فرمولاسیون و ارزیابی عصاره میخک بارگذاری شده در هیدروژل کیتوسان بر روی رده سلولی فیبروبلاست موشی
محورهای موضوعی : فصلنامه زیست شناسی جانوری
سئودا شمشاد
1
,
فرشته شریفی
2
*
1 - گروه زیست شناسی، واحد تهران مرکزی، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
2 - گروه زیست شناسی، واحد تهران مرکزی، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
کلید واژه: عصاره میخک, هیدروژل, کیتوسان, زخم‌پوش, ضدباکتریایی,
چکیده مقاله :
آسیبها یا نواقص شدید پوستی می‌تواند عامل بسیاری از مشکلات موجود زنده باشد، که می‌تواند زندگی فرد را تحت تاثیر قرار دهد. وجود فعالیت قابل قبول ضدباکتریایی همراه با زیستسازگار و زیستتخریبپذیر بودن نیاز اساس در توسعهی کاربردی زخم‌پوش جهت کاهش یا محدود نمودن سوء مصرف آنتیبیوتیک سنتزی است. هدف از مطالعه حاضر طراحی، تهیه و توسعه ساختار هیدروژلی کارآمد بر پایه کیتوسان (CS) حاوی عصاره میخک (CEO) با فعالیت تشدید شده ضد باکتریایی، غیر سمی، و ظرفیت التیام زخم بوده است. ساختار هیدروژل با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) و آنالیز طیف جذبی (FTIR) مورد مطالعه قرار گرفت. همچنین، سمیت هیدروژل طراحی شده با استفاده از آزمون MTT مورد ارزیابی قرار گرفت. براساس تصاویر SEM افزوده شدن عصاره میخک موجب افزایش اندازه منافذ هیدروژل CS شده است. نتیجه آزمون FTIR تائید کننده حضور و تلفیق عصاره میخک با CS در ساختار هیدروژل بود. تحقیقات ما نشاندهندهی عدم اثر سمی عصاره میخک بارگذاری شده در هیدروژل CS بر روی سلول‌های فیبروبلاست موشی (L929) بود. بعلاوه، هیدروژل طراحی شده فعالیت ضد باکتریایی علیه استافیلوکوکوس ارئوس و اشریشیاکلی بوده است. براساس نتایج بدست آمده، هیدروژل CS/CEO دارای ظرفیت بزرگ کاندید شدن برای کاربرد زخم‌پوش بدون آنتیبیوتیک است.
Severe skin damage or defects can cause various problems in living animates, which could affect a patient's life. Developing wound dressings with acceptable antibacterial activity, besides biocompatibility and biodegradability, is essential in developing wound healing applications for decreasing or limiting synthetic antibiotic abuse. The present study aimed to design, prepare, and develop a functional hydrogel structure based on chitosan (CS) containing clove extract (CEO) with enhanced antibacterial activity, non-toxicity, and wound-healing potential. The hydrogel structure was studied using a scanning electron microscope (SEM) and Fourier transform infrared (FTIR). In addition, the cytotoxicity of the designed hydrogel was assayed by the MTT test. Based on the SEM, adding clove extract increased the pore size of the CS hydrogel. FTIR analysis confirmed the presence and mixture of clove extract with CS in the hydrogel structure. Our investigations displayed that the clove extract-loaded CS hydrogel did not have cytotoxic effects on the mouse fibroblast (L929) cells. In addition, the designed hydrogel showed antibacterial activity against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. According to the results, CS/CEO hydrogel is a great potential candidate for antibiotic-free wound healing applications.
1. Anjum S, Arora A, Alam MS, Gupta B. Development of antimicrobial and scar preventive chitosan hydrogel wound dressings. Int J Pharm. 2016;508(1-2):92-101.
2. Ma L, Gao C, Mao Z, Zhou J, Shen J, Hu X, Han C. Collagen/chitosan porous scaffolds with improved biostability for skin tissue engineering. Biomaterials. 2003; 24(26):4833-4841.
3. Akbari A, Rabbani S, Irani S, Zandi M, Sharifi F, Ameli F, Mohamadali M. In vitro and in vivo study of carboxymethyl chitosan/polyvinyl alcohol for wound dressing application. J Appl Polym Sci. 2022; 139(10):51764.
4. Khorasani MT, Joorabloo A, Adeli H, Milan PB, Amoupour M. Enhanced antimicrobial and full-thickness wound healing efficiency of hydrogels loaded with heparinized ZnO nanoparticles: In vitro and in vivo evaluation. Int J Biol Macromol. 2021;166:200-212..
5. Adeli H, Khorasani MT, Parvazinia M. Wound dressing based on electrospun PVA/chitosan/starch nanofibrous mats: Fabrication, antibacterial and cytocompatibility evaluation and in vitro healing assay. Int J Biol Macromol. 2019; 122:238-254.
6. Kabirkoohian A, Bakhshi H, Irani S, Sharifi F. Chemical Immobilization of Carboxymethyl Chitosan on Polycaprolactone Nanofibers as Osteochondral Scaffolds. Appl Biochem Biotechnol. 2023;195(6):3888-3899.
7. El-Samad LM, Hassan MA, Basha AA, El-Ashram S, Radwan EH, Abdul Aziz KK, Tamer TM, Augustyniak M, El Wakil A. Carboxymethyl cellulose/sericin-based hydrogels with intrinsic antibacterial, antioxidant, and anti-inflammatory properties promote re-epithelization of diabetic wounds in rats. Int J Pharm. 2022; 629:122328.
8. Feng W, Wang Z. Biomedical applications of chitosan-graphene oxide nanocomposites. iScience. 2021; 25(1):103629.
9. Mourya VK, Inamdar NN, Tiwari A. Carboxymethyl chitosan and its applications. Advanced Materials Letters, Review Article Adv. Mat. Lett. 2010; 1(1):11-33.
10. Fei Liu X, Lin Guan Y, Yang DZ, Li, Z. Yao KD. Antibacterial action of chitosan and carboxymethylated chitosan. J Appl Polym Sci. 2001;79(7):1324-1335.
11. Li B, Cui J, Xu T, Xu Y, Long M, Li J, Liu M, Yang T, Du Y, Xu Q. Advances in the preparation, characterization, and biological functions of chitosan oligosaccharide derivatives: A review. Carbohydr Polym. 2024;332:121914.
12. Dreiss CA. Hydrogel design strategies for drug delivery. Currt Opin Colloid Interface Sci. 2020;48:1-17.
13. Zhou Y, Yang H, Liu X, Mao J, Gu S, Xu W. Electrospinning of carboxyethyl chitosan/poly(vinyl alcohol)/silk fibroin nanoparticles for wound dressings. Int J Biol Macromol. 2013;53:88-92..
