کلون سازی و بیان ژن رمزکننده آنزیم لاکاز قارچ Trametes در میزبان مخمری و تعیین خصوصیات کینتیکی و بیوشیمیایی آنزیم

محورهای موضوعی : آلودگی میکروبی مواد غذائی

اردشیر حسام پور ¹ (گروه زیست شناسی ، دانشکده علوم پایه ، واحد تهران مرکزی دانشگاه آزاد اسلامی ، تهران ، ایران.)
نوشین مهندسی ² (گروه زیست شناسی ، دانشکده علوم پایه ، واحد تهران مرکزی دانشگاه آزاد اسلامی ، تهران ، ایران.)

تاریخ دریافت : 1396/02/20 تاریخ پذیرش : 1396/09/28 تاریخ انتشار : 1396/11/01

کلید واژه: مخمر, پیکیا پاستوریس, لاکاز, قارچ ترامتس,

چکیده مقاله :

لاکاز متعلق به خانواده پلی فنول اکسیداز است و به دلیل خواص ساختاری و عملکردی در حذف آلودگی های زیست محیطی اهمیت بسیار زیادی دارد. اخیرا قابلیت اکسیداسیون مواد فنلی و غیر فنلی لاکاز مورد توجه بسیاری از محققان قرار گرفته است. هدف از این پژوهش، تولید لاکاز نوترکیب و تعیین خصوصیات بیوشیمایی و کینتیکی آنزیم است. از آنجائیکه قارچ Trametes قابلیت تولید مقدار اندک لاکاز را دارد، جهت تولید انبوه، توالی آمینواسیدی لاکاز شناسایی و توالی ژنی مطابق ترجیج کدونی میزبان مخمری Pichia pastoris، طراحی و سنتز شد. ژن لاکاز سنتزی تحت کنترل پروموتور قوی القایی AOX و سیگنال پپتید αMF در ناقل PpinkαHC کلون سازی و پس از انتقال به میزبان متیلوتروف Pichia pastoris داخل ژنوم اینتگره شد و به ترتیب در محیط های بیانیBMGY و القاییBMMY با متانول به صورت خارج سلولی بیان شد. پس از بررسی کمی وکیفی آنزیم، خصوصیات فیزیکوبیوشیمیایی آنزیم نوترکیب تعیین شد. بررسی فعالیت لاکازی سوپرناتانت مخمرهای ترانسفورم شده، بیان خارج سلولی آنزیم نوترکیب فعال را نشان داد. بررسی سوپرناتات نشان داد وزن مولکولی لاکاز نوترکیب 65 کیلو دالتون است. همچنین بررسی ویژگی های بیوشیمیایی لاکاز نوترکیب، محدوده pH اسیدی وسیع با pH بهینه 8/4 و نتایج سنجش پروفایل دمایی، بهینه دمای C°60 را نشان داد. با بررسی پارامترهای کینتیکی، µM140= Km تعیین شد که نتایج بدست آمده نشان داد لاکاز نوترکیب با مقدار تولید انبوه و خصوصیات فیزیکوشیمیایی مناسب با معیارهای صنعتی، به صورت فعال و خارج سلولی بیان شده است. آنزیم لاکاز نوترکیب بیان شده قابلیت کاربری در صنایع متعدد دارویی، غذایی و استفاده در بیوتکنولوژی جهت پاکسازی محیط زیست را دارد.

چکیده انگلیسی:

Laccases have received much attention from researchers in last decades due to their ability to oxidase both phenolic and non-phenolic lignin related compounds as well as highly recalcitrant environmental pollutants, which makes them very useful for their application to several biotechnological processes. Despite of Trametes Laccase wildly application as detoxification of industrial effluents, its native low expression, makes it unsuitable for industrial application. In this study, heterologous expression of Trametes Laccase gene in methylotrophic yeast, P.pastoris with αMF as signal peptide and PpinkαHC expression vector under methatol induction in BMGY and BMMY media was investigated and expressed active recombinant laccase biochemical and biophysical properties in compare with native Trametes Laccase was studied. According to codon performance of P.pastoris, Trametes Laccase gene sequence designed and synthetic genes under control of inducible AOX1 promoter was successfully high expressed as active form in yeast host, SDS-PAGE analysis showed the recombinant laccase in size of 65KDa with Km=140µM.Analysis of Laccase biochemical and biophysical properties demonstrated that recombinant Laccase has wide pH profile with pH optima 4.8 and optimum temperature of 60 °C with high activity in P.pastoris host. We conclude that recombinant P.pastoris Laccase could fulfil a serried of predefined industrial quality criteria to be used in industry like, broad pH optimum ,substrate specify and proper thermal stability. Therefore studied methylotrophic yeast could be an appropriate host for expression and production of recombinant Laccase, with industrial application.