Comparison of laboratory and semi-industrial extraction methods for β-glucan-rich polysaccharide production from Shiitake mushroom (Lentinula edodes)

محورهای موضوعی : food biotechnology

sharareh rezaeian ¹ , Hamidreza Pourianfar ²

1 - Industrial Fungi Biotechnology Research Department, Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR)- Khorasan Razavi Branch, Mashhad, Iran
2 - Industrial Fungi Biotechnology Research Department, Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR)- Khorasan Razavi Branch, Mashhad, Iran

تاریخ دریافت : 1404/03/13 تاریخ پذیرش : 1404/07/06 تاریخ انتشار : 1404/07/07

کلید واژه: Shiitake, β-glucan, polysaccharides, extraction, semi-industrial scale, nutrition, safety,

چکیده مقاله :

Shiitake mushroom (Lentinula edodes) is recognized as a potent source of health-promoting polysaccharides, particularly β-glucans. This study established a semi-industrial protocol for producing β-glucan-enriched polysaccharide extracts from dried shiitake fruiting bodies. A multi-step procedure involving hot-water extraction, ethanol precipitation, and spray drying was implemented at both laboratory and semi-industrial scales. The extraction yield reached 33.00% at the laboratory scale and 25.00% at the semi-industrial scale. Enzymatic quantification indicated β-glucan and α-glucan contents of approximately 28.00% and 5.00%, respectively, with no significant variation between scales (p ≥ 0.05). The final extract demonstrated acceptable microbial quality, an absence of toxic metals and pathogens, and favorable nutritional characteristics. Compared to a commercial reference product available in the Iranian market, the extract exhibited higher protein and fiber contents, as well as more than double the β-glucan concentration (28.00% vs. 13.6%). The method developed in the present study offers a scalable, reproducible, and economically viable approach for the production of high-purity shiitake polysaccharide extracts suitable for functional food and nutraceutical applications.

چکیده انگلیسی:

Shiitake mushroom (Lentinula edodes) is recognized as a potent source of health-promoting polysaccharides, particularly β-glucans. This study established a semi-industrial protocol for producing β-glucan-enriched polysaccharide extracts from dried shiitake fruiting bodies. A multi-step procedure involving hot-water extraction, ethanol precipitation, and spray drying was implemented at both laboratory and semi-industrial scales. The extraction yield reached 33.00% at the laboratory scale and 25.00% at the semi-industrial scale. Enzymatic quantification indicated β-glucan and α-glucan contents of approximately 28.00% and 5.00%, respectively, with no significant variation between scales (p ≥ 0.05). The final extract demonstrated acceptable microbial quality, an absence of toxic metals and pathogens, and favorable nutritional characteristics. Compared to a commercial reference product available in the Iranian market, the extract exhibited higher protein and fiber contents, as well as more than double the β-glucan concentration (28.00% vs. 13.6%). The method developed in the present study offers a scalable, reproducible, and economically viable approach for the production of high-purity shiitake polysaccharide extracts suitable for functional food and nutraceutical applications.

منابع و مأخذ:

