود که نمایی شبیه سنجاق قفلی دارد. مهمترین انواع بیماریزای این باکتری شامل: پرسینیا پستیس، پرسینیا پسود و توبرکلوریس و پرسینیاانترکولیتیکا میباشد (4).
اولین مرحله عفونت یرسینیا انتروکولیتیکا در روده کوچک اتصال به سلولهای M پلاکهای پیر است. دراین مرحله چندین ژن حائز اهمیت میباشند. یکی از آنها ژنی به نام inv میباشد که پروتئین سطحی به نام Invasion را کد میکند. علت نامگذاری این ژن این است که که سلولهای تولید کننده Invasion میتوانند به سلولهای کشت بافت متصل شده و آن را مورد تهاجم قرار دهند. هم چنین بررسیهای اتصال و تهاجم به سلولهای کشت بافت به وسیلهی لوکوس دیگری به نام ail (لوکوس اتصال و تهاجم) شناسایی شده است. ژن inv به طور ترجیحی در 20 درجه سانتی گراد بیان می گردد. اما در 37 درجه سانتی گراد بیان نمیشود. نقش اصلی این پروتئین محافظت باکتری در برابر کشته شدن توسط کمپلمان است. اثبات شده که ژن yadA (چسبنده A یرسینیا) مهمترین شاخص بیماریزایی یرسینیا انتروکولیتیکا در مرحله اولیه عفونت ریه میباشد. فعالیتهای yadA به شرح زیر است (10-8).
بیماریهای منتقله از راه غذا یکی از مشکلات بسیار مهم در کشورهای توسعه یافته و در حال توسعه میباشند. از آنجا که در شهرستان شهرکرد تا کنون تحقیقی در زمینه جداسازی سویه های یرسینیا انتروکولیتیکا از گوشت قرمز، تعیین فراوانی فاکتورهای حدت این سویه ها و ارتباط بین تولید بیوفیلم و فاکتورهای حدت صورت نگرفته است در این تحقیق بر آن شدیم تا میزان آلودگی به این باکتری را برآورد کنیم و ضمن تعیین میزان شیوع سروتیپ O3 فاکتورهای حدت و ارتباط بین تولید بیوفیلم و فاکتورهای حدت را در این سویه ها بررسی شد.
روش کار
جداسازی باکتری از گوشت
در اين تحقيق به منظور جستجوي یرسینیا انتروکولیتیکا درگوشت قرمزعرضه شده در سطح شهرستان به روش خوشه ای- تصادفی شهرستان شهرکرد نمونه گیری صورت گرفت. نمونه ها شامل 384 نمونه ی گوشت کاو، گوسفند و یز میباشد که در شرایط استریل و در مجاورت یخ به آزمایشگاه میکروب شناسی مواد غذایی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد منتقل گردید..
جهت تشخیص میکروبی یرسینیا انتروکولیتیکا از گوشت قرمز، 25 گرم نمونه گوشت، با تیغ بیستوری در شرایط کاملا استریل به لایه های بسیار نازک بریده شد و سپس به 225 سی سی فسفات بافر سالین با 2/7=pH اضافه و به مدت دو هفته در دمای یخچال سرماگذاری شد. روز چهاردهم یک سی سی از سوسپانسیون غنی شده با 9 سی سی پتاس 25% با یک همزن برقی به مدت 30 ثانیه کاملا مخلوط گردید و سپس یک لوپ از این مخلوط بر روی محيط کشت انتخابي- افتراقی Novobiocin) CINagar (cefsulodin-Irgasan کشت داده و به مدت 48 ساعت در دمای 25 درجه انکوبه شد. پس از انجام رنگ آمیزی گرم روی کلنیهای مشکوک و مشاهده باسیلهای کوچک گرم منفی در آنها، آزمایشهای افتراقی جهت تعیین بیوتیپ O:3 یرسینیا انتروکولیتیکا صورت گرفت. در محیط CIN agar کلنی باکتریهای یرسینیا به رنگ قرمز پر رنگ و به قطر 4-2 میلی متر مشاهده میگردند (11).
