ایجاد پلاک توسط سویه V4ویروس عامل بیماری نیوکاسل بر روی کشت سلولی و بررسی مولکولی با روش واکنش زنجیره پلیمراز نسخه‌برداری معکوس RT-PCR))
محورهای موضوعی : پاتوبیولوژی مقایسه ای
ساناز سبحانی، محمدجواد مهربانپور .
1
(
.
)
کلید واژه: ویروس نیوکاسل, واکنش زنجیره پلیمراز نسخه‌بردا, کشت سلولی,
چکیده مقاله :
امروزه در بسیاری از کشورهای دنیا واکسن کلون شده مورد استفاده قرار می‌گیرد. جهت کلون کردن یک ویروس، یکی از راه‌ها رشد ویروس بر روی کشت سلول و جدا کردن پلاک‌های مجزا و متفاوت و بررسی آنها از لحاظ مورفولوژی و ژنتیکی است. دراین تحقیق، ابتدا سلول‌های ) Madin-Darby Canine Kidney MDCK) بصورت تک لایه و بطور استاندارد کشت داده شد. رقت های مختلف ویروس به سلول‌های تک لایه MDCK همراه با تریپسین، آگار و سولفات منبزیوم اضافه شد. ویروس توانست بر روی سلول‌های فوق تکثیر و ایجاد اثر سایتوپاتیک (CPE) و پلاک نماید. در رقت 6-10 تعداد 6 پلاک که از لحاظ شکل و اندازه تفاوت داشتند برداشته شدند و جهت تکثیر به تخم‌مرغ جنین دار 11-9 روزه تلقیح گردید. بعد از 48 ساعت مایع آلانتوئیک هر تخم‌مرغ حاوی پلاک برداشت ونسبت به جداسازی RNA هر پلاک اقدام گردید. منطقه شکست (Cleavage site)پروتئین ادغامی(Fusion) با تست RT-PCR انجام شد و محصول PCR خالص‌سازی وسکانس گردید. سکانس نوکلئوتیدها و آمینواسیدها برای هر پلاک با سوش های ثبت شده در بانک ژنی مقایسه شد. سکانس نوکلئوتیدهای تمامی پلاک‌های بدست آمده، 97 تا 99% همخوانی با ویروس V4در بانک ژنی را تایید نمود. هدف از این پژوهش ایجاد پلاک از سوش V4 ویروس نیوکاسل بر روی سلول‌های MDCK جهت ایجاد پلاک‌های مجزا و در نهایت بررسی مولکولی پلاک‌های ایجاد شده می‌باشد.
. Cloned vaccines are used in many countries nowadays. One of the ways for cloning a virus is propagation of the virus on cell culture to obtain discrete different plaques in order to study their morphology and genetics. In this study monolayer Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell cultures were prepared by standard method. Various dilutions of the viruses were inoculated into monolayer MDCK cell cultures that were supplemented with magnesium sulfate and trypsin, and over laid with agar medium. The viruses could reproduce on these cells and caused cytopathic effect and plaques. At 10-6 virus dilution, 6 various shape and size discrete plaques were obtained and inoculated into allantoic fluid 9-11 days embryonated eggs. After 48 hrs, the allantoic fluids contain plaques were harvested and their RNA extracted. Cleavage site of fusion protein, with RT-PCR test was performed and the PCR products were purified and sequenced. The sequences of nucleotides and amino acids for each plaque were compared with those of the registered strain at gene bank as well as with each other. Molecular studies showed that all plaques are lentogenic strain of Newcastle disease virus and has about 97% to 99% homology with the strain V4 in the gene bank. The aim of this study is produce clear plaque by V4 strain of NDV on MDCK cell line and studies the molecular variations among them.