1. Al-Saffar, A. Z., Hadi, N. A., & Khalaf, H. M. (2020). Antitumor activity of β-glucan extracted from Pleurotus eryngii. Indian Journal of Forensic Medicine & Toxicology, 14(3), 2493–2498. http://doi.org/10.37506/ijfmt.v14i3.10811
2. Amir Shah, R., Rasouli, A., Vahidi, H., & Kobarfard, F. (2024). Molecular identification of Shiitake (Lentinula edodes), analysis and production of beta-glucan using beech wood sawdust waste. International Journal of Biological Macromolecules, 280(Part 1), 135539. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.135539
3. Atila, F. (2019). Compositional changes in lignocellulosic content of some agro-wastes during the production cycle of shiitake mushroom. Scientia Horticulturae, 245, 263–268. https://doi.org/10.1016/j.scienta.2018.10.029
4. Avni, S., Ezove, N., Hanani, H., Yadid, I., Karpovsky, M., Hayby, H., et al. (2017). Olive mill waste enhances α-glucan content in the edible mushroom Pleurotus eryngii. International Journal of Molecular Sciences, 18(7), 1564. https://doi.org/10.3390/ijms18071564
5. Bak, W. C., Park, J. H., Park, Y. A., & Ka, K. H. (2014). Determination of glucan contents in the fruiting bodies and mycelia of Lentinula edodes cultivars. Mycobiology, 42(3), 301–304. https://doi.org/10.5941/MYCO.2014.42.3.301
6. Dai, Y., Wang, L., Chen, X., Song, A., He, L., Wang, L., et al. (2023). Lentinula edodes Sing polysaccharide: Extraction, characterization, bioactivities, and emulsifying applications. Foods, 12(17), 3289. https://doi.org/10.3390/foods12173289
7. Ebrahim, R. M., Kashaninezhad, M., Mirzaei, H. E., & Khomeiri, M. (2010). Effect of temperature, osmotic solution concentration and mass ratio on kinetics of osmotic dehydration of button mushroom (Agaricus bisporus). Journal of Agricultural Science and Natural Resources, 16(1A), 208-216
8. Gil-Ramirez, A., Clavijo, C., Palanisamy, M., Soler-Rivas, C., Ruiz-Rodriguez, A., Marín, F. R., et al. (2011). Edible mushrooms as potential sources of new hypocholesterolemic compounds. In Proceedings of the 7th International Conference on Mushroom Biology and Mushroom Products (Vol. 2, pp. 110–119).
9. Gover, O., Hayby, H., Levy, A., Fishman, E., Danay, O., Ezov, N., et al. (2019). Enhanced anti-inflammatory effects by glucans extracted from the stalks of Pleurotus eryngii grown in substrates containing olive mill waste. Journal of Nutrition and Health & Food Science, 7(2), 1-12. https://doi.org/10.15226/jnhfs.2019.001155
10. Handayani, D., Meyer, B. J., Chen, J., Tang, P., Kwok, P. C. L., Chan, H. K., et al. (2012). The comparison of the effect of oat and shiitake mushroom powder to prevent body weight gain in rats fed high fat diet. Food and Nutrition Sciences, 3(7), 1009-1011. https://doi.org/10.4236/fns.2012.37134
11. Jiamyangyuen, S., Srijesdaruk, V., & Harper, W. J. (2005). Extraction of rice bran protein concentrate and its application in bread. Journal of Science and Technology, 27(1), 55-64.
12. Kim, J., Lim, J., Bae, I. Y., Park, H. G., Lee, H. Y. G., & Lee, S. (2010). Particle size effect of Lentinus edodes mushroom powder on the physicochemical, rheological, and oil-resisting properties of frying batters. Journal of Texture Studies, 41(3), 381–395. https://doi.org/10.1111/j.1745-4603.2010.00231x
13. Kozarski, M., Klaus, A., Nikšić, M., Vrvić, M. M., Todorović, N., Jakovljević, D., et al. (2012). Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharide extracts from widely used mushrooms. Journal of Food Composition and Analysis, 26(1-2), 144–153. https://doi.org/10.1016/j.jfca.2012.02.004
14. Liu, Y., & Huang, G. (2019). Extraction and derivatisation of active polysaccharides. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 34(1), 1690–1696. https://doi.org/10.1080/14756366.2019.1660654
15. Maheshwari, G., Sowrirajan, S., & Joseph, B. (2017). Extraction and isolation of β-glucan from grain sources-A review. Journal of Food Science, 82(7), 1535–1545. https://doi.org/10.1111/1750-3841.13765
16. McCleary, B. V., & Draga, A. (2016). Measurement of β-glucan in mushrooms and mycelial products. Journal of AOAC International, 99(2), 364–373. https://doi.org/10.5740/jaoacint.15-0289
17. Mohammadnejad, S., Pourianfar, H. R., Drakhshan, A., Jabaleh, I., & Rezayi, M. (2019). Potent antiproliferative and pro-apoptotic effects of a soluble protein fraction from Lentinus tigrinus. Journal of Food Measurement and Characterization, 13(4), 3015–3024. https://doi.org/10.1007/s11694-019-00222-4
18. Morales, D., Smiderle, F. R., Piris, A. J., Soler-Rivas, C., & Prodanov, M. (2019). Production of a β-D-glucan-rich extract from Lentinula edodes using microfiltration and reverse osmosis. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 51, 80–90. https://doi.org/10.1016/j.ifset.2018.04.003
19. Noh, J. E., Yoon, S. R., Lim, A. K., Kim, H. J., Huh, D., & Kim, D. I. (2012). A study on the yield of functional components of citrus peel extracts using optimized hot water extraction and enzymatic hydrolysis. Korean Journal of Food and Cookery Science, 28(1), 51–55. https://doi.org/10.9724/kfcs.2012.28.1.051.
20. Oliveira, L. D. C., Oliveira, M., Meneghetti, V. L., Mazzutti, S., Colla, L. M., Elias, M. C., et al. (2012). Effect of drying temperature on quality of β-glucan in white oat grains. Food Science and Technology, 32(4), 775–783. https://doi.org/10.1590/S0101-206120120004000105
21. Peng, C., Kong, J., You, L., & Ma, F. (2011). Optimization of ultrasonic-assisted extraction of lentinan polysaccharides and antioxidant activity. Modern Food Science and Technology, 27(4), 452–456.
22. Pérez-Bassart, Z., Fabra, M. J., Martínez-Abad, A., & López-Rubio, A. (2023). Compositional differences of β-glucan-rich extracts from three relevant mushrooms. Food Chemistry, 402, 134207. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2022.134207
23. Philippoussis, A., Diamantopoulou, P., & Israilides, C. (2007). Productivity of agricultural residues for Lentinula edodes cultivation. International Biodeterioration & Biodegradation, 59(3), 216–219. https://doi.org/10.1016/j.ibiod.2006.10.007
24. Ren, Y., Bai, Y., Zhang, Z., Cai, W., & Del Rio Flores, A. (2019). Preparation and structure analysis methods of natural polysaccharides: A review. Molecules, 24(17), 3122. https://doi.org/10.3390/molecules24173122
25. Rezaeian, S., & Pourianfar, H. R. (2017). A comparative study on bioconversion of agro-wastes by wild and cultivated strains of Flammulina velutipes. Waste and Biomass Valorization, 8(8), 2631–2642. https://doi.org/10.1007/s12649-016-9698-7
26. Ruthes, A. C., Smiderle, F. R., & Iacomini, M. (2015). D-Glucans from edible mushrooms: A review. Carbohydrate Polymers, 117, 753–771.
https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2014.10.051
27. Sari, M., Prange, A., Lelley, J. I., & Hambitzer, R. (2017). Screening of beta-glucan contents in cultivated and wild mushrooms. Food Chemistry, 216, 45–51. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.08.010
28. Singla, A., Gupta, O. P., Sagwal, V., Kumar, A., Patwa, N., Mohan, N., et al. (2024). Beta-glucan as a soluble dietary fiber: Origins, biosynthesis, bioavailability and applications. Nutrients, 16(6), 900. https://doi.org/10.3390/nu16060900
29. Smiderle, F. R., Morales, D., Gil-Ramírez, A., de Jesus, L. I., Gilbert-López, B., Iacomini, M., et al. (2017). Evaluation of microwave-assisted and pressurized liquid extractions of β-D-glucans from mushrooms. Carbohydrate Polymers, 156, 165–174. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2016.09.029
30. Wang, Y., & Zhang, H. (2021). Advances in extraction, purification, and bioactive mechanisms of Flammulina velutipes polysaccharides: A review. International Journal of Biological Macromolecules, 167, 528–538. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2020.11.028
31. Zechner-Krpan, V., Petravić-Tominac, V., Galović, P., Galović, V., Filipović-Grčić, J., & Srečec, S. (2010). Application of different drying methods on β-glucan isolated from spent brewer’s yeast using alkaline procedure, Agriculturae Conspectus Scientificus, 75(1), 45–50.
32. Zhang, M., Cui, S. W., Cheung, P. C. K., & Wang, Q. (2007). Antitumor polysaccharides from mushrooms: A review on their isolation process, structural characteristics and antitumor activity. Trends in Food Science & Technology, 18(1), 4-19. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2006.07.013

متن کامل:



علوم غذايي و تغذيه/ بهار 1404 / سال بیست و دوم / شماره 2                                                                                                                               Food Technology & Nutrition / Spring 2025 / Vol. 22 / No. 2

 سارا ثابتی و همكاران

 

جداسازی بیفیدوباکتریوم‏ها و شناسایی مولکولی آن‏ها در انواع ماست‏ و پنیر صنعتی و سنتی

 

 

