جداسازی‌گونه‌های‌مولد‌سم‌آفلاتوکسین بر‌اساس‌ردیابی‌ژن‌هایaflR وver1 و شناسایی‌گونه با تعیینتوالیهایITS در برنج مصرفی مشهد خراسان
الموضوعات :حامد فراجی 1 , فریده طباطبایی یزدی 2 , نعمت الله رزمی 3
1 - دانشجوی دکتری، گروه میکروبیولوژی، دانشکده کشاورزی و فن آوری مدرن ، واحد شیراز، دانشگاه آزاد اسلامی، شیراز، ایران.
2 - استاد، گروه علوم وصنایع غذایی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.
3 - استاد، گروه میکروبیولوژی، دانشکده کشاورزی و فن آوری مدرن ، واحد شیراز، دانشگاه آزاد اسلامی، شیراز، ایران.
الکلمات المفتاحية: آفلاتوکسین, آسپرژیلوس, واکنش زنجیره ای پلیمراز,
ملخص المقالة :
برنج یکی از غلات مهم و منابع اصلی انرژی مردم جهان است و به لحاظ مواد مغذی و رطوبت نسبی بالا در معرض آلودگیهای قارچی می-باشد. آفلاتوکسین یکی از متابولیتهای ثانویه قارچی بوده و جزء خطرناکترین سموم سرطانزا میباشد؛ دستهای از قارچهای مولد سم آفلاتوکسین بطور بالقوه می‌توانند در غلات و خشکبار به شدت خطرناک باشند. از مهمترین قارچهای تولید کننده آفلاتوکسین، آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس پارازیتیکوس می باشد. در این تحقیق جداسازی و شناسایی گونههای مولد سم آفلاتوکسین از برنج بر اساس روشهای کشت و مورفولوژی پروپاگولهای قارچی صورت پذیرفت سپس ژنهای aflR وver1 که در بیوسنتز آفلاتوکسین نقش ساختمانی و تنظیمی دارند با پرایمر مخصوص تکثیر شده و عملیات الکتروفورز روی آنها انجام شد و در نهایت جهت تایید روش مولکولی، اندازه گیری آفلاتوکسین با ستون های ایمونو افینیتی و دستگاه HPLC بر روی کشتهای خالص جداسازی شده، انجام شد. نتایج نشان داد از 60 نمونه جمع آوری شده،20 نمونه دارای قارچهای مولد آفلاتوکسین میباشند. 2 نوع قارچ با خصوصیات مورفولوژیک مشابه آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس پارازیتیکوس شناسایی شدند که توسط کشت روی محیط اختصاصی AFAP مورد تایید قرار گرفت. بر این اساس بررسی ژنهای ساختاری و تنظیمی مهم مانند aflR وver1 جهت سنجش های اولیه حضور و آلودگی مواد غذایی مناسب وکارآمد بوده و پیشنهاد میگردد. تعیین توالی ITS نشان داد دو گونه آسپرژیلوس فلاووس Accession No MG430332.1 و آسپرژیلووس پارازیتیکوس MH937579.1 Accession No در برنج غالب هستند.
1. Davari E, Mohsenzadeh M, Mohammadi, G. and Rezaeian-Doloei, R. Characterization of aflatoxigenicAspergillusflavus and A. parasiticus strain isolates from animal feedstuffs in northeastern Iran. Iranian journal of veterinary research. 2015; 16(2): 150-158
2. Erami M, Hashemi S. J, Pourbakhsh S. A, Shahsavandi S, Mohammadi S, Shooshtari A. H, Jahanshiri Z. Application of PCR on detection of aflatoxinogenic fungi. Archives of Razi Institute. 2007; 62(2): 95-100.
3. Gallo A, SteA G, BAttiLAni P, LoGRieCo A. F, PeRRone G. Molecular characterization of an Aspergillus flavus population isolated from maize during the first outbreak of aflatoxin contamination in Italy. Phytopathologia Mediterranea. 2012;16(4): 198-206.
4. Hedayati M. T, Omran S. M, Soleymani A, Armaki M. T. Aflatoxins in food products in Iran: A review of the literature. Jundishapur journal of microbiology. 2016; 9(7): 123-129
5. Konietzny U, Greiner R. The application of PCR in the detection of mycotoxigenic fungi in foods. Brazilian Journal of Microbiology. 2003; 34(4): 283-300.
6. Lai X, Liu R, Ruan C, Zhang H, Liu C. Occurrence of aflatoxins and ochratoxinA in rice samples from six provinces in China. Food Control. 2015; 50: 401-404.
