طراحی محاسباتی ادغام ریبوسوئیچ تتراسایکلین در بالادست ژن ERG11 در مخمر کومگاتائلا فافی با استفاده از سیستم کریسپر-کس9
محورهای موضوعی : قارچ شناسی
سجاد یزدان پناه
1
,
حسن محبت کار
2
*
,
محمد برشان تشنیزی
3
,
ساره ارجمند
4
1 - گروه زیست فناوری، دانشکده علوم و فناوری‌های زیستی، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران
2 - استاد-دانشگاه اصفهان
3 - گروه آموزشی مهندسی علوم زیستی، دانشکده علوم و فنون نوین، دانشگاه تهران، تهران، ایران.
4 - مرکز فناوری پروتئین، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران
کلید واژه: پروتئین‌های نوترکیب, کومگاتائلا فافی, ارگوسترول, ریبوسوئیچ, کریسپر-کس9, سیالیت غشاء.,
چکیده مقاله :
سابقه و اهداف: کومگاتائلا فافی (Komagataella phaffii) به طور گسترده به‌عنوان گزینه‌ای برتر برای تولید پروتئین‌های نوترکیب شناخته شده است. بااین‌حال، کارایی آن در ترشح این پروتئین‌ها هنوز ایده‌آل نیست. یکی از عوامل محدودکننده، سختی غشای سلولی در این مخمر است که تا حد زیادی تحت‌تأثیر میزان ارگوسترول قرار دارد. ژن ERG11 مسئول کدگذاری آنزیم مهمی در مسیر بیوسنتز ارگوسترول است. کاهش بیان ERG11 می‌تواند باعث افزایش سیالیت غشاء و به طور بالقوه بهبود ترشح پروتئین شود. در این مطالعه، هدف طراحی روشی برای کنترل پویای بیان ERG11 با الحاق ریبوسوئیچ تتراسایکلین (TcRs) در ناحیه غیرکدشونده ۵′ (5′UTR) آن بوده است.
مواد و روش‌ها: از تکنیک‌های محاسباتی شامل پیش‌بینی ساختار ثانویه RNA و داکینگ مولکولی استفاده شد تا محل‌های بهینه برای الحاق ریبوسوئیچ شناسایی شوند. علاوه بر این، راهبردی مبتنی بر کریسپر-کس9 (CRISPR-Cas9) طراحی شد تا الحاق دقیق TcRs بالادست ERG11 از طریق نوترکیبی هم‌ساخت ممکن شود.
نتایج: با تحلیل‌های محاسباتی، چهار محل الحاق مناسب برای TcRs شناسایی و یک سازه DNA دهنده شامل TcRs با دو بازوی همسان برای ورود دقیق طراحی شد. همچنین، سه sgRNA به‌صورت راهبردی طراحی شدند تا توالی‌های مجاور محل الحاق ریبوسوئیچ را هدف قرار دهند که این امر موجب افزایش کارایی و دقت الحاق از طریق نوترکیبی هم‌ساخت می‌شود.
نتیجه‌گیری: این مطالعه محل‌های مؤثر برای الحاق را مشخص و روش معتبری برای وارد کردن ریبوسوئیچ در جایگاه ژنی ERG11 ارائه می‌دهد. این روش می‌تواند به عنوان راهکاری برای تنظیم پویای سیالیت غشاء و افزایش ترشح پروتئین‌های نوترکیب در کومگاتائلا فافی مورد استفاده قرار گیرد.
Background and Objectives: Komagataella phaffii (K. phaffii) is widely recognized as a top choice for producing recombinant proteins. However, its efficiency in secreting these proteins remains less than ideal. One limiting factor is the rigidity of the yeast cell membrane, which is largely influenced by ergosterol levels. The ERG11 gene is responsible for coding a crucial enzyme in the ergosterol biosynthesis pathway. Reducing the expression of ERG11 could increase membrane fluidity, potentially improving protein secretion. In this study, we aim to design a method to dynamically control the expression of ERG11 by integrating a tetracycline riboswitch (TcRs) into its 5′ untranslated region (5′UTR).
Materials and Methods: Computational techniques, including RNA secondary structure prediction and molecular docking, were utilized to identify optimal sites for riboswitch insertion. Additionally, a CRISPR/Cas9-based knock-in strategy was designed to enable precise integration of the TcRs upstream of ERG11 through homologous recombination.
Results: Based on computational analyses, four suitable insertion sites for TcRs were identified, and a DNA donor construct comprising TcRs with two homologous arms was designed for precise integration. Additionally, three single-guide RNAs (sgRNAs) were strategically designed to target sequences adjacent to the riboswitch insertion sites, thereby enhancing the efficiency and accuracy of knock-in via homologous recombination.
Conclusion: This work highlights effective insertion sites and provides a validated approach for introducing a regulatory riboswitch into the ERG11 locus. This method offers a potential means to modulate membrane fluidity dynamically, enhancing the secretion of recombinant proteins in K. phaffii.
References:
1. Juturu V, Wu JC. Heterologous protein expression in Pichia pastoris: latest research progress and applications. ChemBioChem. 2018;19.
2. Pan Y, Yang J, Wu J, Yang L, Fang H. Current advances of Pichia pastoris as cell factories for production of recombinant proteins. Front Microbiol. 2022;13:1059777.
3. Lv W, Cai M. Advancing recombinant protein expression in Komagataella phaffii: opportunities and challenges. FEMS Yeast Res. 2025;25.
