تشخیص مولکولی لپتوسپیراهای بیماری زا با استفاده از روش PCR بر اساس ژن lipl32

محورهای موضوعی : باکتری شناسی

فاطمه رحیمی زارچی ¹ , پژواک خاکی ² , سهیلا مرادی بید هندی ³

1 - دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات، گروه زیست شناسی، تهران، ایران
2 - بخش میکروب شناسی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، ایران
3 - بخش میکروب شناسی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، ایران

تاریخ دریافت : 1397/05/02 تاریخ پذیرش : 1397/11/23 تاریخ انتشار : 1398/12/01

کلید واژه: PCR, ژن lipl32, <i>لپتوسپیرا</i>,

چکیده مقاله :

لپتوسپیروز یکی از بیماری های مهم قابل انتقال از حیوان به انسان است. LipL32 یکی از مهمترین پروتئین های غشای خارجی لپتوسپیرا است که تنها در سرووارهای بیماری زا وجود دارد و فاکتور مناسبی جهت شناسایی لپتوسپیراهای بیماری زا می باشد. بنابراین هدف از انجام این پژوهش، تشخیص مولکولی لپتوسپیراهای بیماری زا بر اساس ژن lipL32 می باشد. در این بررسی از سرووارهای بیماری زا و غیر بیماری زای استاندارد لپتوسپیرا استفاده شد. باکتری ها در محیط کشت اختصاصیEMJH کشت داده شدند و DNA ژنومیک آن ها با روش استاندارد فنول کلروفرم ایزوآمیل الکل تخلیص گردید. پرایمر اختصاصی جهت تکثیر ژن lipL32طراحی شد. دمای اتصال (Annealing) برای این پرایمر 61 درجه سانتی گراد، غلظت مناسب پرایمر 10 پیکومول ، میزان حساسیت 4-10 pg/µlو همچنین تعیین ویژگی آن در PCR مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به داده های PCR تایید شد که این ژن فقط در سرووارهای بیماری زای لپتوسپیرا حضور دارد و قطعه bp 272 حاصل که نشان دهنده تکثیر ژن lip L32 می باشد، در سرووار غیر بیماری زا مشاهده نگردید. شناسایی روش های سریع تشخیص لپتوسپیراهای بیماری زا پیش از ورود به فاز حاد بیماری بسیار حائز اهمیت می باشد. بنابراین جهت تشخیص لپتوسپیراهای بیماری زا، روش های مولکولی مبتنی بر PCR با استفاده از ژن lipL32که در کوتاه ترین زمان ممکم پاسخی دقیق و قابل اعتماد ارائه می دهند، پیشنهاد می گردد.

منابع و مأخذ:

1. Ahmed, N., Devim S.M., Valverde Mde, L., Vijayachari, P., Machang'u, R.S, Ellis, W.A., Hartskeerl, R.A. (2006). Multilocus sequence typing method for identification and genotypic classification of pathogenic Leptospira species. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 23: 5-28.


2. Ahmed, S.A., Sandai, D.A., Musa, S., Hoe, C.H., Riadzi, M., Lau, K.L., Tang TH. (2012). Rapid diagnosis of leptospirosis by multiplex PCR. Malaysian Journal of Medical Sciences, 19: 9–16.


3. Alizadeh, S.A., Abdolahpour, G., Pourmand, M.R., Naserpour, T., Najafipour, R., Eshraghi, S.S. (2014). Evaluation of New ELISA based on rLsa63 - rLipL32 antigens for serodiagnosis of Human Leptospirosis. Iranian Journal of Microbiology, 6: 184-9.


4. Bomfim, M.R., Barbosa-Stancioli, E.F., Koury, MC. (2008).  Detection of pathogenic leptospires in urine from naturally infected cattle by nested PCR. Veterinary journal, 178:251-256.


5. Bourhy, Y.P., Zinini, F., Giry, C., Picardeau, M. (2011). Comparison of real-time PCR assays for detection of pathogenic Leptospira spp. in blood and identification of variations in target sequences. Journal Clinical Microbiology, 49:2154-60.


6. Cabral Pires, B., Berzin Grapiglia, J., Moreira, L., Jaeger, L.H., Carvalho-Costa, F.A, Lilenbaum, W. (2018). Occurrence of uterine carriers for Leptospira interrogans on slaughtered cows. Microbial Pathogenesis. 114:163-165.


7. Cerqueira, GM., Picardeau, M. (2009). A century of Leptospira strain typing. Journal of molecular epidemiology and evolutionary genetics in infectious diseases, 9:760-8.


8. Cheema, P.S., Srivastava, S.K., Amutha, R., Singh, S., Singh, H., Sandey, M. (2007). Detection of pathogenic leptospires in animals by PCR based on lipL21 and lipL32 genes. Indian Journal of Experimental Biology, 45: 568-73.


9. Costa, F., Hagan, J.E., Calcagno, J., Kane, M., Torgerson, P., MartinezSilveira, M.S., Stein, C., Abela-Ridder, B., Ko, A.I. (2015). Global morbidity and mortality of leptospirosis: a systematic review. PLOS Neglected Tropical Diseases, 9: 9.


10. Dittrich, S., Rattanavong, S., Lee, S.J., Panyanivong, P., Craig, S,B., Tulsiani, S.M., Blacksell, S,D., Dance, D.A., Dubot-Pérès, A., Sengduangphachanh, A., Phoumin, P., Paris, DH., Newton, PN. (2015). Orientia, rickettsia, and leptospira pathogens as causes of CNS infections in Laos: a prospective study. Lancet Global Health, 3: 104-12.