سارا ثابتیa*، محمد خضریb، داوود سالارباشیc*، الیاس نطاق اشتیوانیd

 

 a دانشجوی کارشناسی ارشد بهداشت و ایمنی مواد غذایی، گروه علوم تغذیه و صنایع غذایی، دانشگاه علوم پزشکی گناباد، ایران

 b استادیار میکروبیولوژی مواد غذایی، آزمایشگاه کنترل مواد غذایی، معاونت غذا و دارو، دانشگاه علوم پزشکی مشهد، مشهد ایران

 c دانشیار علوم و صنایع غذایی، گروه بیوشیمی و تغذیه، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی گناباد، ایران

 d استادیار علوم تغذیه، گروه بیوشیمی و تغذیه، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی گناباد، ایران

 

 

 

 

تاریخ دریافت مقاله: 06/04/1404                        تاریخ پذیرش مقاله: 31/06/1404

 

چکیده

مقدمه: پروبیوتیک‏ها میکروارگانیسم‏های زنده غیر بیماری زا هستند که برای بهبود تعادل میکروبی به ویژه در دستگاه گوارش تجویز می‏شوند. بیفیدوباکتریوم، یکی از مهم ترین گروه‏های پروبیوتیک است که به دلیل فواید افزایش دهنده سلامتی، به طور گسترده در صنایع غذایی مورد استفاده قرار می‏گیرد. ماست‌ و پنیر از اجزای مهم رژیم غذایی هستند. با وجود این، بررسی متون نشان داد که مطالعات کافی در خصوص جداسازی پروبیوتیک‌ها به ‌ویژه بیفیدوباکتریوم از ماست‌ و پنیر پروبیوتیک صنعتی و‌ سنتی تولید شده در شهرهای خاص خراسان رضوی وجود ندارد. لذا مطالعه حاضر با هدف جداسازی و شناسایی بیفیدوباکتریوم در این محصولات با استفاده از روش‏های کشت و PCR انجام شد.

مواد و روش‏ها: در مجموع 20 نمونه ماست و 10 نمونه پنیر جمع‏آوری شد. محصولات سنتی از شهرهای مشهد، نیشابور و گناباد در استان خراسان رضوی جمع آوری شدند. هر نمونه تحت رقت، همگن سازی و کشت در محیط‏کشت‏ اختصاصی TOS قرار گرفت. شناسایی بیفیدوباکتری‏ها با استفاده از تکنیک شمارش کلونی بر اساس روش استاندارد بین‏المللی ISO  2024 : (220 IDF) 29981 که بر اساس مورفولوژی سلولی و رنگ‏آمیزی گرم کلنی‏های شاخص بود، انجام شد. سپس از روش‌های واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) برای تایید نهایی این جدایه‌ها استفاده شد.

یافته‌ها: پس از کشت بی‌هوازی نمونه‌ها بر روی محیط کشت اختصاصی TOS، بیفیدوباکتری‌هایی با مورفولوژی نامنظم، میله‌ای یا شاخه‌دار در اکثر نمونه‌های سنتی و صنعتی مشاهده شد. فراوانی بیفیدوباکتریوم در محیط TOS برای ماست و پنیر صنعتی پروبیوتیک به ترتیب %4/44 و %100 و در ماست و پنیر سنتی، %9/90 و %7/85 بود.

نتیجه‌گیری: جداسازی بیفیدوباکتریوم از ماست و پنیر سنتی نشان داد که این محصولات سنتی منبع امیدوارکننده‏ای از سویه‏های پروبیوتیک هستند. در آینده، بررسی سویه‌های بومی ممکن است منجر به معرفی استارترهای منطقه‌ای شود که با میکرو فلور گوارشی جمعیت محلی سازگارتر است. با این حال، تعیین گونه نیاز به توالی و بررسی بیشتر دارد.

 

واژه‏های کلیدی: بیفیدوباکتریوم، پنیر، ماست، PCR

 

* نویسنده مسئول مكاتبات                                                    email: [e-mail], [e-mail]

 

مقدمه

پروبیوتیک‌ها توسط سازمان بهداشت جهانی و سازمان غذا و کشاورزی ملل متحد1 به‏عنوان «میکروارگانیسم‌های زنده‌ای که مصرف آن‏ها، به‏مقدار کافی برای سلامتی میزبان مفید است» تعریف شدند. واژه پروبیوتیک از زبان یونانی گرفته شده و به معنای "برای زندگی" است (Hotel and Cordoba, 2001). غذای پروبیوتیک به عنوان یک محصول فرآوری شده تعریف می‏شود که حاوی میکروارگانیسم‏های پروبیوتیک زنده در زمینه مناسب و در غلظت کافی باشد (Saxelin et al., 2003). ماست و پنیر به عنوان مهمترين محصولات تخميري به دليل ميزان كلسيم و فسفر بالا، از محبوب ترين فرآورده‏هاي لبني تخميري مي‏باشند. ماست از هم زيستي دو باكتري همو فرمنتاتيو2¹ استرپتوكوكوس ترموفيلوس3 و لاكتوباسيلوس دلبروكي زيرگونه بولگاريكوس4² توليد و اهمیت ویژه‏اي در رژیم غذایی افـراد دارند (Tesfaye et al., 2019).

بیفیدوباکتری‌ها به طور کلی به عنوان بی‏هوازی‏های گرم مثبت، غیر اسپورساز، غیر متحرک و کاتالاز منفی شناخته می‏شوند که گلوکز را به طور انحصاری و از مسیر فروکتوز 6 فسفات می‏شکنند. همچنین جزو گونه‌های کمی هستند که قادر به سازگاری در اتمسفر حاوی 10% CO2 می‏باشند (Perry and Staley, 1997). جنس Bifidobacterium متعلق به شاخه Actinobacteria است که در آن، گونه‏ها دارای مورفولوژی نامنظم هستند و به صورت منحنی (club-shaped)، میله‏ای کوتاه و میله‏ای Y شکل دو شاخه یا منشعب ظاهر می‏شوند (Madigan et al., 2004). دمای رشد بهینه این میکروارگانیسم، 37 تا 41 می‏باشد. در حال حاضر 30 گونه در جنس بیفیدوباکتریوم وجود دارند که 10 گونه از منابع انسانی (پوسیدگی دندان، مدفوع و واژن)، 17 گونه از روده یا شکمبه حیوانات، دو گونه از فاضلاب و یکی از شیر تخمیر شده، جدا شده است (Kim et al., 2020). چندین گونه از این جنس، یکی از گروه‌های اصلی باکتری‌های پروبیوتیک را تشکیل می‌دهند (Fontana et al., 2013). 