14. Tamer TM, Alsehli MH, Omer AM, Afifi TH, Sabet MM, Mohy-Eldin MS, Hassan MA. Development of Polyvinyl Alcohol/Kaolin Sponges Stimulated by Marjoram as Hemostatic, Antibacterial, and Antioxidant Dressings for Wound Healing Promotion. Int J Mol Sci. 2021;22(23): 13050.
15. Moeini A, Pedram P, Makvandi P, Malinconico M, Gomez d'Ayala G. Wound healing and antimicrobial effect of active secondary metabolites in chitosan-based wound dressings: A review. Carbohydr Polym. 2020; 233:115839..
16. Sharifi F, Hasani M, Atyabi SM, Yu B, Ghalandari B, Li D, et al. Mesenchymal stem cells encapsulation in chitosan and carboxymethyl chitosan hydrogels to enhance osteo-differentiation. Mol Biol Rep. 2022; 49(12):12063-12075..
17. Zhang M, Yang M, Woo MW, Li Y, Han W, Dang X. High-mechanical strength carboxymethyl chitosan-based hydrogel film for antibacterial wound dressing. Carbohydr Polym. 2021;256:117590.
18. Caldwell MD. Bacteria and Antibiotics in Wound Healing. Surg Clin North Am. 2020; 100(4):757-776.
19. Zhang J, Ge J, Xu Y, Chen J, Zhou A, Sun L, Gao Y, Zhang Y, Gu T, Ning X. Bioactive multi-engineered hydrogel offers simultaneous promise against antibiotic resistance and wound damage. Int J Biol Macromol. 2020; 164:4466-4474..
20. Banerjee K, Madhyastha H, Sandur VR, Manikandanath NT, Thiagarajan N, Padma T. Anti-inflammatory and wound healing potential of a clove oil emulsion. Colloids Surf B Biointerfaces. 2020; 193:111102.
21. Ali R, Khamis T, Enan G, El-Didamony G, Sitohy B, Abdel-Fattah G. The healing capability of clove flower extract (CFE) in streptozotocin-induced (STZ-induced) diabetic rat wounds infected with multidrug resistant bacteria. Molecules. 2022;27(7): 2270.
22. Mohammadnezhad J, Khodabakhshi-Soreshjani F, Bakhshi H. Preparation and evaluation of chitosan-coated eggshell particles as copper (II) biosorbent. Desalin. Water Treat. 2016; 57(4):1693-1704.
23. Ray M, Pal K, Anis A, Banthia AK. Development and characterization of chitosan based polymeric hydrogel membranes. Des. Monomers Polym. 2010; 13(3):193-206.
24. Sharifi F, Atyabi SM, Norouzian D, Zandi M, Irani S, Bakhshi H. Polycaprolactone/carboxymethyl chitosan nanofibrous scaffolds for bone tissue engineering application. Int J Biol Macromol. 2018;115:243-248.
25. González-Rivera J, Duce C., Falconieri D, Ferrari C, Ghezzi L, Piras A, et al. Coaxial microwave assisted hydrodistillation of essential oils from five different herbs (lavender, rosemary, sage, fennel seeds and clove buds): Chemical composition and thermal analysis. Innovative Innov Food Sci Emerg Technol, 2016;33:308-318.
26. Parham S, Zargar Kharazi A. Cellulosic textile/clove nanocomposite as an antimicrobial wound dressing: In vitro and in vivo study. Colloids Surf B Biointerfaces. 2022;217:112659.
27. Liang H, Mirinejad MS, Asefnejad A, Baharifar H, Li X, Saber-Samandari S, et al. Fabrication of tragacanthin gum-carboxymethyl chitosan bio-nanocomposite wound dressing with silver-titanium nanoparticles using freeze-drying method. Mater Chem Phys. 2022;279(10):125770
28. Guo W, Ding X, Zhang H, Liu Z, Han Y, Wei Q, Okoro OV, Shavandi A, Nie L. Recent Advances of Chitosan-Based Hydrogels for Skin-Wound Dressings. Gels. 2024;10(3):175.
29. Sivanesan I, Hasan N, Muthu M, Blessing G, Gopal J, Chun S, Shin J, Oh JW. Exploring the impact of chitosan composites as artificial organs. Polymers. 2022;14(8):1587.
30. Shah A, Ashames AA, Buabeid M A, Murtaza G. Synthesis, in vitro characterization and antibacterial efficacy of moxifloxacin-loaded chitosan-pullulan-silver-nanocomposite films. J Drug Deliv Sci Technol. 2020;55:101366.
31. Omidi M, Yadegari A, Tayebi L. Wound dressing application of pH-sensitive carbon dots/chitosan hydrogel. RSC Adv. 2017;7(18):10638-49.
32. Arafa AA, Nada AA, Ibrahim AY, Sajkiewicz P, Zahran MK, Hakeim OA. Preparation and characterization of smart therapeutic pH-sensitive wound dressing from red cabbage extract and chitosan hydrogel. Int J Biol Macromol. 2021;182: 1820-1831.
33. Unalan I, Endlein SJ, Slavik B, Buettner A, Goldmann WH, Detsch R, Boccaccini AR. Evaluation of Electrospun Poly(ε-Caprolactone)/Gelatin Nanofiber Mats Containing Clove Essential Oil for Antibacterial Wound Dressing. Pharmaceutics. 2019;11(11):570.
34. Hameed M, Rasul A, Waqas MK, Saadullah M, Aslam N, Abbas G, Latif S, Afzal H, Inam S, Akhtar Shah P. Formulation and evaluation of a clove oil-encapsulated nanofiber formulation for effective wound-healing. Molecules, 2021; 26(9):2491.
زیستشناسی جانوري، سال هفدهم، شماره سوم، بهار 1404، صفحات 12-1، شمشاد و شریفی
Formulation and Evaluation of Clove Extract-Loaded Chitosan Hydrogel on the Mouse Fibroblast Cell Line
Sevda Shemshad1, Fereshteh Sharifi1,2*
1- Department of Biology, Central Tehran Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
2- Soft Tissue Engineering Research Center, Tissue Engineering and Regenerative Medicine Institute, Central Tehran Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
*Corresponding author: Fer.sharifi.368@iau.ac.ir
Received: 24 September 2024 Accepted: 27 January 2025
DOI: 10.60833/ascij.2025.1184989
Abstract
Severe skin damage or defects can cause various problems in living animates, which could affect a patient's life. Developing wound dressings with acceptable antibacterial activity, besides biocompatibility and biodegradability, is essential in developing wound healing applications for decreasing or limiting synthetic antibiotic abuse. The present study aimed to design, prepare, and develop a functional hydrogel structure based on chitosan (CS) containing clove extract (CEO) with enhanced antibacterial activity, non-toxicity, and wound-healing potential. The hydrogel structure was studied using a scanning electron microscope (SEM) and Fourier transform infrared (FTIR). In addition, the cytotoxicity of the designed hydrogel was assayed by the MTT test. Based on the SEM, adding clove extract increased the pore size of the CS hydrogel. FTIR analysis confirmed the presence and mixture of clove extract with CS in the hydrogel structure. Our investigations displayed that the clove extract-loaded CS hydrogel did not have cytotoxic effects on the mouse fibroblast (L929) cells. In addition, the designed hydrogel showed antibacterial activity against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. According to the results, CS/CEO hydrogel is a great potential candidate for antibiotic-free wound healing applications.