7. Lee C. Z, Liou G. Y, Yuan G. F. Comparison of the aflR gene sequences of strains in Aspergillus section Flavi. Microbiology. 2006; 152(1): 161-170.
8. Magnani M, Fernandes T, Prete C. E. C, Homechim M, Ono E. Y. S, Vilas-Boas L. A, et al. Molecular identification of Aspergillus spp. isolated from coffee beans. Scientia Agricola. 2005; 62(1): 45-49.
9. Mostafa A A, Amer S. M. Molecular characterization of toxigenic Aspergillus flavus strains isolates from animal feed stuff in Egypt. Life Science Journal. 2013; 10(2): 20-30.
10. Moubasher H, Abutaleb A, Senousy H. H. Molecular differentiation between aflatoxinogenic and nonaflatoxinogenic strains of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus. Microbiology. 2013; 82(1): 642-646
11. Reddy K. R. N, Reddy C. S, Muralidharan K. Efficacy of certain agrochemicals on Aspergillus spp. And subsequent aflatoxin production in rice. Pesticide Biochemistry and Physiology. 2008; 174(3): 1541-1550
12. Rosa C. A. R, Cavaglieri L. R, Ruadrew S. Craft J, Aidoo K. Occurrence of toxigenic Aspergillus spp. and aflatoxins in selected food commodities of Asian origin sourced in the West of Scotland. Food and Chemical Toxicology. 2013; 55(1): 653-658
13. Thathana M. G, Murage H, Abia A. L. K, Pillay M. Morphological Characterization and Determination of Aflatoxin-Production Potentials of Aspergillus flavus Isolated from Maize and Soil in Kenya. Agriculture. 2017; 7(10): 75-80.
14. Zhang K, Banerjee k. A Review: Sample Preparation and Chromatographic Technologies for Detection of Aflatoxins in Foods. Toxins. 253; 12(1): 1-39.
نشریه ی نوآوری در علوم و فناوری غذایی/ دوره شانزدهم / شماره ی چهارم / زمستان1403 صفحه 74-67
(مقاله پژوهشی)
جداسازی‌گونه‌های‌مولد‌سم‌آفلاتوکسین بر‌اساس‌ردیابی‌ژن‌هایaflR وver1 و شناسایی‌گونه با تعیینتوالیهایITS در برنج مصرفی مشهد خراسان
حامد فراجی1*، فریده طباطبایی یزدی2، نعمت الله رزمی3
1-دانشجوی دکتری، گروه میکروبیولوژی، دانشکده کشاورزی و فن آوری مدرن ، واحد شیراز، دانشگاه آزاد اسلامی، شیراز، ایران.
2-استاد، گروه علوم وصنایع غذایی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.
3-استاد، گروه میکروبیولوژی، دانشکده کشاورزی و فن آوری مدرن ، واحد شیراز، دانشگاه آزاد اسلامی، شیراز، ایران.
تاریخ دریافت:11/03/1401 تاریخ پذیرش:25/07/1401
DOI: 10.30495/jfst.2022.1959801.1801
چکیده
برنج یکی از غلات مهم و منابع اصلی انرژی مردم جهان است و به لحاظ مواد مغذی و رطوبت نسبی بالا در معرض آلودگیهای قارچی میباشد. آفلاتوکسین‌کی‌از متابولیتهای ثانویه قارچی بوده و جزء خطرناکترین سموم سرطانزا میباشد؛ دستهای از قارچهای مولد‌سم‌آفلاتوکسین‌به‌طور‌بالقوه‌میتوانند‌در غلات و خشکبار به شدت خطرناک باشند. از مهمترین قارچهای تولید کننده آفلاتوکسین، آسپرژیلوس فلاووس و‌آسپرژیلوس پارازیتیکوس‌می باشد. در این تحقیق جداسازی و شناسایی‌گونههای مولد سم‌آفلاتوکسین از برنج بر اساس روشهای کشت و مورفولوژی پروپاگول‌های‌قارچی صورت پذیرفت سپس ژنهای aflR وver1 که در بیوسنتز آفلاتوکسین نقش ساختمانی و تنظیمی دارند با پرایمر مخصوص‌تکثیر‌شده و عملیات الکتروفورز روی آنها انجام شد و در نهایت جهت تایید روش مولکولی، اندازهگیری آفلاتوکسین با ستون‌های ایمونو افینیتی و دستگاهHPLC بر روی‌کشت‌های خالص جداسازی شده، انجام شد. نتایج‌نشان‌داد از60 نمونه‌جمع‌آوری شده،20 نمونه‌دارای قارچهای مولد آفلاتوکسین میباشند. 2 نوع قارچ با خصوصیات مورفولوژیک مشابه آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس پارازیتیکوس شناسایی شدند که توسط کشت روی محیط اختصاصی AFAP مورد تایید قرار گرفت. بر این اساس بررسی ژنهای ساختاری و تنظیمی مهم مانند aflR وver1 جهت سنجش‌های اولیه حضور و‌آلودگی مواد غذایی مناسب و کارآمد بوده و پیشنهاد میگردد. تعیین توالیITS نشان داد دو‌گونه‌آسپرژیلوس‌فلاووس Accession NoMG430332.1 و آسپرژیلووس پارازیتیکوس MH937579.1 Accession No در برنج غالب هستند.
