مطالعه اثر استافیلوفاژ جدا شده از فاضلاب بر استافیلوکوکوسهای جدا شده از شیرخام

محورهای موضوعی : آلودگی میکروبی مواد غذائی

نیما بهادر ^{1 *} , مریم حسینی سربس ² , بهار عجم لطفی ³ , مائده نوشادی ⁴ , ماه منیر بهرامیان ⁵ , سیده گلناز خانی ⁶

1 - دانشگاه آزاد شیراز
2 - گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم، شیراز
3 - گروه بیولوژی، موسسه زند
4 - گروه بیولوژی، موسسه آموزش عالی زند
5 - گروه مهندسی صنایع غذایی، واحد شیراز، دانشگاه آزاد اسلامی
6 - گروه بیولوژی، موسسه آموزش عالی زند

تاریخ دریافت : 1403/02/01 تاریخ پذیرش : 1403/12/22 تاریخ انتشار : 1403/12/25

کلید واژه: استافیلوکوک آرئوس, ماستیت, شیر, استافیلوفاژ,

چکیده مقاله :

استافیلوکوکوس آرئوس، مهمترین عامل ماستیت در میان حیوانات تولید کننده لبنیات می‌باشد. اخیراً این ارگانیسم به‌عنوان یک باکتری مقاوم به چند دارو شناسایی شده است، بنابراین هدف از تحقیق حاضر جداسازی باکتری استافیلوکوکوس آرئوس ازشیر گاو آلوده به ماستیت و متعاقبا ارزیابی اثر فاژهای جدا شده از محیط برروی جدایه‌ها در جهت کنترل می‌باشد. در تحقیق حاضر 50 نمونه شیر، از دامداری‌هایی که گاوهایی مشکوک به عفونت پستان داشتند جمع آوری گردید. نمونه‌ها بر روی محیط کشت مانیتول سالت آگار منتقل گردید و کلنی‌ها مشکوک پس از رنگ آمیزی گرم به کمک آزمون‌های بیوشیمیایی شناسایی گردید. سپس الگوی آنتی بیوتیکی جدایه‌ها ارزیابی شد. از طرف دیگر فاژ از نمونه‌های فاضلاب جداسازی گردید و به کمک آزمون‌هایی شامل: عکسبرداری الکترونی، نوع نوکلئیک اسید، محدوده میزبان، اثر pH بر فاژ شناسایی گردید و اثر فاژ بر جدایه‌ها مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج بدست آمده بیانگر آن است که از 5‍ نمونه 6 جدایه استاف به کمک آزمون‌های بیوشیمیایی تایید گردید. همچنین از بین آنتی بیوتیک‌های انتخابی، آنتی بیوتیک‌های کلرامفنیکل ، سیپروفلوکساسین و جنتامایسین 100% روی باکتری‌های جدا شده اثر داشته اند و سایر انتی بیوتیکها اثر متفاوتی نشان دادند. فاژ جداشده از محیط پلاگ‌های شفاف در دمای اتاق و 37 درجه تولید کرده اند که متعلق به خانواده سیفوویریده وحاویDNA بوده و محدوده اثر باکتری‌های گرم مثبت با Ph خنثی داشته است. نتایج بدست آمده بیانگر آن است که فاژ بر جدایه استافیلوکوک اثر داشته و می‌تواند به‌عنوان یک عامل بیولوژیک کنترل کننده عفونت در نظر گرفته شود. ‏‏

چکیده انگلیسی:

Staphylococcus aureus is an important agent of mastitis among animal with capability to produce dairy compounds. Nowadays, the organism is recognized as multi drug resistant organism. Therefore, the aim of this study is isolation of Staphylococcus aureus from raw milk of cows infected with mastitis and the evaluation of bacteriophage on the same organisms. In this study 50 milk samples were collected from suspected cows with mastitis. The samples were cultivated on mannitol salt agar and the supposed colonies were identified using gram stain and biochemical tests. Then antibiotic pattern were evaluated. On the other hand, the sewage samples were collected and based on some tests including: electron micrograph, nucleic acid type, host range, pH bacteriophages were identified. Results indicated that out of 50 samples 6 isolates were confirmed using biochemical tests. In addition among antibiotics, chloramphenicol, ciprofloxacin, and gentamycin 100% had effect on the isolates and the other antibiotics showed different results. Detected phages showed clear plaque at room temperature and 37C, and they were belong to siphoviridae family with DNA, and had effect on gram positive bacteria at neutral pH. The results illustrated that phages had effect on Staphylococcus aureus and we could use them as biocontrol agents against infections.

منابع و مأخذ:

