تاثیر پوشش کیتوزانی حاوی نانولیپوزوم پروتئین هیدرولیز شده ضایعات میگو در کنترل لکهسیاه و افزایش ماندگاری میگوی پا سفید غربی (Litopenaeus vannamei)
الموضوعات :
سیده معصومه کمالی
1
,
بهاره شعبان پور
2
,
پرستو پورعاشوری
3
,
معظمه کردجزی
4
1 - گروه فرآوري محصولات شیلاتی، دانشکده شیلات و محیط زیست، دانشگاه علوم کشاورزي و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران.
2 - گروه فرآوري محصولات شیلاتی، دانشکده شیلات و محیط زیست، دانشگاه علوم کشاورزي و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران.
3 - گروه فرآوري محصولات شیلاتی، دانشکده شیلات و محیط زیست، دانشگاه علوم کشاورزي و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران.
4 - گروه فرآوري محصولات شیلاتی، دانشکده شیلات و محیط زیست، دانشگاه علوم کشاورزي و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران.
الکلمات المفتاحية: نانولیپوزوم, پروتئین هیدرولیز شده, لکه سیاه, ماندگاری, میگوی پا سفید غربی.,
ملخص المقالة :
در پژوهش حاضر، اثر پوشش کیتوزان حاوی نانولیپوزوم پروتئین هیدرولیز شده ضایعات میگو بر کنترل لکهسیاه و ماندگاری میگوی پا سفید غربی (Litopenaeus vannamei) طی 20 روز نگهداری در یخ مورد بررسی قرار گرفت. پروتئین هیدرولیز شده (H) با استفاده از آنزیم آلکالاز تولید شد و خواص عملکردی آن مورد سنجش قرار گرفت. همچنین اثر غلظتهای مختلف آن بر مهار آنزیم پلیفنلاکسیداز (PPO) میگو اندازهگیری شد. غلظت بهینه H با بالاترین درصد بازدارندگی آنزیم انتخاب و در نانولیپوزوم بارگذاری شده یا با کیتوزان پوشش داده شدند، سپس میگوها در این پوششها غوطهور شدند. نتایج نشان داد که پروتئین هیدرولیز شده (H) دارای محتوای پروتئین (6/81%)، درجه هیدرولیز (DH) (54/32%) و میانگین طول زنجیره پپتیدی PCL)) (07/3) است. پروتئین هیدرولیز شده با غلظت 5/1% بالاترین اثر بازدارندگی آنزیم PPO را پس از 1 و3 دقیقه با مقادیر 08/60 و 98/47% نشان داد. در آخرین روز نگهداری، تیمار Ch-N-H بهترین عملکرد را در فاکتورهای PH، ارزش پراکسید (PV) و بافت (سختی) نشان داد (05/0 P <). تغییرات رنگ در تیمار N-H کمترین مقدار را داشت (05/0 P <). نتایج بازهای نیتروژنه فرار (TVN) نشان داد میگوهای تیمار Ch-N-H 16 روز قابلیت ماندگاری در یخ را دارند. لکهسیاه میگوهای تیمار شده با انواع پوششهای پروتئین هیدرولیز شده به طور معنیداری کمتر از تیمار شاهد بود. این نتایج نشان میدهد که ریزپوشانی پروتئین هیدرولیز شده با نانولیپوزوم و پوشش کیتوزان میتواند در کنترل لکه سیاه و افزایش ماندگاری میگو به عنوان یک جایگزین طبیعی مناسب برای متابیسولفیتسدیم موثر واقع شود.
1. Adler-Nissen, J. 1986. A Review of food hydrolysis specific areas. In: Enzymic hydrolysis of food proteins, J. Adler-Nissen (Ed.), Elsevier Applied Science Publishers, Copen hagen, Denmark pp. 57–109.
2. Altunkaya A. Effect of whey protein concentrate on phenolic profile and browning of fresh-cut lettuce (Lactuca sativa). Food Chemistry 2011; 128: 754-760.
3. AOAC, 2005. Official methods of analysis. (Sixteenth Ed.) Association of Official Analytical Chemists, Washington DC. USA
4. Arancibia M. Y, Lopez-Caballero M. E, Gomez-Guillen M. C, Montero P. Chitosan coatings enriched with active shrimp waste for shrimp preservation. Food Control. 2015; 54: 259-266.
5. Cahú T. B, Santos S. D, Mendes A, Córdula C. R, Chavante S. F, Carvalho L. B, et al. Recovery of protein, chitin, carotenoids and glycosaminoglycans from Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) processing waste. Process Biochemistry. 2012; 47: 570–577.
6. Colakoglu F. A, Ormanci H. B, Altin A. Determination of the shelf life of fresh shrimp (Parapaneus longirostris) treated with Frische-star. Ege Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 2006; 23(1/3): 383–386.
7. Connell, J. J. 1995. Intrinsic quality. In control of fish quality (pp. 5-36). London, UK: Fishing News Books/Blackwell Science.
8. Donsì F, Annunziata M, Vincensi M, Ferrari G. Design of nanoemulsion-based delivery systems of natural antimicrobials: effect of the
emulsifier. Journal of Biotechnology. 2012; 159 (4): 342–350.
9. Fan W, Sun J, Chen Y, Qiu J, Zhang Y, Chi Y. Effects of chitosan coating on quality and shelf life of silver carp during frozen storage. Food chemistry. 2009; 115(1): 66-70.
10. Farajzadeh F, Motamedzadegan A, Shahidi S. A, Hamzeh S. The effect of chitosan-gelatin coating on the quality of shrimp (Litopenaeus vannamei) under refrigerated condition. Food control. 2016; 67: 163-170.
11. Firdous A, Ringø E, Elumalai P. Effects of green tea and amla extracts on quality and melanosis of Indian white prawn (Fenneropenaeus indicus, Milne Edwards, 1837) during chilled storage. Aquaculture and fisheries. 2021; 6: 617–627.
12. Fonkwe L. G, Singh R. K. Protein recovery from enzymatically deboned turkey residue by enzymic hydrolysis. Process Biochemistry. 1996; 31: 605.
13. Gibis M, Ruedt C, Weiss J. In vitro release of grape-seed polyphenols encapsulated from uncoated and chitosan-coated liposomes. Food Research International. 2016; 88: 105–113.
14. Girelli A. M, Mattei E, Messina A, Tarola A. M. Inhibition of polyphenol oxidases activity by various dipeptides, Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2004; 52: 2741-2745.
15. Guerard F, Sumaya-Martinez M. T, Laroque D, Chabeaud A, Dufosse L. Optimization of free radical scavenging activity by response surface methodology in the hydrolysis of shrimp processing discards. Process Biochemistry. 2007; 42: 1486–1491.
16. Haard, N. F. 1992. Biochemistry and chemistry of color and color change in seafoods. Advances in seafood biochemistry: Composition and quality, 305–360.
17. Jean W. G, Sharron L.O. Comparison of refractometer and biuret methods for total protein measurement in body cavity fluids. Veterinary Clinical Pathology. 2001; 30(1): 16-18.
18. Jiménez A, Sánchez-González L, Desobry S, Chiralt A, Arab Tehrany E. Influence of nanoliposomes incorporation on properties of film forming dispersions and films based on corn starch and sodium caseinate. Food Hydrocolloids. 2014; 35: 159-169.
19. Kamali M, Shabanpour B, Pourashouri P, Kordjazi M. Effect of chitosan-coated Ulva intestinalis sulfated polysaccharide nanoliposome on melanosis and quality of Pacifc white shrimp during ice storage. International Journal of Biological Macromolecules. 2023; 230: 123275.
20. Kilincceker O, Dogan I. S, Kucukoner E. Effect of edible coatings on the quality of frozen fish fillets. LWT-Food science and technology. 2009; 42(4): 868-873.
21. Kristinsson H. G, Rasco B. A. Fish protein hydrolysates: production, biochemical, and functional properties. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2000; 40(1): 43-81.
22. Lee E. H., Lim S. J, Lee M. K. Chitosan-coated liposomes to stabilize and enhance transdermal delivery of indocyanine green for photodynamic therapy of melanoma. Carbohydrate Polymers. 2019; 224: 115-143.
23. Lee S. Y, Wang R, Sorderhall K. A lipopolysaccharide- and β-1, 3-glucan-binding protein from hemocytes of the freshwater crayfish Pacifastacus leniusculus purification, characterization, and cDNA cloning. Journal of Biological Chemistry. 2000; 275: 1337-1343.
24. Li T, Li J, Hu W, Li X. Quality enhancement in refrigerated red drum (Sciaenops ocellatus) fillets using chitosan coatings containing natural preservatives. Food Chemistry. 2013;138 (2-3): 821-826.
25. Liaset B, Nortvedt R, Lied E, Espe M. Studies on the nitrogen recovery in enzymic hydrolysis of Atlantic salmon (Salmosalar, L). frames by Protamex MT protease. Process Biochemistry. 2002; 37:1263–1239.
26. Lu Q, Li D. C, Jiang J. G. Preparation of a tea polyphenol nanoliposome system and its physicochemical properties. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2011; 59(24): 13004-13011.
27. Luo Z, Qin Y, Ye Q. Effect of nano-TiO2-LDPE packaging on microbiological and physicochemical
quality of Pacific white shrimp during chilled storage. International Journal of Food Science and Technology. 2015; 50: 1567–1573.