واژه‌های‌کلیدی: آفلاتوکسین، آسپرژیلوس، واکنش زنجیره ای پلیمراز.
*مسئول مکاتبات: hamed.0102@gmail.com
1-مقدمه
با‌توجه‌به‌این‌که‌برنج‌مستعد‌آلودگی‌با‌دسته‌ای از آسپرژیلوس‌های دارای چرخه بیوسنتز آفلاتوکسین میباشد و از آن‌جایی که جز‌مهمترین مواد در رژیم‌غذایی مردم آسیا از جمله ابران است می‌تواند خطرات فراوانی برای سلامت جامعه ایجاد کند و به دلیل رطوبت بالا و شرایط کشت در شالیزار در مقایسه با بقیه غلات‌خشک‌مثل‌گندم، مستعد‌رشد قارچ‌های‌مولد سم‌می باشد. بر‌این‌اساس‌در‌بسیاری از مقالات‌به‌تولید آفلاتوکسین به صورت انبوه در راکتور اشاره شده است که نشان می‌دهد برنج از نظر مواد غذایی و ریز مغذی‌ها، کاملاً بستر ساز تولید آفلاتوکسین است. آفلاتوکسین‌ها به‌عنوان‌خطرناک‌ترین مایکوتوکسین‌های شناخته شده، جز رده یک مواد سرطانزا میباشند. در بین آسپرژیلوس‌ها،آسپرژیلوس‌فلاووس،آسپرژیلوس پارازیتیکوس و آسپرژیلوس‌نومیوس‌قادر به تولید‌آفلاتوکسین هستند(7).روش
اصلی‌و معتبر‌اندازهگیری‌میزان آفلاتوکسین HPLC1 می باشد ولی به این دلیل که این روش هزینه بسیار بالایی دارد؛ ردیابی ژن‌های‌مهم‌در‌بیوسنتز‌آفلاتوکسین‌برای‌جداسازی آسپرژیلوس‌های مولد‌سم‌می‌تواند‌بسیار‌مقرون‌به‌صرفه‌و‌کارآمد‌باشد. آفلاتوکسین طی‌فرایند‌بیوسنتز‌پیچیده و چند مرحله‌ای تولید میشود نزدیک به۲۰۰ ژن در تولید آفلاتوکسین نقش دارند بعضی از این ژن‌ها مانندver1وafl Rبه لحاظ عملکرد اهمیت بیشتری دارند(11). محصول‌ژنیver1موجب‌تبدیل‌ورسیکولین2به استریگماتوسیستین3 می‌شود‌که این ماده یکی از پیش ساز‌های انتهایی چرخه تولید آفلاتوکسین است. همچنین ژن afl R نقش تنظیمی در چرخه بیوسنتز آفلاتوکسین دارد و محصول آن یک پروتئین انگشت روی4 متصل شونده به DNA میباشد؛ که با اتصال به DNA باعث کنترل فرایند تولید آفلاتوکسین میگردد(5). بررسی دو ژن‌ساختاری‌و‌نظیمی‌کمک‌می‌کند‌تا‌تولید آفلاتوکسین بصورت دقیقتری ارزیابی شود (9،5). در تحقیقات ردی و همکاران، قارچ‌های‌توکسین‌زای‌برنج‌مصرفی‌هند مورد مطالعه قرار گرفت که‌نشان‌داد‌گونه‌های‌آسپرژیلوس‌زیادی‌می‌توانند‌در‌برنج حضور داشته باشند و ارتباط بین‌گونه‌های توکسین‌زا و غیر توکسین‌زا را‌مورد‌بررسی‌قرار‌داد(3). جداسازی مولکولی آسپرژیلوس‌های مولد‌سم‌در‌قهوه‌در‌سال۲۰۰۵صورت‌گرفت‌که‌نشان‌داد گونههای غالب‌در‌قهوه،آسپرژیلوس‌فلاووس و آسپرژیلوس اکراسئوس5 می‌باشند‌که‌به‌ترتیب‌تولیدکننده‌آفلاتوکسینGوBو اکراتوکسین A هستند(9). مطالعه انواع ژنهای مشارکت‌کننده در تولید آفلاتوکسین شامل ژنهای تنظیمی و ساختاری مانند ژنهای ver 1، omt1، nor1 و aflR که توسط محققین زیادی انجام شده است؛ ضمن اینکه در این تحقیقات روش‌هایی برای شناسایی و‌تأیید‌تولید‌سم‌توسط‌گونه‌های‌توکسین‌زا‌ارائه گردیده است(9).