روش‌های سنتی مبتنی بر کشت با عوامل انتخابی همچنان محبوب‌ترین روش‌ها برای جداسازی پروبیوتیک هستند (Ho et al., 2022). پژوهشگران در طول تاریخ بر رویکردهای فنوتیپی کلاسیک (آزمایش‏های کشت و بیوشیمیایی) برای تشخیص و شناسایی بیفیدوباکتری‏ها تکیه کرده‏اند. این رویکردها هنوز دارای ارزش‏هایی برای شناسایی و تشخیص برخی گونه‏های بیفیدوباکتری هستند، اما آنها اغلب، فشرده و زمان بر هستند و می‏توانند در تمایز گونه‏های نزدیک به هم مشکل ساز باشند. روش‌های سریع، دقیق و قابل اعتماد برای تشخیص و شناسایی بیفیدوباکتری‌ها در یک جمعیت باکتریایی مخلوط به یک چالش بزرگ تبدیل شده‌است (Mianzhi and Shah, 2017). شناسایی خصوصیات بیفیدوباکتریوم از طریق روش‌های مولکولی، عمدتاً از رویکردهای ژنوتیپی مبتنی بر اسید نوکلئیک بهره برده است (Satokari et al., 2003). ³

ماست‌ و پنیر از این نظر منحصر به فرد هستند که می‌توانند حاوی هر دو کشت استارتر و پروبیوتیک باشند. تفاوت عمده بین ماست و پنیر استاندارد و پروبیوتیک اضافه کردن باكتري‏هاي پروبیوتیک مانند بیفیدوباکتریوم بیفیدوم است (Ebojie, 2016). پروبیوتیک‌‏ها میکروارگانیسم‌‏های غیر پاتوژن و مفیدی هستند که شناسایی آنها در محصولات لبنی سنتی نه تنها می‌تواند منجر به جداسازی باکتری‏های پروبیوتیکی با خصوصیات ویژه شود، بلکه می‌تواند دیدگاه مناسبی برای تولید انبوه محصولات لبنی سنتی که به طور طبیعی حاوی باکتری‏های پروبیوتیکی هستند به ما عرضه کند (Koushki et al., 2014). بنابراین، جداسازی و شناسایی انواع باکتری‌های بالقوه پروبیوتیک از محصولات لبنی مختلف سنتی می‌تواند به حفظ این باکتری‌ها برای استفاده در محصولات غذایی تخمیری و کاربردی کمک کند (Abiri et al., 2021). ⁴

در مطالعات گذشته، در محصولات لبنی، باکتری‏های لاکتیک اسید به ویژه لاکتوباسیلوس با پتانسیل پروبیوتیکی شناسایی شدند و تاکنون جداسازی و شناسایی مولکولی بیفیدوباکتریوم‏ها از انواع ماست و پنیر سنتی در سه شهر مشهد، گناباد و نیشابور انجام نشده است. همچنین در مطالعات گذشته مقایسه مولکولی بیفیدوباکتریوم‏ها بین انواع ماست و پنیر سنتی و صنعتی صورت نگرفته است. درحال حاضر فقط محصولات پروبیوتیک در سطح محدود در برخی واحدهای لبنی و در فرآورده‏های محدودی مانند انواع ماست و پنیر تولید و مصرف می‏شود. این مطالعه، با ایجاد این دیدگاه علمی از وضعیت وجود باکتری‏های پروبیوتیک در فرآورده‏های سنتی طبیعی، منجر به ترویج فرهنگ استفاده از فرآورده‏های سنتی می‏شود. بنابراین، هدف از انجام این مطالعه، جداسازی و شناسایی مولکولی بیفیدوباکتریوم‏ها از انواع ماست و پنیر صنعتی و سنتی است و بر این اساس الگوی مناسب برای تولید انبوه آن‏ها در سطح صنعتی ایجاد خواهد شد که منجر به افرایش تولید و مصرف این فرآورده‏ها در دراز مدت خواهد شد؛ که این باعث خودکفایی در واردات استارتر می‏شود و منجر به کاهش هزینه در تولید محصولات پروبیوتیک خواهد شد.

 

مواد و روش‏ها

-       شناسایی میکروبی بیفیدوباکتریوم

شناسایی، شمارش و جداسازی بیفیدوباکتریوم‏ها بر اساس روش استاندارد بین‏المللی 29981ISO 2024: (220 IDF) روش bifidobacteria colony count technique براساس مورفولوژی سلولی، رنگ آمیزی گرم کلنی‏های شاخص انجام شد (ISO, 2024).

TOS-agar⁵ باعث رشد بیفیدوباکتریوم‏های مورد استفاده در فرآورده‏های لبنی می‏شود، که توسط سایر باکتری‌های اسید لاکتیک قابل استفاده نیستند. در این مطالعه از محیط کشت اختصاصی TOS-MUP استفاده شد. موپیروسین برای مهار رشد باکتری‌های غیر هدف اضافه می‌شود و گزینش‌پذیری محیط را افزایش می‌دهد (Roy, 2001).

نمونه‌های صنعتی از سوپرمارکت‌های مشهد خریداری شدند، در حالی که نمونه‌های سنتی به طور تصادفی از مغازه‌های لبنیات محلی در همان سه شهر تهیه شدند. تمام جمع‌آوری‌ها، تحت نظارت بهداشت، در پاییز 1403 انجام شد. سپس نمونه‌ها برای تجزیه و تحلیل بیشتر به آزمایشگاه میکروبی غذا و داروی مشهد منتقل شدند.