بررسی تولید بیوفیلم به روش میکروتیتر پلیت
بهمنظور بررسی تولید بیوفیلم توسط باکتری از روش میکروتیتر پلیت 96 خانهای استفاده شد. باکتریهایی که توانایی اتصال به سطوح را داشته باشند در انتها باقی مانده و به رنگ بنفش دیده میشوند و باکتریهایی که توانایی اتصال به سطوح را نداشته باشند، از سطح حذف میشوند. جذب نوری چاهکهای رنگ شده با کریستال ویوله در 620 نانومتر توسط دستگاه الیزا ریدر خوانده شد. ایزوله‌هایی که OD مساوی یا بالاتر از 3/0 داشته باشند به عنوان بیوفیلم قوی، در صورتیکه OD بین 2/0 تا 299/0 داشته باشند بهعنوان بیوفیلم متوسط، درصورتیکه OD بین 1/0 تا 199/0 دارا باشند به عنوان بیوفیلم ضعیف و در صورتیکه OD کمتر از 1/0 داشته باشند بیوفیلم منفی نظر گرفته میشوند (12)
آزمایش PCR جهت تشخیص قطعی یرسینیا انتروکولیتیکا
جهت تشخیص قطعی یرسینیا انتروکولیتیکا بر روی تمامی نمونه هایی که از نظر کشت مثبت تشخیص داده میشوند، در حضور زوج پرایمر های طراحی شده زیر واکنش PCR انجام میشود. مشاهده باند 361 جفت بازی نشان دهنده مثبت بودن این تست میباشد (13)
Y.ent: ACCTTTGTGATTGACGTTACTCGC
Y.ent: CAAGTCGACATCGTTTACAGCG
آزمایش PCR جهت تعیین سروتیپ O:3 یرسینیا انتروکولیتیکا
آزمایش PCR جهت تشخیص سروتیپ O:3 یرسینیا انتروکولیتیکا با استفاده از زوج پرایمرهای Yer-F و Yer-R انجام شد (14).
جدول (1): توالی پرایمرهای مورد استفاده جهت سروتیپ O:3 یرسینیا انتروکولیتیکا
اندازه ی محصول جفت باز | توالی پرایمر | ژن |
405 | Yer O3-F:CGCATCTGGGACACTAATTCG Yer O3-R:ACGAATTCCATCAAAACCACC | rfbC |
آزمایش PCR جهت ردیابی حضور ژنهای حدت در سویه های یرسینیا انتروکولیتیکا
به منظور ردیابی حضور ژنهای حدت در سویه های یرسینیا انتروکولیتیکا جدا شده از نمونه های گوشت قرمز، آزمایش PCR با استفاده از زوج پرایمرهای نشان داده شده در جدول انجام میشود..
جدول (2): توالی پرایمرهای مورد استفاده جهت ردیابی ژنهای حدت در سویه های یرسینیا انتروکولیتیکا
اندازه ی محصول جفت باز |
| پرایمر | ژن |
570 | CTGTGGGGAGAGTGGGGAAGTTTGG GAACTGCTTGAATCCCTGAAAACCG | Yc1 Yc2 | inv |
170 | ACTCGATGATAACTGGGGAG CCCCCAGTAATCCATAAAGG | Ail1 Ail2 | ail |
145 | AATGCTGTCTTCATTTGGAGCA ATCCCAATCACTATGACTTC | Pr2a Pr2c | ystA |
590 | TCATGGCAGAACAGCAGTCAG ACTCATCTTACCATTAAGAAG | Virf1 Virf2 | virf |
849 | CTTCAGATACTGGTGTGCGCTGT ATGCCTGACTAGGAGCGATATCC | yadA1 yadA2 | yadA |
یافته ها
در تحقیق حاضر با استفاده از روشهای میکروبیولوژی و تستهای بیوشیمیایی از مجموع 384 نمونه گوشت قرمز از در 65 نمونه (92/16 درصد) یرسینیا انتروکولیتیکا جداسازی شد. در محیط CIN agar کلنی باکتری یرسینیا انتروکولیتیکا به رنگ قرمز پر رنگ و به قطر 4-2 میلی متر مشاهده گردید. آلودگی به یرسینیا انتروکولیتیکا در گوشت گاو (69/27 درصد)، در گوشت گوسفند (84/33 درصد) و در گوشت گوساله (64/38 درصد) گزارش گردید. که در تجزیه و تحلیل آماری با آزمون مربع کای بین نوع گوشت و آلودگی با یرسینیا انتروکولیتیکا ارتباط آماری معنی داری مشاهده نگردید.