Keywords: Clove extract, Hydrogel, Chitosan, Wound dressing, Antibacterial.
فرمولاسیون و ارزیابی عصاره میخک بارگذاری شده در هیدروژل کیتوسان بر روی رده سلولی فیبروبلاست موشی
سئودا شمشاد1، فرشته شریفی1، 2*
1- گروه زیستشناسی، واحد تهران مرکزی، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
2- مرکز تحقیقات مهندسی بافت نرم، پژوهشکده مهندسی بافت و طب بازساختی، واحد تهران مرکزی، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
*مسئول مکاتبات: Fer.sharifi.368@iau.ac.ir
تاریخ دریافت: 03/07/1403 تاریخ پذیرش: 08/11/1403
DOI: 10.60833/ascij.2025.1184989
چکیده
آسیبها یا نواقص شدید پوستی می‌تواند عامل بسیاری از مشکلات موجود زنده باشد، که می‌تواند زندگی فرد را تحت تاثیر قرار دهد. وجود فعالیت قابل قبول ضدباکتریایی همراه با زیستسازگار و زیستتخریبپذیر بودن نیاز اساس در توسعهی کاربردی زخم‌پوش جهت کاهش یا محدود نمودن سوء مصرف آنتیبیوتیک سنتزی است. هدف از مطالعه حاضر طراحی، تهیه و توسعه ساختار هیدروژلی کارآمد بر پایه کیتوسان (CS) حاوی عصاره میخک (CEO) با فعالیت تشدید شده ضدباکتریایی، غیرسمی، و ظرفیت التیام زخم بوده است. ساختار هیدروژل با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) و آنالیز طیف جذبی (FTIR) مورد مطالعه قرار گرفت. همچنین، سمیت هیدروژل طراحی شده با استفاده از آزمون MTT مورد ارزیابی قرار گرفت. بر اساس تصاویر SEM افزوده شدن عصاره میخک موجب افزایش اندازه منافذ هیدروژل CS شده است. نتیجه آزمون FTIR تائید کننده حضور و تلفیق عصاره میخک با CS در ساختار هیدروژل بود. تحقیقات ما نشاندهندهی عدم اثر سمی عصاره میخک بارگذاری شده در هیدروژل CS بر روی سلول‌های فیبروبلاست موشی (L929) بود. بعلاوه، هیدروژل طراحی شده فعالیت ضد باکتریایی علیه استافیلوکوکوس ارئوس و اشریشیاکلی بوده است. براساس نتایج بدست آمده، هیدروژل CS/CEO دارای ظرفیت بزرگ کاندید شدن برای کاربرد زخم‌پوش بدون آنتیبیوتیک است.
کلمات کلیدی: عصاره میخک، هیدروژل، کیتوسان، زخم‌پوش، ضدباکتریایی.
مقدمه
یکی از چالشهای مهم حوزه درمان و پزشکی مدیریت صحیح و به موقع زخم‌های پوستی می‌باشد (1). بر اساس آمارهای ارائه شده توسط دانشگاه علوم پزشکی تهران هزینه درمان زخم به‌طور متوسط بیش از 2000 دلار در مراحل اولیه درمان می‌باشد، که در صورت عدم رسیدگی به موقع و انجام درمان کارآمد این هزینه به بیش از 15000 دلار میرسد. از سوی دیگر با توجه به محدودیتهای عملکردی فرد بیمار هزینههای روانی، خانوادگی و اجتماعی بسیاری بر جامعه تحمیل میکند. از این رو، طراحی و تهیه زخمپوشهایی که توانایی تسریع بهبود زخم را داشته باشند یکی از اولولیتهای درمانی کشور می‌باشد. روشهای متنوعی برای درمان زخم مطرح بوده، که از این جمله می‌توان به پیوندهایی همانند آلوگرفت، اتوگرفت و زنوگرفت، استفاده از پانسمانهای زخم که موجود در شبکه داروخانهای و پانسمانهای مدرن تحت عنوان زخم‌پوش اشاره نمود (2). زخمپوشها یا جانشینهای مهندسی زیستی شده پوست همانند هیدروژل، اسپانچ و پدهای الکتروریسی شده عموما از پلیمرها تهیه می‌شوند (3). زخمپوشها باید ویژگیهای منحصر به فردی از جمله حفظ رطوبت محل زخم و جلوگیری از خشک شدن محل زخم، محافظت از زخم در برابر عفونت، محافظت فیزیکی از زخم و تسریع روند بهبودی را ارئه دهند. برای تامین مشخصات مطرح شده برای زخم‌پوش دو جنبه مهم که شامل نوع پلیمر سازنده و دیگری روش تهیه زخم‌پوش می‌باشد، موردتوجه است (4، 5). پلیمرهای مورد استفاده در ساخت زخم‌پوش از دو منبع طبیعی (کلاژن، الژینات، ژلاتین، هیالورونیک اسید، کیتوسان و ...) و سنتزی (پلیکاپرولاکتون، پلیلاکتیک اسید، پلیوینیل الکل و....) قابل تهیه می‌باشد (6). یکی از پلیمرهای طبیعی که به‌طور وسیعی در تهیه زخمپوشها مورد استفاده می‌باشد، کیتوسان است (7، 8). کیتوسان طی فرآیند داستیلاسیون از پلیمر طبیعی کیتین بدست میآید. کیتوسان ویژگیهای متمایزکنندهای نظیر زیستسازگاری، غیرسمی بودن، زیستتخریبپذیر بودن، ضدالتهاب، تسریع روند انعقاد خون و ضدمیکروبی می‌باشد (9-11). ساختارهای متنوعی از زخمپوشها در سالهای اخیر مورد توجه بوده است، که از این جمله می‌توان به پدهای الکتروریسی شده، اسپانچها، ساختارهای پاششی بصورت اسپری، هیدروژل‌ها و غیره می‌توان اشاره نمود (12-15). مشخصههایی همانند قابلیت جذب آب، متورم شدن، قابلیت بارگذاری ترکیبات زیستفعال، وجود ماهیت ساختاری مشابه ماتریکس خارجسلولی طبیعی، روشهای متنوع در تهیه، قابلیت استفاده از طیف وسیعی از پلیمرها و ترکیبات طبیعی در ساخت موجب مقبولیت و توجه