28. McEvily A. J, Iyengar R, Otwell S. 1991. Sulfit alternative prevents shrimp melanosis. Food Technology. 1991; 45: 80-86.
29. Mehdizadeh A, Shahidi S. A, Shariatifar N, Shiran M, Ghorbani A, Sarae H, Evaluation of chitosan-zein coating containing free and nano-encapsulated Pulicaria gnaphalodes (Vent.) Boiss. Extract on quality attributes of rainbow trout. Journal of Aquatic Food Product Technology. 2021; 30 (3): 1–14.
30. Mehdizadeh A, Shahidi S. A, Shariatifar N, Shiran M, Ghorbani A, Saraei, H. Physicochemical characteristics and antioxidant activity of the chitosan/zein flms incorporated with Pulicaria gnaphalodes L. extract-loaded nanoliposomes. Journal of Food Measurement and Characterization. 2022; 16: 1252–1262.
31. Montero P, Avalos A, Perez-Mateos M. Characterization of polyphenoloxidase of prawns (Penaeus japonicus). Alternatives to inhibition - additives and high - pressure treatment. Food Chemistry. 2001; 75(3): 317-324.
32. Nirmal N. P, Benjakul S. Effect of ferulic acid on inhibition of polyphenoloxidase and quality changes of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) during iced storage. Food Chemistry. 2009; 116(1): 323–331.
33. Ovissipour M, Abedian A. M, Motamedzadegan A, Rasco B, Safari R, Shahiri H. The effect of enzymatic hydrolysis time and temperature on the properties of protein hydrolysates from Persian sturgeon (Acipenser persicus) viscera. Food Chemistry. 2009; 115: 238-242.
34. Pabast M, Shariatifar N, Beikzadeh S, Jahed G. Effects of chitosan coatings incorporating with free or nano-encapsulated Satureja plant essential oil on quality characteristics of lamb meat. Food Control. 2018; 91: 185–192.
35. Sallam K. I, Ishioroshi M, Samejima K. Antioxidants and antimicrobial effects of garlic in chicken sausage. Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie (LWT). 2004; 37(8): 849–855.
36. Wang Q, Lei J, Ma J, Yuan G, Sun H. Effect of chitosan-carvacrol coating on the quality of Pacific white shrimp during iced storage as affected by caprylic acid. International Journal of Biological Macromolecules. 2018; 106: 123-129.
37. Wang Y, Liu L, Zhou J, Ruan X, Lin J, Fu L. Effect of chitosan nanoparticle coatings on the quality changes of postharvest whiteleg shrimp, Litopenaeus vannamei, during storage at 4 ºC. Food and Bioprocess Technology. 2014; 8(4): 907-915.
38. Xia H, Tang Y, Huang R, Liang J, Ma S, Chen D, Feng Y, Lei Y, Zhang Q, Yang Y, Huang Y. Nanoliposome use to improve the stability of phenylethyl resorcinol and serve as a skin penetration enhancer for skin whitening. Coatings. 2022; 12: 362.
39. Yu S. H, Hsieh H. Y, Pang J. C, Tang D. W, Shih C. M, Tsai M. L, et al. Active films from water-soluble chitosan/cellulose composites incorporating releasable caffeic acid for inhibition of lipid oxidation in fish oil emulsions. Food Hydrocolloids. 2013; 32: 9–19.
40. Yuan G, Lv H, Tang W, Zhang X, Sun H. Effect of chitosan coating combined with pomegranate peel extract on the quality of Pacific white shrimp during iced storage. Food Control. 2016; 59: 818-823.
41. Zhang B, Ma L. K, Deng S. G, Xie C. Qiu X. H. Shelf-life of pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) as affected by weakly acidic electrolyzed water ice-glazing and modified atmosphere packaging. Food Control. 2015; 51: 114-121.
Journal of Innovation in Food Science and Technology , Vol 17, No 1, Spring 2025
Homepagr: https://sanad.iau.ir/journal/jfst E-ISSN: 2676-7155
(Original Research Paper)
The Effect of Chitosan Coating Containing Hydrolyzed Protein Nanoliposome of Shrimp Waste in Controlling Black Spot and Increasing Shelf Life of White Leg Shrimp
(Litopenaeus vannamei)
Seyyedeh Masumeh Kamali1, Bahareh Shabanpour1*, Parastoo Pourashouri1, Moazameh Kordjazi1
1-Department of Sea Food Processing, Faculty of Fisheries and Environmental Sciences, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran.
Received:25/11/2022 Accepted:14/02/2023
Abstract
In this study, the effect of chitosan coating containing hydrolyzed protein nanoliposome of shrimp waste on black spot control and shelf life of white leg shrimp (Litopenaeus vannamei) during 20 days storage in ice was investigated. Hydrolyzed protein (H) was produced using alcalase enzyme and its functional properties were measured. Also, the effect of its different concentrations on inhibiting the enzyme polyphenol oxidase (PPO) of shrimp was measured. The optimal concentration of H with the highest percentage of enzyme inhibition was selected and loaded into nanoliposomes or coated with chitosan, then the shrimps were immersed in these coatings. The results showed that hydrolyzed protein (H) has protein content (81.6%), degree of hydrolysis (DH) (32.54%), and an average length of the PCL peptide chain (3.07%). Hydrolyzed protein with a concentration of 1.5% showed the highest inhibitory effect of PPO enzyme after 1 and 3 minutes with values of 60.08 and 47.98%. On the last day of storage, the Ch-N-H treatment showed the best performance in the factors of pH, peroxide value (PV), and texture (Hardness) (P < 0.05). Color changes in the N-H treatment had the lowest value (P <0.05). The results of volatile basic nitrogen (TVN) showed that shrimps treated with Ch-N-H can be kept in ice for 16 days. The black spot of shrimps treated with different types of hydrolyzed protein coatings was significantly lower than the control treatment. These results show that hydrolyzed protein microencapsulation with nanoliposome and chitosan coating can be effective in controlling black spot and increasing shelf life of shrimp as a suitable natural alternative to sodium metabisulfite.
Key words: Nanoliposome, Hydrolyzed Protein, Black Spot, Shelf Life, White Leg Shrimp.
*Corresponding Author: b_shabanpour@yahoo.com
E-ISSN: 2676-7155 سایت مجله: https://sanad.iau.ir/journal/jfst
(مقاله پژوهشی)
تاثیر پوشش کیتوزانی حاوی نانولیپوزوم پروتئین هیدرولیز شده ضایعات میگو در کنترل لکهسیاه و افزایش ماندگاری میگوی پا سفید غربی
(Litopenaeus vannamei)
سیده معصومه کمالی1، بهاره شعبانپور1*، پرستو پورعاشوری1، معظمه کردجزی1
1-گروه فرآوري محصولات شیلاتی، دانشکده شیلات و محیط زیست، دانشگاه علوم کشاورزي و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران.
تاریخ دریافت:04/09/1401 تاریخ پذیرش: 25/11/1401
چکیده
در پژوهش حاضر، اثر پوشش کیتوزان حاوی نانولیپوزوم پروتئین هیدرولیز شده ضایعات میگو بر کنترل لکهسیاه و ماندگاری میگوی پا سفید غربی (Litopenaeus vannamei) طی 20 روز نگهداری در یخ مورد بررسی قرار گرفت. پروتئین هیدرولیز شده (H) با استفاده از آنزیم آلکالاز تولید شد و خواص عملکردی آن مورد سنجش قرار گرفت. همچنین اثر غلظتهای مختلف آن بر مهار آنزیم پلیفنلاکسیداز (PPO) میگو اندازهگیری شد. غلظت بهینه H با بالاترین درصد بازدارندگی آنزیم انتخاب و در نانولیپوزوم بارگذاری شده یا با کیتوزان پوشش داده شدند، سپس میگوها در این پوششها غوطهور شدند. نتایج نشان داد که پروتئین هیدرولیز شده (H) دارای محتوای پروتئین (6/81%)، درجه هیدرولیز (DH) (54/32%) و میانگین طول زنجیره پپتیدی PCL)) (07/3) است. پروتئین هیدرولیز شده با غلظت 5/1% بالاترین اثر بازدارندگی آنزیم PPO را پس از 1 و3 دقیقه با مقادیر 08/60 و 98/47% نشان داد. در آخرین روز نگهداری، تیمار Ch-N-H بهترین عملکرد را در فاکتورهای PH، ارزش پراکسید (PV) و بافت (سختی) نشان داد (05/0 P <). تغییرات رنگ در تیمار N-H کمترین مقدار را داشت (05/0 P <). نتایج بازهای نیتروژنه فرار (TVN) نشان داد میگوهای تیمار Ch-N-H 16 روز قابلیت ماندگاری در یخ را دارند. لکهسیاه میگوهای تیمار شده با انواع پوششهای پروتئین هیدرولیز شده به طور معنیداری کمتر از تیمار شاهد بود. این نتایج نشان میدهد که ریزپوشانی پروتئین هیدرولیز شده با نانولیپوزوم و پوشش کیتوزان میتواند در کنترل لکه سیاه و افزایش ماندگاری میگو به عنوان یک جایگزین طبیعی مناسب برای متابیسولفیتسدیم موثر واقع شود.