در مجموع 20 نمونه ماست و 10 نمونه پنیر جمع‏آوری شد. 9 نمونه ماست پروبیوتیک از 5 نوع برند A، B، C، D و E؛ 3 نوع پنیر پروبیوتیک از 3 برند F، G و H؛ 11 ماست سنتی و 7 پنیر سنتی از 3 شهر مشهد(M)، گناباد(G) و نیشابور(N) استان خراسان رضوی جمع‏آوری شد. از هر نمونه، 10 گرم با دقت 05/0 گرم وزن شد و با استفاده از رقیق‌کننده پپتون نمکی (MRD⁶) به صورت سریالی رقیق شد تا به رقت 001/0 برسد. 1 میلی‌لیتر از رقت 001/0 به یک پلیت خالی منتقل و با 12 تا 15 میلی‌لیتر از محیط کشت مربوطه مخلوط شد. برای دقت بیشتر، هر آزمایش، برای هر نمونه با 3 بار تکرار با رقت 001/0 انجام شد. پلیت‌ها به مدت 48 تا 72 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد تحت شرایط بی‌هوازی انکوبه شدند و از جارهای بی‌هوازی برای حفظ محیط مناسب استفاده شد. پس از انکوباسیون، کلنی‌های بیفیدوباکتریوم بر اساس ویژگی‌های مورفولوژیکی آنها، از جمله مورفولوژی کلنی و سلولی در محیط‌های انتخابی، مشاهده و جداسازی شدند. فقط پلیت‌هایی که حاوی 300 واحد تشکیل کلنی (CFU) یا کمتر بودند و کلنی‌های سفید رنگ داشتند، برای بررسی میکروسکوپی و مورفولوژیکی انتخاب شدند (ISO, 2024).

 

-        تایید بیفیدوباکتریوم‏ها به روش PCR

برای شناسایی باکتری‏ها به روش PCR، ابتدا استخراج DNA به روش عمومی استخراج باکتری‏های گرم مثبت صورت گرفت. برای استخراج DNA از کیت blackPREP Food DNA I Kit استفاده ‏شد. پس از استخراج DNA، با استفاده از مستر میکس قرمز امپلیکون، برنامه دمایی و زمانیPCR  انجام شد و ژن S rRNA16 تکثیر شد. در نهایت محصولات PCR با استفاده از الکتروفورز روی ژل آگارز 1% w/v، با رنگ‌آمیزی با Safe Stain و نمودار شدن در زیر نور آبی مرئی، مشاهده ‏شدند (Mashak, 2016). از S rRNA16، یک قطعه ژن
یک کیلوبایتی با استفاده از آغازگرهای
7-f AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')-5') و (5'AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3') 261-r تکثیر ‏شد.

 

-       تجزیه و تحلیل آماری

آنالیزهای آماری توسط نرم‏افزار SPSS نسخه 25 انجام شد. مقایسه میانگین داده‏های حاصل توسط آزمون آماری chi-square و تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از Crosstabs انجام شد. در نهایت مقادیر 05/0>p  معنی‏دار تلقی شد.

 

یافته‏ها 

-       بررسی ماکروسکوپی بیفیدوباکتریوم

کلنی‏های مربوط به گونه بیفیدوباکتریوم بر روی محیط کشتTOS-MUP ، متمایل به سفید مدور یا دوکی شکل⁷، تا حدودی ستاره‏ای شکل و یا برگ شبدری به قطر mm 1 تا mm 4، مشاهده شدند.   

 

 

Figure 1- Colonies of Bifidobacteria after incubation at 37 °C under anaerobic conditions for 48–72 h on TOS culture medium

شکل 1- کلنی‌های بیفیدوباکتریوم پس از انکوباسیون در دمای ۳۷ درجه سانتی‏گراد تحت شرایط بی‌هوازی به مدت ۴۸ تا ۷۲ ساعت در محیط کشت TOS

 

-       بررسی حضور بیفیدوباکتریوم در انواع ماست و پنیر

در این مطالعه 9 ماست پروبیوتیک از 5 نوع برند A، B، C، D، E (که از برند A و E، 2 تاریخ تولید متفاوت و از برند D، 3 تاریخ تولید متفاوت تهیه شد.) و 11 ماست سنتی از 3 شهر استان خراسان رضوی جمع‏آوری شد؛ که 4 نمونه از شهر مشهد (M)، 4 نمونه از شهر گناباد (G) و 3 نمونه از شهر نیشابور (N) از نظر وجود باکتری بیفیدوباکتریوم در محیط کشت ‏TOS با 3 بار تکرار با رقت 001/0 مورد بررسی قرار گرفت؛ که وجود و عدم حضور کلنی‏های مشاهده شده به صورت کمی به شرح جدول 1 می‏باشد. با توجه به جدول 1، بیفیدوباکتریوم در ماست‌های صنعتی پروبیوتیک A2، B، C و 2E و در همه‌ی ماست‌های سنتی به جز یکی از ماست‏های سنتی مشهد (M1)، مشاهده شد.

همچنین در این مطالعه 3 پنیر پروبیوتیک از 3 برند F، G، H و 7 پنیر سنتی از 3 شهر استان خراسان رضوی جمع‏آوری شد؛ که 3 نمونه از شهر مشهد (M)، 2 نمونه از شهر گناباد (G) و 2 نمونه از شهر نیشابور (N) از نظر وجود باکتری بیفیدوباکتریوم در محیط کشت TOS با 3 بار تکرار با رقت 001/0 مورد بررسی قرار گرفت؛ که وجود و عدم حضور کلنی‏های مشاهده شده به صورت کمی به شرح جدول 2 می‏باشد. همانطور که در جدول 2 ذکر شده است، در تمام نمونه‌های پنیر صنعتی پروبیوتیک و همه‌ی نمونه‌های پنیر سنتی، به جز در یکی از پنیرهای سنتی گناباد (G2)، بیفیدوباکتریوم مشاهده شد.

با توجه به جدول 3، از نظر وجود بیفیدوباکتریوم تفاوت معناداری بین انواع ماست سنتی و صنعتی پروبیوتیک وجود دارد و به صورت کلی، در %70 انواع ماست، بیفیدوباکتریوم مشاهده شد؛ که به تفکیک صنعتی و سنتی به ترتیب %4/44 و %9/90 می‏باشد. ⁸

همانطور که در جدول 4 مشاهده می‌شود، از نظر وجود بیفیدوباکتریوم تفاوت معناداری بین انواع پنیر سنتی و صنعتی پروبیوتیک وجود ندارد و به صورت کلی، در %90 انواع پنیر، بیفیدوباکتریوم مشاهده شد؛ که به تفکیک صنعتی و سنتی به ترتیب %100 و % 7/85 می‏باشد.

مقایسه‌ی مشاهده و عدم مشاهده بیفیدوباکتریوم در محیط کشت TOS در انواع ماست و پنیر در شکل‏های 1 و 2 نشان داده شده ‌است.