1. Ameer Hamza, A. H., Shehla Perveen, S. P., Zaigham Abbas, Z. A., & Shafiq-ur-Rehman, S.-u.-R. (2016). The lytic SA phage demonstrate bactericidal activity against mastitis causing
Staphylococcus aureus. Journal of Open life sicence, 11(1):39. 2. Bahador, N. (2005). Bacteriophages isolation characterization and exploitation in environmental problems [PhD, Puna
University]. 3. Baserisalehi, M, Bahador, N. : diagnostic of bacteriology ,
Navid Publication 2012, 105 4. Bueno, E., García, P., Martínez, B., & Rodríguez, A. (2012). Phage inactivation of Staphylococcus aureus in fresh and hard-type cheeses. International journal of food microbiology, 158(1), 23-27.
5. Can, H. Y., Elmalı, M., & Karagöz, A. (2017). Molecular typing and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus strains isolated from raw milk, cheese, minced meat, and chicken meat samples. Korean journal for food science of animal resources, 37(2), 175.
6. Clinical and Laboratory Standards Institute. (2014). ‘’Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fourth Informational Supplement’’. CLSI document M100-S24, 34: 219.
7. Deghorain, M., & Van Melderen, L. (2012). The Staphylococci phages family: an overview. Viruses, 4(12), 3316-3335.
8. Farajvand, N., & Alimohammadi, M. (2014). Prevalence of Staphylococcus aureus in four famous brand of doogh produced in Iran. Iranian Journal of Health and Environment, 7(1).
9. Fitzgerald, J. R., Monday, S. R., Foster, T. J., Bohach, G. A., Hartigan, P. J., Meaney, W. J., & Smyth, C. J. (2001). Characterization of a putative pathogenicity island from bovine Staphylococcus aureus encoding multiple superantigens. Journal of bacteriology, 183(1), 63-70.
10. Jamalludeen, N., Johnson, R. P., Friendship, R., Kropinski, A. M., Lingohr, E. J., & Gyles, C. L. (2007). Isolation and characterization of nine bacteriophages that lyse O149 enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary microbiology, 124(1-2), 47-57.
11. Harda, L., Silva, E., Campos, WF., Fiol, F. (2018) . biotechnological applications of bacteriophages: state of the art. 212-213: 38-58.
12. Kluytmans, J., & Wertheim, H. (2005). Nasal carriage of Staphylococcus aureus and prevention of nosocomial infections. Infection, 33, 3-8.
13. Kulinkina, A. V. Shinee, E. Herrador, B., Nygard, K. and Schmoll, O. (2016). The situation of water-related infectious diseases in the Pan-European Region. WHO.
14. Levy, S. B., & Marshall, B. (2004). Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and responses. Nature medicine, 10(Suppl 12), S122-S129.
15. Li, J., Law, H. K., Lau, Y. L., & Chan, G. C. F. (2004). Differential damage and recovery of human mesenchymal stem cells after exposure to chemotherapeutic agents. British journal of haematology, 127(3), 326-334.
16. Mishra, A., Sharma, N., Kumar, A., Kumar, N., Bayyappa, M. G., & Kumar, S. (2014). Isolation, characterization and therapeutic potential assessment of bacteriophages virulent to Staphylococcus aureus associated with goat mastitis. Iranian journal of veterinary research, 15(4), 320.
17. Najafi, A., Ziabakhsh, D. M., Karimian, H., Abedinia, A. R., & Hosseininezhad, M. (2011). Microbiological changes of pousti cheese during ripening. Journal of Food Technology and Nutrition, 8(2), 85-91.
18. Premarathne, J., Thung, T., New, C., Huat, J., Basri, D., Rukayadi, Y., Nakaguchi, Y., Nishibuchi, M., & Son, R. (2017). Distribution of bacteriophages in food and environment samples. International Food Research Journal, 24(2), 888-896.
19. Rola, J. G., Czubkowska, A., Korpysa-Dzirba, W., & Osek, J. (2016). Occurrence of Staphylococcus aureus on farms with small scale production of raw milk cheeses in Poland. Toxins, 8(3), 62.
20. Sadeghifard, N., Jalilian, A., Seidkhani, A., & Rostamzad, A. (2006). A study on contamination of E. coli and S. aureus in raw milk in Ilam during 1999-2003. Journal of Ilam University of Medical Sciences, 14(1), 44-49.
21. Sambrook, J., & David, W. (2001). Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York (3rd ed.).
22. Schulz-Collins, D., & Senge, B. (2004). Acid-and acid/rennet-curd cheeses part A: Quark, cream cheese and related varieties. In Cheese: Chemistry, physics and microbiology (Vol. 2, pp. 301-328).
23. Teng., L., Feng, M., Liao, S., Zheng, Zh., Jia, Ch., Zhou, X., Nambiar, RB., M, Zh., and Yue M. (2023). A cross sectional study of companion animal derived multi drug E. coli in Hangzhou, China. Journal of Microbiol Spectr. 11(2); e02113-22.
24. Van Boeckel., T., P. Brower, C., Gilbert, M. & Laxminaryan, R. (2015). Global trends in antimicrobial use in food. Journal of PNAS. 112(18) 5649-5654.
25. Wang, X., Xu, M., Cai, Y., Yang, H., Zhang, H., & Zhang, C. (2009). Functional analysis of the disulphide loop mutant of staphylococcal enterotoxin C2. Applied microbiology and biotechnology, 82, 861-871.
26. Wayne, P. (2011). Clinical and laboratory standards institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing.

متن کامل:



مجله میکروب شناسی مواد غذایی                                                                                     

مطالعه اثر استافیلوفاژ جدا شده از فاضلاب بر استافیلوکوکوس های جدا شده از شیرخام

نیما بهادر1، مریم حسینی سربس1،بهار عجم لطفی2، مائده نوشادی2، ماه منیر بهرامیان3 ، سیده گلناز خانی2

1. گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، کشاورزی و فناوریهای نوین، واحد شیراز،دانشگاه آزاد اسلامی، شیراز، ایران

2. گروه بیولوژی، موسسه آموزش عالی زند، شیراز، ایران

3 گروه صنایع غذایی، ، دانشکده علوم پایه، کشاورزی و فناوریهای نوین، واحد شیراز،دانشگاه آزاد اسلامی، شیراز، ایران

نویسنده مسئول: [e-mail]

چکیده

استافیلوکوکوس اورئوس  ، مهمترین عامل ورم پستان در میان حیوانات تولید کننده شیر می‌باشد. اخیراً این ارگانیسم به‌عنوان یک باکتری مقاوم به چند دارو شناسایی شده است، بنابراین هدف از تحقیق حاضر جداسازی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس  ازشیر گاو آلوده به ورم پستان و متعاقبا ارزیابی اثر فاژهای جدا شده از محیط برروی جدایه‌های بدست آمده می‌باشد. در تحقیق حاضر 50 نمونه شیر، از دامداری‌هایی که گاوهایی مشکوک به ورم پستان داشتند جمع آوری گردید. نمونه‌ها به محیط کشت مانیتول سالت آگار منتقل گردید و کلنی‌ها مشکوک پس از رنگ آمیزی گرم به کمک آزمون‌های بیوشیمیایی شناسایی گردید. سپس الگوی آنتی بیوتیکی جدایه‌ها ارزیابی شد. از طرف دیگر فاژ از نمونه‌های فاضلاب جداسازی گردید و به کمک آزمون‌هایی شامل: عکسبرداری الکترونی، تعیین نوع نوکلئیک اسید، محدوده اثر بر میزبان، اثر pH شناسایی گردید.سپس اثر فاژ بر جدایه‌ها مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج بدست آمده بیانگر آن است که از 50 نمونه جمع آوری شده 6 جدایه استاف به کمک آزمون‌های بیوشیمیایی تایید گردید. همچنین از بین آنتی بیوتیک‌های انتخابی، آنتی بیوتیک‌های کلرامفنیکل ، سیپروفلوکساسین و جنتامایسین 100% روی باکتری‌های جدا شده اثر داشته اند و سایر آنتی بیوتیکها اثرات متفاوتی نشان دادند. فاژ جداشده از محیط با بروز پلاگ‌های شفاف در دمای اتاق و 37 درجه ،حاویDNA ، محدوده اثر باکتری‌های گرم مثبت و رشد در pH خنثی متعلق به خانواده سیفوویریده شناسایی گردید. نتایج بدست آمده بیانگر آن است که فاژ بر جدایه استافیلوکوک اثر داشته و می‌تواند به‌عنوان یک عامل بیولوژیک کنترل کننده عفونت در نظر گرفته شود.  ‏‏