جدول (3): فراوانی یرسینیا انتروکولیتیکا در نمونه های گوشت قرمز
نوع نمونه | تعداد نمونه اخذ شده | تعداد موارد مثبت | درصد |
گوشت گاو | 128 | 18 | 69/27 |
گوشت گوسفند | 128 | 22 | 84/33 |
گوشت گوساله | 128 | 25 | 64/38 |
مجموع | 384 | 65 | 92/16 |
تایید ایزوله ها با روش PCR
در آزمون PCR تمامی نمونه های مثبت شده در کشت در حضور پرایمر اختصاصی طراحی شده مورد بررسی قرار گرفتند که در تمامی موارد باند 372 جفت بازی مشاهده گردید. سروتیپ O:3 در 30 ایزوله (15/46 درصد) از نمونه ها با داشتن باند 405 جفت بازی مثبت گزارشدند.
نتایج مربوط به آزمایش تشکیل بیوفیلم با روش میکروتیترپلیت
روش میکروتیتر پلیت بهمنظور بررسی تشکیل بیوفیلم 65 ایزوله یرسینیا انتروکولیتیکا جدا شده از نمونه های گوشت قرمز استفاده شد، که براساس OD در سه گروه قوی، متوسط و ضعیف طبقه‌بندی شدند. 35 ایزوله (85/53 درصد) واکنش بیوفیلم قوی، 20 ایزوله (77/30 درصد) واکنش بیوفیلم متوسط و 10 ایزوله (38/15 درصد) واکنش بیوفیلم ضعیف را نشان دادند. واکنش بیوفیلم منفی در هیچ‌کدام از ایزولهها مشاهده نگردید.
نمودار (1): نتایج مربوط به آزمایش بیوفیلم با روش میکروتیترپلیت
ردیابی ژنهای حدت
بیشترین فراوانی مربوط به ژن inv (83 درصد) و کمترین فراوانی مربوط به ژن virF (23/29 درصد) بود. نتایج در جدول (4) نشان داده شده است.
جدول (4) فراوانی ژنهای حدت در ایزوله های یرسینیا انتروکولیتیکا
ژن | inv | ail | ystA | yadA | virF |
تعداد | 54 | 27 | 28 | 22 | 19 |
درصد | 83 | 53/41 | 43 | 84/33 | 23/29 |
فراوانی ژنهای inv،ail، A yadA, yst و vir F و در ایزوله هایی که بیوفیلم قوی تولید میکردند به ترتیب: 25/59 درصد، 77/77 درصد، 14/82 درصد، 5/87 درصد و 94/87 درصد گزارش گردید و در ایزوله هایی که بیوفیلم متوسط تولید میکردند به ترتیب: 62/29 درصد، 51/18 درصد، 14/28 درصد، 37/9 درصد و 05/21 درصد گزارش گردید. همچنین در ایزوله هایی که بیوفیلم ضعیف تولید میکردند به ترتیب: 25/9 درصد، 70/3 درصد، 57/3 درصد، 12/3 درصد و 26/5 درصد گزارش گردید.
جدول (5): فراوانی ژنهای حدت در ایزوله های یرسینیا انتروکولیتیکا بر اساس واکنش بیوفیلم
ژنهای ویرولانس |
واکنش بیوفیلم |
| |||
|
| ||||
قوی
| متوسط
| ضعیف
| |||
Inv | 32 | 16 | 5 | ||
25/59
| 62/29 | 25/9 | |||
Ail
| 21 | 5 | 1 | ||
77/77 | 51/18 | 70/3 | |||
ystA
| 23 | 4 | 1 | ||
14/82 | 28/14 | 57/3 | |||
yadA
| 28 | 3 | 1 | ||
5/87 | 37/9 | 12/3 | |||
virF
| 15 | 4 | 1 | ||
94/87 | 05/21 | 26/5 | |||
براساس آزمون کای دو بین واکنش بیوفیلم قوی و ژنهای A inv, ail, virF, yst و yadA رابطه آماری معنادار آماری گزارش گردید (p-value<0.05)
بحث
ميكروبها تغييرات مطلوب و نامطلوب در مواد غذايي پديد مي آورند. تغييرات نامطلوب سبب آلودگي مواد غذايي و در نهايت فساد مواد غذايي ميگردد. فساد عبارت است از هر نوع تغيير در طعم، بو، بافت يا ظاهر ماده غذايي كه آن را نامطبوع و بدمزه ميكند. فساد مواد غذايي مسئله اكولوژيك است. بسياري از مواد غذايي تحت شرايطي که آلودگي با انواع ميكروبها را فراهم ميسازد تهيه يا توليد ميشود و رشد انواع ميكروبها به تركيب مادة غذايي و شرايط انبار كردن بستگي دارد. ميكروبهايي كه قادر به رشد هستند ويژگيهاي متابوليكي غذا را تغيير داده و طعم، بو، بافت و ظاهر فرآورده را دگرگون ميسازند. فرآورده