 

-       بررسی میکروسکوپی بیفیدوباکتریوم

تصاویر رنگ‏آمیزی باکتری‏ها در شکل 2 آمده است. بیفیدوباکتریوم‏ها گرم مثبت با مورفولوژی میله‏ای کوتاه و منحنی (club-shaped) و میله‏ای Y شکل دوشاخه مشاهده شدند.

با توجه به جدول 5، تقریبا ادعای بیشتر محصولات با نتایج مشاهده شده تطابق دارد؛ به جز ماست 2A، انواع ماست برند D و ماست 1E که نتایج مشاهده شده برخلاف ادعای محصول می‏باشد. همانطور که در جدول 5 مشاهده می‌شود، از بین 5 برند ماست‏ صنعتی پروبیوتیک، ادعای 2 برند و از بین 3 برند پنیر پروبیوتیک، ادعای تمام آن‏ها کاملا با نتایج آزمایشات میکروبی تطابق داشت. بنابراین، برای تایید صحت نتایج آزمون میکروبی از روش PCR به عنوان تست نهایی استفاده کردیم.

 

---

[1] (FAO)                                  2 Homofermentative

[2] 4 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

[3] 1 Food and Agriculture Organization of the United Nations

[4] 3 Streptococcus thermophilus

[5] 2 Maximum Recovery Diluent

[6] 1 Trans-galactosylated Oligosaccharide Agar

[7]  Lenticular

[8] 1 Lenticular

 

 

Figure 2- Microscopic morphology of Bifidobacteria isolated from yoghurt and cheese samples.

شکل 2- ریخت‌شناسی میکروسکوپی بیفیدوباکتریوم‌های جدا شده از نمونه‌های ماست و پنیر.

   

جدول 1- تعداد کلنی‏های مشاهده شده در محیط کشت TOS در ماست‏های صنعتی پروبیوتیک و سنتی 3 شهر خراسان رضوی

Table 1- Number of colonies observed in TOS culture medium in industrial probiotic and traditional yogurts in 3 cities of Khorasan Razavi

Sample	TOS (cfu/g)
Yogurt A1	<1000
Yogurt A2	1.8×107
Yogurt B	4.32×106
Yogurt C	2.88×106
Yogurt D1	<1000
Yogurt D2	<1000
Yogurt D3	<1000
Yogurt E1	<1000
Yogurt E2	5×105
Traditional yogurt M1	<1000
Traditional yogurt M2	6×105
Traditional yogurt M3	105
Traditional yogurt M4	1.8×107
Traditional yogurt G1	1.4×105
Traditional yogurt G2	8×104
Traditional yogurt G3	5.4×106
Traditional yogurt G4	7×105
Traditional yogurt N1	2.16×106
Traditional yogurt N2	2.16×107
Traditional yogurt N3	2.88×107

 

جدول 2- تعداد کلنی‏های مشاهده شده در محیط کشت TOS در پنیر‏های صنعتی پروبیوتیک و سنتی 3 شهر خراسان رضوی

Table 2- Number of colonies observed in TOS culture medium in probiotic industrial and traditional cheeses in 3 cities of Khorasan Razavi

Sample	TOS (cfu/g)
Cheese F	5×105
Cheese G	3.6×106
Cheese H	2.04×106
Traditional cheese M1	5×105
Traditional cheese M2	105
Traditional cheese M3	1.8×107
Traditional cheese G1	1.8×107
Traditional cheese G2	<1000
Traditional cheese N1	3.6×106
Traditional cheese N2	3.6×106

 

جدول 3- فراوانی و درصد حضور و عدم حضور بیفیدوباکتریوم در محیط کشت TOS در نمونه‌های ماست صنعتی و سنتی و در مجموع

Table 3- Frequency and percentage of the presence and absence of Bifidobacteria on TOS culture medium in industrial and traditional yogurt samples, and in total.

Yogurt type	Bifidobacteria absent (N, %)	Bifidobacteria present (N, %)	Total (N, %)	Fisher's exact test result
Industrial	5 (55.6%)	4 (44.4%)	9 (100%)	P-Value= 0/49
Traditional	1 (9.1%)	10 (90.9%)	11 (100%)
Total	6 (30%)	14 (70%)	20 (100%)

 

جدول 4 -فراوانی و درصد حضور و عدم حضور بیفیدوباکتریوم در محیط کشت TOS در نمونه‌های پنیر صنعتی و سنتی و در مجموع

Table 4- Frequency and percentage of the presence and absence of Bifidobacteria on TOS culture medium in industrial and traditional cheese samples, and in total

Cheese type	Bifidobacteria absent (N, %)	Bifidobacteria present (N, %)	Total (N, %)	Fisher's exact test result
Industrial	0 (0%)	3 (100%)	3 (100%)	P-Value = 1
Traditional	1 (14.3%)	6 (85.7%)	7 (100%)
Total	1 (10%)	9 (90%)	10 (100%)

 

 

 

Figure 3- Presence and absence of Bifidobacteria in TOS culture medium among industrial and traditional yogurt samples

شکل 3- حضور و عدم حضور بیفیدوباکتریوم در محیط کشت TOS در نمونه‌های ماست صنعتی و سنتی

 

 

 

Figure 4- Presence and absence of Bifidobacteria in TOS culture medium among industrial and traditional cheese samples

شکل 4- حضور و عدم حضور بیفیدوباکتریوم در محیط کشت TOS در نمونه‌های پنیر صنعتی و سنتی

 

 

-       نتایج شناسایی بیفیدوباکتریوم‏ها به روش PCR

برای تایید نهایی، 9 نمونه مشکوک از بین تمام نمونه‏ها انتخاب و PCR انجام شد. با توجه به شکل 5، نتایج PCR به شرح جدول 6 می‏باشد.

با توجه به جدول 6، به جز نمونه‏های ماست A2 ، D1

و E1، نتایج میکروبی و PCR سایر نمونه‏ها کاملا با هم مطابقت دارند. بنابراین با توجه به جدول 6، با در نظر گرفتن نتیجه PCR، به عنوان تست تاییدی، ادعای 3 برند ماستA2 ، D1 و E1 برخلاف آنچه (مشاهده میکروسکوپی) که در جدول 5 ذکر شد، صحیح می‏باشد.