واژه های کلیدی: کنترل بیولوژیک، محصولات لبنی، استافیلوکوکوس اورئوس ، ورم پستان، استافیلوفاژ

 

 

 

 

 

مقدمه

بر اساس گزارشات بدست آمده از سازمان بهداشت جهانی سالانه، ۴۲۰۰۰۰ نفر به دلیل بیماری‌های ناشی از مواد غذایی جان خود را از دست می‌دهند. این امر تاثیر اقتصادی ۱۱۰ میلیارد دلاری بر اقتصاد جهانی دارد. همچنین این سازمان اعلام نمود که  تقریبا ۱۸ درصد از شیوع بیماری‌های عفونی مربوط به بیماریهای آب زاد در اروپا 2016 (Kulinkina et al., است که این درصد ممکن است در سایر قاره‌ها بیشتر باشد. از طرف دیگر، باکتری‌های مقاوم به چند دارو (MDR) نه تنها در سلامت انسان بلکه در صنایع دامی نیز نگرانی بزرگ محسوب می‌شوند. بطوریکه استفاده بیش از حد ترکیبات ضد میکروبی در تولید محصولات غذایی حیوانی تا سال ۲۰۳۰ چیزی حدود ۶۷ % پیش‌بینی شده است (Van Boeckel et al., 2015). در این میان، چین بیش‌ترین مصرف کننده مواد ضد میکروبی و پس از آن ایالات‌متحده آمریکا، برزیل، آلمان و هند قرار دارند، که در گزارشات ذکر شده انتقال باکتری‌های MDR از حیوانات به انسان نیز توصیف شده‌ است ( Teng et al., 2023) بنابراین با توجه به عوامل ذکر شده به نظر می رسد که بایستی به فکر راهکاری جدید جهت کنترل این ارگانیسمها بود. 

استافیلوکوکوس اورئوس   یک پاتوژن انسانی - حیوانی است که عامل ایجاد عفونت‌های بیمارستانی، اجتماعی و طیف وسیعی از بیماری‌ها، از عفونت‌های خفیف پوستی تا عفونت‌های شدیدمی باشد(Kluytmans & Wertheim, 2005). این ارگانیسم یکی از پر خطرترین باکتری‌های جدا شده از مواد لبنی است که به دنبال ورم پستان گاوی می‌‌توان آن را جدا نمود. بنابراین ارگانیسم مذکور مسبب کاهش روند اقتصاد، در کشورهای توسعه یافته به شمار می رود و بطور حتم، مقاومت چند دارویی آن چالش این روزها در علم پزشکی و دامپزشکی است(Li et al., 2004; Wang et al., 2009). امروزه فاژها به‌عنوان عوامل ضد باکتریایی برای کنترل پاتوژن‌های غذایی و همچنین کاهش خطرات و ایمنی موادغذایی، مورد استفاده قرار می گیرند(Bueno et al., 2012). باکتریوفاژ‌های لیتیک و محصولات ژنی آن‌ها می‌‍‌تواند بطور بالقوه عاملی در درمان باکتری‌هایی که میزبان خاصی دارند باشند و ضرر کمتری نسبت به آنتی بیوتیک ها دارند (Ameer Hamza et al., 2016). در دهه‌های گذشته، استفاده از باکتریوفاژها در کشورهای غربی به‌ عنوان جایگزینی برای درمان‌های شیمیایی مطرح شده‌است. باکتریوفاژها به خاطر حضور در محیط، به‌عنوان فراوان‌ترین عوامل بیولوژیکی روی زمین شناخته می‌شوند. به‌طور خلاصه، این گروه از ارگانیسمها قادر به لیز کردن باکتری‌های MDR و کاهش اثرات نامطلوب تولید شده توسط مواد شیمیایی بر روی مواد غذایی می‌باشند. در ورم پستان ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس   ، کنترل عفونت به تنهایی دشوار است. امروزه کنترل موفق تنها به‌وسیله پیشگیری از عفونت‌های جدید و جمع آوری گاوهای آلوده می باشد. در طول شیردوشی، به‌علت نوسان نامرتب و خلا هوا،  باکتری می‌تواند در کانال پستان بالا رود.  بر حسب این عمل، اگر جمع‌آوری به طور مناسب صورت نگیرد، به‌طور بالقوه باعث عفونت مجدد می گردد. در این میان بسیاری از گاوها ممکن است پس از زاییدن گوساله های خود مبتلا به عفونت تحت کلینیکی شوند. پایداری باکتری درغدد پستانی، موجب گسترش عفونت در زمان شیردوشیدن می گردد. بنابراین برای جلوگیری از افزایش شیوع عفونت، باید گاوهای عفونی از گله جدا شوند. در بسیاری از دامداری‌ها، به‌علت تعداد زیاد گاوهای عفونی، قادر به ریشه کن کردن استافیلوکوکوس اورئوس  با وجود تکنیک شیرگیری استاندارد نیستند.  بنابراین از آنجایی‌که امروزه از باکتریوفاژها در صنعت غذا استفاده می‌شوند( 2018 Harda et  al.,) این گروه از ارگانیسم‌ها  با استفاده از اندولیزین‌های کد گذاری شده توسط فاژ مسئول تجزیه پپتیدوگلیکان باکتریایی در مرحله نهایی چرخه هستند ( Ghose Euler ., 2020). بنابراین با توجه به اهمیت باکتری استافیلوکوک و تاثیر گذاری آن براقتصاد جامعه، هدف از تحقیق حاضر جداسازی باکتری ازشیر گاو آلوده به ورم پستان و متعاقباً مطالعه اثر فاژهای جدا شده از محیط بر جدایه‌ها در جهت کنترل ارگانیسم می باشد.  