هاي حيواني داراي ميكروبهاي دروني بوده و همچنين توسط محيط و انسان آلودگي پيدا ميكنند. هرگاه حيوان به طرز بهداشتي ذبح گردد بخش دروني گوشت آن عاري از ميكروب است. سطح بدن حيوان كه در معرض هوا قرار ميگيرد به وسيله ی ميكروبهاي پوست و روده، وسايل كشتن و هواي كشتارگاه آلوده ميگردد. گوشت ماهي و مرغ نيز با انواع ميكروبها پوشيده شده به خصوص هنگاميكه آن را تميز كرده و بر روي تخته آلوده خرد مي كنند آلودگي آن افزايش پیدا میکند. ميكروبهاي مختلفي درون گوشت قادر به رشد هستند یک دسته ازاین باكتريها يرسينيا انتروكوليتيكا ميباشد (4). یرسینیا انتروکولیتیکا یک پاتوژن گرم منفی رایج منتقله از طریق مواد غذایی که در آب، فرآورده های لبنی و گوشت یافت میگردد. این پاتوژن یکی از رایجترین عوامل التهاب دستگاه گوارش ناشی از مواد غذایی در غرب و اروپای شمالی است و دارای بروز فزاینده ای در ایالات متحده و کانادا است. شیوع بیماریهای منتقله از مواد غذایی توسط یرسینیا انتروکولیتیکا تقریباً با تمام سروتیپهای بیماریزا همراه است. سروتیپ O:8 خاصیت ذاتی عفونی فاجعه باری برای انسان به همراه دارد در حالیکه سروتیپهای O:3, O:9 مرتبط با موارد خفیفتر هستند (3-1).
مطالعه ی حاضر برآوردی از شیوع یرسینیا انتروکولیتیکا در گوشت قرمز، شناسایی سویه های تولید کننده ی بیوفیلم و بررسی حضور ژنهای حدت این باکتری و ارتباط بین توانایی تولید بیوفیلم و فاکتورهای حدت در این باکتری بود. با توجه به اين كه مسئله بهداشت غذايي از اهميت ويژه اي برخوردار است مشابه چنين تحقيقي در كشورهاي مختلف و همچنين در ايران صورت گرفته است و محققين توانسته اند باكتريهاي مختلفي كه از طريق مواد غذايي انتقال مي یابند همانند يرسينيا، سالمونلا و کمپيلو باكترژژوني را از مواد غذايي جدا نمايند (8).
یافته‌های دیگر محققان حاکی از آن است که یرسینیا انتروکولیتیکا شایعترین گونه ی یرسینیا در گوشت قرمز و مرغ است. سویه های پاتوژن یرسینیا حامل پلاسمید 70 کیلو جفت بازی هستند که pYV نامیده میشود. و باعث کد شدن ژنهای virF, yadA, tccC, ysa میگردد. یا این که با دارا بودن ژنهای کروموزومی inv, ail, yst بیماریزایی خود را اعمال میکنند (14).
بعضی از سویه های پاتوژن فاقد پلاسمید ویرولانس میباشند، این دسته از باکتریها با دارا بودن ژن ystA باعث کد شدن انتروتوکسین مقاوم به حرارت میگردند. درکشتهای سلولی مشخص گردیده که این ژن در تهاجم باکتری به سلولهای پستانداران نقش دارد. از طرف دیگر محققین نشان داده ند که علت اسهال در عفونتهای ناشی از یرسینیا انتروکولیتیکا وجود ژن yst می باشد (9)
در این تحقیق و تحقیقات مشابه ژنهای ail، yst و inv که ژنهای کروموزومی هستند و در تمامی سویه های پاتوژن یرسینیا انتروکولیتیکا وجود دارند مورد بررسی قرار گرفتند. این نکته شایان ذکر است که ژنهای virF و yadA از جمله ژنهای پلاسمیدی یرسینیا انتروکولیتیکا میباشند. مشخص گردیده ژن virF نقش تنظیمی در پلاسمید ویرولانس دارد اگرچه ممکن است این پلاسمید در اثر کشتهای مکرر از بین برود. بیان ژن yadA در باکتری یرسینیا انتروکولیتیکا توانایی اتصال باکتری به سطوح سلول میزبان را افزایش میدهد از طرف دیگر به باکتری این امکان را میدهد که از دسترس سیستم کمپلمان و سایر اجزای سیستم ایمنی فرار کند (13). با توجه به اهمیت این ژنها در ویرولانس باکتری در این تحقیق بر آن شدیم تا به فراوانی این ژنها بپردازیم.
