مقایسه روش PCR-RFLP با روش‌های بیوشیمیایی در تشخیص عوامل سل ریوی انسانی

محورهای موضوعی : میکروب شناسی مولکولی

بهنام رفیعی ¹ (دانشگاه آزاد اسلامی، واحد قم، گروه میکروبیولوژی)
علی اصغر فرازی ² (دانشگاه علوم پزشکی اراک، گروه بیماری‌های عفونی و گرمسیری)
داود صادقی ³ (دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات تهران ،گروه زیست شناسی)
سپیده غنی ⁴ (باشگاه پژوهشگران جوان دانشگاه آزاد اسلامی، واحد اراک)
راضیه نظری ⁵ (دانشگاه آزاد اسلامی، واحد قم، گروه میکروبیولوژی)
روح اله کشاورز ⁶ (موسسه واکسن و سرم سازی رازی کرج، بخش تولید و تحقیق توبرکولین و مالئین)
کیوان تدین ⁷ (موسسه واکسن و سرم سازی رازی کرج، بخش تولید و تحقیق توبرکولین و مالئین)
نادر مصوری مصوری ⁸ (موسسه واکسن و سرم سازی رازی کرج، بخش تولید و تحقیق توبرکولین و مالئین)

تاریخ دریافت : 1389/02/25 تاریخ پذیرش : 1389/05/25 تاریخ انتشار : 1389/04/10

کلید واژه: PCR-RFLP, کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکیلوسیس, ژن کاذب oxyR,

چکیده مقاله :

سابقه و هدف: بیماری سل هنوز هم یکی از مهم‌ترین عوامل مرگ و میر در بسیاری از کشورها است. کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکیلوسیس از مجموعه‌ای از باکتری‌ها با شباهت ژنتیکی زیاد تشکیل شده است که با توجه به طولانی بودن زمان کشت تعیین هویت آن‌ها بسیار مشکل است. هدف از این پژوهش، ارزیابی روش PCR-RFLP برای افتراق مایکوباکتریوم توبرکیلوسیس و مایکوباکتریوم بویس و مقایسه نتایج آن با آزمون‌های بیوشیمیایی است. مواد و روش‌ها: 68 نمونه خلط از بیماران سل ریوی با اسمیر مثبت از مراکز بهداشتی و درمانی استان مرکزی جمع آوری و در محیط کشت‌های اختصاصی کشت شد. همچنین 10 جدایه مایکوباکتریوم بویس مربوط به مناطق مختلف ایران و 6 سویه استاندارد مایکوباکتریوم برای مقایسه استفاده گردید. پس از انجام تست‌های بیوشیمیایی، آزمون PCR براساس ژن کاذب oxyR انجام گرفت. سپس الگوی برش محصول تکثیر یافته با استفاده از آنزیم AluI مورد ارزیابی قرار گرفت. یافته‌ها: در همه جدایه‌های انسانی مایکوباکتریوم توبرکیلوسیس یک قطعه و در جدایه‌های گاوی 3 قطعه پس از برش توسط آنزیم مشاهده شد. از نمونه‌های مورد پژوهش تنها در یک مورد مایکوباکتریوم بویس تشخیص داده شد. همچنین نتایج حاصل از آزمون PCR-RFLP با نتایج حاصل از تست‌های بیوشیمیایی هماهنگی 100% داشت. نتیجه گیری: روش PCR-RFLP روشی سریع و دقیق به‌منظور افتراق مایکوباکتریوم بویس از سایر اعضای کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکیلوسیس می‌باشد و می‌تواند در تشخیص اولیه و درمان مورد استفاده قرار گرفت.