روش‌جداسازی‌مولکولی قارچهای مولد آفلاتوکسین می‌تواند‌جهت‌ارزیابی سریع آلودگی برنج و دیگر غلات مورد استفاده گسترده قرار گیرد. این مطالعه برای اولین بار بر روی برنج ایرانی صورت‌گرفت تا بتوان ضمن ارزیابی برنج از نظر قارچهای موجود و تولید توکسین در آنها، روش مولکولی را با‌روشHPLCمقایسه‌نمود. هدف از انجام این تحقیق شناسایی مولکولی۲ژن‌مهم‌در‌تولید آفلاتوکسین در قارچهای جداسازی شده از برنج مصرفی مشهد میباشد تا بتوان به یک روش دقیق و سریع جهت غربالگری نمونه‌های غلات پی برد و با توجه به سرعت بالا و دقت زیاد روش مولکولی PCR می‌توان بر روی کل نمونهها آزمون مولکولی انجام داد و فقط روی نمونه‌های مثبت، آزمون دقیق و گران قیمت HPLC را انجام داد.
2-مواد و روش‌ها
2-1- تهیه و نمونه برداری برنج
مجموعا ۶۰ نمونه برنج از مراکز فروش سطح شهر و بصورت تصادفی‌‌تهیه‌‌و‌‌با‌‌روش‌های‌‌استاندارد‌‌ملی‌‌شماره 6872 همگن‌سازی شد. در‌این تحقیق از روش نمونه‌برداری کاملاً تصادفی استفاده شد و‌هیچ‌گونه‌آزمونی‌برای جداسازی یا ارزیابی اولیه آلودگی
[1] 1-High Performance Liquid Chromatography
[2] 2- Versicolin
[3] 3- Sterigmatocystin
[4] 4- Zinc Finger Protein
[5] 5-Aspergillus ochraceus
به قارچ صورت نپذیرفت. جامعه آماری این تحقیق شامل۶۰ نمونه برنج ایرانی و وارداتی میباشد که دو سوم نمونهها برنج ایرانی و بقیه انواع برنج پاکستانی بودند.
2-2-کشت قارچ
پس از تهیه سوسپانسیون اولیه و رقت‌های لازم، کشت روی محیط‌کشت‌عمومی DG181 حاوی آنتی بیوتیک کلرامفنیکل صورت پذیرفت، بعد از گذشت 5 روز در دمای 25 درجه سلسیوس،کلنی‌های‌کشت‌شده در پلیت ها، جهت خالص‌سازی و‌شناسایی‌آسپرژیلوس‌ها مورد استفاده قرار گرفتند(9). براساس خصوصیات ظاهری، رنگ، شکل کلنی و اسپرانژیوم، کونیدی و‌ساختار‌میسیلیوم‌شناسایی‌اولیه‌انجام‌شد. براساس شکل ظاهری، از نوع و شکل‌آرایش‌اسپور‌ها‌که‌درآسپرژیلوس‌فلاووس لبوله2 و کاملاً انتهایی به صورت جدا از هم و تقریباً منظم میباشد و در‌آسپرژیلوس پارازیتیکوس به صورت نامنظم و دارای سطح مشجر‌و‌کنگره دار دیده میشود استفاده گردید. همچنین رنگ کلونی‌در‌آسپرژیلوس فلاووس زرد تا قهوه‌ای با ظاهر ابریشمی دارای‌رشته‌های کونیدی با دیواره ضخیم تقریباً ناصاف، کروی یا بیضوی‌می‌باشد‌در‌حالی‌که‌درآسپرژیلوس‌پارازیتیکوس رنگ کلونی سبز تا سبز لجنی با ظاهرکاملاً غیر ابریشمی و کونیدی دارای حاشیه تزئین‌دار یا خاردار میباشد جداسازی صورت پذیرفت(7). سپس از کلنی‌های تایید شده کشت خالص روی محیط‌کشتAFPA3 تهیه‌گردید تا براساس تغییر رنگ محیط کشت شناسایی بهتری صورت پذیرد.