واژه های کلیدی: نانولیپوزوم، پروتئین هیدرولیز شده، لکهسیاه، ماندگاری، میگوی پا سفید غربی.
*مسئول مکاتبات: b_shabanpour@yahoo.com
1- مقدمه
در طول دو دهه گذشته مصرف میگو و همچنین محصولات غذایی حاوی میگو به صورت تجاری توسعه یافته است. با این حال، این توسعه، تولید ضایعات از صنایع غذاهای دریایی را افزایش میدهد. تقریباً 45-48٪ وزنی مواد خام میگو بسته به گونه به عنوان ضایعات دور ریخته میشود. چندین مطالعه نشان دادهاند که پوسته میگو ممکن است به عنوان منبع بالقوه مواد تشکیل دهنده کاربردی باشد و میتواند به عنوان ماده خام برای تولید محصولات با ارزش افزوده استفاده شود. ضایعات میگو از 18 تا 40 درصد پروتئین، 35 درصد مواد معدنی و 14 تا 30 درصد کیتین تشکیل شده است (5). پروتئینهای هیدرولیز شده محصولاتی هستند که از نظر شیمیایی یا بیولوژیکی پروتئینها را به پپتیدهایی با اندازههای مختلف تجزیه میکنند. محققان همچنین به تولید پروتئینهای هیدرولیز شده و پپتیدهای فعال زیستی از محصولات جانبی دریایی به دلیل محتوای پروتئین بالا توجه کردهاند. هیدرولیز آنزیمی، به ویژه آنزیم میکروبی آلکالاز، فرآیندی نسبتا ساده، موثر و کارآمد است که از تخریب پروتئینها نسبت به هیدرولیز با مواد شیمیایی مانند اسیدکلریدریک، سدیم هیدروکسید و هیدروکسید پتاسیم جلوگیری میکند. در مقایسه با سایر آنزیمها، آلکالاز با بالاترین درجه هیدرولیز میتواند هیدرولیز را در زمان نسبتاً کوتاهی و در pH قلیایی انجام دهد و به دلیل مصرف کم این آنزیم و بازده بالا مقرون به صرفه میباشد (21). این ترکیبات نقشهاي بیولوژیکی مهمی را در سطوح سلولی ایفا میکنند. بسیاری از گزارش‌ها نشان دادهاند که پروتئینها و پپتیدهای فعال زیستی مشتق شده طبیعی، مانند پروتئین ابریشم، پروتئین گندم و پروتئین برنج، میتوانند فعالیت پلیفنلاکسیداز را مهار کنند (2). لکه سیاه یک مکانیسم طبیعی پس از مرگ است که شامل یک کمپلکس آنزیمی پلیفنل اکسیداز1 است و در حضور اکسیژن ترکیباتی را تشکیل میدهد که میتوانند به رنگدانه های نامحلول پلیمریزه شوند (28). لکهسیاه در میگو ارزش بازار آن را به شدت کاهش میدهد و منجر به زیان مالی قابل توجهی میشود. ترکیبات سولفیت اغلب برای غلبه بر یا کاهش لکهسیاه در میگو و سختپوستان استفاده میشوند، اما در سال‌های اخیر واکنشهای نا مطلوب و آلرژیزا در مواد سولفیتی جستجو برای روش‌های جایگزین برای کاهش ملانوز، با استفاده از ترکیبات با منشاء طبیعی ضروری به نظر میرسد. بنابراین میتوان به جای سولفیتها از پروتئینها برای سرکوب PPO استفاده کرد. ضایعات میگو به دلیل این که حجم بالایی از محصول را تشکیل میدهند از این رو تبدیل آن ها به یک محصول با ارزش افزوده هم میتواند مشکلات زیست محیطی ناشی از دور ریز این ضایعات را کم کند و همچنین در طی فرآوری و تولید پروتئین هیدرولیز شده میتوان از باقیمانده مواد کیتینی حاصل، کیتوزان تولید کرد که از نظر اقتصادی مقرون به صرفه باشد (5). به عبارتی چندین محصول با ارزش افزوده با قابلیتهای زیستی تولید میشودکه دارای خواص زیستفعال بالایی هستند. با این حال، يكي از مشكلات اساسي كه به طور عمده كاربرد تركيبات طبيعي را در صنايع غذايي و دارويي محدود میسازد، كارايي پايين ناشي از حساسيت به شرايط محيطي و كاهش پايداري در طي فرايند و نگهداري و دسترسي زيستي پايين آنها است (26). ریزپوشانی روشی برای محافظت از ترکیبات در برابر واکنشهای ناخواسته، افزایش پایداری آنها در برابر عوامل نامطلوب محیطی، محدود کردن واکنش احتمالی آن ها با ترکیبات غذایی، حفظ ثبات و کنترل انتشار هدفمند آن ها است. این یک راه حل موثر برای غلبه بر این چالشها است (34). نانولیپوزومها مقاومت بیشتری در برابر ناپایداری نشان میدهند و همچنین میتوانند اثربخشی و پایداری مواد محصور شده را افزایش دهند (29). نانولیپوزومها نیز با موانعی در کپسوله‌سازی ترکیبات کاربردی و تقویت فرمول‌های غذایی مختلف از جمله دوام فیزیکی پایین، حساسیت بالا به تنش‌های دما و آزادسازی سریع ترکیبات بارگذاری شده در طول نگهداری مواجه هستند. رویکرد جدید پوشش‌دهی نانولیپوزومها با ترکیبات خوراکی
[1] 1- PPO
میتواند بر محدودیت ذکر شده و چالش تثبیت نانولیپوزومها در سطح غذا غلبه کند. این استراتژی در تعدیل آزادسازی ترکیبات زیست فعال موثر است. همچنین میتواند اثر مواد محصور شده را بر روی سطح جامد محصولات طولانیتر کند و عملکرد پوششهای خوراکی را افزایش دهد (8). پوشش کیتوزان منجر به پایداری بهتر لیپوزومها در طول فرآوری و نگهداری میشود، از شرایط محیطی نامطلوب و تخریب محافظت میکند و از تعامل با ترکیبات غذا جلوگیری میکند (13). از سوی دیگر، پوششهای زیست تخریب‌پذیر مانند کیتوزان به دلیل فعالیت‌های ضد میکروبی ذاتی، اثرات هم افزایی در ترکیب با مواد دیگر از خود نشان میدهند. علاوه بر این، برخی مطالعات دیگر پایداری لیپوزومها و پراکندگی همگن آن ها را در ساختار فیلم کیتوزان گزارش کردهاند (30). یک مطالعه نشان داده است که نانولیپوزومهای بارگذاری شده با فنیل اتیل رزورسینول یک سیستم تحویل مناسب برای مهار فعالیت تیروزیناز و ملانین در پوست هستند (38). علاوه بر این، لیپوزومهای پوشش داده شده با کیتوزان برای درمان ملانوم موضعی پوست موثر هستند (22). در این راستا، در تحقیق حاضر، تولید و شناسایی پروتئین هیدرولیز شده از ضایعات میگو با استفاده از آنزیم تجاری آلکالاز انجام شد و با غلظتهای مختلف بر مهار آنزیم پلی فنل اکسیداز میگو مورد ارزیابی قرار گرفت. سپس بهترین غلظت با بیشترین اثر بازدارندگی بر روی آنزیم PPO انتخاب و در نانولیپوزوم بارگذاری و با کیتوزان پوشش داده شدند. در نهایت، تأثیر پوششهای مختلف بر ویژگیهای شیمیایی، رنگ، بافت، و لکه سیاه میگو (Litopenaeus vannamei) در طی 20 روز نگهداری در یخ مورد بررسی قرار گرفت.
2- مواد و روشها
2-1- آمادهسازی پروتئین هیدرولیز شده
ضایعات میگو از بازار ماهی فروشان گرگان تهیه شد و پس از انتقال به آزمایشگاه فرآوری دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان در آسیاب با نیتروژن مایع خرد و پودر شد. آلکالاز با فعالیت 4/2 واحد آنسون (AU/kg) وچگالی 18/1 گرم در میلی لیتر از شرکت نووازیم دانمارک در تهران تهیه شد. تجزیه و تحلیل کلدال برای تعیین مقدار پروتئین برای محاسبه مقدار نمونه مورد نیاز برای فرآیند هیدرولیز بر اساس نسبت آنزیم به پروتئین با استفاده از روش AOAC (2005) استفاده شد (3). آزمایش هیدرولیز در ارلن مایر شیشهای در شرایط کنترل شده با استفاده از pH متر مطابق روش جرارد و همکاران (2007) با تغییرات جزئی انجام شد (15). برای اطمینان از غیرفعال شدن آنزیم‌های درون‌زای ضایعات میگو، 100 گرم ضایعات آسیاب شده میگو با آب دیونیزه شده مخلوط شد و به مدت 20 دقیقه در آب جوش قرار داده شد. سپس نمونه به مدت 1 ساعت در دمای 50 درجه سانتیگراد در یک ارلن مایر با صفحه داغ، دماسنج و pH متر ارتعاشی هیدرولیز شد. مقدار کمی از هیدروکسید سدیم 4 مولار و یا هیدروکلراید 4 مولار اضافه شد تا pH 8 ثابت بماند. واکنش با حرارت دادن نمونه در آب جوش به مدت 20 دقیقه تکمیل شد که آلکالاز را غیرفعال کرد. سپس پروتئین هیدرولیز شده پس از سانتریفیوژ کردن مخلوط واکنش در g4000 به مدت 15 دقیقه به دست آمد. سپس مایع رویی جمعآوری و در فریزر ºC80- نگهداری شد و پس از آن در دستگاه خشککن انجمادی (فریز درایر) به صورت پودر درآمد. از پروتئین هیدرولیز شده مایع برای تعیین خواص عملکردی استفاده شد.