همانگونه که در قسمت نتایج بیان گردید، از مجموع 384 نمونه گوشت قرمز از در 65 نمونه (92/16 درصد) یرسینیا انتروکولیتیکا جداسازی شد. آلودگی به یرسینیا انتروکولیتیکا در گوشت گاو (69/27 درصد)، در گوشت گوسفند (84/33 درصد) و در گوشت گوساله (64/38 درصد) گزارش گردید. که در تجزیه و تحلیل آماری با آزمون مربع کای بین نوع گوشت و آلودگی با یرسینیا انتروکولیتیکا ارتباط آماری معنی داری مشاهده نگردید. وجود لایه ی لزج و چسبناک سطحی به صورت کپسول در سطح سلول باکتری باعث مقاوم شدن باکتری به فاگوسیتوز میگردد. وجود پلی ساکارید خارج سلولی توسط باکتری باعث تشکیل بیوفیلم میگردد. این ساختار در ایجاد عفونتهای ناشی از باکتریها بسیار مؤثر است. بیوفیلم نه تنها میکروارگانیسمهای تشکیل دهنده آن را از تیمار بهداشتی محافظت میکند بلکه محلی برای مبادله مواد ژنتیکی است. اصولا باکتریها وقتی تشکیل بیوفیلم میدهند مقاومت آنها نسبت به شرایط نامساعد محیطی و بیوسایدها زیاد میشود و از طرف دیگر در بیوفیلم مواد را نگهداری و تغلیظ میکنند و از مواد متابولیکی یکدیگر مصرف مِیکنند. در یک بیوفیلم ممکن است جذب مواد آلی و تغذیه کمتر از زمانی باشد که باکتریها آزاد هستند ولی پایداری ژنتیکی در آنها بیشتر است و پلاسمیدها در بیوفیلم پایدارتر میباشند. بیوفیلم باکتری را در برابر آنتیبیوتیکها، آنتی بادیها و سلولهای فاگوسیتوز مقاوم میکند. بیوفیلم باکتریایی، جامعه ای از باکتریهای چسبنده و رشد کننده بر سطوح جاندار یا بی جان محصور در یک ماتریکس پلی ساکاریدی میباشد. در طبیعت میکروارگانیسمها اغلب در ارتباط نزدیکی با سطوح جامد رشد میکنند که این سطوح ممکن است بافتهای نرم زنده و یا سطوح غیر زنده، مواد غوطه ور و یا ذرات خاک باشد. ارتباط و پیوستگی با سطوح جامد منجر به تشکیل بیوفیلم میکروبی میگردد. تشکیل بیوفیلم منافع زیادی برای ارگانیسم متشکله دارد از جمله حفاظت آنها در برابر سیستم ایمنی میزبان، مقاومت در برابر آنتیبیوتیکها و ضد عفونی کننده ها، حفظ و نگهداری محیط فیزیکی شیمیایی مناسب برای رشد و بقاء میکروارگانیسم، بنابراین آنها قادرند در شرایط نامساعد محیطی مقاومت کرده و به حیات خود ادامه دهند. تصور میشود که تشکیل بیوفیلم منافع زیادی برای ارگانیسمهای متشکله دارد از جمله حفاظت آنها در برابر سیستم ایمنی میزبان، مقاومت در برابر آنتیبیوتیکها همچنین حفظ و نگهداری محیط فیزیکوشیمیایی مناسب برای رشد و بقا، بنابراین آنها قادرند در شرایط نامساعد محیطی مقاومت کرده و به حیات خود ادامه دهند. با توجه به مقاومت آنتی بیوتیکی بیوفیلم باکتریها نسسبت به حالت پلانکتونیک، این مسئله اهمیت بررسی و تشخیص بیوفیلم در عفونت ایجاد شده و لحاظ این مسئله را در درمان نشان میدهد (12).