2-3-استخراج DNA از قارچهای جداسازی شده
برای استخراجDNA از اسپور قارچهای خالص‌سازی شده، بر روی محیط کشت BHI 4 کشت داده شد و در دمای 25 به مدت 48 ساعت همراه با تکان دادن در 200 دور در دقیقه، گرمخانه‌گذاری‌شد.در‌مرحله‌بعد500 میکرولیتر از سوسپانسیون جهت استخراج DNA طبق روش مبتنی بر تخریب دیواره‌ها با C-TAB5و‌شوک‌‌حرارتی‌و‌ترسیب پروتئین‌ها بوسیله کلروفرم مورد استفاده قرار‌گرفت (10). شستشوی DNA استخراجی طی چند مرحله با اتانول و ایزوپروپانول صورت پذیرفت تا به DNAایی‌با‌کیفیت‌و‌خالص دست پیدا کرد.DNA استخراجی در محلول 1/0درصد بافر6 TE حل شد و یک شبانه روز در دمای یخچال نگهداری شد تا از انحلال کامل آن اطمینان حاصل شود. DNA استخراج شده تا زمان انجام7PCR در دمای منفی 20 درجه سلسیوس نگهداری شد(6).
2-4-واکنشهای زنجیره ای پلیمرازیPCR
از ترمال‌سایکلر Bio Rad T-100 با قابلیت شیب دمایی برای PCR استفاده شد بهینه‌سازی دمای واسرشتگی با تکرار فرایند PCRانجام‌شد.PCRژنهایaflR،ver 1 و ITS با پرایمر‌های اختصاصی‌انجام‌گردید‌در‌جدول۱توالی پرایمر‌ها، تعداد باز‌های آلی و درصد گوانین سیتوزین آورده شده است. مقادیر مورد نیاز مواد و محلول‌ها با توجه به اندازه، دمای ذوب پرایمر‌ها و پیش‌بینی اندازه محصول نهایی بهینه‌سازی شده و در جدول ۲ با جزییات ارائه شده است. مشخصات دستگاه، چرخه و زمان لازم برای فرایند در جدول ۳ با جزییات ارائه شده است.
[1] -Dichloran 18% Glycerol Agar
[2] - Lobulated Spore
[3] -Asprgillus Flavous &Aspergillus Parasiticus Media
[4] -Brain Heart Infusion Broth
[5] 5-Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
[6] 6-Tris EDTA Buffer
[7] 7-Polymerase Chain Reaction
جدول 1- توالی پرایمر ژن های afl R و ver 1و ITS
GC percent | Base number | Sequence | Primer | |
50 | 24 | 5 GCCGCAGGCCGCGGAGAAAGTGGT 3 | Ver1(forward primer) | |
40 | 23 | 5 GGGGATATACTCCCGCGACACAGCC 3 | Ver 1(reverse primer) | |
60 | 24 | 5 TATCTCCCCCCGGGCATCTCCCGG 3 | afl R (forward primer) | |
50 | 25 | 5 CCGTCAGACAGCCACTGGACACGG 3 | afl R (reverse primer) | |
60 | 20 | 5 TCCGTAGGTGAACCTTGCGG 3 | ITS1 (forward primer) | |
47 | 19 | 5 TCCTCCGCTTATGATATGC 3 | ITS4 (reverse primer) | |
جدول2 - غلظت و مقادیر مواد و واکنشگر‌ها برای PCRژنهای afl R و ver 1و ITS
Reagent | Final concentration | Volume (ul) | ||
ver 1 | aflR | ITS | ||
DNA | 10-50 ng | 3 | 4 | 5 |
Water | -- | 13.9 | 12.8 | 11.9 |
PCR Buffer(10x) | 1x | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
MgCl2 (25 mmol/lit) | 1.5 mmol/lit | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
dNTP (10 mmol/lit) | 0.8mmol/lit | 2 | 2 | 2 |
Forward Primer | 0.8mmol/lit | 1 | 1 | 1 |
Reverse Primer | 0.8mmol/lit | 1 | 1 | 1 |
Taq DNA polymerase (5U/ul) | 0.5 unit | 0.1 | 0.2 | 0.1 |
جدول3 - مشخصات چرخه ها و زمان های مورد نیاز برایPCR ژن های afl R و ver 1و ITS
Steps | ver1 | aflR | ITS |
Annealing | 10 min in 95 °C | 10 min in 95 °C | 5 min in 95 °C |
Extension | 30 sec in 95 °C 30 sec in 59 °C 60 sec in 72 °C | 30 sec in 95 °C 30 sec in 60 °C 60 sec in 72 °C | 45 sec in 94 °C 45 sec in 61 °C 60 sec in 72 °C |
Number of cycle | 30 | 35 | 38 |
