طراحی، کلونینگ و بیان ژن ctxB-tcpA-c-cpe در اشریشیا کلی به عنوان کاندیدای واکسن وبا

محورهای موضوعی : زیست فناوری میکروبی

نگار صعود ¹ , محمد کارگر ² , سید محمد حسین حسینی ³ , مجتبی جعفری‌ نیا ⁴

1 - دانشجوی دکتری ژنتیک دانشگاه آزاد علوم تحقیقات
2 - دانشگاه آزاد اسلامی، واحد جهرم، گروه میکروبیولوژی
3 - استادیار بخش ایمنی شناسی، مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی شعبه شیراز، سازمان تحقیق، آموزش و ترویج کشاورزی، شیراز، ایران.
4 - گروه زیست شناسی واحد مرودشت دانشگاه آزاد اسلامی مرودشت ایران

تاریخ دریافت : 1399/02/27 تاریخ پذیرش : 1399/07/25 تاریخ انتشار : 1400/03/01

کلید واژه: واکسن ویبریو کلرا, پایانه C توکسین کلاستریدیوم پرفرینجنس, tcpA, ctxB,

چکیده مقاله :

سابقه و هدف: پیلی و زیر واحد B توکسین مهمترین عوامل بیماری‌زایی ویبریو کلرا می‌باشند. در این پژوهش، از پایانه C توکسین کلاستریدیوم پرفرینجنس به عنوان یک سیستم تحویل استفاده گردید و با ایجاد کایمرای TcpA-CtxB پروتین حاصل در باکتری اشریشیا کلی بیان شد.مواد و روش‌ها: به صورت تجربی، توانایی سازه دارای CtxB-TcpA-CPE در مقایسه با توالی‌های پروتینی کامل هر یک از پروتین‌های CtxB، TcpA و C-CPE مورد مطالعه قرار گرفت. تکثیر قطعات ژنی با استفاده از PCR و سپس کلونسازی در وکتورهای بیانی انجام شد. به منظور ساخت سازه، پروتین کایمرای هدف با استفاده از لینکر طراحی و به روش سنتتیک تولید شد. پس از تولید، پروتین‌ها تخلیص و سپس با روش ایمونوبلات مورد تایید قرار گرفتند.یافتهها: پروتین کایمرا تولید شده 484 اسیدامینه داشت. این تعداد آمینواسید میتواند نشان دهنده پایداری پروتین باشد. ژن c-cpe، ژن tcpA و ژن ctxB به ترتیب دارای اندازههای 381،375 و 675 جفت باز بودند. نتایج هضم آنزیمی و تعیین توالی نشان دهنده‌ی همولوژی نوکلئوتیدی محصولات بدست آمده با توالی ژن‌های ثبت شده در NCBI بود. این ژن‌ها به طور موفقیت آمیزی در میزبان اشریشیا کلی وارد و اندازه باند پروتینی آن‌ها در SDS-PAGE به ترتیب، 15، 25، 25 و 52 کیلودالتون بود.نتیجه‌گیری: براساس مطالعات فیزیکوشیمیایی صورت گرفته، به نظر می‌رسد که این پروتین نوترکیب کاندیدای خوبی برای بررسی به عنوان واکسن خوراکی ویبریو کلرا باشد که البته برای اثبات این فرضیه به انجام آزمون‌های چالشی و مطالعات تکمیلی بیشتری نیاز دارد.

چکیده انگلیسی:

Background & Objectives: TcpA protein and B subunit of cholera toxin are the most important virulence factors of Vibrio cholorea. In the current survey, we applied the C-terminal of          clostridium perferingenes toxin as a delivery system to bind the CtxB-TcpA fusion as an antigen,      cloning it in a prokaryote vector, evaluated the level of  expression.Materials & Methods: In experimental survey, the ability of a constructs based on                    CtxB-TcpA-C-CPE with complete protein sequences of each protein was studied. After             amplification of tcpA, ctxB, and c-cpe genes using PCR, they were cloned in expression plasmids. For fusion protein, all of the three protein sequences were constructed with linker. After             expression, the proteins were purified and then confirmed using immunoblot methods.  Results: This fusion protein consists of 484 amino acids. PCR amplification for the c-cpe, tcpA and ctxB genes amplified 381, 375 and 675 bp; respectively. The result of enzymatic restrictions and sequencing indicated the exact homology of the synthesized proteins and the others submitted in NCBI. According to the SDS-PAGE results, the TcpA, CtxB, and C-CPE proteins were 15, 25 and 25 kD respectively.Conclusion: According to physicochemical results, this fusion protein may be suitable candidate as a vaccine, however; further experimental trials are needed to approve this conclusion.