گسترده به هیدروژل‌ها در سالهای اخیر شده است (12، 16، 17). یکی از معضلات مهم در درمان زخم، جلوگیری از بروز عفونت باکتریایی می‌باشد. به‌طور رایج، آنتیبیوتیکهای سنتزی یکی از گزینههای مورد توجه برای پیشگیری و در صورت نیاز کنترل عفونت باکتریایی است. اما نکته قابل تامل که در سالهای اخیر بسیار مدنظر پژوهشگران بوده است، احتمال بروز مقاومت آنتیبیوتیکی و یا سوء مصرف آنتیبیوتیک در بیماران دریافت کننده دارو می‌باشد (18، 19). از این رو، استفاده از ترکیباتی که قابلیت ارائه خاصیت ضد میکروبی بویژه ضد باکتریایی را داشته باشند جز اولویتهای کاربردی در تهیه زخمپوشها قرار گرفت. براساس مطالعات انجام شده، استفاده از عصاره میخک موجب ایجاد خاصیت ضدمیکروبی و باکتریایی به همراه مشخصه ضدالتهابی که به‌طور موثر در تسریع روند بهبود زخم نقش ایفا میکند (20، 21). تحقیقات بیانگر اثر ضدباکتریایی عصاره میخک بر روی باکتری‌های گرم مثبت (استافیلوکوکوس ارئوس) و گرم منفی (اشریشیا کلی) می‌باشد (20). از این رو، استفاده از عصاره میخک نه تنها می‌تواند راه حلی برای کاهش سوء مصرف آنتیبیوتیک باشد، بلکه تامین کننده خاصیت ضدالتهابی بههمراه جلوگیری از رشد باکتری‌های شاخص عفونت زخم پوستی می‌باشد خواهد بود. تهیه هیدروژل به روشی که قابلیت حمل و انتقال ماده زیست فعال در ترمیم زخم را داشته باشد، یکی از نکات قابل توجه می‌باشد. بر این اساس، ماهیت ساختاری مورد استفاده در این مطالعه هیدروژل تنظیم شده با استفاده از تغییر pH بر پایه پلیمر کیتوسان که عصاره میخک درون محلول پلیمری بارگذاری شده است، انتخاب شد.
مواد و روشها
کیتوسان با میزان 79 درصد داستیلاسیون از Bio Basic (کانادا) خریداری شد. 3-(4،5-دی میتیل تیازول-2) 2، 5 دیپنیل تترازولیوم بروماید (MTT)، دیمتیلسولفوکساید (DMSO) از شرکت سیگا-آلدریج (آلمان) تهیه شد. استیکاسید، هیدروکسید سدیم (NaOH)، پارافرمالدئید، و اتانول از شرکت مرک (آلمان) خریداری گردید. سلول فیبروبلاست موشی (L929) و نمونه‌های باکتری E. coli و S. aureus از مرکز ملی ذخایر ژنتیک (ایران) تهیه شد. محیط کشت سلول (DMEM)، سرم جنین گاوی (FBS)، تریپسین/EDTA از شرکت گیبکو (کانادا) خردیداری شد. عصاره میخک بصورت هدیه دریافت شد.
تهیه هیدروژل: برای آمادهسازی هیدروژل کیتوسان 5/1 درصد (w/v) (CS) از پودر توزین شده و در حلال اسید استیک (1%) در دمای اتاق به مدت 24 ساعت تحت استیرر قرار گرفت. همزمان با هم خوردن محلول تهیه شده، با استفاده از محلول NaOH (N10) میزان pH تا محدوده خنثی افزایش داده می‌شود. برای تهیه هیدروژل کیتوسان حاوی عصاره میخک (CS/CEO) ابتدا محلول کیتوسان 5/1 درصد در حلال اسید استیک تهیه می‌شود. سپس عصاره میخک به میزان 0625/0 درصد به محلول افزوده می شده و در نهایت با استفاده از محلول NaOH (N10) میزان pH تا محدوده خنثی تنظیم می‌شود.
بررسی ساختار هیدروژل با میکروسکوپ الکترونی (SEM): ارزیابی ساختار و منافذ هیدروژل‌های تهیه شده با استفاده از میکروسکوپ الکترونی SEM (MIRAⅡΙ، چک) تحت ولتاژ KV5 انجام شد. برای این منظور نمونه هیدروژل‌های CS و CS/CEO در محلول ترکیبی گلوتارآلدئید و پارافرمالدئید (2 درصد) به مدت یک ساعت فرو برده شد. سپس با PBS شستشو داده و در فریزر 80- درجه به مدت 4 ساعت قرار گرفت. نمونه فریز شده هیدروژل‌ها با استفاده از دستگاه خشک کن انجمادی (FD-5010-BT، ایران) خشک و با استفاده از پوششدهی لایه طلا برای مشاهده توسط میکروسکوپ الکترونی آماده شد.
آزمون طیفسنجی Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR): برای آزمون گروههای عاملی و پیوندهای شیمیایی ساختارهای هیدروژل CS به‌طور پایه و تلفیق شده با عصاره میخک CS/CEO از طیف سنجی FTIR استفاده شد. طیف سنجی FTIR با دستگاه اسپکتوفتومترBurker (Equinox 55، آلمان) با وضوح cm-1 4 و محدودهی cm-1 400-4000 انجام شد.
ویژگیهای ضد میکروبی هیدروژل‌های CS/CEO: جهت ارزیابی فعالیت ضدمیکروبی هیدروژل‌های تهیه شده از دو سویه باکتری استفاده گردید. مشخصه های باکتری‌ها در جدول شماره 1 ارائه شده است. برای انجام تست ضد میکروبی ابتدا باکتری‌های E. coli و S. aureus بر روی محیط کشت نوترون آگار با استفاده از سوآپ استریل بصورت یکدست کشت داده شد و به مدت 24 ساعت درون انکوباتور قرار داده شد. سپس، در مرکز پلیتها میزان µl 300 از از نمونه‌های عصاره میخک (CEO extract)، هیدروژل کیتوسان (CS) و هیدروژل کیتوسان حاوی عصاره میخک (CS/CEO) افزوده شد. با گذشت 24 ساعت از انکوباسیون نمونه‌های تیمار شده در انکوباتور، قطر هالههای عدم رشد اندازگیری و بصورت نمودار گزارش شد.