 

جدول 5- مقایسه ادعای محصولات صنعتی پروبیوتیک با نتایج مشاهده شده

Table 5- Comparison of claims of industrial probiotic products with observed results

Compliance or non-compliance with product claims	Observed result	Product Claim	Product type
It complies with the product claim.	Bifidobacteria were not observed.	Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus/Starter: Lactobacillus L. Casei	Yogurt A1
It does not comply with the product claim.	Bifidobacteria were observed.	Yogurt A2
It complies with the product claim.	Bifidobacteria were observed.	Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus, Streptococcus thermophilus/Starter: Bifidobacterium animalis subspecies lactis or Lactobacillus acidophilus or Lactobacillus casei	Yogurt B
It complies with the product claim.	Bifidobacteria were observed.	Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus/Starter: Lactobacillus acidophilus or Bifidobacterium bifidium	Yogurt C
It does not comply with the product claim.	Bifidobacteria were not observed.	Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus/Starter: Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium	Yogurt D1 & D2
It does not comply with the product claim.	Bifidobacteria were not observed.	Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium	Yogurt D3
It does not comply with the product claim.	Bifidobacteria were not observed.	Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus/Starter: Bifidobacterium lactis	Yogurt E1
It complies with the product claim.	Bifidobacteria were observed.	Bifidobacterium lactis	Yogurt E2
It complies with the product claim.	Bifidobacteria were observed.	Bifidobacterium lactis or Lactobacillus acidophilus	Cheese F
It complies with the product claim.	Bifidobacteria were observed.	Bifidobacterium or Lactobacillus acidophilus	Cheese G
It complies with the product claim.	Bifidobacteria were observed.	Bifidobacterium	Cheese H

 

 

Figure 5- PCR amplification of Bifidobacteria isolates.

M: DNA ladder; Bifido: reference Bifidobacteria strain; C⁺: positive control; C⁻: negative control; lanes 3, 8, 13, 16, 20, and 24: positive samples (~1500 bp); lanes 1, 7, and 28: negative samples.

شکل5- تکثیر PCR از جدایه‌های بیفیدوباکتری‌ها.

 M: نردبان DNA؛ بیفیدوباکتری‌ها: سویه مرجع بیفیدوباکتری‌ها؛ C⁺: کنترل مثبت؛ C⁻: کنترل منفی؛ ردیف‌های ۳، ۸، ۱۳، ۱۶، ۲۰ و ۲۴: نمونه‌های مثبت (حدود ۱۵۰۰ جفت باز)؛ ردیف‌های ۱، ۷ و ۲۸: نمونه‌های منفی.

 

جدول 6- مقایسه نتایج PCR با تایید مورفولوژیکی روی محیط کشت TOS در 9 نمونه ماست و پنیر منتخب

Table 6- Comparison of PCR results with morphological confirmation on TOS in nine selected yogurt and cheese samples

Sample No.	Sample type	Morphological confirmation in the TOS agar medium culture	Final confirmation test result by PCR method
1	Traditional yogurt M1	-	-
3	Traditional yogurt G1	+	+
7	Yogurt A2	+	-
8	Yogurt D1	-	+
13	Traditional yogurt N3	+	+
16	Yogurt E1	-	+
20	Traditional cheese M1	+	+
24	Cheese G	+	+
28	Traditional cheese G2	-	-

 

 

 

بحث

در مطالعه حاضر، کلنی‏های مربوط به گونه بیفیدوباکتریوم بر روی محیط کشتTOS-MUP ، متمایل به سفید مدور یا دوکی شکل، تا حدودی ستاره‏ای شکل و یا برگ شبدری به قطر mm 1 تا mm 4، مشاهده شدند. به صورت میانگین تعداد کلنی‏های مشاهده شده در ماست و پنیر صنعتی پروبیوتیک به ترتیب CFU/g 106×86/2 و 106×05/2 و در ماست و پنیر سنتی به ترتیب CFU/g106×05/7 و 106×26/6 بود.

مطالعه‌ای که توسط Mashak (2016) انجام شد، نمونه‏های کشک زرد از نظر وجود سویه‏های بیفیدوباکتریوم مورد بررسی قرار گرفت. مطابق با این مطالعه، تعداد کلنی برای ایزوله‏های فرض شده بیفیدوباکتریوم از
log CFU/mL 2.37 تا 7.17 متغیر بود. حد پایین توصیه شده توسط فدراسیون بین المللی لبنیات (IDF) برای تعداد بیفیدوباکتری‏ها در محصولات لبنی CFU/mL 106 است. پنجاه و چهار جدایه که به صورت کلنی‌های سفید و گرد یا دوکی روی mMRS آگار ظاهر شدند، بیفیدوباکتریوم در نظر گرفته شدند. از بین این جدایه‏ها، تنها 12 جدایه به عنوان G+ و میله‏ای شکل شناسایی شدند (Mashak, 2016). محصول لبنی در این مطالعه با مطالعه حاضر متفاوت می‌باشد؛ با این حال، یافته‌های هر دو مطالعه، مشاهدات مشابهی را در مورد شناسایی بیفیدوباکتریوم نشان می‌دهد.

در مطالعه Elobaid و همکاران (2020) که شامل جداسازی و شناسایی بیفیدوباکتریوم از چهار فرآورده لبنی مختلف بود، 20 نمونه جمع آوری شد. در مطالعه فعلی، 30 نمونه از 2 نوع فرآورده‌ی لبنی جمع آوری شد. محصولات لبنی مورد استفاده در مطالعه Elobaid و همکاران (2020) همانند مطالعه حاضر، با دقت انتخاب شدند تا معیارهای زیر را برآورده کنند: الف) محصولات باید در بین جمعیت محبوب باشند و به طور منظم مصرف شوند و ب) برای محصولات تجاری مورد استفاده، در دسترس بودن بیفیدوباکتریوم در محصولات نیاز به تایید سازنده محصولات تجاری داشت. محصولات مورد استفاده در این مطالعه ماست و پنیر در 2 نوع صنعتی پروبیوتیک و سنتی بود که با محصولات Elobaid و همکاران (2020) که شامل پودر ماست، نوشیدنی ماست پاستوریزه، کفیر شیر گاو و ماست خانگی بود، تا حدودی متفاوت بود. در مطالعه Elobaid و همکاران (2020) ، هر نمونه با استفاده از یک لوپ به یک صفحه MRS  آگار به عنوان محیط انتخابی تلقیح شد. سپس به صورت بی هوازی در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت انکوبه شد. جدایه‌ها با رنگ آمیزی گرم و حساسیت آن‌ها به موپیروسین تأیید شدند. اما در مطالعه حاضر از محیط کشت MUP  TOS- استفاده شد. مورفولوژی حاصل از مشاهدات رنگ آمیزی گرم جدایه‌های بیفیدوباکتریوم، ویژگی‌های ساختاری کلیدی بیفیدوباکتریوم را نشان داد که شامل ساختار میله‌ای Y شکل دوشاخه‌ای است که همراستا با مشاهدات مطالعه حاضر است. بیفیدوباکتریوم با ساختار میله‌ای شکل به طور مشخص در مشاهده رنگ آمیزی گرم برای نمونه‌های گرفته شده از نوشیدنی ماست پاستوریزه دیده شد. از 20 نمونه آزمایش شده، شش ایزوله شناسایی شده به عنوان بیفیدوباکتریوم بر روی آگارMan Rogosa Sharpe (MRS) از 4 منبع مختلف جدا شد و با آزمایش‌های رنگ‌آمیزی گرم و تست حساسیت آن به موپیروسین شناسایی شد. پنج جدایه از ماست خانگی و یک جدایه از نوشیدنی ماست پاستوریزه به دست آمد (Elobaid et al., 2020). بر اساس مطالعه فعلی، بیفیدوباکتریوم در 4 نمونه از 9 نمونه ماست صنعتی پروبیوتیک و 10 نمونه از 11 نمونه ماست سنتی و در گروه پنیرها، همه‌ی پنیرهای صنعتی پروبیوتیک و در 6 نمونه از 7 نمونه پنیر سنتی مشاهده شد.