Final elongation | 3 min in 72 °C | 3 min in 72 °C | 3 min in 72 °C |
محصولات PCR با استفاده از الکتروفورز افقی، برند Bio RadمدلEH-1013جداسازی‌شدند.مشخصات‌ژل الکتروفورز شامل یک درصد آگار در بافر TBE1 و دستگاه با ولتاژ ثابت 100 ولت و زمان یک ساعت راه اندازی شد(8). محصول PCR500 تا600نوکلوتیدی‌‌‌برای‌ژنafl R1 و 200 نوکلوتیدی برای ژن 1 ver مورد انتظار میباشد. تعیین توالی به وسیله شرکت‌سیناژن‌روی‌محصولاتPCR توالیITS توسط دستگاه DNA Analysis AB Science انجام شد و مقایسه در بانک ژنی مرکز NCBI2 صورت پذیرفت. برای تایید روش مولکولی و صحه‌گذاری بر حضور دو ژن aflR و ver 1 از روش اندازهگیری آفلاتوکسین به عنوان محصول اصلی این ژن‌ها،به‌وسیله‌ستون‌ایمونوافینیتی‌وHPLCاستفاده‌شد.اندازه گیری آفلاتوکسین در کشت خالص قارچهای جداسازی شده پس از 7روز‌گرمخانه‌گذاری‌در‌دمای25درجه سلسیوس طبق استاندارد ملی ایران به شماره 6872 به شرح زیر انجام گردید: بعد از آسیاب نمونهها و همگنسازی‌کامل، عبور از الک با منافذ 850 میکرون جهت اطمینان از خرد شدن کامل دانهها صورت گرفت. سپس مقدار مشخصی از نمونه توزین و بوسیله حلال مناسب استخراج انجام شد. بعد از رقیق سازی، با عبور مقدار معینی‌عصاره‌از‌ستون ایمیونوافینیتی مخصوص‌آفلاتوکسین‌های گروه B وG فرایند تخلیص صورت پذیرفت(14). در پایان با تزریق نمونهها و استانداردهای کاری، تعیین مقدار نهایی انجام شد.
4- نتایج و بحث
از۶۰ نمونه‌ای‌که فرایند جداسازی روی‌آن‌ها انجام شد،20 نوع قارچ با خصوصیات مورفولوژیک مشابه آسپرژیلوس فلاووس و‌آسپرژیلوس‌پارازیتیکوس قابل‌شناسایی بودند که فرایند تأیید، با کشت‌روی‌محیط اختصاصیAFAP صورت گرفت. حضور دو گونه غالب در بیشتر جداسازی‌های سایر محققین هم دیده شده است و گسترش این نوع قارچهای مولد سم، نشان دهنده توانایی تطبیق این گونهها با شرایط محیطی میباشد. در بخش تأیید مولکولی با انجام PCR ژنهای aflR وver1 متوجه شدیم سه مورد از سویههای جداسازی شده فاقد ژنهای مورد نظر بودند و بر این اساس از فرایند‌های بعدی مطالعه حذف شدند. یکی از جدایه‌های حذف شده تقریباً خصوصیات اصلی مورفولوژیک گونه آسپرژیلوس فلاووس را دارا بود این امر مبین این موضوع است که جداسازی و شناسایی بر اساس روش مورفولوژی شاید راهگشا و کم هزینه باشد ولی کامل و دقیق نیست و روش مولکولی ارزیابی ژنی می‌تواند با دقت و حساسیت بالا در تأیید گونههای توکسین‌زا مورد استفاده قرار گیرد. هم اکنون روشهای مولکولی به سرعت در حال رشد و توسعه توسط دانشمندان و شرکت‌های تولید کیت و تجهیزات میباشند. با توجه به تحقیقات قبلی توسط مباشر و همکاران در سال2013 دوگونه غالب مولد سم آفلاتوکسین در بیشتر غلات از جمله‌گندم و جو آسپرژیلوس فلاووس و با فراوانی‌کمتر آسپرژیلوس پارازیتیکوس میباشد، در تحقیق حاضر هم نتایج مشابهی به دست آمد(11). در تحقیقات تاتانا و همکاران در سال 2017 ، گونه کاملا جدیدی از آسپرژیلوس جداسازی و شناسایی شد که قادر به تولید آفلاتوکسین در غلات میباشد؛ این‌‌گونه‌‌آسپرژیلوس‌‌کوروجنسیس3بوده‌‌‌‌و‌‌‌قادر‌‌‌استآفلاتوکسین‌های گروه B,G را تولید کند. بنابراین در شرایط خاص، گونههای دیگر هم‌میتوانند سهمی در‌تولید آفلاتوکسین در غلات داشته باشند(13). برخی از گونهها که فقط آفلاتوکسین B1,B2 را تولید‌کردهاند آسپرژیلوس فلاووس هستند و قارچ‌هایی که هر چهار نوع سم آفلاتوکسین را تولید کرده ،آسپرژیلوس‌پارازیتیکوس یا آسپرژیلوس نومیوس4 هستند(1). از میانسویههای جدا شده 5/ 70 درصد آسپرژیلوس فلاووس و‌تنها7/17 درصد آسپرژیلوس پارازیتیکوس میباشند و بقیه جدایهها توان تولید آفلاتوکسین را نداشتند. نتایج تعیین توالی