ارزیابی زیستسازگاری هیدروژل CS/CEO: به منظور ارزیابی زیستسازگاری هیدروژل CS/CEO از کشت سلول فیبروبلاست موشی (L929) استفاده شد. برای این منظور، ابتدا سلول‌های L929 به تعداد 104 درون چاهکهای پلیت کشت سلول 24 خانه به مدت 24 ساعت کشت داده شدند. سپس، نمونه هیدروژل CS/CEO در حجم 100 میکرولیتر به محیط اضافه و مجددا به مدت 24 ساعت درون انکوباتور قرار گرفتن. با گذشت 24 ساعت از تیمار سلول‌ها با هیدروژل CS/CEO مورفولوژی سلول‌ها در مجاورت هیدروژل با استفاده از میکروسکوپ نوری معکوس (Bell, INV-100FL) مشاهده شد. از کشت سلول در پلیت کشت سلول بعنوان نمونه کنترل استفاده شد.
ارزیابی زندهمانی سلول L929 در مجاورت هیدروژل CS/CEO: نمونه هیدروژل CS/CEO با pH حدود 8/6 به حجم 100 میکرولیتر برداشته و به تعداد 104 سلول L929 با آن مخلوط گردید. سپس با استفاده از محلول NaOH میزان pH به حدود خنثی (2/7 تا 4/7) تنظیم شد. نمونه‌های سلول-هیدروژل با استفاده از PBS و محیط کشت شست و شو داده شدند. در ادامه، نمونه‌های سلول-هیدروژل آماده سازی شده به پلیت کشت سلول 96 خانه منتقل می‌شود. نمونه‌ها با استفاده از محیط کشت DMEM حاوی FBS 10 درصد برای بازه زمانی 24، 48 و 72 ساعت درون انکوباتور CO2 5 درصد با رطوبت 95 درصد قرار داده شد. برای هر بازه زمانی تعداد 3 بار تکرار از نمونه (3 = n) و کشت در پلیت کشت سلول بعنوان نمونه کنترل در نظر گرفته شد. پس از گذشت بازههای زمانی تعریف شده، محلول MTT (10 درصد) از حجم کل محیط کشت تهیه و به هر چاهک افزوده و به مدت 3 ساعت درون انکوباتور قرار داده شد. بلورهای فرومازون تشکیل شده بعد از 3 ساعت انکوباسیون، با استفاده از DMSO حل و با استفاده از دستگاه خوانش میکروپلیت (Bio-Tek) در محدوده طول موج 570 نانومتر خوانده شد.
جدول 1- مشخصهی باکتری‌های مورد اتفاده در تست ضدمیکروبی
Table 1. Characteristics of the bacteria used in antibacterial testing
Gram Reaction | Standard Number | Bacterium name |
Positive | ATTC 25923 | Staphylococcus areus (S. aureus) |
Negative | ATTC 1330 | Escherichia coli (E. coli) |
نتایج
ساختار هیدروژل با میکروسکوپ الکترونی (SEM): بر اساس تصاویر بدست آمده از میکروسکوپ الکترونی (SEM)، ساختار هیدروژل CS دارای منافذ با ابعاد کوچکتر و سازمانیافتهتری هستند، درحالیکه با افزوده شدن عصاره میخک (CS/CEO) اندازه منافذ بزرگتر شده است. همچنین در تصاویر a1، هیدروژل CS/CEO دارای سطوح غیر یکدست و خشن می‌باشد. اما نمونه هیدروژل CS دارای سطوحی یکدست و صاف است.
طیفسنجیFourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR): در تصویر b1، طیف جذب بدست آمده در دو نمونه هیدروژل CS و CS/CEO ارائه شده است. در نمودار پیک جذبی ناحیه cm-1 3444 مربوط به کشش ارتعاشی پیوندهای N-H و O-H برای گروههای آمین و هیدروکسیل می‌باشد (22, 23). پیکهای ناحیه cm-1 1245 و 1163 به ترتیب مربوط به کشش ارتعاشی گروههای آمین پیوندهای C-N و کشش ارتعاشی نامتقارن پلهای استری پیوندهای C-O قابل مشاهده است (24). در محدود cm-1 3591 و 1609 مربوط به گروه ائوژنول در عصاره میخک می‌باشد (25). براساس پیکهای قابل مشاهده در نمودار شکل b1، وجود پلیمر کیتوسان همراه با عصاره میخک (CS/CEO) قابل تائید است.
ارزیابی فعالیت ضدمیکروبی هیدروژل‌های CS/CEO: بهمنظور ارزیابی و مقایسه فعالیت ضدمیکروبی هیدروژل تهیه شده CS/CEO، دو نمونه هیدروژل کیتوسان (CS) و عصاره میخک (CEO extract) نیز مورد مطالعه قرار گرفت. براساس تصاویر و نمودار ارائه شده در شکل b و a2، بیشترین فعالیت ضدمیکروبی علیه دو باکتری E. coli و S. aurous مربوط به عصاره استخراج شده از گیاه میخک می‌باشد. نکته قابل توجه وجود فعالیت ضدباکتریایی هیدروژل CS فاقد بارگذاری عصاره میخک است، که تائیدکننده خاصیت ضدباکتریایی کیتوسان می‌باشد. فعالیت ضدباکتریایی هیدروژل‌ها (CS و CS/CEO) و عصاره میخک علیه باکتریE. coli بیشتر از باکتری S. aureus است.
بررسی زیستسازگاری و زندهمانی سلول L929 در مجاورت هیدروژل: همانطور که تصاویر a3 قابل مشاهده است، هیدروژل CS/CEO فاقد سمیت برای سلول‌های L929 بوده یا به عبارتی زیستسازگار می‌باشد. در مقایسه نمونه تیمار شده با هیدروژل CS/CEO با نمونه کنترل تفاوتی در روند رشد و مورفولوژی سلول‌ها دیده نمی‌شود. میزان زندهمانی سلول‌های L929 با استفاده از تست MTT در مقایسه هیدروژل CS/CEO با نمونه کنترل در شکل b3 ارائه شده است. هر دو نمونه مورد مطالعه روند رشد و تکثیر سلول‌های L929 در بازه زمانی 72 ساعت دارای نرخ فزاینده است. سلول‌های L929 تیمار شده با هیدروژل CS/CEO روند رشد افزایشی را در 3 بازه زمانی نشان می دهند، به‌طوریکه در مقایسه 24 با 72 ساعت دارای سطح معنی‌داری 001/0 p < می‌باشد. این درحالی است که رشد سلولی نمونه‌های کنترل در مقایسه با تیمار شده با هیدروژل CS/CEO بیشتر است. این نکته می‌تواند بدلیل حضور عصاره میخک در نمونه هیدروژل CS باشد.
