کلون و بیان ژن vp1 ویروس تب برفکی و fliC سالمونلا در باکتری اشرشیاکلای
محورهای موضوعی : باکتری شناسیمهرنوش قدیر 1 , سید محمود عظیمی 2 , ناصر هرندی 3
1 - گروه میکروبیولوژی, دانشکده علوم, دانشگاه آزاد اسلامی, کرج
2 - موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، بخش تب برفکی، کرج
3 - استادیار دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج
کلید واژه:
چکیده مقاله :
تب برفکی یک بیماری وزیکولی ویروسی است که منجر به بروز خسارات وسیع در صنعت دامپروری می گردد. امروزه برای کنترل این بیماری از ویروس غیرفعال شده استفاده می شود کهمهمترین نقطه ضعف آن کوتاه بودن طول دوره ایمنی است.لذا تلاش های زیادی در زمینه بکارگیری ادجوانهای موثر تر در فرمولاسیون واکسن صورت گرفته است. هدف از این تحقیق تولید فیوژن پروتئین VP1 ویروس تب برفکی (Opanasia2) و فلاژلین سالمونلا (fliC)به عنوان یک ادجوانت ملکولی استژن 1Dکه مسئول سنتز پروتئین VP1است به طولbp 800 توسط PCR تکثیر داده شد و در وکتور PTZ57 کلون گردید, سپس این وکتور توسط آنزیم هایHindIII و XhoI برش داده شده و در داخل ناقل بیانی pET41b که حاوی ژن فلاژلین سالمونلا بود کلون گردید. پلاسمید نوترکیب به باکتری Escherichia coli(BL21DE3) انتقال داده شد و بیان توسط IPTG(0.5 mM) القا گردید. بیان پروتئین توسطSDS-PAGE در ژل آکریل آمید 12% و وسترن بلات مورد بررسی قرار گرفت. الحاق ژن های vp1و fliCبا استفاده از روش PCR و هضم آنزیمی با دو آنزیم HindIIIو XhoIبا مشاهده باند هایی به طولهای تقریبی bp700 و 1500 تایید گردید. برای خالص سازی از رزین Ni-NTA و گرادیان pH استفاده شد که بیشترین میزان بازیافت پروتئین در5/4 pHمشاهده گردید. بیان پروتئین با مشاهده باند KDa76در آزمایش SDS-PAGE در ژل 12% آکریل آمید ووسترنبلات توسطAntiHis دررسوب باکتریالقاءشده تاییدگردید.با توجه به نتایج به دست آمده ژن فیوژن vp1- fliCsalmonella با طول 2200 bpکلون گردیده و پروتئین حاصل باوزنKDa76با موفقیت بیان و تخلیص گردید.
1-Baxt B, Grubman, Marvin J (2004). Foot –and – Mouth Disease, Clinical Microbiology Reviews, 27: 465– 493.
2-Delaney, K. N., Phipps, J. P., Johnson, J. B.,&Mizel, S. B. (2010). “A recombinant flagellin-poxvirus fusion protein vaccine elicits complement-dependent protection against respiratory challenge with vaccinia virus in mice”.Viral immunology, 23: 201- 210.
3-Cuadros, C., Lopez-Hernandez, F. J., Dominguez, A. L., McClelland, M., &Lustgarten, J. (2004). “Flagellin fusion proteins as adjuvants or vaccines induce specific immune responses”. Infection and immunity, 72: 2810-2816.
4-Grubman MJ, Baxt B. Foot-and-mouth disease.ClinMicrobiol Rev 2004; 17: 465-93.
5-Guisheng G, Guiling Z, Hua X, Qiumei S, Yanying Z (2012). Cloning of Structural Protein VP1 Gene of Foot and Mouth Disease Viruse and its Expression in Escherichia coli, International Conference on Biological and Medical Sciences, 7:117- 122.
6-Hema M, Chandran D, Nagendrakumar S B,Madhanmohan M, SrinivasanV A (2009). Construction of an infectious cDNA clone of foot-and-mouth disease virus type O1BFS 1860 and its use in the preparation of candidate vaccine.Journal of Biosciences34: 45-58.
7-Nagarajan G, Ashok Kumar C, Dechamma HJ, Reddy GR, Ganesh K, and Suryanarayana VVS(2008). Cloning and expression of FMDV-VP1 immunoreactive peptide in trivalent form and its application
as immunogen.Indian J Biotechnol,7: 472-7.
8-Rodriguez, L. L., &Grubman, M. J.(2009).“Foot and mouth disease virus vaccines”.Vaccine, 27: D90- D94.
9-Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001).Molecular cloning: a laboratory manual. Volume 1–3.
10-Song, L., Zhang, Y., Yun, N. E., Poussard,A. L., Smith, J. N., Smith, J. K.,…&Paessler, S. (2009). “Superior efficacy of a recombinant flagellin: H5N1 HA globular head vaccine is determined by the placement of the globular head within flagellin”. Vaccine, 27:5875-5884.
11-Tanom, A., Farajnia, S., Peerayeh, S. N.,&Majidi, J. (2013).“Cloning, expression and characterization of recombinant exotoxin A-flagellin fusion protein as a new vaccine candidate against
Pseudomonas aeruginosa infections”.Iranian biomedical journal, 17:1.
12-Whittle, B. L., Lee, E., Weir, R. C.,&Verma, N. K. (1997).“Immune response to a Murray Valley encephalitis virus epitope expressed in the flagellin of an attenuated strain of Salmonella”. Journal of medica l microbiology, 46: 129-138.