راه اندازی روش Real-time PCR برای تشخیص و تعیین کمی ویروس سرخک با استفاده از ژن F
محورهای موضوعی : میکروب شناسی مولکولیطاهره زارعی 1 , خسرو آقایی‌پور 2 , فرشید کفیل‌زاده 3 , عبدالحمید شوشتری 4
1 - دانشگاه آزاد اسلامی، واحد جهرم، گروه میکروبیولوژی
2 - موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی کرج، بخش بیوتکنولوژی
3 - دانشگاه آزاد اسلامی، واحد جهرم، گروه میکروبیولوژی
4 - موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی کرج، بخش تحقیق و تشخیص بیماری‌های طیور
کلید واژه: Real-time PCR, ویروس سرخک, ژن F,
چکیده مقاله :
سابقه و هدف: با وجود کنترل بیماری سرخک در جهان، اما گزارش‌هایی از ابتلا به این ویروس در جمعیت‌های واکسینه شده وجود دارد. بنابراین تشخیص دقیق و به‌موقع این ویروس ضروری است. روش‌های جدید مولکولی در تشخیص ویروس ارائه شده است که توان تعیین مقدار این ویروس را ندارند. هدف از این پژوهش راه اندازی روش Real-time PCR با استفاده از ژن F ویروس سرخک می‌باشد. مواد و روش‌ها: این مطالعه با طراحی دو پرایمر و یک پروب راه اندازی و از ژن F کلون شده در داخل پلاسمید pET-22b(+) استفاده گردید. رقت‌های متوالی در مبنای 10 از پلاسمید استاندارد حاوی ژن آماده شد و منحنی استاندارد رسم گردید. جهت انجام پروژه از کیت Taq Man ساخت شرکت ABI استفاده گردید. یافته‌ها: حداقل 30 ذره ویروسی در هر واکنش مشخص گردید و در محدوده رقت‌های 4-10تا 9- 10 معادل ( 101×3- 106×3) نسخه بهترین حالت خطی برای منحنی استاندارد دیده شد. نتیجه گیری: نتایج نشان داد که تکنیک Real-time PCR می‌تواند به عنوان روشی بسیار اختصاصی و سریع برای تشخیص و تعیین تعداد ویروس سرخک از نمونه‌های حاوی این ویروس به‌کار رود.
Background and objective: Although measles disease has controlled measles disease worldwide, there are some reports of the viral infection in vaccinated populations. Therefore, accurate and timely diagnosis is essential for the virus. Most of new molecular methods for virus detection cannot quantify the virus load. The purpose of this study was to set up Real-time PCR method using measles virus F gene. Materials and methods: Firstly, two primers and a probe from the F gene cloned into plasmid pET-22b (+)(Novagen) were designed. A ten fold serial dilution of standard plasmid containing the gene was prepared and a standard curve was plotted .The project was carried out on the 7500 Real-Time PCR detection System (Applied Biosystems) with Taq man kit (Applied Biosystems). Result: At least 30 viral particles per reaction could be determined and the dilutions between 10-4 to 10-9 equivalent 3×101 to 3×106 copies of the standard curve) were linear at best. Conclusion: Real-time PCR results showed that the technique can be used as highly specific and rapid method to detect and to determine the number of measles viral particles from the samples containing the virus.
1. Knipe D, Howley P. Filds Virology (fifth edition). Lippincott Williams and Wilkins, 2006, ISBN 0-7817-1832-5.
2. El Mubarakab HS, De Swarta RL, Osterhausa ADME, Schuttena M. Development of a semi-quantitative Real-Time RT PCR for the detection of measles virus. J Clin virol. 2005; 32:313-317.
3. Wakefield AH. Detection of measles virus genomic RNA in cerebrospinal fluid of children with regressive autism: a report of three cases. J Am Phys Surg. 2004; 9(2):38-45.
4. Wong ML, Medrano JF. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 2005; 39:75-85.
5. Ozoemena LC, Minor PD, Afzal MA. Comparative evaluation of measles virus specific TaqMan PCR and conventional PCR using synthetic and natural RNA templates. J Med virol. 2004; 73:79-84.
6. Kimberly B, Hummel, Lowe L, Bellini WJ, Rota PA. Development of quantitative gene-specific Real-Time RT PCR assays for the detection of measles virus in clinical specimens. J Virol Meth. 2006; 132: 166-173.
7. Schalk JAC, van den Elzen C, Ovelgonne H, Baas C, Peter MJ, Jongen M. Estimation of the number of infectious measles viruses in live virus vaccines using quantitative Real-Time PCR. J virol meth. 2004; 117:179-187.