2-2- سنجش خواص عملکردی پروتئین هیدرولیز شده
میزان کل پروتئین در مواد خام (25/6 N ×) با دستگاه کجلدال به روش AOAC(2005) اندازهگیري شد (3). غلظت پروتئین در نمونه پروتئین هیدرولیز شده به روش بیورت با اندازهگیري شدت جذب در طول موج540 نانومتر اندازهگیری شد (17). براي رسم منحنی استاندارد از سرم آلبومین گاوي خالص استفاده گردید. بازده محصول بر اساس وزن ضایعات میگو با استفاده از معادله 1 محاسبه شد. درجه هیدرولیز1 با روش فونك و سينگ (1996) به كمك
[1] - DH
تريكلرواستيك اسيد1 اندازهگيري شد (12). مبناي اين روش اندازهگيري درصد نسبت پروتئينهاي محلول در تريكلرواستيك اسيد 10 درصد به كل پروتئينهاي موجود در نمونه ميباشد. سپس مقدار پروتئين در فاز محلول اندازهگيري و ميزان درجه هيدروليز از طريق معادله 2 محاسبه گرديد. میانگین طول زنجیره پپتیدی2 بر اساس معادله 3 معرفی شده توسط آدلر- نیسن و اولسن (1986) در نمونه تخمین زده شد (1).
(1) 100 × (ضایعات میگو (g)/ پروتئین هیدرولیز شده تولیدی (g)) = بازده (%)
(2) 100 × (مقدار پروتئین نمونه/پروتئین محلول درTCA 10 %) DH = (%)
(3) DH /100PCL =
2-3- استخراج آنزیم پلیفنلاکسیداز (PPO) میگو
آنزیم PPO با استفاده از روش نیرمال و بنجاکول (2009) با تغییرات جزئی استخراج گردید (32). سفالوتوراکسهای چندین میگو جدا و با نیتروژن مایع آسیاب و پودر شدند. بافر فسفات سدیم (150 میلیلیتر، باpH 2/7، حاویNaCl 1 مولار) و2/0% بریج-35 به مخلوط حاصل اضافه شد. سپس مخلوط در سانتریفیوژ یخچالدار (Eppendorf Centrifuge, 5810R, Germany) با دورg8000 به مدت 30 دقیقه سانتریفیوژ شد. به مایع رویی سولفات آمونیوم جامد اضافه شد تا 40 درصد اشباع به دست آید و در یخچال به مدت نیم ساعت نگهداری شد. رسوب حاصله با سانتریفیوژ جمعآوری شد و با بافر فسفاتسدیم در سه برابر حجم خود مخلوط شد. نمونه در کیسه دیالیز 12 ساعت در یخچال نگهداری شد تا دیالیز انجام شود، با جایگزینی بافر جدید با بافر قبلی سه بار دیالیز صورت گرفت. در نهایت با سانتریفیوژ مواد تهنشین شده جدا گردید و از فاز آبی به عنوان آنزیم PPO استفاده گردید. با استفاده از L-DOPA به عنوان یک سوبسترا ظرفیت فعالیت آنزیم با روش نیرمال و بنجاکول (2009) با تغییرات جزئی اندازهگیری شد (32). فعالیت آنزیم (1/0 میلیلیتر) به صورت رنگ سنجی در ترکیب با L-DOPA (6/0 میلیلیتر)، بافر فسفاتسدیم (4/0 میلیلیتر)، آب دیونیزه و تولید دوپاکروم در 475 نانومتر به مدت 3 دقیقه در دمای 45 درجه سانتیگراد توسط اسپکتروفتومتر UV (Biochrom، Libra S12, UK) اندازهگیری شد. یک واحد فعالیت آنزیم پلیفنلاکسیداز، افزایش در جذب به میزان 001/0 در نظر گرفته شد. بلانکهای آزمایش با حذف آنزیم و سوبسترا و جایگزینی آنها با آب در محلول واکنش ساخته شد.
2-4- ارزیابی بازدارندگی آنزیم PPO توسط پروتئین هیدرولیز شده
پروتئین هیدرولیز شده (1/0 میلیلیتر) با غلظتهای مختلف 1، 2، 3 و 4 درصد در حجم مساوی با آنزیم PPO مخلوط شد تا غلظتهای نهایی 5/0، 1، 5/1 و 2 درصد (w/v) به دست آید ودر دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت نیم ساعت نگهداری شد. سپسL-DOPA 15 میلیمولار 45 درجه سانتیگراد و بافر سنجش (4/0 میلیلیتر) به آن اضافه شد (32). اثر بازدارندگی آنزیم PPO توسط غلظتهای مختلف پروتئین هیدرولیز شده با ثبت اعداد جذب در 210 ثانیه (هر 30 ثانیه) اندازهگیری شد و فعالیت بازدارنده به صورت درصد مهار با فرمول زیر محاسبه گردید:
100 × ](فعالیت آنزیمPPO )/(فعالیت آنزیم PPO در حضور پروتئین هیدرولیز شده - فعالیت آنزیم PPO)[ = (%) مهار آنزیم
2-5- آمادهسازی نانولیپوزوم
محلولی حاوی 5 درصد (وزنی/وزنی) لسیتین با مخلوط کردن لسیتین با آب مقطر ساخته شد. در دمای اتاق، سوسپانسیون به مدت 4 ساعت مخلوط شد. برای به دست آوردن سوسپانسیون کلوئیدی، مخلوط به مدت 180 ثانیه در فرکانس 40 کیلوهرتز و توان 40 درصد (1 ثانیه روشن و 1 ثانیه خاموش) فراصوت (Topsonics Sonicator، ایران) شد (18). نانولیپوزومها در بطریهای استریل در دمای 4 درجه سانتیگراد در تاریکی نگهداری شدند.
2-6- تهیه محلولهای پوششی آزمایش
محلول کیتوزان 1 درصد (90 درصد درجه استیلاسیون و وزن مولکولی 25 کیلو دالتون) در اسید استیک (1 درصد) تهیه شد و به مدت 1 ساعت هم زده شد. محلول 5/1% پروتئین هیدرولیز شده (H) در آب مقطر ساخته شد. (H)
[1] - TCA
[2] - PCL
در محلول نانولیپوزوم (100 میلیلیتر) حل شد تا محلول نانولیپوزوم حاوی پروتئین هیدرولیز شده (N-H) به دست آید. (H) به محلول کیتوزان اضافه شد تا پروتئین هیدرولیز شده با پوشش کیتوزان (Ch-H) به دست آید. سپس 20 میلی لیتر محلول نانولیپوزوم حاوی (H) با 80 میلی لیتر محلول کیتوزان (v/v) به مدت 48 ساعت درتاریکی مخلوط شد تا محلول نانولیپوزوم حاوی پروتئین هیدرولیز شده در پوشش کیتوزان (Ch-N-H) بدست آید (18).
2-7- جمعآوری و آماده سازی نمونههای میگو
میگوی پا سفید غربی (Litopenaeus vannamei) با وزن حدود 17- 16 گرم از سایت پرورش میگوی گمیشان در استان گلستان خریداری شد. نمونهها به صورت تازه و بدون هیچ نوع افزودنی در مخلوط یخ با نسبت وزنی (1:2) نگهداری و به آزمایشگاه فرآوری دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان منتقل شدند. سپس با آب سرد شسته و در یخ نگهداری شدند. میگوها بلافاصله برای اعمال پوششها و تیماربندی مورد استفاده قرار گرفتند.
2-8- غوطهوری میگو در محلولهای پوششی
میگوها به طور تصادفی به 6 گروه کنترل (Con)، متابیسولفیت سدیم (Met)، پوششهای پروتئین هیدرولیز شده (H)، نانولیپوزوم حاوی پروتئین هیدرولیز شده (N-H)، پروتئین هیدرولیزشده با پوشش کیتوزان (Ch-H) و نانولیپوزوم حاوی پروتئین هیدرولیزشده در پوشش کیتوزان (Ch-N-H) تقسیم شدند. میگوهای گروههای مختلف به ترتیب در محلولهای موردنظر با نسبت میگو به محلول 2 :1 (w/v) در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه غوطهور شدند. پس از غوطهور شدن، میگوها به مدت 3 دقیقه در دمای اتاق آبکش شدند. بخش دیگری از میگوها با 25/1% متابیسولفیتسدیم حل شده در آب مقطر به نسبت میگو/ محلول 2 :1 (w/v) به مدت 1 دقیقه تیمار شدند (40). نمونههای هر تیمار در کیسههای پلاستیکی زیپدار و در یخ با نسبت میگو به یخ 2 :1 (w/w) در جعبههای یونولیت قرار داده شدند و سپس در یخچال نگهداری شدند. هر دو روز، یخ ذوب شده برداشته میشد و با حجم مساوی از یخ دوباره پر میشد تا نسبت میگو به یخ حفظ شود.