مواد و روشها

غربالگری استافیلوکوکوس اورئوس  از شیر

در تحقیق حاضر 50 نمونه شیر به صورت تصادفی از دامداری‌هایی که گاوهایی مشکوک به ورم پستان داشته و توسط دامپزشک مورد تایید قرار گرفته جمع آوری گردید. نمونه‌ها از اولین شیر صبحگاهی در بطری‌های استریل جمع آوری و با زنجیره سرد از طریق جعبه یخ به آزمایشگاه منتقل و آنالیز انجام گردید. جهت جداسازی، نمونه‌ها با سواپ برروی محیط کشت مانیتول سالت آگار منتقل و پلیت‌ها در دمای 37 درجه سیلسیوس به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. سپس کلونی‌های زرد طلائی جهت آزمون‌های بعدی خالص سازی گردید(Fitzgerald et al., 2001). برای شناسایی جدایه‌ها، ابتدا به کمک رنگ آمیزی گرم و سپس به کمک آزمون‌های کاتالاز، اکسیداز، اوره آز، احیای نیترات، تست ژلاتیناز، استفاده از قند گلوکز، DNAes، کواگولاز و همولیز آنالیز گردید. (Bahador, 2005)

تعیین الگوی آنتی بیوتیکی جدایه ها

تعیین الگوی آنتی بیوتیکی جدایه‌ها به روش بررسی حساسیت باکتری‌ها نسبت به آنتی بیوتیک‌های مختلف بر اساس CLSI 2017 مورد آنالیز قرار گرفت. برای این منظور یک دهم میلی لیتراز ارگانیسم فعال بر روی محیط مولرهینتون آگار منتقل ودر تمامی جهات به صورت چمنی کشت داده، سپس بوسیله پنس استریل آنتی بیوتیک‌های مورد نظر شامل:تتراسایکلین(TE30)، سیپروفلوکساسین(CP5)، آموکسی سیلین(AMX25)، آمپی سیلین(AM10)، جنتامایسین(GM10)، کلرامفنیکل(C30)، نووبیوسین(NB) با فاصله از سایرآنتی بیوتیک ها و دیواره بر سطح پلیت منتقل گردید. محیط‌های کشت در اینکوباتور دمای 37 درجه سیلسیوس به مدت 24 ساعت انکوبه شدند وپس از زمان مذکور محیط براساس تشکیل هاله بررسی گردید و بر اساس استاندارد بین الملی CLSI 2017 حساسیت و مقاومت آنها همراه با درصد فراوانی تعیین شد (Wang et al., 2009; Wayne et al.,2011).

جداسازی باکتریوفاژ از فاضلاب

جهت جداسازی باکتریوفاژ‌ها از فاضلاب بیمارستان نمازی شیراز نمونه تهیه گردید. ابتدا جهت غنی سازی  20ml از آب فاضلاب باml 20 محیط باکتریوفاژ براث مخلوط نموده و مقداری از کلنی باکتریایی استافیلوکوکوس اورئوس  را با لوپ برداشته و در محیط کشت داده، سپس محیط‌ها دردمای 37 درجه به مدت 24 ساعت اینکوبه گردید. پس از گذشت 24 ساعت، محیط فاژ براث کانسنتریت را از فیلتر با منفذ 45 میکرومتر عبور داده شد و 1.0ml از محلول فیلتر شده فاژ براث کانسنتریت را با 1.0ml از باکتری کشت یافته در محلول نوترینت براث که 24 ساعت از رشد آن گذشته مخلوط نموده و روی محیط نوترینت آگار کشت داده. محیط نوترینت آگار در سه دمای4 دمای اتاق (27درجه)، و 37 درجه سیلسیوس قرار داده شد و بعد از 5 ساعت هر 2 ساعت یکبار محیط‌ها از نظر تشکیل پلاک مورد مطالعه قرار گرفت( Sambrook & David, 2001;Jamalludeen et al., 2007). 

شناسایی باکتریوفاژها

جهت شناسایی باکتریوفاژ با استفاده از عکسبرداری الکترونی، نمونه‌های عبور یافته از فیلتر سرسرنگی با منفذ 45 میکرومتر به دانشگاه دامپزشکی شیراز بخش میکروسکوپ الکترونی منتقل گردید. نمونه فاژ مورد نظر برای عکسبرداری با اورانیل استات 2% بر روی کربن پوشیده شده از مس با روش استاندارد منتقل و عکس‌ها با میکروسکوپ الکترونی  CM-10(شرکت فیلیپس هلند با ولتاژ 100KV ) گرفته شد و بر حسب کمیته بین المللی رده‌های ویروسی ICTV طبقه بندی گردید(Jamalludeen et al., 2007). تعیین نوکلئیک اسید فاژ، توسط آنزیم  RNAse انجام شد و برای بررسی محدوده اثرگذاری فاژ، از باکتری‌های گرم مثبت شامل: استرپتوکوک، استافیلوکوکوس اپیدرمیس و استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس و گرم منفی شامل: اشرشیا کلای و سالمونلا استفاده گردید. بدین منظور 1.0ml از هر یک از باکتری‌های گرم مثبت به صورت مجزا در نوترینت براث به مدت 24 ساعت رشد نموده به همراه 1.0ml از محلول فاژ براث بر روی محیط نوترینت آگارافزوده و با سواپ بصورت چمنی کشت داده شد. پس از گذشت 5 ساعت، هر 2 ساعت یکبار محیط از نظر رشد پلاگ بررسی گردید .(Jamalludeen et al., 2007)  همچنین جهت ارزیابی بقای فاژدر pH های مختلف، محیط کشت فاژ براث با pH های مختلف از 9-4 به کمک اسید کلریدریک و سود تهیه گردید. سپس نمونه فاژ خالص به مدت یک ساعت در محیط‌های مذکور دردمای 37 درجه نگه داری شد. پس از زمان مذکور 0.1ml  از باکتری‌های کشت یافته و 0.1ml از فاژ بر روی محیط کشت نوترینت آگار مخلوط شده و به‌صورت کامل در سطح پلیت به فرم سفره‌ایی کشت داده شد. پلیت‌ها در دمای 37 و 25 درجه سیلسیوس قرار داده شد و پس از 5 ساعت هر 2 ساعت یک‌بار از نظر حضور پلاک مورد ارزیابی قرار گرفت(Bahador, 2005) . 