در این تحقیق در روش میکروتیتر پلیت از 65 ایزوله یرسینیا انتروکولیتیکا جدا شده از نمونه های گوشت قرمز استفاده واکنش بیوفیلم قوی در 35 ایزوله (85/53 درصد)، واکنش بیوفیلم متوسط در 20 ایزوله (77/30 درصد) و واکنش بیوفیلم ضعیف در 10 ایزوله (38/15 درصد) واکنش بیوفیلم مشاهده گردید. فراوانی ژنهای inv،ail، A yadA, yst و vir F و در ایزوله هایی که بیوفیلم قوی تولید میکردند نسبت به ایزوله هایی که بیوفیلم متوسط و ضعیف تولید میکردند بیشتر گزارش شد.
Thoerner و همکاران درسال 2003 در مطالعه ایی که بر روی 140 سویه یرسینیا انتروکولیتیکای جدا شده از منابع مختلف انجام دادند، نشان دادند، بیوتیپهای 1B, 2, 3, 4 مربوط به انواع بیماریزای یرسینیا انتروکولیتیکای جدا شده از انسان و حیوانات میباشند و بیوتیپ 1A در انواع غیربیماریزای انسانی یرسینیا انتروکولیتیکا مشاهده میشود. در این تحقیق از 53 باکتری جدا شده از حیوانات 46 مورد (87 درصد) از خوک جدا شده بود که مربوط به بیوتیپهای بیماریزا بود. 2 بیوتیپ از بز، 4 بیوتیپ از سگ و 5 بیوتیپ 1A از گاو و سگ جداشده بود. تحقیقات آنها نشان داد، که سروتیپهای O:3 و O:9 شایعترین سروتیپها در انواع بیماریزای انسانی میباشند. به طوریکه از 42 مورد یرسینیا انتروکولیتیکای انسانی 16 مورد مربوط به سروتیپ O:3، 11 مورد O:9 و 15 مورد سروتیپهای دیگر تشخیص داده شدند. جهت بررسی وجود ژنهای ویرولانس مشخص گردید 80 درصد از استرینهای بیوتیپ 1A که با موارد غیر بیماریزای انسانی ارتباط دارند فقط از نظر ژن inv مثبت میباشند. در صورتی که در استرین های بیوتیپ 2 در 66 درصد موارد از نظر ژنهای ydA, ail و virF مثبت میباشند. در بیوتیپ 3، 73 درصد موارد از نظر ژن در virF مثبت میباشند در صورتیکه yadA در این نمونه ها منفی گزار ش گردید در استرینهای بیوتیپ 4، 46 درصد موارد از نظر ژنهای ystB و ail مثبت تشخیص داده شدند (15).
در بررسی انجام شده توسط Zheng و همکاران در 2008 که بر روی 160 نمونه یرسینیا انتروکولیتیکای جدا شده از مدفوع انسانی صورت گرفت، فراوانی ژنهای,inv virF, yadA,ystA,ail به ترتیب 100 درصد، 94 درصد، 89 درصد و 82 درصد گزارش گردید (14).
در مطالعه انجام شده توسط Waneet و همکاران که با هدف رد یابی ژن ail بر روی 215 سویه بالینی یرسینیا و 40 سویه از سایر گونه های باکتریايی انجام شد، ژن ail در بیوتیپهای بیمار زای 1B, 2, 3, 4,5 مشاهده گردید و بیوتیپهای 1A فاقد ژن ail بودند (16).
در مطالعه ی انجام شده توسط Niskanen و همکاران درسال 2003 در سوئد که بر روی 468 نمونه مدفوع از 58 گونه ی مختلف از پرندگان مهاجر انجام شد، 8/12% از گونه های یرسینیا از نمونه ها جداسازی شدند. بیشترین گونه ی یرسینیای جدا شده یرسینیا انتروکولیتیکا با 6/5 درصد گزارش گردید. در این بررسی 10 نمونه یرسینیا انتروکولیتیکای جدا شده از غاز دارای سروتیپ O:3 بودند که عامل بیماری های انسانی میباشند. با توجه به نتایج به دست آمده در این تحقیق و سایر تحقیقات میتوان نتیجه گرفت که وجود تمامی ژنهای ویرولانس در سویه های بیماریزای یرسینیا انتروکولیتیکا ضروری نمیباشد به طوریکه بعضی از این سویه ها ممکن است فاقد چندین ژن ویرولانس باشند و بیماریزایی خود را از طریق فاکتورهای ناشناخته دیگر اعمال نمایند (17).