چکیده انگلیسی:

Background and Objective: Tuberculosis is one of important cause of death in several countries. Mycobacterium tuberculosis complex is consisted of homogenous slow growing mycobacteria that their isolation and identification are difficult and time consuming. The objective of this study was to evaluate a molecular method for differentiation of Mycobacterium tuberculosis from Mycobacterium bovis, and at the same time, to compare the method with biochemical tests. Material and methods: In this study 68 sputum specimens were collected from the smear positive patients who hospitalized in health centers of Markazi province. The samples were cultivated in the specialized cultures. Also, 10 isolates of Mycobacterium bovis that were obtained from different area of Iran as well as 6 standard strains have been used for comparison. After performance of biochemical tests, oxyR pseudogene was amplified by PCR and the PCR products were digested by AluI endonuclease. Results:  The digestion on PCR products of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis showed one and three fragment panel, respectively, on the gele. Only one isolate of human Mycobacterium bovis strain has been identified. The results of PCR-RFLP were consistent with biochemical tests. Conclusion: Since PCR-RFLP is a rapid and accurate method for differentiation between Mycobacterium bovis and other Mycobacterium tuberculosis complex and the results are important in terms of diagnosis and treatment of tuberculosis.

منابع و مأخذ:

1. Sohn KY, Shrestha S, Khagi A, Malla SS, Pokharel BM, Khanal MP, Rijal B, Bajracharya P. Polymerase chain reaction detection of Mycobacterium tuberculosis from sputum. J Nepal Med Assoc. 2003; 42: 65-70.

2. Shinnick TM, and Good RC. Mycobacterial taxonomy. Europ J Clin Microbiol Infect Dis. 1994; 13(11): 884-901.

3. Salian NV, Rish JA, Eisenach KD, Cave MD, Bates JH. Polymerase chain reaction to detect Mycobacterium tuberculosis inhistologic specimens. Am J Respir Crit Care Med. 1998; 158(4): 1150-1156.

4. Palomino JC. Nonconventional and new methods in the diagnosis of tuberculosis: Feasibility and applicability in the field. Eur Respir J. 2005; 26(2): 339-350.

5. Collins DM, Erasmuson SK, Stephens DM, Yates GF, De Lisle GW. DNA fingerprinting of Mycobacterium bovis strains by restriction fragment analysis and hybridization with insertion elements IS1081 and IS6110. J Clin Microbiol. 1993; 31 (5):1143-1147.

6. Pavlik I, Yayo Ayelle W, Havelkova M, Svejnochova M, Katalinik-Jankovic V, Zolnir-Dovc M. Mycobacterium bovis in human population in four Central European countries during 1990–1999. Vet Med -Czech. 2003; 48(4): 90–98.

7. Cruciani M, Mengoli C. An overview of meta-analyses of diagnostic tests in infectious diseases. Infect Dis Clin North Am. 2009; 23(2): 225-267.

8. Ben-selma W, Harizi H, Marzouk M, Ben Kahla I, Ben Lazreg F, Ferjeni A, Boukadida J. Evaluation of the diagnostic value of measuring IgG, IgM and IgA antibodies to mycobacterial A60 antigen in active tuberculosis. Diagn Microbiol Infect Dis. 2010; 68(1): 55-59.

9. Heifets LB, and Good RC, Current laboratory methods for the diagnosis of tuberculosis. In: Bloom BR, ed. Tuberculosis: pathogenesis, protection, and control. Washington DC; American Society for Microbiology. 1994: 85–109.

10. Murray M, Nardell E. Molecular epidemiology of tuberculosis: achievements and challenges to current knowledge. Bull World Health Organ. 2002; 80(6): 477-482

11. Chimara E, Ferrazoli L, Ueky SY, et al. Reliable identification of mycobacterial species by PCR restriction enzyme analysis (PRA)-hsp65 in a reference laboratory and elaboration of a sequencebased extended algorithm of PRA-hsp65 patterns. BMC Microbiol. 2008; 8: 48.

12. Sreevatsan S, Escalante P, Pan X, Gillies DA, Siddiqui S, Khalaf CN, Kreiswirth BN, Bifani P, Adams LG, Ficht T, Perumaalla VS, Cave MD, van Embden JD, Musser JM. Identification of a polymorphic nucleotide in oxyR specific for Mycobacterium bovis. J Clin Microbiol. 1996; 34(8): 2007–2010.