 

آنالیز آماری داده ها

نتایج بدست آمده از الگوی آنتی بیوتیکی جدایه ها مورد آنالیز آماری با استفاده از آزمون‌های آماری ANOVA به کمک نرم افزار SPSS در سطح اطمینان 95% مورد ارزیابی قرار گرفت.

یافته ها

درتحقیق حاضر از بین 50 نمونه شیر، 6 سویه استافیلوکوکوس اورئوس  جداسازی گردید که همگی به کمک آزمون‌های بیوشیمیایی تایید شدند. نتایج حاصل از الگوی آنتی بیوتیکی در شکل (1) و جدول (1) نشان داده شده است، از بین آنتی بیوتیک‌های انتخابی، آنتی بیوتیک‌های کلرامفنیکل، سیپروفلوکساسین، جنتامایسین و نووبیوسین 100% روی باکتری‌های جدا شده اثر داشته اند . همچنین آنتی بیوتیک‌های آموکسی سیلین و تتراسایکلین تا 83.4% و آنتی بیوتیک آمپی سیلین، 66.7% روی باکتری‌ها اثر داشته اند. نمونه شماره 5 نسبت به آنتی بیوتیک‌ها خیلی حساس بوده است و نمونه شماره 3 مقاومت بیشتری نسبت به آنتی بیوتیک‌ها داشته است. وسایر نمونه‌های شماره 1، 2، 4 و 6 تقریبا به یک میزان نسبت به آنتی بیوتیک‌ها حساس بوده اند ( جدول 2). 

 

 

شکل 1- بررسی حساسیت باکتری استافیلوکوکوس اورئوس  نسبت به آنتی بیوتیک

جدول 1- تعیین درصد حساسیت جدایه ها به آنتی بیوتیک‌ها

آنتی بیوتیک		(%)حساس		(%)نیمه حساس	(%)مقاوم
کلرامفنیکل		100		-	-
آموکسی سیلین		66.7		-	33.3
آمپی سیلین		66.7			33.3
نووبیوسین		100			-
سیپروفلوکساسین		100		-	-
جنتامایسین		100		-	-
تتراسایکلین	83.4		-			16.6

 

 

 

 

 

 

جدول ۲-  تعیین الگوی آنتی بیوتیکی جدایه‌ها

	C	AMX	AM	NB	CP	GM	TE
جدایه ها	>18	>29	>29		>21	>15	>19
1	25±۰.۵۷	32±۰	30±۰.۷	±۰.۵ 17	21±۰	16±۰.۵	30±۱.۱۵
2	26±۰	30±۱.۴۱	۰.۷ 32±	17±۰	21±۰.۷	17±۰.۷	32±۰.۵۷
3	34±۰	±۰.۵ ۱۵	±۰.۵ ۱۵	23±۱	33±۰	30±۰.۵	10±۰
4	31±۱	32±۰	33±۱.۱۵	14±۰.۵	25±۰.۵	25±۰.۵	25±۰
5	35±۱.۴۱	44±۱.۴۱	36±۰.۵	25±۰.۵	31±۰.۵	30±۰	32±۱.۴۱
6	20±۰	22±۰.۵	22±۰.۵	12±۰.۵	24±۰	27±۰.۵	25±۰

 

طبق بررسی صورت گرفته توسط نرم افزار SPSS و آزمون‌های ANOVA، تفاوت معنی داری بین میانگین اثر گذاری آنتی بیوتیک‌ها وجود داشته است. همچنین طبق نمودار(1) آنتی بیوتیک‌های آمپی سیلین و جنتامایسین طول بیشتری را نشان داده که بیانگر پراکندگی بیشتر داده‌ها ست. با توجه به نمودار Box-Plot (1) که برای جمعیت‌های غیر نرمال و مقایسه جمعیت‌ها کارایی دارد،  توزیع داده‌ها در کل آنتی بیوتیک‌ها نامتقارن بوده است و آنتی بیوتیک‌های کلرامفنیکل ، آموکسی سیلین ، آمپی سیلین، سیپروفلوکساسین و جنتامایسین همپوشانی داشته اند ولی با آنتی بیوتیک نووبیوسین همپوشانی کمی مشاهده شده است. همچنین در این نمودار نووبیوسین با تتراسایکلین هیچ همپوشانی نداشته اند. طبق نمودار Error-Bar  (2) نیز میانگین اثر آنتی بیوتیک‌ها متفاوت بوده است و کل آنتی بیوتیک‌ها با هم همپوشانی داشته اند ولی با آنتی بیوتیک نووبیوسین کمترین هم پوشانی را داشته اند

 

 

نمودار۱- اثر آنتی بیوتیک‌ها بر نمونه‌ها به‌وسیله نمودار BOX-PLOT

 

نمودار ۲- اثر آنتی بیوتیک‌ها بر نمونه‌ها به‌وسیله نمودار Error-Bar

در این تحقیق دو نوع استافیلوفاژ جدا شده که هر دو متعلق به خانواده سیفوویریده می باشد ( شکل 2) (2005ICTV-International Committee on Taxonomy of Viruses. ).

 

شکل2 – الکترون میکروگراف استافیلوفاژ

بررسی ماده ژنتیکی استافیلوفاژ با آنزیم RNAse مشخص کرد که هر دو فاژ حاوی ماده ژنتیکی، DNA است (شکل 3).