[1] - Tris-borate-EDTA
[2] -National Center for Biotechnology Information
[3] - Aspergillus Chorogensis
[4] -Aspergillus Nomius
نشان داد دو گونه آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس پارازیتیکوس در برنج حضور دارند شناسه گونهها، میزان تطابق و کد اختصاصی برای ردیابی در سایت NCBI و بانک ژنی در جدول ۴ نشان داده شده است. این یافته‌ها با مطالعه کشتهای خالص و ریخت شناختی آنها مورد تأیید قرار گرفت. همچنین از روی متابولیتهای ثانویه تولید شده توسط این دو گونه (آفلاتوکسین‌های B، G) که به وسیلهHPLC اندازه‌گیری‌شده‌بودند نتایج جداسازی مولکولی تأیید گردید بدین ترتیب که گونه آسپرژیلوس فلاووس تنها توان‌تولید‌آفلاتوکسین‌های‌گروه Bرا دارد که در آنالیز HPLC فقط دو سمB1، B2دیده شد و برای‌آسپرژیلوس‌پارازیتیکوس پارازیتیکوس‌دو‌گروه سم B، G شامل آفلاتوکسین‌های B1،2 B،G1 ، G2 دیده شدند(13،2). نتایج تجزیه دستگاهی نشان‌داد‌سه‌سویه‌از‌سویه‌‌های‌مشکوک‌به‌آسپرژیلوسً پارازیتیکوس توان‌تولید‌هر4نوع‌سم‌آفلاتوکسین‌را دارا میباشند و بدین‌ترتیب از آن جا که تولید آفلاتوکسین‌های B1,B2,G1,G2توسط آسپرژیلوس پارازیتیکوس انجام میشود(12)، احتمال اینکه سویههای جداسازی شده آسپرژیلوس پارازیتیکوس باشند را تقویت مینماید.
جدول 4 - مشخصات گونههای جداسازی‌شده بر اساس توالی‌های ITS و مقایسه با بانک ژنی
ردیف | شناسه توالی | میزان تطابق (درصد) | جنس و گونه | شماره اختصاصی سویه |
1 | TS-1 | 13/99 | آسپرژیلوس فلاووس | MG430332.1 |
2 | TS-5 | 100 | آسپرژیلوس پارازیتیکوس |
FU(Flourecent Unit) |
شکل 1- کروماتوگرام آفلاتوکسین‌هایB,G : زمان ماند برای آفلاتوکسین‌های B1,B2,G1,G2
آزمون‌های مولکولی حضور ژنهای اختصاصیver 1 , afl R در‌تمام‌نمونه‌هایی‌که‌توسط‌روشHPLCقادر‌به‌تولید‌آفلاتوکسین بودند تایید‌کرد در همان سه مورد که تولید سم دیده نشده بود ژنهای اختصاصی بیوسنتز آفلاتوکسین هم دیده نشدند.کنترل مثبت برای نتایج آزمون‌های مولکولی PCR و اندازهگیری آفلاتوکسین با سویه قارچ‌آسپرژیلوس‌فلاووس‌خالص با شماره شناسایی PTTC No: 5018 تهیه‌شده از‌مرکز‌کلکسیون قارچ و باکتری ایران انجام شد.(4)
500-600bp |
Negative control |
Test samples |
Ladder 100bp |
شکل 2- ژل الکتروفورز محصول ژن ver1 با اندازه 600-500 باز
4-نتیجه‌گیری
از آن‌جائی که بر اساس آخرین‌گزارش سازمان غله ایران در سال1400، مصرف سالانه برنج نزدیک 40 کیلوگرم برای هر نفر میباشد، کنترل کیفیت در این محصول بسیار مهم است. بر این‌اساس، با توجه به دقت بالای‌شناسایی دو ژن aflR ,ver 1 به عنوان روشی‌سریع و‌کم‌هزینه در مقایسه با روشهای کشت و‌شناسایی‌‌مورفولوژیک‌قارچ،می‌تواند‌جهت‌جداسازی‌گونه‌های مولد‌آفلاتوکسین،به‌خوبی‌موثر‌باشد. دوگونه مولد آفلاتوکسین
جداسازی شده کاملا با گونههای شایع در سایر غلات‌مطابقت دارند و نشان می‌دهد این گونهها گسترش بسیار زیادی دارند وکنترل‌آلودگی‌‌از‌مراحل‌ابتدایی‌بسیار‌مهمتر‌از فرایندهای‌کنترلی در انتهای عرضه برنج میباشد تا ضمن حفظ سلامت محصول، از مصرف مواد نگهدارنده جلوگیری شود. انجام مطالعات بر روی مراحل مختلف از ابتدای تولید تا عرضه‌ی فراورده‌های غذایی‌پرمصرف مانند برنج برای ارائه محصولات سالم وطبیعی پیشنهاد میگردد.