2-9- ارزیابی آزمایشهای شیمیایی
2-9-1- pH
تقریباً 2 گرم میگوی پوست کنده با آب مقطر (1:2) (w/v) در دمای اتاق به مدت 5 دقیقه همگن شد. با استفاده از pH متر دیجیتال (Metrohm, Switzerland, 713) pH تعیین شد (40). آزمایشها در سه تکرار انجام شد.
2-9-2- بازهای نیتروژنه فرار1
مطابق روش (2005)AOAC در دستگاه سوکسله، 5 گرم نمونه به 2 گرم اکسید منیزیم در یک فلاسک حرارتی حاوی آب مقطر اضافه شد. در ظرف دریافت کننده، چند قطره نشانگر فنل فتالئین به اسید بوریک (2 درصد) اضافه شد (3). در قسمت بعدی به دو مخزن (گرمایش و دریافتکننده) وصل و دمای آب کنترل شد. پس از 3 دقیقه، تقطیر متوقف شد. محتوای فلاسک گیرنده با اسید H2SO405/0 نرمال تا نقطه پایانی تیتر شد. بازهای نیتروژنه فرار به شرح زیر تعیین شد.
(4)
TVN (mg/100g) = (V×N×100×14) / W
V = حجم H2SO4 مورد استفاده برای نمونه (ml)
N = نرمالیته H2SO4، W = وزن نمونه بر حسب گرم.
2-9-3- ارزش پراکسید2
مقدار پراکسید با توجه به روش سالام و همکاران تعیین شد (35).3 گرم نمونه در یک ارلن در دمای60 درجه سانتیگراد در حمام آب حرارت داده شد تا چربی ذوب شود. ظرف به مدت 3 دقیقه با 30 میلیلیتر محلول اسید استیک- کلروفرم (3:2 v/v) کاملاً تکان داده شد تا چربی حل شود. پس از افزودن محلول یدیدپتاسیم اشباع (5/0میلیلیتر) به فیلتراسیون، واکنش با افزودن محلول نشاسته به عنوان شاخص ادامه یافت. تیتراسیون با محلول استاندارد تیوسولفات سدیم انجام
[1] - TVN
[2] - PV
شد. برای تعیین PV از معادله زیر استفاده شد که به عنوان پراکسید میلیاکی والان در هر کیلوگرم نمونه گزارش شد:
(5) PV (meq / kg) = [(S × N) / W] × 100
S = حجم تیتراسیون (ml)، N = نرمالیته محلول تیوسولفات سدیم (01/0N = ) و W = وزن نمونه (g).
2-10- اندازهگیری رنگ پوسته میگو
رنگ میگو با استفاده از رنگسنج اتوماتیک (Hunter Lab, Lovibond, CAM-System 500, UK) طبق روش زانگ و همکاران (2015) اندازهگیری شد (41). L* (روشنایی) نشان دهنده روشنایی در مقیاس 0 (تاریکی) تا 100 (سفیدی)، مقیاس a* (قرمزی) از مقادیر منفی برای سبز تا مقادیر مثبت برای قرمز و مقیاس b* (زردی) محدوده از مقادیر منفی برای آبی به مقادیر مثبت برای زرد است. رنگ در سه ناحیه (سر، بدن و دم) روی پوسته میگو تعیین شد. برای هر نمونه، اندازه‌گیری‌های سهگانه در هر ناحیه پوسته انجام شد و میانگین مقادیر نمونهها ثبت شد. اختلاف رنگ کل1 که نشاندهنده میزان تفاوت رنگ بین میگوها در ابتدای نگهداری و پس از دوره نگهداری است، با استفاده از معادله زیر محاسبه شد:
(6) ΔE = [(L*-L* 0)2 + (a*- a*0)2+ (b*- b*0)2]1/2
که در آن L*0، a*0 و b*0 مقادیر پارامترهای رنگ L*، a* وb* در شروع نگهداری.
2-11- سنجش بافت (سختی)
بافت‌سنج (Brookfield Engineering Laboratories, Inc., Middleboro, MA) برای ارزیابی بافت (سختی) نمونههای گوشت میگو بر اساس روش زانگ و همکاران (2015) استفاده شد (41). تجزیه و تحلیل پروفایل بافت2 در دمای اتاق و تحت شرایط زیر انجام شد: سرعت ثابت آزمایش: 1 میلی‌متر بر ثانیه، تغییر شکل نمونه: 50% و زمان نگه داشتن بین چرخهها: 3 ثانیه. پارامتر تحلیل بافت با استفاده از نرمافزار Pro-Lite V1.0 از منحنیهای نیرو- زمان تولید شده از هر نمونه محاسبه شد. تمام اندازه‌گیری‌ها بر روی شش نمونه میگو انجام شد و مقدار متوسط به دست آمد.
2-12- ارزیابی لکهسیاه
ارزیابی لکهسیاه میگوی پا سفید غربی از طریق بازرسی بصری توسط شش نفر از اعضای آموزش دیده با استفاده از امتیاز دهی بر اساس روش مونترو و همکاران (2001) انجام شد (31). از اعضای پانل خواسته شد که امتیاز لکهسیاه (100%- 0) را برای میگو، که در آن 0 = بدون لکهسیاه، 20% = خفیف (20% سطح میگو)، 40% = متوسط (20 تا 40% سطح میگو)، 60% = قابل توجه (40 – 60% سطح میگو)، 80% = شدید (60 – 80% سطح میگو) و 100% = بسیار سنگین (80% تا کل سطح میگو) در نظر گرفته شود. برای ارزیابی لکهسیاه هر 4 روز یکبار برای هر تیمار نمونهبرداری شد.
2-13- تجزیه و تحلیل آماری
این پژوهش در قالب طرح کاملا تصادفی اجرا شد و آنالیزها در آزمایش لکه سیاه و بافت در 6 تکرار، در آزمایش تغییر رنگ در 3 تکرار در سه قسمت بدن (9 تکرار) و در سایر آزمایشها با 3 تکرار انجام شد. تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از تحلیل واریانس دو طرفه (ANOVA) در نرم افزار SPSS (نسخه 16) و آزمون‌های چند دامنه‌ای دانکن برای برآورد تفاوت معنیداری بین میانگین‌ها در بین تیمارها و زمانهای مختلف انجام شد. دادهها به صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شد و تغییرات آماری در سطح معنیداری 05/0 P < محاسبه شد.
3- نتایج و بحث
3-1- ویژگیهای عملکردی پروتئین هیدرولیز شده (H)
نتایج آنالیز آماري نشان داد غلظت پروتئین اولیه در ضایعات میگو با روش کلدال 5/12%، میزان پروتئین موجود در پروتئین هیدرولیز شده حاصل 53/0 ± 6/81% و بازده پروتئین 33/0 ± 49/9% برآورد شد (جدول 1). بازیافت پروتئین یکی از فاکتورهاي مهم در بررسی عملکرد آنزیمها
[1] - ΔE
[2] - TPA
در هیدرولیزهاي پروتئینی غذایی محسوب میشود که توانایی یک آنزیم در جداسازي پروتئینهاي محلول از غیر محلول و میزان بازدهی فرایند در طی هیدرولیزاسیون آنزیمی میباشد (25). یکی دیگر از پارامترهاي کلیدي پروتئینهای هیدرولیز شده، درجه هیدرولیز است که به عنوان درصدي از پیوندهاي پپتیدي شکسته شده تعریف میشود. خصوصیات پروتئین هیدرولیز شده با درجه هیدرولیز و ساختار پپتیدهاي تولید شده تعیین میشود و این موارد بستگی به طبیعت پروتئین و خصوصاً نوع آنزیم به کار رفته و شرایط هیدرولیز به ویژه دما و pHدارد. در این مطالعه درجه هیدرولیز 68/0 ± 54/32% و طول زنجیره پپتیدی 06/0 ± 07/3 محاسبه شد. طول زنجیره به اندازه هیدرولیز، شرایط هیدرولیز، غلظت آنزیم و نوع پروتئین هیدرولیز شده بستگی دارد (21). نتـايج سـاير محققـين نيـز حـاكي از ميـزان بـالاي پـروتئين در روشهاي هيدروليز شده ميباشد كـه نتـايج تحقيـق حاضـر را تاييـد ميكند. اویسی پور و همكــاران (2009) طــي تحقيقــي نشـان دادنـد كـه ميـزان پـروتئين در هيـدروليز امعـاء و احشـاء تاسماهي ايراني با استفاده از آنزيم آلكالاز، در حـدود 66 درصـد ميباشد (33).