 

شکل3-تعیین نوکلیئک اسید استافیلوفاژهای جدا شده، چاهک اول: جدایه اول، چاهک دوم: جدایه دوم و چاهک سوم: لدر100 جفت بازی (شرکت یکتا تجهیز ایران)

 

 

 ازطرف دیگر تحقیق حاضر نشان داد که استافیلوفاژهای جدا شده بر روی باکتری‌های گرم مثبت شامل: استرپتوکوک، استافیلوکوکوس اپیدرمیس و استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس موثر بوده و پلاک مشاهده گردید، این در حالیست که بر روی باکتری‌های گرم منفی بی تاثیر بود. جهت ارزیابی بقای فاژ در pH های مختلف محیط کشت فاژ براث با pHهای مختلف از 9-4 به کمک اسید کلریدریک و سود تهیه گردید. تحقیق حاضر نشان داد که فا‌ژها تنها در  7 PH بقای خود را حفظ نموده و اثر ضد باکتریایی خود را نشان میدهند.

بحث

   شیر و فرآورده‌های آن به دلیل مفید بودنشان برای سلامتی و خصوصیات مناسب تغذیه‌ای آنها سبب شده است که امروزه در پژوهش‌های علمی و در تجارت،  بسیار مورد توجه قرار گیرد(Farajvand & Alimohammadi, 2014). شیر یک غذای کامل اما در عین حال یک محیط رشد مناسب برای فعالیت باکتری‌های مختلف است. میکروب‌های شیر روی طعم و خواص فیزیکی شیر تاثیر نامطلوب داشته و موجب بیماری در انسان می‌شوند. بنابراین با توجه به تهیه محصولات لبنی مختلف از شیر خام و آماده سازی و رساندن آن احتمال وجود خطرات بهداشتی و انتقال باکتری‌های بیماری زا از گروه استافیلوکوک‌ها و انتروکوک‌ها در اثر مصرف این فرآورده‌ها وجود دارد (Najafi et al., 2011). استافیلوکوکوس اورئوس   ، باکتری مهاجم با توانایی گسترده استفاده از آنزیم‌ها و سموم مختلف است که در صنایع غذایی به عنوان یک میکروارگانیسم مهم به شمار می آید و متاسفانه امروزه سویه‌های مقاوم به داروی آن در کشور‌های درحال توسعه و توسعه یافته بسیار گزارش شده است که می تواند تهدیدی بر سلامت جامعه باشد. این ارگانیسم از آنجایی‌که می تواند التهاب پستان را درگاو ایجاد نماید و با‌ر‌ها از شیر جداشده، قابل انتقال به انسان می‌باشد. این ارگانیسم همچنین به‌عنوان یک پاتوژن برجسته در عفونت‌های بیمارستانی و اجتماعی شناخته می‌شود که قادر به تحریک عفونت‌های مختلف در نقاط مختلف بدن در بیماران است و بروز عفونت‌های شدید با این ارگانیسم اغلب با میزان قابل توجهی مرگ و میر( ۲۵ درصدی) همراه است. در غیاب درمان‌های جایگزین بهتر، آنتی بیوتیک‌ها هنوز رویکرد اصلی برای درمان عفونت‌ها هستند، با این حال استفاده بیش از حد از آنتی بیوتیک‌ها به نوبه خود منجر به افزایش مقاومت ضد میکروبی شده است. بنابراین، ضروری است که استراتژی‌های جدیدی برای کنترل عفونت‌های مقاوم به دارو ایجاد شود . طی مطالعه‌ای که صدیقی فرد و همکاران در ایلام در خصوص بررسی آلودگی شیر خام از نظر اشرشیاکلی و استافیلوکوکوس اورئوس   انجام دادند، دریافتند که میزان آلودگی اشرشیا کلی و استافیلوکوکوس اورئوس   از زمان دوشیدن شیر تا مرحله فروش به‌طور معنی داری افزایش می‌یابد (Sadeghifard et al., 2006). اخیرا مشخص شده که 3% از حیوانات درگیر عفونت استافیلوکوکوس اورئوس   هستند (Schulz-Collins & Senge, 2004) . همچنین استافیلوکوکوس اورئوس   ، 10 تا 12 درصد از عفونت‌های ورم پستان را شامل می شود.  بنابراین هدف اصلی تحقیق اثر استافیلوفاژ به‌عنوان یک محافظ بیولوژیک بر روی استافیلوکوک‌های جدا شده از شیر گاوهای آلوده به ماستیت می‌باشد تا به این طریق سویه‌های مقاوم شناسایی شده و اثر فاژ بر روی آنها مطالعه گردد. باکتریوفاژها، برای درمان عفونت‌های باکتریایی پیش از ظهور آنتی بیوتیک‌ها مورد استفاده بودند، اما پس از آن به دلیل درک نظری محدود و فرایندهای آماده‌سازی ناکارآمد در آن زمان با آنتی بیوتیک‌ها جایگزین شدند. اخیرا به دلیل مشکل جدی مقاومت به آنتی بیوتیک دوباره توجه بسیاری از محققان به فاژ‌ها از جمله استافیلوفاژ جلب شده است. در ایالات متحده حدود 40 تا 60 % سویه‌های استافیلوکوکی بیمارستانی مقاومت چند دارویی گزارش شده است (Levy & Marshall, 2004) و سرعت مرگ و میر گونه‌های مقاوم به متی سیلین نسبت به گونه‌های حساس به متی سیلین سه برابر شدیدتر است. به‌طوری که طی تحقیقی که توسط رولا و همکاران در سال 2016  در یک دوره سه ساله بر روی شیر خام انجام گردید نشان داد که پنیرهای تهیه شده از شیر مذکور از نه مزرعه دامداری در لهستان تهیه گردید که از 244 نمونه جدا شده قادر به جداسازی 122 جدایه استافیلوکوک با میزان 50% فراوانی بوده است. وی همچنین نشان داد که میزان مقاومت به تتراسیکلین در بین جدایه‌ها 4.1% بوده است که در مقایسه با تحقیق حاضر (16.6%) کمتر می‌باشد. بنابراین پیشنهاد نمودند که نمونه‌های شیر و پنیر تولید شده در کشور باید به طور مرتب از نظر حضور این ارگانیسم و مقاومت آنتی بیوتیکی ارزیابی شود (Can et al., 2017). همچنین کان وهمکاران در سال 2017 برروی استافیلوکوکوس اورئوس   های مقاوم به متی سیلین جدا شده از شیرخام، پنیر، گوشت چرخ کرده گوساله و نمونه‌های گوشت مرغ انجام شده، از 160 نمونه جمع آوری شده 20 نمونه درگیر با ارگانیسم مذکور بوده است که چیزی حدود 12.5% می باشد این درحالیست که در مقایسه با تحقیق حاضر میزان باکتری‌های جدا شده 6% است. از طرف دیگر میزان ارگانیسم‌های مقاوم به متی سیلین در تحقیق انجام شده توسط کان و همکاران 97% بوده است که در تحقیق حاضر جدایه‌ها با 33.3% مقاوم به آمپی سیلین وآموکسی سیلین گزارش شده اند. همچنین اثر جنتامایسین در ایزوله‌های هر دو تحقیق به صورت یکسان گزارش شده و برابر 100 درصد بوده است این در حالیست که اثر تتراسیکلین در بین جدایه‌های بدست آمده از هر دو تحقیق متفاوت می‌باشد و چیزی برابر 30% برای جدایه‌های کان و همکاران است و برای جدایه‌های بدست آمده از تحقیق حاضر برابر 16.6% می‌باشد (Rola et al., 2016).