5-سپاسگزاری
این تحقیق با حمایت مالی موسسه علوم تحقیقاتی امین آزمای شرق و دانشگاه آزاد اسلامی واحد شیراز انجام شده است.
6-منابع
1. Davari E, Mohsenzadeh M, Mohammadi, G. and Rezaeian-Doloei, R. Characterization of aflatoxigenicAspergillusflavus and A. parasiticus strain isolates from animal feedstuffs in northeastern Iran. Iranian journal of veterinary research. 2015; 16(2): 150-158
2. Erami M, Hashemi S. J, Pourbakhsh S. A, Shahsavandi S, Mohammadi S, Shooshtari A. H, Jahanshiri Z. Application of PCR on detection of aflatoxinogenic fungi. Archives of Razi Institute. 2007; 62(2): 95-100.
3. Gallo A, SteA G, BAttiLAni P, LoGRieCo A. F, PeRRone G. Molecular characterization of an Aspergillus flavus population isolated from maize during the first outbreak of aflatoxin contamination in Italy. Phytopathologia Mediterranea. 2012;16(4): 198-206.
4. Hedayati M. T, Omran S. M, Soleymani A, Armaki M. T. Aflatoxins in food products in Iran: A review of the literature. Jundishapur journal of microbiology. 2016; 9(7): 123-129
5. Konietzny U, Greiner R. The application of PCR in the detection of mycotoxigenic fungi in foods. Brazilian Journal of Microbiology. 2003; 34(4): 283-300.
6. Lai X, Liu R, Ruan C, Zhang H, Liu C. Occurrence of aflatoxins and ochratoxinA in rice samples from six provinces in China. Food Control. 2015; 50: 401-404.
7. Lee C. Z, Liou G. Y, Yuan G. F. Comparison of the aflR gene sequences of strains in Aspergillus section Flavi. Microbiology. 2006; 152(1): 161-170.
8. Magnani M, Fernandes T, Prete C. E. C, Homechim M, Ono E. Y. S, Vilas-Boas L. A, et al. Molecular identification of Aspergillus spp. isolated from coffee beans. Scientia Agricola. 2005; 62(1): 45-49.
9. Mostafa A A, Amer S. M. Molecular characterization of toxigenic Aspergillus flavus strains isolates from animal feed stuff in Egypt. Life Science Journal. 2013; 10(2): 20-30.
10. Moubasher H, Abutaleb A, Senousy H. H. Molecular differentiation between aflatoxinogenic and nonaflatoxinogenic strains of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus. Microbiology. 2013; 82(1): 642-646
11. Reddy K. R. N, Reddy C. S, Muralidharan K. Efficacy of certain agrochemicals on Aspergillus spp. And subsequent aflatoxin production in rice. Pesticide Biochemistry and Physiology. 2008; 174(3): 1541-1550
12. Rosa C. A. R, Cavaglieri L. R, Ruadrew S. Craft J, Aidoo K. Occurrence of toxigenic Aspergillus spp. and aflatoxins in selected food commodities of Asian origin sourced in the West of Scotland. Food and Chemical Toxicology. 2013; 55(1): 653-658
13. Thathana M. G, Murage H, Abia A. L. K, Pillay M. Morphological Characterization and Determination of Aflatoxin-Production Potentials of Aspergillus flavus Isolated from Maize and Soil in Kenya. Agriculture. 2017; 7(10): 75-80.
14. Zhang K, Banerjee k. A Review: Sample Preparation and Chromatographic Technologies for Detection of Aflatoxins in Foods. Toxins. 253; 12(1): 1-39.