در مطالعه‌ی دیگری که توسط Thisted انجام شد نشان دادند که خوک‌ها به عنوان مخزن اصلی یرسینیا انتروکولیتیکای منتقله از غذا هستند. آنها گوشت خوک را از یخچال و مغازه‌های محلی که توسط بیماران مبتلا به یرسینيوز خریداری شده بودند جمع آوری کردند و برای بررسی حضور گونه های یرسینيا مورد بررسی قرار دادند. از مجموع 118 نمونه از محصولات گوشت خوک (91 نمونه خام و 27 نمونه آماده به مصرف) در 9 مورد (89/9%) از گوشتهای خام خوک گونه ی پاتوژن یرسینیا شناسایی شدو سروتیپ O:3 یرسینیا انتروکولیتیکا در 6 مورد به روش PCR شناسایی شد (18).
از نظر تئوری چنین به نظر میرسد که سویه های پاتوژن یرسینیا انتروکولیتیکا باید واجد تمامی ژنهای ویرولانس (کروموزمی و پلاسمیدی) باشند ولی تحقیقات مختلف نشان داد که تنها ژن inv در تمامی سویه های پاتوژن وجود دارد و بقیه ژنهای ویرولانس به میزان کمتری وجود دارند یا اصلا وجود ندارند. بنابراین برای ایجاد بیماریزایی توسط این باکتری وجود تمامی ژنهای ویرولانس ضروری نمیباشد و چگونگی ایجاد بیماری توسط این باکتری به بیوتیپ و سروتیپ این باکتری بستگی دارد. بنابراین این نکته بدیهی است که سویه های پاتوژن یرسینیا انتروکولیتیکا دارای ژنهای ویرولانس ناشناخته دیگر باشند که بر روی پلاسمید یا کروموزم واقع شده اند. استرینهای بیوتیپ 1A که برای انسان بیماریزایی ندارند. ممکن است فاقد فاکتورهای ویرولانس باشند از این رو غیر بیماری زا میگردند. هر چند تحقیقات دیگر انجام شده توسط محققین دیگر نشان داده که بعضی از استرینهای بیوتیپ 1A از نظر وجود ژن ystB مثبت هستند.
با توجه به نتايج به دست آمده كه حاكي از حضور يرسينيا انتروکولیتیکا در گوشت قرمز ميباشد و نيز از آنجايي كه اين باكتري به راحتي از طريق غذا قابل انتقال بوده و به راحتي در دماي 4 درجه سانتي‌گراد يخچال رشد ميكند. لذا توصيه ميگردد كه مسئولین بهداشتي كشور توجه خاصي به اين مسئله مبذول داشته تا از خطرات بهداشتي و اقتصادي آن جلوگيري به عمل آيد.
.
.
.
مراجع
1- Alenizi D, Ringwood T, Redhwan, A, Bouraha B, Wren BW, Prentice M. All Yersinia enterocolitica are pathogenic: Virulence of phylogroup 1 Y. enterocolitica in a Galleria mellonella infection model. Microbiol. 2016; 162 (8): 1379-1387.
2- Altrock A, Seinige D, Kehrenberg C. Yersinia enterocolitica isolates from wild boars hunted in lower saxony, Germany. Appl and Environ Microbiol. 2015; 81(14): 4835–4840.
3- Bancerz KA, Lipczynska-Ilczuk K. Evaluation of the correlation between the mRNA expression Levels of ystA and ymoA genes in Y. enterocolitica strains with different enterotoxic properties. Pathogens. 2021; 10 (9): 1136. 1150.
4- Bancerz KA, Szczerba TA, Platt SA, Michalczyk M, Szweda W. Characterization of ail-positive Yersinia enterocolitica of different biotypes using HRMA. Int J Food Microbiol. 2018; 269: 46–51.
5- Bari ML, Hossain MA, Isshiki K. Behavior of Yersinia enterocolitica in foods. J Pathogens. 2011; 54 (2): 1-12.
6- Bancerz A, Szczreba A, platt A. Isolation, Biotyping and serotping of Yersinia entercoliica, Bull Vet Inst pulawy. 2011; 55: 39-43.