جدول 1- ویژگیهای عملکردی پروتئین هیدرولیز شده (H)
ویژگیهای عملکردی (%) | |
پروتئین اولیه ضایعات | 5/12 ± 0 |
پروتئین در هیدرولیز | 53/0 ± 60/81 |
بازده پروتئین | 33/0 ± 49/9 |
درجه هیدرولیز | 68/0 ± 54/32 |
طول زنجیره پپتید | 06/0 ± 07/3 |
مقدارها بر اساس میانگین ± انحراف معیار
3-2- اثر پروتئین هیدرولیز شده ضایعات میگو (H) بر مهار آنزیم پلیفنلاکسیداز (PPO) میگو
تغییرات در فعالیت آنزیم PPO و مهار آن در غلظتهای 5/0، 1، 5/1 و 2% از پروتئین هیدرولیز شده (H) در 210 ثانیه در شکل 1 نشان داده شده است. کاهش مقدار جذب (فعالیت) نشان داد که مهار PPO توسط پروتئین هیدرولیز شده افزایش یافت. در غلظت 5/1% H، فعالیت PPO به حداقل خود رسید. به عبارت دیگر، این غلظت H بعد از 1 و 3 دقیقه (به ترتیب 08/60 و 98/47 درصد) بازدارندگی بالاتری از PPO را نسبت به سایر غلظتها نشان داد. قبلاً گزارش شده است که پروتئینها، پپتیدها و اسیدهای آمینه میتوانند فعالیت PPO را مهار کنند. آنها ممکن است مس ضروری را درمحل فعال PPO کلات کنند و با o- کینونها واکنش دهند (14). در مطالعه لی و همکاران (2000) گزارش شده است که هیدرولیز پروتئین توسط پروتئازها، بسترهایی برای فعالسازی PPOفراهم میکند. به عبارت دیگر لیپوپلیساکارید و پروتئین متصل به گلوکان 1در فعالسازی سیستم فعال کننده PPO در خرچنگ آب شیرین (Pacifastacus leniusculus) نقش دارد (23). با این حال، هیچ اطلاعات دقیقتری در مورد اثر پروتئین هیدرولیز شده ضایعات میگو بر روی آنزیم PPO میگوی پا سفید غربی در دسترس نیست.
[1] - LGBP
شکل 1- اثر غلظتهای مختلف پروتئین هیدرولیز شده ضایعات میگو بر بازدارندگی فعالیت آنزیم پلیفنلاکسیداز (PPO) میگو طی زمان (میانگین ± انحراف معیار) (3n= ).
حروف بزرگ (A-B) و کوچک (a-b) متفاوت به ترتیب نشاندهنده تفاوت معنیداری در غلظتها و زمانهای مختلف است (05/0p <).
(*) نشاندهنده فعالیت آنزیم PPO است.
3-3- تغییرات آزمایشات شیمیایی
3-3-1- pH
طبق یک گزارش،pH 7/7 یا کمتر برای میگو نشاندهنده کیفیت عالی، 7/7- 95/7 کیفیت قابل قبول و 95/7 یا بالاتر نشاندهنده کیفیت پایین است (6). شکل 2 میزان pH را در میگو با تیمارهای مختلف در طی 20 روز نگهداری در یخ نشان میدهد. میگوی تازه سفید اقیانوس آرام در روز صفر دارای pH 4/6- 7/6 بود. با افزایش زمان نگهداری، pH تمام میگوها به طور معنیداری افزایش یافت (05/0< P). در بین تمام نمونهها، میگوهای تیمار شده با Ch-N-H کمترین pH با مقدار 22/7 را در روز آخر نگهداری نشان دادند (05/0P <). تیمار پروتئین هیدرولیز شده (H) از سایر تیمارها بالاتر بود. روند افزایشی pHبا افزایش زمان نگهداري را میتوان به افزایش فعالیت باکتريهاي اتولیتیک و پروتئولیتیک در طول دوره نگهداري و فساد میکروبی- آنزیمی نسبت داد که باعث تولید مواد افزایش دهنده pH مانند آمونیوم، آمونیاك، تريمتیل آمین میشوند (20). با همین استدلال میتوان ثبات و پایداري pHرا در تیمار نانولیپوزوم حاوی پروتئین هیدرولیز شده در پوشش کیتوزان را در طول دوره نگهداري توجیه کرد. به این صورت که با افزایش زمان نگهداري، این پوشش توانسته تا حد زیادي مانع از فعالیت باکتريهای عامل فساد و تولید ترکیبات فرار افزایش دهنده pH شود. این موضوع نشان میدهد که پوشش نانولیپوزوم حاوی پروتئین هیدرولیز شده توام با کیتوزان نسبت به پروتئین هیدرولیز شده خالص توانسته است از افزایش pHجلوگیری کند. در تحقیق فان و همکاران (2009) نیز مانند تحقیق حاضر روند افزایشی pH با افزایش زمان نگهداري مشاهده و همچنین اثر کیتوزان در کندترکردن سرعت افزایش pH ثابت شد (9).
شکل2- تغییرات pH (میانگین ± انحراف معیار) میگوی پا سفید غربی با انواع مختلف پوششهای حاوی پروتئین هیدرولیز شده ضایعات میگو یا بدون آن در طی روزهای نگهداری در یخ (3n= ). حروف بزرگ (A-B) و کوچک (a-b) متفاوت روی ستونها به ترتیب نشاندهنده تفاوت معنیداری بین تیمارها و روزهای نگهداری است (05/0P < )
3-3-2- TVN
بازهای نیتروژنه فرار (TVN) نشانگر فساد است و ممکن است اساساً به آمونیاک تولید شده از کاتابولیسم باکتریایی ترکیبات حاوی نیتروژن نسبت داده شود (4). محتوای اولیه TVN 3/6 میلیگرم در 100 گرم بود که کمتر از میزان گزارش شده توسط فرجزاده و همکاران (2016) بود (10). حد TVN 30- 35 میلیگرم نیتروژن بر 100 گرم برای محصولات دریایی معمولاً فاسد در نظر گرفته میشود (7). مقدار TVN در روز شانزدهم، در تیمارهای Ch-N-H وCh-H در محدوده توصیه شده (زیر 30 میلیگرم در 100 گرم) بود. در پایان نگهداری، محتوای TVN همه میگوهای از حد مجاز فراتر رفتند و کاهش تدریجی کیفیت را نشان دادند (شکل 3). اندازه‌گیری‌های TVN نشان میدهد که میگوهای دارای پوشش Ch-N-H وCh-H در انبار یخ 16 روز ماندگاری دارند. به عبارت دیگر، هنگامی که پروتئین هیدرولیز شده با پوشش کیتوزان و یا نانولیپوزوم ترکیب شد، مقدار TVN را کاهش داد. وانگ و همکاران (2018) دریافتند که در مقایسه با پوشش کیتوزان خالص، پوشش کیتوزان کارواکرول به طور قابل توجهی افزایش مقدار TVN میگو را در مراحل بعدی نگهداری کند کرد (36). علاوه بر این، یافتههای فوق با تحقیقات قبلی مطابقت دارد که فیلمهای مبتنی بر کیتوزان به شکل نانو حامل برای ترکیبات زیست فعال امکان توسعه بسته بندی عملکردی با خواص ضد میکروبی و آنتیاکسیدانی را فراهم میکند که سیستم مطلوبی برای تضمین کیفیت، ایمنی و ماندگاری محصولات غذایی دریایی است (39).
شکل 3- میزان بازهای نیتروژنه فرار (TVN) (میانگین ± انحراف معیار) در میگوی پا سفید غربی با انواع مختلف پوششهای حاوی پروتئین هیدرولیز شده ضایعات میگو یا بدون آن در طی روزهای نگهداری در یخ (3n= ).
حروف بزرگ (A-B) و کوچک (a-b) متفاوت روی ستونها به ترتیب نشاندهنده تفاوت معنیداری بین تیمارها و روزهای نگهداری است (05/0P < )
3-3-3- PV
عدد پراکسید (PV) شاخصی جهت تشخیص میزان هیدروپراکسیدها یا محصولات اولیه اکسیداسیون چربیها هستند. مطابق نتایج، نانولیپوزوم حاوی پروتئین هیدرولیز شده در پوشش کیتوزان (Ch-N-H) توانست به صورت فعالتري با اکسیداسیون و تولید هیدرو پراکسیدها مقابله کند (شکل 4). در روز آخر این تیمار و تیمار نانولیپوزوم حاوی پروتئین هیدرولیز شده (N-H) با مقادیر 6/0 و 68/0 عدد پراکسید پایینتر و نتیجه مطلوبتری نسبت به سایر تیمارها نشان دادند (05/0 P <). به طورمحتمل این پوششها با اثر متقابل نسبت به پروتئین هیدرولیز شده خالص، قدرت بیشتري در برابر نفوذ اکسیژن داشته است. پراکسید (PV) کمتر در نمونهها ممکن است به دلیل تبدیل سریع تر به مواد دیگر باشد. پوششهای کیتوزان و نانولیپوزوم به عنوان یک مانع موثر در برابر نفوذپذیری اکسیژن گزارش شده است و ممکن است به عنوان یک لایه محافظ بین سطح میگو و محیط اطراف عمل کند. از آن جایی که تمام نمونهها کمتر از ده مگا اکیوالان بر کیلوگرم چربی داشتند، این یک حد قابل قبول در نظر گرفته میشود. این نتایج با یافتههای کمالی و همکاران (2023) همخوانی دارد که مشاهده کردند پوشش کیتوزان نانولیپوزوم حاوی پلی ساکارید سولفاته جلبک سبز در جلوگیری از اکسیداسیون لیپید در میگو مفید و موثر واقع شده است (19). به طور مشابه فرجزاده و همکاران (2016) گزارش کردندکه پوششهای ژلاتین-کیتوزان اکسیداسیون لیپید در میگو را به تاخیر میاندازد (10).
