کلونینگ ژن استرپتوکیناز استرپتوکوکوس پایوژنز در E.coli
الهام سیاسی-تربتی
1
(استادیار میکروبیولوژی ، گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شمال، تهران، ایران)
فاطمه فخر فاطمی
2
(گروه بیوتکنولوژی- دانشکده علوم زیستی- دانشگاه آزاد اسلامی – واحد تهران شمال – تهران – ایران.)
میترا صاحی
3
()
الکلمات المفتاحية: استرپتوکیناز, استرپتوکوکوس پایوژنز, ژن ska , کلونینگ, E.coli XL1Blu,
ملخص المقالة :
سابقه وهدف- استرپتوکیناز به عنوان یک آنزیم ضد لخته خون درون عروق می باشد و از آن در درمان گرفتگی رگ های خونی در پیامدهای همچون سکته های قلبی، مغزی، ریوی و تشکیل لخته خون درون عروق استفاده می شود. اخیرا اهمیت استرپتوکیناز نوترکیب در درمان مشخص شده است. هدف از این تحقیق کلونینگ ژن استرپتوکیناز استرپتوکوکوس پایوژنز در E.coli بود. مواد و روش ها - ابتدا ژنوم باکتری استرپتوکوکوس پایوژنز استخراج شد و PCR برای ژن ska انجام شد. برای بررسی اندازه و کیفیت قطعه تکثیر یافته، الکتروفورز روی ژل آگارز صورت گرفت. سپس با کیت TA کلونینگ ژن مورد نظر وارد وکتور PTG19 گردید و پلاسمید نوترکیب حاصل به باکتری E.coli XL1-Blue داخل شد. بررسی داده های حاصل از توالی یابی قطعه کلون شده در وکتور و مقیاسه آن با توالی مرجع در بانک اطلاعاتی NCBI ، برای صحت کلونینگ این ژن انجام شد. یافته ها- نتایج نشان داد که محصول PCR ژن ska با طول bp 513 بود. این ژن اولین بار با استفاده از تکنیک TA کلونینگ در وکتور PTG19 و سلول میزبان E.coli XL1Blue کلون گردید. نتایج تعیین توالی قطعه کلون شده نشان دهنده حضور ژن ska کد کننده استرپتوکیناز بود. بحث – ژن skaتکثیر شد و با انجام تکنیک TA کلونینگ در وکتور PTG19 و سلول میزبان E.coli XL1Blue ، صحت کلونینگ مورد تایید قرار گرفت.
1- Nagamalesh UM, Prakash VS, Naidu KCK, Sarthak S, Hegde AV, Abhinay T. Acut pulmonary
thromboembolism: Epidemiology, predictors, and long-term outcome - A single center experience. Indiana
Heart J. 2017; 69(2): 160-164.
2. Monzavi N, Aghasadeghi MR, Arabi R, Memarnejadian A, Sadat M, Khanahmad H, Ebrahimi M,
Roohhvand F. Design, cloning, expression and evaluation of cysteine- substitutes of intact and truncated
molecules of streptokinase. Physiology and Pharmacology. 2010; 14 (1): 56 – 65.
3. Banerjee A, Chisti Y, Banerjee U. Streptokinase--a clinically useful thrombolytic agent. Biotechnol Advance. 2004; 22(4): 287–307.
4. Parker W, Storey R. Long-term antiplatelet therapy following myocardial infarction: implications of PEGASUS-TIMI 54. Heart. 2016; 102(10): 783–789.
5. Maheshwari N, Kantipudi S, Maheshwari A, Arora K, Vandana, Kwatra N, Sahni G. Amino-Terminal Fusion of Epidermal Growth Factor 4,5,6 Domains of Human Thrombomodulin on Streptokinase Confers Anti-Reocclusion Characteristics along with Plasmin-Mediated Clot Specificity. PLoS One. 2016; 11(3): e0150315.