7- Fukushima H, Shimizu S, Inatsu Y. Yersinia enterocolitica and Yersina pseudotuberculosis detection in food. J path. 2011; 45 (4): 56-67.
8- Juliana P, Falcao DP, Andre PS, Molecular typing and virulence markers of Yersinia enterocolitica strains from human, animal and food origins isolated between 1968 and 2000 in Brazil. J Med Microbiol. 2006; 55 (2): 1539–1548.
9- Lambertz ST, Nilsson CH, Lindblad M. Real – time PCR method for detection of pathogenic Yersinia enterocolitica in food, Applied and Environmental Microbiology. 2008. 74(19):6060-6067
10- Thisted lambertz S, Danielsson TN, Idenrification and characterization of pathogenic Yersinia enterocolitica isolates by PCR. Appl Environ Microbiol. 2005; 71: 3674-3681.
11- Thoemer P, Kingombe C, Eissig CB. PCR detection of virulence genes in Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberclosis and investigation of virulence gene distribution. Appl Environ Microbiol. 2003; 69: 1810-1816.
12- Bottone EJ. Yersina enterocolitica overview and epidemiologic correlates, Microbes infect. 1999; 1(4): 323-30.
13- Aulisiso CC, Stanfield JT. Evaluation of virulence factor testing and Characteristics of pathogenicity in Yersinia enterocolitica infect. 1983; Immune. 40:300-335
14- Zheng, H, Sun Y. 2008, Investigation of virulence gence in slinical isolates of Yersinia enterocolitica. Med Microbiol. 2008; 53 (2): 368-374.
15- Thoemer P, Kingombe C, Eissig-Choisa B. PCR Detection of virulence genes in Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberclosis and investingation of virulence gene distribution. Appl Environ Microb. 2003; 69: 1810-1816.
16- Wannet WJ, Ressinj M. Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica by a rapid and sensitive duplex PCR assay. J Clin Microbiol. 2001. 39(2): 4483-7786.
17- Niskanen T, waldnstrom J, Fredriksson M. Vir F positive Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia enterocolitica found in migratory birds in Sweden. Appl Environmen Microbiol. 2003; 69: 4670-4675.
18- Thisted lS, Danielsson N. Identification and characterization of pathogenic Yersinia enterocolitica isolates by PCR. Appl and Environmental Microbiology. 2005; 71: 3674-3681.
Relationship between biofilm production and virulence factors in Yersinia
enterocolitica strains isolated from red meat in Shahrekord city
Najma Molavi1*, Manouchehr Momeni2, Hussein Khodabandeh1
1. Department of Microbiology, Faculty of Basic Silences, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran.
2. Department of Food Hygiene and Quality Control, Faculty of Veterinary Medicine, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran
Corresponding Author: Molavinajmeh15@gmail.com
Abstract
Yersinia enterocolitica is a gram-negative bacterium that belongs to the Enterobacteriaceae family. This bacterium is a food pathogenic bacterium that is mainly transmitted by contaminated meat, milk and water. Unsanitary meat is one of the main sources of Yersinia enterocolitica infection to humans. The present study was conducted with the aim of investigating the frequency of virulence genes and the relationship between biofilm production and virulence factors in Yersinia enterocolitica isolates isolated from meat supplied to Shahrekord market. 384 samples of red meat were randomly collected from meat supply stores in Shahrekord city and analyzed by biochemical and molecular methods in order to identify Yersinia enterocolitica. The isolated microbial strains were investigated in order to investigate the biofilm production ability by microtiter plate method and the virulence genes were investigated by PCR test. From a total of 384 red meat samples, Yersinia enterocolitica was isolated from 65 samples (16.92%). Contamination was reported in beef (27.69%), mutton (33.84%) and veal (38.64%). 35 isolates (53.85%) showed strong biofilm reaction, 20 isolates (30.77%) showed moderate biofilm reaction and 10 isolates (15.38%) showed weak biofilm reaction. The frequencies of inv, ail, yadA, ystA and virF genes were reported as: 83%, 41.53%, 43% 33.84% and 29.23%, respectively. In the statistical analysis with Chi-square test, a significant relationship was observed between virulence genes and strong biofilm reaction. Considering the importance of red meat in the transmission of Yersinia enterocolitica to humans, it is recommended to follow the hygiene principles and not to consume contaminated meat, to use the PCR test in order to accurately identify the contamination in food.
Key words: Meat, Virulence genes, Yersinia enterocolitica,.