8. Thomas B, Beard S, Jin L, Brown KE, Brown DWG. Development and evaluation of a Real-Time PCR assay for rapid identification and semi-quantitation of measles virus. J Med virol. 2007; 79:1587-1592.
9. Tevfik Dorak M. Real-Time PCR (Advanced methods). 2007; ISBN-13: 978-0-4153-77348.
10. Akiyama M, Kimura H, Tsukagoshi H, Taira K, Mizuta K, Saitoh M, Nagano M, Sutoh A, Noda M, Morita Y, Sakatsume O, Okabe N, Tashiro M. Development of an assay for the detection and quantification of the measles virus nucleoprotein (N) gene using Real-Time reverse transcriptase PCR. J Med Microbiol. 2009; 58:683-643.
11-Thompson RCA. Molecular Epidemiology of Infectious Disease. 2006; ISBN 0 340 759097.
12-Schneider-Schaulies J, ter Meulen V, Schneider-Schaulies S. Measles virus interaction with cellular receptor: consequences for viral pathogenesis. J Neurovirol. 2001; 7: 391-399.
13. Schneider H, Kaelin K, Billeter MA. Recombinant measles virus defective for RNA editing and V protein synthesis are viable in cultured cells. Virology. 1997; 227:314-322.
14. Drago L, Lombardi A, De Vecchi E, Giuliani G, Bartolone R, Gismondo MR. Comparison of nested PCR real time PCR of Herpesvirus infections of central nervous system in HIV patients. BMC Infect Dis. 2004; 4-55.
15. Llop P, Bonaterra A, Penalver J, Lopez MM. Development of a highly sensitive nested-PCR procedure using a single closed tube for detection of Erwinia amylovora in asymptomatic plant material. Appl Environ Microbol. 2000; 66:2071-2078.
16. Morita Y, Suzuki T, Shiono M, Shiobara M, Saitoh M, Tsukagoshi H, Yoshizumi M, Ishioka T, Kato M, Kozawa K, Ttanaka-Taya K, Yasui Y, Noda M, Okabe N, Kimura H. Sequnce and phylogenetic analysis of the nucleoprotein (N) gene in measles viruses prevalent in Gunma Japan . Jpn Infect Dis. 2007; 60:402-404.
17. Plummet S, Gerlier D. Optimized Sybr Green Real-Time PCR assay to quantify the absolute copy number of measles virus RNAs using gene specific primers. J virol methods. 2005; 128:79-87.
18. Min BS, Noh YJ, Shin JH, Baek SY, Min KI, Ryu SR, Kim BG, Park MK, Choi SE, Yang EH, Park SN, Hur SJ, Ahn BY. Assessment of the quantitative Real-Time polymerase chain reaction using a cDNA standard for human group A rotavirus. J virol methods. 2006; 137: 280-286.
19. Bukland R, Gerald C. Fusion glycoprotein of measles virus: Nucleotide sequence of the gene and comparison with other Paramyxoviruses. J gen Virol. 1987; 68:1695-1703.
20. Bradstreet JJ, El Dahr J, Anthony A, Kartzinel JJ, Wakefield AH. Detection of measles virus genomic RNA in cerebrospinal fluid of children with regressive autism: a report of three cases. J Am Phys Surg. 2004; 9(2):38-45.
21. Uhlman V, Martin CM, Sheils O, Pilkington L, Silva I, Killalea A, Murch SB, Walker-Smith J, Thomson M, Wakefield AJ, O'Leary JJ. Potential viral pathogenic mechanism for new variant inflammatory bowel disease. Mol Pathol. 2002; 55:84-90.
22. Stamley FR, Patel MM, Holloway BP, Pellet PE. Quantitative fluorogenic probe PCR assay for detection of human Herpesvirus 8 DNA in clinical specimens. J Clin Microbiol. 2006; 39:3537-3540.
23. Kreuzer KA, Lass U, Nagel S, Ellerbrok H, Pauli G, Pawlaczyk-Peter B, Siegert W, Huhn D, Schmidt CA. Applicability of an absolute quantitative procedure to monitor intra-individual bcr/abl transcript kinetics in clinical samples from chronic myelogenous leukemia patients. Int J Cancer. 2000; 86:741-746.
24. King DP, Reid SM, Hutchings GH, Grierson SS, Wilkinson PJ, Dixon LK, Bastos AD, Drew TW. Development of a Taq Man PCR assay with internal amplification control for the detection of African swine fever virus. J Virol Methods. 2003; 107:53-61.