شکل 1- مشخصهیابی هیدروژل‌های سنتز شده. (a) تصاویر SEM از هیدروژل‌های CS و CS/CEO، بزرگنمایی تصاویر: 500 میکرون. (b) طیف FTIR هیدروژل‌های CS و CS/CEO.
Fig. 1. The synthesized hydrogels characterization. (a) SEM images of CS and CS/CEO hydrogels Magnification: 500 µm. (b) FTIR spectra of CS and CS/CEO hydrogels.
شکل 2- ارزیابی فعالیت ضد میکروبی هیدروژل‌های سنتز شده. (a) تصاویر فعالیت ضدمیکروبی هیدروژل‌های CS و CS/CEO در مقابل سویههای باکتری E.coli and S. aureus. (b) نمودار میانگین ناحیه بازداری بر روی محیط آگار برای E.coli and S. aureus بعد از انکوباسیون با هیدروژل‌های CS و CS/CEO.
Fig. 2. The antimicrobial activity assay of synthesized hydrogels. (a) Antimicrobial activity of images of CS and CS/CEO hydrogels against E. coli and S. aureus. strains (b) Average diameter of inhibition zone area on agar for E. coli and S. aureus after incubation of CS and CS/CEO hydrogels.
شکل 3- ارزیابیهای برونتنی. (a) تصاویر میکروسکوپ نوری سلول‌های L929 بر روی هیدروژل CS/CEO بعد از 24 ساعت انکوباسیون. کشت در پلیت کشت سلول بدون هیدروژل بعنوان کنترل در نظر گرفته شد. بزرگنمایی تصاویر x100 می‌باشد. (b) زندهمانی سلول فیبروبلاستی موشی (L929) کشت شده بر روی هیدروژل CS/CEO و کنترل در بازه زمانی 24-72 ساعت بعد از انکوباسیون.
Fig. 3. In-vitro assay. (a) Inverted microscopy images of L929 cells on CS/CEO hydrogel after 24h incubation. A plate well without hydrogel was used as a control. The magnification of images is 100x. (b) The cell viability of mouse fibroblast cells (L929) was seeded on CS/CEO hydrogel and controlled after 24-72h incubation.
بحث
پوست بعنوان بزرگترین بافت بدن دارای عملکردهای زیستی متنوعی در بدن جانداران از جمله محافظت فیزیکی، ساخت ویتامین D، امکان تعریق و تنظیم دمای بدن می‌باشد. بروز آسیب یا نقصی در ساختار پوست تحت عنوان زخم تعریف می‌شود. زخم‌های پوستی درمان نشده موجب محدودیت عملکرد فرد شده و حتی می‌تواند تهدید کننده حیات موجود زنده باشند. از این رو، مدیریت به موقع و صحیح زخم‌های پوستی یکی از چالشهای مهم حوزه بهداشت و درمان است. بر این اساس، طراحی و تهیه پانسمانهای مدرن زخم یا زخم‌پوش جزو حوزههای مطالعاتی و تحقیقاتی قابل توجه در زیستپزشکی می‌باشد (8، 26). زخم‌پوش باید قابلیت محافظت از محل آسیبدیده به همراه تامین شرایطی از جمله حفظ رطوبت محیط، قابلیت تبادل هوا، امکان تعویض بدون آسیب مجدد به بافت در حال ترمیم، تسریع روند بهبود، التیام بخش و... را داشته باشد (27، 28). جهت تامین مشخصههای ذکر شده توجه به دو نکته نوع ماده سازنده و روش ساخت زخم‌پوش حائز اهمیت است. تنوع گستردهای از مواد طبیعی و سنتزی در ساخت زخم‌پوش مورد استفاده قرار میگیرند. از جمله مواد طبیعی که در سالهای اخیر مورد توجه محققین این حوزه قرار گرفته است، پلیمر کیتوسان می‌باشد. کیتوسان محصول داستیلاسیون کیتین منشأ گرفته از سختپوستان است. این بیوپلیمر زیستسازگار و زیستتخریبپذیر بوده که ویژگیهای اولیه مورد نیاز یک زخم‌پوش می‌باشد. همچنین، خاصیت ضدمیکروبی بویژه ضدباکتریایی و ضدقارچی، تسریع روند انعقاد خون، خاصیت آنتیاکسیدان، ضدتوموری و ماهیت کاتیونیک موجب تمایز غیرقابلاغماض این پلیمر شده است (15، 29، 30). تهیه ساختاری با ماهیت کارآمد بر پایه کیتوسان به عنوان زخم‌پوش یکی از نکات کلیدی می‌باشد. با توجه به ویژگیهایی ذکر شده برای زخم‌پوش، هیدروژل‌های تنظیم شونده بواسطهی pH یکی از گزینههای مورد توجه محققین می‌باشد (31، 32). هیدروژل ساختاری زیستسازگار، منعطف، جاذب رطوبت می‌باشند (31). در میان ساختارهای هیدروژل مطرح شده، هیدروژل‌های تنظیمشونده به pH، قابليت بارگذاری ترکیبات زیستفعال را دارا می‌باشند (32). يکي از ترکيبات زيستفعال مورد توجه در تهيه زخم‌پوش عصاره بدست آمده از گياه ميخک (CEO) است. ساختار هیدروژل CS تهیه شده با استفاده از تنظیم pH و تلفیق شده با CEO بواسطهی تصویر SEM (شکل a1) مورد مطالعه قرار گرفت. براساس تصوير شکل a1، افزوده شدن CEO موجب افزايش اندازه منافذ نسبت به نمونه فاقد CEO شده است. همچنين بر اساس نمودار طيف جذبي FTIR و وجود تغيير در پيکهاي جذبي در نمونه حاوي CEO در طول موجهاي cm-1 1609 و 3591 که مربوط به گروه عاملي ائوژنول است، نسبت به هيدروژل CS تائيد کننده تلفيق و حضور CEO در هيدروژل تهيه شده است (20) (شکل b1). وجود عفونت های مقاوم به درمان آنتیبیوتیکی در مراکز درمانی نیاز به وجود خاصیت ضدباکتریایی قوی در زخم‌پوش بدون بکارگیری آنتیبیوتیکهای سنتزی برای درمان بیماران با آسیبات پوستی مورد توجه است (20). استفاده از مادهای بجز داروهای آنتیبیوتیک رایج جز اولویتهای تحقیقاتی می‌باشد. ترکیبات موثر بدست آمده از CEO علاوه بر تامین خاصیت ضدمیکروبی چشمگیر تامینکننده ویژگی ضدالتهابی نیز می‌باشند. دو مشخصه