 13. Jeon CY, Hwang SH, Min JH, Prevots DR, Goldfeder LC, Lee H, Eum SY, Jeon DS, Kang HS, Kim JH, Kim BJ, Kim DY, Holland SM, Park SK, Cho SN, Barry CE 3rd, Via LE. Extensively drug-resistant tuberculosis in South Korea: risk factors and treatment outcomes among patients at a tertiary referral hospital. Clin Infect Dis. 2008; 46(1): 42-49.

14. Van Soolingen D, de Haas PE, Kremer K. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) typing of mycobacteria. Methods Mol Med. 2001; 54: 165-203.

15. Collins CH, Grange JN, Yates MD. Tuberculosis bacteriology. 2 nd edn. Oxford: Butter word- Heinemann. 1997; pp. 110-117.

16. Alcaide F, Richter I, Bernascoin C, Springer B, Hagenau C, Schulze-Röbbecke R, Tortoli E, Martín R, Böttger EC, Telenti A. Heterogeneity and clonality among isolates of Mycobacterium kansasii: implications for epidemiological and phathogenicity studies. J Clin Microbiol. 1997; 35(8): 1959-1964.

17. Devallois A, Goh KS, Rastogi N. Rapid identification of mycobacteria to species level by PCR- restriction fragment length polymorphism analysis of the hsp65 gene and proposition of an algorithm to differentiate 34 mycobacterial species. J Clin Microbiol. 1997; 35(11): 2969-2973.

18. Stermann M, Bohrssen A, Diephaus C, et al. Polymorphic nucleotide within the  promoter of nitrate reductase (NarGHJI) is specific for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 2003; 41(7): 3252-3259.

19. Warren RM, Gey van Pittius NC, Barnard M, Hesseling A, Engelke E, de Kock M, Gutierrez MC, Chege GK, Victor TC, Hoal EG, van Helden PD. Differentiation of Mycobacterium tuberculosis complex by PCR amplification of genomic regions of difference. Int J Tuberc Lung Dis. 2006; 10(7): 818-822.

20. Sadaii jahromi N, Frania P, Kargar M, Kazempour M ,Noruzi J, Masjedi MR, Velayati AA. Relationship between interleukin12 receptor beta1 gene polymorphisms with pulmonary tuberculosis among the Iranian population. J Microb World. 2009; 2: 113-116.

21. Biet F, Boschiroli ML, Thorel MF, Guilloteau LA. Zoonotic aspects of Mycobacterium bovis and Mycobacterium avium-intracellulare complex (MAC). Vet Res. 2005; 36(3): 411-436.

22. Blazquez J, Espinosa de Los Monteros LE, Samper S, Martin C, Guerrero A, Cobo J, Van Embden J, Baquero F, Gómez-Mampaso E. Genetic characterization of multidrug-resistant Mycobacterium bovis strains from a hospital outbreak involving human immunodeficiency virus positive patients. J Clin Microbiol. 1997; 35(6): 1390-1393.

23. de la Rua-Domenech R. Human Mycobacterium bovis infection in the United Kingdom: Incidence, risks, control measures and review of the zoonotic aspects of bovine tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 2006; 86(2): 77-109.

24. de Kantor IN, Ambroggi M, Poggi S, Morcillo N, Da Silva Telles MA, Osório Ribeiro M, Garzón Torres MC, Llerena Polo C, Ribón W, García V, Kuffo D, Asencios L, Vásquez Campos LM, Rivas C, de Waard JH. Human Mycobacterium bovis infection in ten Latin American countries. Tuberculosis (Edinb). 2008; 88(4): 358-365.

25. Rezaeetalab F, Akbari H, Rezaeetalab GH. A delay in diagnosis patient with pulmonary tuberculosis. Med J Mashhad Univ Med Sci. 2008; 51(99): 37-40 [In persian].