در پژوهش حاضر، از فاضلاب بیمارستان نمازی شیراز به منظور جداسازی باکتریوفاژ علیه استافیلوکوکوس اورئوس  نمونه گیری انجام شد. باکتریوفاژها پس از شناسایی اولیه جهت اثر بر روی جدایه‌های استاف از شیر خام مورد ارزیابی قرار گرفت. کنترل باکتری‌های جدا شده از شیر توسط باکتریوفاژ بحثی است که توسط پری ماراتنی و همکاران نیز در رابطه با باکتری‌های مقاوم به آنتی بیوتیک جدا شده از غذا نیز اشاره شده است. وی و همکاران اعتقاد داشتند که باکتریوفاژها می توانند به عنوان یک جایگزین مناسب برای باکتری‌های جدا شده از غذا به شمار آیند. بر همین اساس پس از غربالگری اولیه باکتری‌های از غذا باکتریوفاژ از نمونه های محیطی و غذا جداسازی و اثر آن را بر روی باکتری‌هایی مانند استافیلوکوکوس اورئوس ، لیستریا منوسیتوژن و اشریشیا کلی مورد ارزیابی قرار دادند و از  آن به‌عنوان یک عامل موثر درکنترل باکتری‌های غذازاد معرفی نمودکه تحقیقات وی در راستای تحقیق حاضر می باشد (Premarathne et al., 2017).

نمونه‌ها پس از غنی سازی توسط میکروسکوپ الکترونی  مورد آنالیز قرار گرفت و بر اساس تعیین ماده ژنتیکی (DNA)، مرفولوژی و نوع پلاگ در خانواده سیفوویریده مانند سایر پژوهش‌های پیشین معرفی گردید(Deghorain & Van Melderen, 2012). در تحقیق حاضر بهترین زمان اثر گذاری فاژ بر جدایه‌های استافیلوکوک بین 6 تا 8 ساعت پس از کشت و بهترین دمای اثرگذاری، دمای اتاق و دمای 37 درجه سانتیگراد تعیین شد که بر خلاف پژوهش انجام شده توسط جمال الدین و همکاران می‌باشد(Jamalludeen et al., 2007). همچنین فاژ درpH خنثی(Kluytmans & Wertheim, 2005) به‌خوبی رشد  داشت که مشابه باتحیقات سایرین می باشد (Mishra et al., 2014). 

نتیجه گیری کلی

   در این پژوهش، اثر فاژ بر روی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس   مورد ارزیابی قرار گرفت و نتایج بیانگر آن بود که با توجه به روند افزایش مقاومت باکتری استافیلوکوکوس اورئوس  نسبت به آنتی بیوتیک‌های مختلف، می‌توان از فاژتراپی برای نابودی این باکتری استفاده کرد. بیشترین اثر فاژ بر روی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس   ، پس از گذشت حدودا 8 ساعت از زمان کشت و در دمای اتاق وهمچنین در دمای 37 درجه سانتیگراد می‌باشد که می‌توان این امر را در حذف ارگانیسم در نظر گرفت و فاژ درمانی را به جایگزین درمان با آنتی بیوتیک قرار داد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

منابع

 

1.       Ameer Hamza, A. H., Shehla Perveen, S. P., Zaigham Abbas, Z. A., & Shafiq-ur-Rehman, S.-u.-R. (2016). The lytic SA phage demonstrate bactericidal activity against mastitis causing Staphylococcus aureus. Journal of Open life sicence, 11(1):39.

2.       Bahador, N. (2005). Bacteriophages isolation characterization and exploitation in environmental problems [PhD, Puna University].

3.       Baserisalehi, M, Bahador, N. : diagnostic of bacteriology , Navid Publication 2012, 105

4.       Bueno, E., García, P., Martínez, B., & Rodríguez, A. (2012). Phage inactivation of Staphylococcus aureus in fresh and hard-type cheeses. International journal of food microbiology, 158(1), 23-27.

5.       Can, H. Y., Elmalı, M., & Karagöz, A. (2017). Molecular typing and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus strains isolated from raw milk, cheese, minced meat, and chicken meat samples. Korean journal for food science of animal resources, 37(2), 175.

6.       Clinical and Laboratory Standards Institute. (2014). ‘’Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fourth Informational Supplement’’. CLSI document M100-S24, 34: 219.

7.       Deghorain, M., & Van Melderen, L. (2012). The Staphylococci phages family: an overview. Viruses, 4(12), 3316-3335.

8.       Farajvand, N., & Alimohammadi, M. (2014). Prevalence of Staphylococcus aureus in four famous brand of doogh produced in Iran. Iranian Journal of Health and Environment, 7(1).