ضدمیکروبی و ضدالتهابی در CEO موجب استفاده گسترده از این ترکیب در حوزههای مختلف زیست پزشکی شده است (26، 33، 34). در مطالعه در سال 2019، از نانوفیبرهای الکتروریسی شدهی پلیکاپرولاکتون/ ژلاتین حاوی روغن میخک به عنوان زخم‌پوش استفاده شد. در این مطالعه روغن میخک جهت ایجاد ویژگی ضدباکتریایی استفاده شد. در این مطالعه افزایش غلظت روغن میخک موجب افزایش مهار رشد باکتری E. coli با افزایش زمان تیمار شده است. این در حالی است که در مورد باکتری S. aureus تا 6 ساعت نخست روند کاهش رشد باکتری را مشاهده میکنیم ولی پس 24 ساعت از گذشت تیمار میزان مهار رشد نسبت به 6 ساعت کمتر شده است (33). در مطالعه حاضر استفاده همزمان دو ترکیب با پتانسیل ضدمیکروبی پلیمر کیتوسان (CS) و عصاره میخک (CEO) موجب اثر همافزایی در تامین ویژگی ضدباکتریایی میگردد. در نتایج تست ضدباکتریایی نیز (شکل 2)، اثر مهار رشد و تکثیر باکتری در هر یک از ترکیبات به تنهایی و هیدروژل تلفیقی (CS/CEO) بهوضوح قابلمشاهده است. تمامي ساختارهاي تهيه شده در زمينه زخم‌پوش نياز به تائيد زيستسازگاري در شرايط برون تني (in vitro) دارند. در اين مطالعه از رده سلول فيبروبلاست موشي (L929) استفاده گرديد. بر اساس تصاوير ميکروسکوپي بدست آمده از تيمار سلول‌هاي L929 با هيدروژل CS/CEO هيچگونه سميت سلولي مشاهده نشد (شکل a3). در ادامه بررسي از آزمون MTT براي تعيين ميزان زندهماني سلول‌هاي تيمار شده با هيدروژل CS/CEO در بازه زماني 24 تا 72 ساعت در برابر نمونه سلول L929 کشت شده در کف پليت مورد ارزيابي قرار گرفت. براساس نمودار ارائه شده در تصوير b3، سلول‌هاي تيمار شده با هيدروژل CS/CEO داراي روند رشد فزاينده بوده است. به‌طوريکه در بازه زماني 24 تا 72 ساعت داراي سطح معنيداري (001/0 <p ) ميباشد. در مطالعه انجام شده در سال 2021، سلول فيبروبلاستي بر روي نانوالياف کيتوسان/پلياتيلناکسايد حاوي عصاره ميخک براي مدت 48 ساعت کشت داده شد. در نمونه حاوي عصاره ميخک فاقد تفاوت معنيداري نسبت به نمونه کنترل است (34). در مطالعه حاضر سه بازه زماني بويژه 24 ساعت نخست براي بررسي دقيق ويژگيهاي هيدروژل تهيه شده در برابر سلول‌هاي فيبروبلاست بعنوان مطالعات پايه جهت تعميم به مطالعات درون تني (in vivo) در نظر گرفته شد (شکل b3).
نتیجهگیری
عصاره میخک (CEO) بارگذاری شده درون هیدروژل بمنظور ارتقا ویژگیهای هیدروژل تهیه شده از پلیمر کیتوسان با موفقیت انجام شد. ویژگیهای ساختاری و شمیایی هیدروژل CS/CEO بواسطهی آزمونهای SEM و FTIR بررسی شد. ساختار هیدروژل تهیه شده فاقد سمیت برای سلول L929 بوده و به‌طور فعال از رشد باکتری‌های E. coli و S. aureus جلوگیری کرده است. براساس نتایج بدست آمده در مطالعه حاضر هیدروژل CS/CEO حساس به pH علاوه بر زیستسازگاری دارای ظرفیت آنتیباکتریایی می‌باشد. وجود مشخصه ضدباکتریایی با بهرهگیری از ترکیبات طبیعی می‌تواند راهحلی امیدبخش برای کاهش مقاومت به آنتیبیوتیکهای سنتزی در حوزه زیست پزشکی باشد. ساختار هیدروژلCS/CEO دارای قابلیت استفاده بعنوان زخم‌پوش در مطالعات تکمیلی در محیط درونتنی (in vivo) می‌باشد.
منابع
1. Anjum S, Arora A, Alam MS, Gupta B. Development of antimicrobial and scar preventive chitosan hydrogel wound dressings. Int J Pharm. 2016;508(1-2):92-101.
2. Ma L, Gao C, Mao Z, Zhou J, Shen J, Hu X, Han C. Collagen/chitosan porous scaffolds with improved biostability for skin tissue engineering. Biomaterials. 2003; 24(26):4833-4841.
3. Akbari A, Rabbani S, Irani S, Zandi M, Sharifi F, Ameli F, Mohamadali M. In vitro and in vivo study of carboxymethyl chitosan/polyvinyl alcohol for wound dressing application. J Appl Polym Sci. 2022; 139(10):51764.
4. Khorasani MT, Joorabloo A, Adeli H, Milan PB, Amoupour M. Enhanced antimicrobial and full-thickness wound healing efficiency of hydrogels loaded with heparinized ZnO nanoparticles: In vitro and in vivo evaluation. Int J Biol Macromol. 2021;166:200-212..
5. Adeli H, Khorasani MT, Parvazinia M. Wound dressing based on electrospun PVA/chitosan/starch nanofibrous mats: Fabrication, antibacterial and cytocompatibility evaluation and in vitro healing assay. Int J Biol Macromol. 2019; 122:238-254.
6. Kabirkoohian A, Bakhshi H, Irani S, Sharifi F. Chemical Immobilization of Carboxymethyl Chitosan on Polycaprolactone Nanofibers as Osteochondral Scaffolds. Appl Biochem Biotechnol. 2023;195(6):3888-3899.
7. El-Samad LM, Hassan MA, Basha AA, El-Ashram S, Radwan EH, Abdul Aziz KK, Tamer TM, Augustyniak M, El Wakil A. Carboxymethyl cellulose/sericin-based hydrogels with intrinsic antibacterial, antioxidant, and anti-inflammatory properties promote re-epithelization of diabetic wounds in rats. Int J Pharm. 2022; 629:122328.