6. Vellanki R, Potumarthi R, Doddapaneni K, Anubrolu N, Mangamoori L. Constitutive optimized production of streptokinase in Saccharomyces cerevisiae utilizing glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase promoter of Pichia pastoris. Biomed Res Int. 2013; 20(13): 268-249.
7. Jafari R, Mirshahi M. Production and purification of recombinant streptokinase Using pMAL expression
vector. Tehran University Medical Journal. 2007; 65(1): 13-18.
8. Lotfi A, Schweiger MJ, Giugliano G, Murphy S, Cannon CP. High-dose atorvastatin does not negatively influence clinical outcomes among clopidogrel treated acute coronary syndrome patients-a Pravastatin or Atorvastatin Evaluation and Infection Therapy-Thrombolysis in Myocardial Infarction 22 (PROVE IT-TIMI 22) analysis. Am Heart J. 2008; 155(5): 954–958.
9. Brown T. Gene cloning and DNA analysis. John Wiley & Sons Ltd press, UK. 6 th edition. 2010: 328-338.
10. Doogab Y. Genetic Engineering and its Emergence in Biotechnology. University of Chicago Press, USA. 1th edition. 2015: 103-260.
11. Kunamneni A, Abdelghani T, Ellaiah P. Streptokinase--the drug of choice for thrombolytic therapy. Journal Thromb Thrombolysis. 2007; 23(1): 9–23.
12. Kumar R, Singh J. Expression and secretion of a prokaryotic protein streptokinase without glycosylation and degradation in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 2004; 21(16): 1343–1358.
13. Adivitiya-Dagar V, Devi N, Khasa Y. High level production of active streptokinase in Pichia pastoris fed-batch culture. Int J Biol Macromol. 2016; 83: 50–60.
14. Malke H, Steiner K, Gase K, Frank C. Expression and regulation of the streptokinase gene. Methods. 2000; 21(2): 111–124.
15. Pratap J, Rajamohan G, Dikshit K. Characteristics of glycosylated streptokinase secreted from Pichia pastoris: enhanced resistance of SK to proteolysis by glycosylation. Appl Microbiol Biotechnol. 2000; 53(4): 469–475.
16. Tharp AC, Laha M, Panizzi P, Thompson MW, Fuentes-Prior P, Bock P. Plasminogen substrate recognition by the streptokinase-plasminogen catalytic complex is facilitated by Arg253, Lys256, and Lys257 in the streptokinase beta-domain and kringle 5 of the substrate. J Biol Chem. 2009; 284(29): 19511–1921.
17. Yadav S, Aneja R, Kumar P, Datt M, Sinha S, Sahni G. Identification through combinatorial random and rational mutagenesis of a substrate-interacting exosite in the gamma domain of streptokinase. J Biol Chem. 2011; 286(8): 6458–6469.
18. Molaee N, Abtahi H, Mosayebi Gh. Expression of Recombinant Streptokinase from Streptococcus
Pyogenes and its Reaction with Infected Human and Murine Sera. Iran J Basic Med Sci. 2013; 16(9): 985-
989.
19. Arabi R, Roohvand F, Noruzian, Aghasadeghi MR, Memarnejadian A, Khanahmad H, Sadat M, Motevali
F. Cloning and expression of truncated and intact streptokinase molecules in E.coli and evaluation of their
biological activities. Journal Agriculture Biotechnology. 2011; 2(1): 55-67.
20. Njadmoghadam MR, Modaresi M, Babashamsi M, Chamankhah M. Streptokinase: extraction, cloning and
high expression of active recombinant protine with facility in purification. Journal of shahid beheshti medical
science University. 2006; 30(3): 245-252.
21. Bagheri S, Maghsoudi H, Motevalli F, KhoshdelNezamiha F, Hasanzadeh SM, Arabi-Mianroodi R. Site-
Directed Mutation,Cloning and Expression of Streptokinase for reducing a New Suitable Molecule for
PEGylation. Arak Medical University Journal. 2016; 19(108): 1-10.