4. Baumann K, Adelantado N, Lang C, Mattanovich D, Ferrer P. Protein trafficking, ergosterol biosynthesis and membrane physics impact recombinant protein secretion in Pichia pastoris. Microb Cell Fact. 2011;10.
5. Adelantado, N., Tarazona, P., Grillitsch, K., García-Ortega, X., Monforte, S., Valero, F., Feussner, I., Daum, G., & Ferrer, P. (2017). The effect of hypoxia on the lipidome of recombinant Pichia pastoris. Microb Cell Fact, 16, 86. https://doi.org/10.1186/s12934-017-0699-4
6. Foroudi, M. R., Khodavandi, A., Alizadeh, F., Mahmoudi, H., & Pishgar, E. Presence pattern of genes related to ergosterol biosynthesis in colonizing Candida albicans isolates from patients with multiple sclerosis. J Microbial World, 2019; 17(4) (In Persian).
7. Majdi M,Khazaei Koohpar Z,Nasrollahi Omran A. Investigation of mutations in hotspot regions of ERG11 gene in fluconazole-resistant isolates of Candida albicans in the west of Mazandaran. J Microbial World, 2018; 11(3) (In Persian).
8. Solat R, Rahimi P, Bakhshi Khaniki GR, Aghasadeghi MR, Vahabpour R, Shokri M. Expression of full length of HCV-E2 gene in yeast Pichia pastoris. J Microbial World. 2016;8(4) (In Persian).
9. Edwards BAL, Batey RT. Riboswitches: a common RNA regulatory element riboregulation in bacteria. Nat Educ. 2010;3(9).
10. Ge H, Marchisio MA. Aptamers, riboswitches and ribozymes in S. cerevisiae synthetic biology. Life. 2021;11.
11. Wittmann A, Suess B. Engineered riboswitches: expanding researchers’ toolbox with synthetic RNA regulators. FEBS Lett. 2012;586(15):2076–83.
12. Serganov A, Nudler E. A decade of riboswitches. Cell. 2013;152(1-2):17–24.
13. Bauer G, Suess B. Engineered riboswitches as novel tools in molecular biology. J Biotechnol. 2006 Jun 25;124(1):4–11.
14. Hanson S, Berthelot K, Fink B, McCarthy JEG, Suess B. Tetracycline-aptamer-mediated translational regulation in yeast. Mol Microbiol. 2003;49(6).
15. Suess B, Hanson S, Berens C, Fink B, Schroeder R, Hillen W. Conditional gene expression by controlling translation with tetracycline-binding aptamers. Nucleic Acids Res. 2003;31.
16. Weigand JE, Suess B. Tetracycline aptamer-controlled regulation of pre-mRNA splicing in yeast. Nucleic Acids Res. 2007;35(12).
17. Vieira IPV, Pimentel FSA, Coelho CM, De Marco JL, de Moraes LMP, Torres FAG. Use of an on/off tetracycline riboswitch to control protein production in Komagataella phaffii. AMB Express. 2023;13(1).
18. Wieder, N., D’Souza, E. N., Martin-Geary, A. C., Lassen, F. H., Talbot-Martin, J., Fernandes, M., Chothani, S. P., Rackham, O. J. L., Schafer, S., Aspden, J. L., MacArthur, D. G., Davies, R. W., & Whiffin, N.. Differences in 5’untranslated regions highlight the importance of translational regulation of dosage sensitive genes. Genome Biology, 2024; 25(1), 111.
19. Kelvin, D., & Suess, B.. Tapping the potential of synthetic riboswitches: reviewing the versatility of the tetracycline aptamer. RNA Biology, 2023; 20(1), 457.
20. Lorenz, R., Bernhart, S. H., Höner zu Siederdissen, C., Tafer, H., Flamm, C., Stadler, P. F., & Hofacker, I. L. . ViennaRNA Package 2.0. Algorithms for Molecular Biology, 2011; 6(1), 1–14.
21. Yan Y, Zhang D, Zhou P, Li B, Huang SY. HDOCK: a web server for protein-protein and protein-DNA/RNA docking based on a hybrid strategy. Nucleic Acids Res. 2017;45(W1).
22. Sarzynska J, Popenda M, Antczak M, Szachniuk M. RNA tertiary structure prediction using RNAComposer in CASP15. Proteins. 2023;91(12):1790–9.
23. Dominguez, C., Boelens, R. & Bonvin, A. M. J. J. HADDOCK: a protein-protein docking approach based on biochemical or biophysical information. J Am Chem Soc 125, 1731–1737 (2003).
24. Concordet JP, Haeussler M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 2018;46(W1).
25. Gassler T, Heistinger L, Mattanovich D, Gasser B, Prielhofer R. CRISPR/Cas9-mediated homology-directed genome editing in Pichia pastoris. Methods Mol Biol. 2019.
26. Gunišová S, Valášek LS. Fail-safe mechanism of GCN4 translational control - uORF2 promotes reinitiation by analogous mechanism to uORF1 and thus secures its key role in GCN4 expression. Nucleic Acids Res. 2014;42(9):5880–93.
27. Lin Y, May GE, Kready H, Nazzaro L, Mao M, Spealman P, et al. Impacts of uORF codon identity and position on translation regulation. Nucleic Acids Res. 2019;47(17):9358–67.
28. Mengstie MA, Azezew MT, Dejenie TA, Teshome AA, Admasu FT, Teklemariam AB, et al. Recent advancements in reducing the off-target effect of CRISPR-Cas9 genome editing. Biologics. 2024;18:21.