8. Feng W, Wang Z. Biomedical applications of chitosan-graphene oxide nanocomposites. iScience. 2021; 25(1):103629.
9. Mourya VK, Inamdar NN, Tiwari A. Carboxymethyl chitosan and its applications. Advanced Materials Letters, Review Article Adv. Mat. Lett. 2010; 1(1):11-33.
10. Fei Liu X, Lin Guan Y, Yang DZ, Li, Z. Yao KD. Antibacterial action of chitosan and carboxymethylated chitosan. J Appl Polym Sci. 2001;79(7):1324-1335.
11. Li B, Cui J, Xu T, Xu Y, Long M, Li J, Liu M, Yang T, Du Y, Xu Q. Advances in the preparation, characterization, and biological functions of chitosan oligosaccharide derivatives: A review. Carbohydr Polym. 2024;332:121914.
12. Dreiss CA. Hydrogel design strategies for drug delivery. Currt Opin Colloid Interface Sci. 2020;48:1-17.
13. Zhou Y, Yang H, Liu X, Mao J, Gu S, Xu W. Electrospinning of carboxyethyl chitosan/poly(vinyl alcohol)/silk fibroin nanoparticles for wound dressings. Int J Biol Macromol. 2013;53:88-92.
14. Tamer TM, Alsehli MH, Omer AM, Afifi TH, Sabet MM, Mohy-Eldin MS, Hassan MA. Development of Polyvinyl Alcohol/Kaolin Sponges Stimulated by Marjoram as Hemostatic, Antibacterial, and Antioxidant Dressings for Wound Healing Promotion. Int J Mol Sci. 2021;22(23): 13050.
15. Moeini A, Pedram P, Makvandi P, Malinconico M, Gomez d'Ayala G. Wound healing and antimicrobial effect of active secondary metabolites in chitosan-based wound dressings: A review. Carbohydr Polym. 2020; 233:115839..
16. Sharifi F, Hasani M, Atyabi SM, Yu B, Ghalandari B, Li D, et al. Mesenchymal stem cells encapsulation in chitosan and carboxymethyl chitosan hydrogels to enhance osteo-differentiation. Mol Biol Rep. 2022; 49(12):12063-12075..
17. Zhang M, Yang M, Woo MW, Li Y, Han W, Dang X. High-mechanical strength carboxymethyl chitosan-based hydrogel film for antibacterial wound dressing. Carbohydr Polym. 2021;256:117590.
18. Caldwell MD. Bacteria and Antibiotics in Wound Healing. Surg Clin North Am. 2020; 100(4):757-776.
19. Zhang J, Ge J, Xu Y, Chen J, Zhou A, Sun L, Gao Y, Zhang Y, Gu T, Ning X. Bioactive multi-engineered hydrogel offers simultaneous promise against antibiotic resistance and wound damage. Int J Biol Macromol. 2020; 164:4466-4474..
20. Banerjee K, Madhyastha H, Sandur VR, Manikandanath NT, Thiagarajan N, Padma T. Anti-inflammatory and wound healing potential of a clove oil emulsion. Colloids Surf B Biointerfaces. 2020; 193:111102.
21. Ali R, Khamis T, Enan G, El-Didamony G, Sitohy B, Abdel-Fattah G. The healing capability of clove flower extract (CFE) in streptozotocin-induced (STZ-induced) diabetic rat wounds infected with multidrug resistant bacteria. Molecules. 2022;27(7): 2270.
22. Mohammadnezhad J, Khodabakhshi-Soreshjani F, Bakhshi H. Preparation and evaluation of chitosan-coated eggshell particles as copper (II) biosorbent. Desalin. Water Treat. 2016; 57(4):1693-1704.
23. Ray M, Pal K, Anis A, Banthia AK. Development and characterization of chitosan based polymeric hydrogel membranes. Des. Monomers Polym. 2010; 13(3):193-206.
24. Sharifi F, Atyabi SM, Norouzian D, Zandi M, Irani S, Bakhshi H. Polycaprolactone/carboxymethyl chitosan nanofibrous scaffolds for bone tissue engineering application. Int J Biol Macromol. 2018;115:243-248.
25. González-Rivera J, Duce C., Falconieri D, Ferrari C, Ghezzi L, Piras A, et al. Coaxial microwave assisted hydrodistillation of essential oils from five different herbs (lavender, rosemary, sage, fennel seeds and clove buds): Chemical composition and thermal analysis. Innovative Innov Food Sci Emerg Technol, 2016;33:308-318.
26. Parham S, Zargar Kharazi A. Cellulosic textile/clove nanocomposite as an antimicrobial wound dressing: In vitro and in vivo study. Colloids Surf B Biointerfaces. 2022;217:112659.
27. Liang H, Mirinejad MS, Asefnejad A, Baharifar H, Li X, Saber-Samandari S, et al. Fabrication of tragacanthin gum-carboxymethyl chitosan bio-nanocomposite wound dressing with silver-titanium nanoparticles using freeze-drying method. Mater Chem Phys. 2022;279(10):125770
28. Guo W, Ding X, Zhang H, Liu Z, Han Y, Wei Q, Okoro OV, Shavandi A, Nie L. Recent Advances of Chitosan-Based
Hydrogels for Skin-Wound Dressings. Gels. 2024;10(3):175.
29. Sivanesan I, Hasan N, Muthu M, Blessing G, Gopal J, Chun S, Shin J, Oh JW. Exploring the impact of chitosan composites as artificial organs. Polymers. 2022;14(8):1587.
30. Shah A, Ashames AA, Buabeid M A, Murtaza G. Synthesis, in vitro characterization and antibacterial efficacy of moxifloxacin-loaded chitosan-pullulan-silver-nanocomposite films. J Drug Deliv Sci Technol. 2020;55:101366.
31. Omidi M, Yadegari A, Tayebi L. Wound dressing application of pH-sensitive carbon dots/chitosan hydrogel. RSC Adv. 2017;7(18):10638-49.
32. Arafa AA, Nada AA, Ibrahim AY, Sajkiewicz P, Zahran MK, Hakeim OA. Preparation and characterization of smart therapeutic pH-sensitive wound dressing from red cabbage extract and chitosan hydrogel. Int J Biol Macromol. 2021;182: 1820-1831.
33. Unalan I, Endlein SJ, Slavik B, Buettner A, Goldmann WH, Detsch R, Boccaccini AR. Evaluation of electrospun poly(ε-caprolactone)/gelatin nanofiber mats containing clove essential oil for antibacterial wound dressing. Pharmaceutics. 2019;11(11):570.
34. Hameed M, Rasul A, Waqas MK, Saadullah M, Aslam N, Abbas G, et al. Formulation and evaluation of a clove oil-encapsulated nanofiber formulation for effective wound-healing. Molecules, 2021; 26(9):2491.