شکل 4-. ارزش پراکسید (PV) (میانگین ± انحراف معیار) در میگوی پا سفید غربی با انواع مختلف پوششهای حاوی پروتئین هیدرولیز شده ضایعات میگو یا بدون آن در طی روزهای نگهداری در یخ (3n= ).
حروف بزرگ (A-B) و کوچک (a-b) متفاوت روی ستونها به ترتیب نشاندهنده تفاوت معنیداری بین تیمارها و روزهای نگهداری است
(05/0P < )
3-4- تغییرات رنگ
یکی از عوامل متعددی که بر ترجیحات مصرفکننده تأثیر میگذارد، رنگ غذاهای دریایی است. با افزایش زمان نگهداری، تغییر رنگ در تیمارهای کنترل و متابیسولفیتسدیم به طور معنیداری افزایش یافت (شکل 5)، در حالی که تغییر رنگ در تیمارها با پوششهای N-H و Ch-Hبه آرامی افزایش یافت و در روز آخر کمترین مقادیر 96/11 و 37/12 بدست آمد (05/0P < ). میگو حاوی هموسیانین است که عملکرد انتقال اکسیژن را همانند پروتئینهای هم انجام میدهد. هموسیانین در حالت اکسیژندار آبی و در حالت بدون اکسیژن بیرنگ یا سفید است. مرحله قهوهای شدن عمدتاً به دلیل واکنش میلارد است که گلیکوژن و پروتئینها برای تولید رنگ قهوهای واکنش تولید میشوند (16). تغییرات رنگ (ΔE) نشاندهنده تغییرات کلی L*، a* و b* است و در این مطالعه با افزایش زمان نگهداری، مشابه نتایج گزارش شده توسط وانگ و همکاران، (2018) اختلاف رنگ در میگوها افزایش یافت (36). در مطالعات مشابه، یوان و همکاران (2016) با افزایش زمان نگهداری، مقادیر ΔE میگو به تدریج در همه گروهها افزایش یافت (40). بنابراین در مطالعه حاضر استفاده از پوششهای نانولیپوزوم حاوی پروتئین هیدرولیز شده و پروتئین هیدرولیز شده با پوشش کیتوزان میتواند تغییر رنگ میگو را به تاخیر بیندازد.
شکل5- تغییر رنگ (میانگین ± انحراف معیار) در میگوی پا سفید غربی با انواع مختلف پوششهای حاوی پروتئین هیدرولیز شده ضایعات میگو یا بدون آن در طی روزهای نگهداری در یخ (9n= ).
حروف بزرگ (A-B) و کوچک (a-b) متفاوت به ترتیب نشاندهنده تفاوت معنیداری بین تیمارها و روزهای نگهداری است (05/0P < )
3-5- بافت (سختی)
سختی مهمترین ویژگی بافتی در گوشت یا غذاهای دریایی است. سختی در همه نمونهها با افزایش زمان به طور معنی داری کاهش یافت (شکل 6). سختی میگوهای تیمار شده با پروتئین هیدرولیز شده با مقدار 8/4 در طی نگهداری از همه تیمارها بالاتر بود در حالی که سختی تیمار نانولیپوزوم حاوی پروتئین هیدرولیز شده در پوشش کیتوزان (Ch-N-H) با مقدار 15/3 از همه نمونهها کمتر محاسبه شد (05/0 < P). تغییر پارامترهای بافت یکی از مولفه‌های اصلی مقبولیت است و تحت تأثیر عوامل متعددی از جمله کاهش pH پس ازمرگ وآرایش پروتئین عضلانی هستند. یافته های حاضر با یافتههای لی و همکاران (2013) مطابقت دارد که بیان کردند عصاره هسته انگور و پلیفنلهای چای، که غنی از ترکیبات پلیفنلی هستند، میتوانند ماندگاری را افزایش دهند و پارامتر بافتی را در فیله ماهی قرمز بهبود بخشند (24). در مطالعه حاضر نیز پروتئین هیدرولیز شده باعث تاخیر در تغییر پارامتر سختی بافت در میگو در طول نگهداری شده است. پیوند بین پروتئین هیدرولیز شده و ماهیچه میتواند با بهبود ویژگیهای بافت در ماهیچه میگو همراه باشد. با این حال وانگ و همکاران (2014) مشاهده کردند استفاده از پوششهای کیتوزان در به تاخیر انداختن تغییر پارامترهای بافت در میگو در طول ذخیره‌سازی مؤثر بوده است (37).
شکل6- سنجش بافت (سختی) (میانگین ± انحراف معیار) در میگوی پا سفید غربی با انواع مختلف پوششهای حاوی پروتئین هیدرولیز شده ضایعات میگو یا بدون آن در طی روزهای نگهداری در یخ (6n= ).
حروف بزرگ (A-B) و کوچک (a-b) متفاوت به ترتیب نشاندهنده تفاوت معنیداری بین تیمارها و روزهای نگهداری است (05/0P < )
3-6- لکه سیاه
فرآیندهای قهوهای شدن بر کیفیت غذایی و ظاهر تأثیر میگذارد. همچنین مقبولیت مصرف کننده را کاهش میدهد و تأثیر اقتصادی قابلتوجهی بر تولیدکنندگان مواد غذایی و صنایع تبدیلی غذایی دارد. در روز صفر نگهداری، لکه سیاه در هیچ یک از نمونهها مشاهده نشد اما با افزایش زمان نگهداری لکه سیاه به طور معنیداری افزایش یافت (شکل 7). تمام نمونهها پس از 20 روز نگهداری، ارزش لکهسیاه کمتری نسبت به شاهد (با امتیاز 9) داشتند. تفاوتی در لکهسیاه بین انواع تیمارهای مختلف حاوی پروتئین هیدرولیز شده و متابی سولفیت سدیم در طول نگهداری وجود نداشت (05/0 > P). پروتئینهای هیدرولیز شده به دست آمده از طریق فرآیند هیدرولیز آنزیمی پروتئینهایی با منشاء دریایی به عنوان آنتیاکسیدانهای طبیعی مهم شناخته میشوند. این احتمال وجود دارد که ریزپوشانی پروتئین هیدرولیز شده در نانولیپوزوم باعث حفظ خاصیت آنتیاکسیدانی آن ها شده و اثر بخشی و پایداری مواد محصور شده را افزایش داده در نتیجه باعث تاخیر در ظهور لکههای سیاه در میگو شده است. به عبارت دیگر، پروتئینها تمایل به تشکیل کمپلکس با آنزیم‌های مختلف دارند و با مسدود کردن محل فعال یا تغییر ساختار کمپلکس نهایی، آن ها را غیرفعال کنند. به طور مشابه لو و همکاران (2015) دریافتند که بستهبندی پلیاتیلن با چگالی کم اصلاح شده با نانو TiO2 در کاهش فعالیت PPO موثرتر بوده و با کاهش نفوذپذیری اکسیژن در به تاخیر انداختن لکه سیاه کمک میکند (27). این نتیجه با یافتههای فردوس و همکاران (2021) مطابقت دارد که مشاهده کردند میگوهای درمان شده با چای سبز و آملا برای شرکت کنندگان تا 2 هفته قابل قبول بودند زیرا میانگین لکه سیاه در آنها کم بود (11). بنابراین مطالعه حاضر بیشتر تایید کرد که پروتئین هیدرولیز شده، به عنوان یک ماده طبیعی و با ارزش افزوده بر لکه سیاه میگو تاثیرگذار است و در پوشش نانولیپوزوم یا کیتوزان میتواند لکه سیاه را در میگو در طول نگهداری یخ کاهش دهد.
شکل7- امتیاز لکهسیاه (میانگین ± انحراف معیار) در میگوی پا سفید غربی با انواع مختلف پوششهای حاوی پروتئین هیدرولیز شده ضایعات میگو یا بدون آن در طی روزهای نگهداری در یخ (6n= ).
*حروف بزرگ (A-B) و کوچک (a-b) متفاوت به ترتیب نشاندهنده تفاوت معنیداری بین تیمارها و روزهای نگهداری است (05/0P < ).
4- نتیجهگیری
در این مطالعه پروتئین هیدرولیز شده با خواص عملکردی بالایی تولید شد و اثر مهارکنندگی بر آنزیم پلیفنلاکسیداز PPO میگو نشان داد. پروتئین هیدرولیز شده در پوشش کیتوزان و نانولیپوزوم باعث افزایش ماندگاری و کنترل لکه سیاه میگو شد. میگوهای این تیمار کمترین مقادیر pH، PV و بافت را نشان دادند. تیمار Ch-H کمترین تغییرات رنگ را نشان داد. با این وجود نتایج آزمایشات TVN نشان داد که تیمارهای Ch-N-H و Ch-H تا 16 روز قابلیت ماندگاری در یخ را دارند و در روز بیست تمام میگوها از حد مجاز مصرف طبق مقدار مجاز TVN فراتر رفتند. بنابراین پروتئین هیدرولیز شده میتواند کاندید خوبی برای تحقیقات بیشتر برای جایگزینی متابی سولفیت سدیم در صنعت فرآوری میگو باشد.
5- منابع
1. Adler-Nissen, J. 1986. A Review of food hydrolysis specific areas. In: Enzymic hydrolysis of food proteins, J. Adler-Nissen (Ed.), Elsevier Applied Science Publishers, Copen hagen, Denmark pp. 57–109.