9.       Fitzgerald, J. R., Monday, S. R., Foster, T. J., Bohach, G. A., Hartigan, P. J., Meaney, W. J., & Smyth, C. J. (2001). Characterization of a putative pathogenicity island from bovine Staphylococcus aureus encoding multiple superantigens. Journal of bacteriology, 183(1), 63-70.

10.       Jamalludeen, N., Johnson, R. P., Friendship, R., Kropinski, A. M., Lingohr, E. J., & Gyles, C. L. (2007). Isolation and characterization of nine bacteriophages that lyse O149 enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary microbiology, 124(1-2), 47-57.

11.       Harda, L., Silva, E., Campos, WF., Fiol, F. (2018) . biotechnological applications of bacteriophages: state of the art. 212-213: 38-58.

12.       Kluytmans, J., & Wertheim, H. (2005). Nasal carriage of Staphylococcus aureus and prevention of nosocomial infections. Infection, 33, 3-8.

13.       Kulinkina, A. V. Shinee, E. Herrador, B., Nygard, K. and Schmoll, O. (2016). The situation of water-related infectious diseases in the Pan-European Region. WHO.

14.       Levy, S. B., & Marshall, B. (2004). Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and responses. Nature medicine, 10(Suppl 12), S122-S129.

15.       Li, J., Law, H. K., Lau, Y. L., & Chan, G. C. F. (2004). Differential damage and recovery of human mesenchymal stem cells after exposure to chemotherapeutic agents. British journal of haematology, 127(3), 326-334.

16.       Mishra, A., Sharma, N., Kumar, A., Kumar, N., Bayyappa, M. G., & Kumar, S. (2014). Isolation, characterization and therapeutic potential assessment of bacteriophages virulent to Staphylococcus aureus associated with goat mastitis. Iranian journal of veterinary research, 15(4), 320.

17.       Najafi, A., Ziabakhsh, D. M., Karimian, H., Abedinia, A. R., & Hosseininezhad, M. (2011). Microbiological changes of pousti cheese during ripening. Journal of Food Technology and Nutrition, 8(2), 85-91.

18.       Premarathne, J., Thung, T., New, C., Huat, J., Basri, D., Rukayadi, Y., Nakaguchi, Y., Nishibuchi, M., & Son, R. (2017). Distribution of bacteriophages in food and environment samples. International Food Research Journal, 24(2), 888-896.

19.       Rola, J. G., Czubkowska, A., Korpysa-Dzirba, W., & Osek, J. (2016). Occurrence of Staphylococcus aureus on farms with small scale production of raw milk cheeses in Poland. Toxins, 8(3), 62.

20.       Sadeghifard, N., Jalilian, A., Seidkhani, A., & Rostamzad, A. (2006). A study on contamination of E. coli and S. aureus in raw milk in Ilam during 1999-2003. Journal of Ilam University of Medical Sciences, 14(1), 44-49.

21.       Sambrook, J., & David, W. (2001). Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York (3rd ed.).

22.       Schulz-Collins, D., & Senge, B. (2004). Acid-and acid/rennet-curd cheeses part A: Quark, cream cheese and related varieties. In Cheese: Chemistry, physics and microbiology (Vol. 2, pp. 301-328).

23.       Teng., L., Feng, M., Liao, S., Zheng, Zh., Jia, Ch., Zhou, X., Nambiar, RB., M, Zh., and Yue M. (2023). A cross sectional study of companion animal derived multi drug E. coli in Hangzhou, China. Journal of Microbiol Spectr. 11(2); e02113-22.

24.       Van Boeckel., T., P. Brower, C., Gilbert, M. & Laxminaryan, R. (2015). Global trends in antimicrobial use in food. Journal of PNAS. 112(18) 5649-5654.

25.       Wang, X., Xu, M., Cai, Y., Yang, H., Zhang, H., & Zhang, C. (2009). Functional analysis of the disulphide loop mutant of staphylococcal enterotoxin C2. Applied microbiology and biotechnology, 82, 861-871.

26.       Wayne, P. (2011). Clinical and laboratory standards institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing.

 

 

 

Study on isolated staphylophage from waste water on detected Staphylococcus from raw milk

Nima Bahador*1, Maryam Hoseini sarbas1, Bahar Ajam Lotfi2, Maedeh Noshadi2, Mahmonir Bahramian3 and seyedeh Golnaz Khani2

1. Department of Microbiology, College of Science, Agriculture and Modern Technology, Shiraz Branch, Islamic Azad University, Shiraz, Iran

2. Department of Biology, Zand Institute of Higher Education, Shiraz, Iran

3. Department of Food Industry, College of Science, Agriculture and Modern Technology, Shiraz Branch, Islamic Azad University, Shiraz, Iran

Corresponding author: [e-mail]

Abstract:

Staphylococcus aureus is an important agent of mastitis among animal with capability to produce dairy compounds. Nowadays, the organism is recognized as multi drug resistant organism. Therefore, the aim of this study is isolation of Staphylococcus aureus from raw milk of cows infected with mastitis and the evaluation of bacteriophage on the same organisms. In this study 50 milk samples were collected from suspected cows with mastitis. The samples were cultivated on mannitol salt agar and the supposed colonies were identified using gram stain and biochemical tests. Then antibiotic pattern were evaluated. On the other hand, the sewage samples were collected and based on some tests including: electron micrograph, nucleic acid type, host range, pH bacteriophages were identified. Results indicated that out of 50 samples 6 isolates were confirmed using biochemical tests. In addition among antibiotics, chloramphenicol, ciprofloxacin, and gentamycin 100% had effect on the isolates and the other antibiotics showed different results. Detected phages showed clear plaque at room temperature and 37C, and they were belong to siphoviridae family with DNA, and had effect on gram positive bacteria at neutral pH. The results illustrated that phages had effect on Staphylococcus aureus and we could use them as biocontrol agents against infections.

Key words: Biological control, Dairy product, Staphylococcus aureus, mastitis, Staphylophage

 

17                                                                                                                  دوره 11 شماره 2 تابستان 1403