11. Haake D.A and Matsunaga, J. (2010). Leptospira: A Spirochete with a Hybrid Outer Membrane. Molecular Microbiology,11:805-814.


12. Gebriel, A.M., Subramaniam, G., Sekaran, S.D. (2016). The detection and characterization of pathogenic Leptospira and the use of OMPs as potential antigens and immunogens. Tropical biomedicine, 23: 194-207.


13. Gollop, J., Katz, R., Rudoy, C and Sasaki M. (1993). Rat-bite leptospirosis. Western journal of medicine, 159:  76–77


14. Haake, D.A, Chao, G., Zuerner, R.L, Barnett, J.K., Barnett, D., Maze, M., Matsunaga, J., Levett, P.N., Bolin, C.A. (2000). The leptospiral major outer membrane protein LipL32 is a lipoprotein expressed during mammalian infection. Infection and Immunity, 68:2276-85.


15. Haukl, P., Rodrigues Guzzo, C., Roman Ramos, H., Lee Ho, P, and Shaker Farah, C. (2009). Structure and Calcium Binding Activity of LipL32, the Major Surface Antigen of Pathogenic Leptospira sp. Journal of Molecular Biology, 390: 722–736.


16. Hery, G., Letheulle, J., Flecher, E., Quentin, C., Piau, C., Le Tulzo, Y. (2015). Massive intra-alveolar hemorrhage caused by Leptospira serovar Djasiman in a traveler returning from Laos. Journal Travel Medicine, 22:212-4.


17. Khodaverdi Darian, E., Forghanifard, M.M., Moradi Bidhendi, S., Chang, Y.F., Yahaghi, E., Esmaelizad, M., Khaleghizadeh, M., Khaki, P. (2013). Cloning and Sequence Analysis of LipL32, a Surface-Exposed Lipoprotein of Pathogenic Leptospira Spp. Iranian Red Crescent medical journal, 15:e8793.


18. Latifah, I., Abdul Halim, A., Rahmat, M.S., Nadia ,M.F., Ubil, Z.E., Asmah, H., Shafariatul Akmar, I., Picardeau, M., Siti Haslina, O., Nasir, M.A. (2017). Isolation by culture and PCR identification of LipL32 gene of pathogenic Leptospira spp. in wild rats of Kuala Lumpur. Malaysian Journal of Pathology, 39: 161-166.


19. Levett, P.N., (2001).Leptospirosis. Clinical microbiology reviews, 14:296-326.


20. Levett, P.N., Morey, R.E., Galloway, R.L., Turner, D.E., Steigerwalt, A.G., Mayer, L.W. (2005). Detection of pathogenic leptospires by real-time quantitative PCR. Journal of Medical Microbiology, 54:45-9.


21. Lilenbaum, W., Kremer, F., Ristow, P., Dellagostin, O., Bourhy, P., Hartskeerl, R., and Vasconcellos, S. (2014). Molecular characterization of the first leptospires isolated from goats in Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, 45: 1527–1530.


22. Merien, F., Amouriaux, P., Perolat, P., Baranton, G., Saint Girons, I. (1992). Polymerase chain reaction for detection of Leptospira spp. in clinical samplesM. Journal of Clinical Microbiology, 30:2219- 24.


23. Niloofa, R., Fernando, N., de Silva, LN., Karunanayake, L., Wickramasinghe, H., Dikmadugoda, N., et al. (2015). Diagnosis of leptospirosis: comparison between microscopic agglutination test, IgM-ELISA and IgM rapid immunechromatography test. plos one journal, 10:e0129236.


24. Plank, R., Dean, D. (2010). Overview of the epidemiology, microbiology, and pathogenesis of Leptospira spp. in humans, Microbes and infection, 2:1265-76.


25. Smythe, L.D., Smith, I.L., Smith, G.A., Dohnt, M.F., Symonds, M.L., Barnett, L.J. (2002). A quantitative PCR (TaqMan) assay for pathogenic Leptospira spp.  BioMed Central infectious diseases, 2: 1–7.


26. Taylor, A.J., Paris, D.H., Newton, P.N. (2015). A systematic review of the mortality from untreated leptospirosis. PLoS neglected tropical diseases, 9: e0003866.


27. Vaganova, A.N., Stoianova, N.A., Tokarevich,  N.K. (2011). Development of PCR test system based on colA gene for detection of leptospirae in clinical material. Journal of microbiology, epidemiology, and immunobiology, 5: 67-71.


28. Wagenaar, J.F., de Vries, P.J., Hartskeerl, R.A. (2004). Leptospirosis with pulmonary hemorrhage, caused by a new strain of serovar Lai: Langkawi. Journal of travel medicine, 11:379-81.


29. Waggoner, J.J., Balassiano, I., Abeynayake, J., Sahoo, MK., Mohamed-Hadley, M.A., Liu, Y.(2014) .Sensitive real-time PCR detection of pathogenic Leptospira spp. and a comparison of nucleic acid amplification methods for the diagnosis of leptospirosis. Public Library of Science one, 9:e112356.


30. Woodward, M.J., Redstone, J.S. (1993). Differentiation of leptospira serovars by the polymerase chain reaction and restriction fragment Length polymorphism. The Veterinary record, 132: 325-6.


31. Yang, C.W., Wu, M.S., Pan, M.J., Hsoeh, W.J., Vandewalle, A., Huang, C.C. (2002).  The Leptospira outer membrane protein LipL32 induces tubulointerstitial nephritis-mediated gene expression in mouse proximal tubule cells. Journal of the American Society of Nephrology, 13: 2037–2045.