2. Altunkaya A. Effect of whey protein concentrate on phenolic profile and browning of fresh-cut lettuce (Lactuca sativa). Food Chemistry 2011; 128: 754-760.
3. AOAC, 2005. Official methods of analysis. (Sixteenth Ed.) Association of Official Analytical Chemists, Washington DC. USA
4. Arancibia M. Y, Lopez-Caballero M. E, Gomez-Guillen M. C, Montero P. Chitosan coatings enriched with active shrimp waste for shrimp preservation. Food Control. 2015; 54: 259-266.
5. Cahú T. B, Santos S. D, Mendes A, Córdula C. R, Chavante S. F, Carvalho L. B, et al. Recovery of protein, chitin, carotenoids and glycosaminoglycans from Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) processing waste. Process Biochemistry. 2012; 47: 570–577.
6. Colakoglu F. A, Ormanci H. B, Altin A. Determination of the shelf life of fresh shrimp (Parapaneus longirostris) treated with Frische-star. Ege Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 2006; 23(1/3): 383–386.
7. Connell, J. J. 1995. Intrinsic quality. In control of fish quality (pp. 5-36). London, UK: Fishing News Books/Blackwell Science.
8. Donsì F, Annunziata M, Vincensi M, Ferrari G. Design of nanoemulsion-based delivery systems of natural antimicrobials: effect of the
emulsifier. Journal of Biotechnology. 2012; 159 (4): 342–350.
9. Fan W, Sun J, Chen Y, Qiu J, Zhang Y, Chi Y. Effects of chitosan coating on quality and shelf life of silver carp during frozen storage. Food chemistry. 2009; 115(1): 66-70.
10. Farajzadeh F, Motamedzadegan A, Shahidi S. A, Hamzeh S. The effect of chitosan-gelatin coating on the quality of shrimp (Litopenaeus vannamei) under refrigerated condition. Food control. 2016; 67: 163-170.
11. Firdous A, Ringø E, Elumalai P. Effects of green tea and amla extracts on quality and melanosis of Indian white prawn (Fenneropenaeus indicus, Milne Edwards, 1837) during chilled storage. Aquaculture and fisheries. 2021; 6: 617–627.
12. Fonkwe L. G, Singh R. K. Protein recovery from enzymatically deboned turkey residue by enzymic hydrolysis. Process Biochemistry. 1996; 31: 605.
13. Gibis M, Ruedt C, Weiss J. In vitro release of grape-seed polyphenols encapsulated from uncoated and chitosan-coated liposomes. Food Research International. 2016; 88: 105–113.
14. Girelli A. M, Mattei E, Messina A, Tarola A. M. Inhibition of polyphenol oxidases activity by various dipeptides, Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2004; 52: 2741-2745.
15. Guerard F, Sumaya-Martinez M. T, Laroque D, Chabeaud A, Dufosse L. Optimization of free radical scavenging activity by response surface methodology in the hydrolysis of shrimp processing discards. Process Biochemistry. 2007; 42: 1486–1491.
16. Haard, N. F. 1992. Biochemistry and chemistry of color and color change in seafoods. Advances in seafood biochemistry: Composition and quality, 305–360.
17. Jean W. G, Sharron L.O. Comparison of refractometer and biuret methods for total protein measurement in body cavity fluids. Veterinary Clinical Pathology. 2001; 30(1): 16-18.
18. Jiménez A, Sánchez-González L, Desobry S, Chiralt A, Arab Tehrany E. Influence of nanoliposomes incorporation on properties of film forming dispersions and films based on corn starch and sodium caseinate. Food Hydrocolloids. 2014; 35: 159-169.
19. Kamali M, Shabanpour B, Pourashouri P, Kordjazi M. Effect of chitosan-coated Ulva intestinalis sulfated polysaccharide nanoliposome on melanosis and quality of Pacifc white shrimp during ice storage. International Journal of Biological Macromolecules. 2023; 230: 123275.
20. Kilincceker O, Dogan I. S, Kucukoner E. Effect of edible coatings on the quality of frozen fish fillets. LWT-Food science and technology. 2009; 42(4): 868-873.
21. Kristinsson H. G, Rasco B. A. Fish protein hydrolysates: production, biochemical, and functional properties. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2000; 40(1): 43-81.
22. Lee E. H., Lim S. J, Lee M. K. Chitosan-coated liposomes to stabilize and enhance transdermal delivery of indocyanine green for photodynamic therapy of melanoma. Carbohydrate Polymers. 2019; 224: 115-143.
23. Lee S. Y, Wang R, Sorderhall K. A lipopolysaccharide- and β-1, 3-glucan-binding protein from hemocytes of the freshwater crayfish Pacifastacus leniusculus purification, characterization, and cDNA cloning. Journal of Biological Chemistry. 2000; 275: 1337-1343.
24. Li T, Li J, Hu W, Li X. Quality enhancement in refrigerated red drum (Sciaenops ocellatus) fillets using chitosan coatings containing natural preservatives. Food Chemistry. 2013;138 (2-3): 821-826.
25. Liaset B, Nortvedt R, Lied E, Espe M. Studies on the nitrogen recovery in enzymic hydrolysis of Atlantic salmon (Salmosalar, L). frames by Protamex MT protease. Process Biochemistry. 2002; 37:1263–1239.
26. Lu Q, Li D. C, Jiang J. G. Preparation of a tea polyphenol nanoliposome system and its physicochemical properties. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2011; 59(24): 13004-13011.
27. Luo Z, Qin Y, Ye Q. Effect of nano-TiO2-LDPE packaging on microbiological and physicochemical
quality of Pacific white shrimp during chilled storage. International Journal of Food Science and Technology. 2015; 50: 1567–1573.
28. McEvily A. J, Iyengar R, Otwell S. 1991. Sulfit alternative prevents shrimp melanosis. Food Technology. 1991; 45: 80-86.
29. Mehdizadeh A, Shahidi S. A, Shariatifar N, Shiran M, Ghorbani A, Sarae H, Evaluation of chitosan-zein coating containing free and nano-encapsulated Pulicaria gnaphalodes (Vent.) Boiss. Extract on quality attributes of rainbow trout. Journal of Aquatic Food Product Technology. 2021; 30 (3): 1–14.
30. Mehdizadeh A, Shahidi S. A, Shariatifar N, Shiran M, Ghorbani A, Saraei, H. Physicochemical characteristics and antioxidant activity of the chitosan/zein flms incorporated with Pulicaria gnaphalodes L. extract-loaded nanoliposomes. Journal of Food Measurement and Characterization. 2022; 16: 1252–1262.
31. Montero P, Avalos A, Perez-Mateos M. Characterization of polyphenoloxidase of prawns (Penaeus japonicus). Alternatives to inhibition - additives and high - pressure treatment. Food Chemistry. 2001; 75(3): 317-324.
32. Nirmal N. P, Benjakul S. Effect of ferulic acid on inhibition of polyphenoloxidase and quality changes of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) during iced storage. Food Chemistry. 2009; 116(1): 323–331.
33. Ovissipour M, Abedian A. M, Motamedzadegan A, Rasco B, Safari R, Shahiri H. The effect of enzymatic hydrolysis time and temperature on the properties of protein hydrolysates from Persian sturgeon (Acipenser persicus) viscera. Food Chemistry. 2009; 115: 238-242.
34. Pabast M, Shariatifar N, Beikzadeh S, Jahed G. Effects of chitosan coatings incorporating with free or nano-encapsulated Satureja plant essential oil on quality characteristics of lamb meat. Food Control. 2018; 91: 185–192.
35. Sallam K. I, Ishioroshi M, Samejima K. Antioxidants and antimicrobial effects of garlic in chicken sausage. Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie (LWT). 2004; 37(8): 849–855.
36. Wang Q, Lei J, Ma J, Yuan G, Sun H. Effect of chitosan-carvacrol coating on the quality of Pacific white shrimp during iced storage as affected by caprylic acid. International Journal of Biological Macromolecules. 2018; 106: 123-129.
37. Wang Y, Liu L, Zhou J, Ruan X, Lin J, Fu L. Effect of chitosan nanoparticle coatings on the quality changes of postharvest whiteleg shrimp, Litopenaeus vannamei, during storage at 4 ºC. Food and Bioprocess Technology. 2014; 8(4): 907-915.
38. Xia H, Tang Y, Huang R, Liang J, Ma S, Chen D, Feng Y, Lei Y, Zhang Q, Yang Y, Huang Y. Nanoliposome use to improve the stability of phenylethyl resorcinol and serve as a skin penetration enhancer for skin whitening. Coatings. 2022; 12: 362.
39. Yu S. H, Hsieh H. Y, Pang J. C, Tang D. W, Shih C. M, Tsai M. L, et al. Active films from water-soluble chitosan/cellulose composites incorporating releasable caffeic acid for inhibition of lipid oxidation in fish oil emulsions. Food Hydrocolloids. 2013; 32: 9–19.
40. Yuan G, Lv H, Tang W, Zhang X, Sun H. Effect of chitosan coating combined with pomegranate peel extract on the quality of Pacific white shrimp during iced storage. Food Control. 2016; 59: 818-823.
41. Zhang B, Ma L. K, Deng S. G, Xie C. Qiu X. H. Shelf-life of pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) as affected by weakly acidic electrolyzed water ice-glazing and modified atmosphere packaging. Food Control. 2015; 51: 114-121.