مطالعات Taye و همکاران (2021)، بر روی گاوهای شیرده برای جداسازی و شناسایی LAB از محصولات لبنی موجود در شهر باهیر دار، شمال غربی اتیوپی و اطراف آن انجام شد.  در مجموع 41 جدایه باکتریایی بر اساس مورفولوژی رشد در محیط‌های انتخابی و سایر آزمایش‌های بیوشیمیایی تحت پنج جنس مختلف LAB مانند لاکتوباسیلوس (24.38%)، لاکتوکوکس (94/21%)، لوکونوستوک (64/14%)، پدیوکوک (31/7%)، استرپتوکوک (51/19%) و بیفیدوباکتریوم (19/12%) از شیر خام، پنیر و ماست جدا و شناسایی شدند. گونه‌های لاکتوباسیلوس شایع ترین LAB جدا شده از شیر و ماست در میان جنس‌های شناسایی شده بودند. با این حال، گونه‌های لاکتوکوکس و بیفیدوباکتریوم به نسبت بیشتری در پنیر یافت شد (Taye et al., 2021). با توجه به جداول 3 و 4، مطالعه حاضر نشان داد که به صورت کلی بین 2 محصول لبنی ماست و پنیر صرف نظر از نوع صنعتی پروبیوتیک و سنتی، در نمونه‌‌‌‌های پنیر (%90)، بیفیدوباکتریوم بیشتری نسبت به نمونه‌های ماست (%70) وجود دارد؛ که این نتیجه مشابه نتیجه Taye و همکاران (2021) بود.

TOS-agar باعث رشد بیفیدوباکتریوم‏های مورد استفاده در فرآورده‏های لبنی می‏شود و آنتی بیوتیک موپیروسین لیتیوم سالت (MUP)¹، رشد اغلب باکتری‏های اسید لاکتیک را که به طور معمول در فرآورده‏های لبنی تخمیری و فرآورده‌های لبنی غیر تخمیری استفاده می‌شوند، را مهار می‏کند. به دلیل انتخابی بودن آنتی بیوتیک MUP، هیچکدام از باکتری‏های شاخص ماست (استرپتوکوکوس ترموفیلوس، لاکتوباسیلوس دلبروکئی زیرگونه بولگاریکوس) و نیز لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس، و لاکتوباسیلوس کازئی و لاکتوباسیلوس رامنوسوس روی محیط‏ کشت TOS-agar، رشد نمی‏کنند. بنابراین، در این مطالعه از محیط کشت اختصاصی TOS-MUP استفاده شد. در همین راستا، در مطالعه Mashak (2016)، آزمایش‌های حساسیت موپیروسین برای تمایز بیفیدوباکتری‌ها از لاکتوباسیل‌ها انجام شد، زیرا ویژگی‌های کشت و بیوشیمیایی هر دو جنس همپوشانی دارند. بیفیدوباکتری‏ها به موپیروسین مقاوم هستند، در حالی که لاکتوباسیل‏ها به آن حساس هستند (Mashak, 2016).

 همانطور که گفته شد در این مطالعه از PCR به عنوان تست تایید نهایی استفاده شد. برای این منظور ژن SrRNA16 و آغازگرهای (پرایمرهای)
7-f AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')-5') و (5'AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3') 261-r تکثیر ‏شدند. نتیجه این تکثیر یک قطعه حدودا bp 1500 بود. به این ترتیب از 9 نمونه مورد آزمایش، 6 نمونه پس از تکثیر با آغازگر مطابق با شکل 5 تشکیل باند دادند.

در مطالعه Saleh و همکاران (2024)، سی و سه جدایه باکتریایی مختلف جمع آوری و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی PCR از نظر بیوشیمیایی، مورفولوژیکی و مولکولی شناسایی شدند. شناسایی مولکولی جدایه‏های بیفیدوباکتریوم با استفاده از پرایمرهای اختصاصی انجام شد. از چهار آغازگر اختصاصی مختلف استفاده شد. اولین پرایمر (g-bifid) یک پرایمر عمومی برای شناسایی جنس Bifidobacterium بود. از بین 33 جدایه جمع آوری شده، تنها 13 جدایه با این آغازگر واکنش داده و نواری در اندازه‏های بین 549 جفت باز تا 563 جفت باز تولید کردند. آزمایشات مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی نشان داد که 13 جدایه به عنوان بیفیدوباکتری شناسایی شدند. بیشترین تعداد ایزوله از انواع ماست‏ها به دست آمد که درصد آن به حدود 43 درصد رسید و پس از آن انواع مختلف شیر که درصد ایزوله‏ها به 30 درصد رسید. در رتبه سوم عسل قرار دارد که درصد جدایه‏ها به 12 درصد و در نهایت سویا به 9 درصد رسید (Saleh et al., 2024). در مطالعه حاضر هم شناسایی مورفولوژیکی و مولکولی با استفاده از پرایمرهای اختصاصی انجام شد که درصد بیفیدوباکتریوم مشاهده شده در ماست و پنیر صنعتی پروبیوتیک به ترتیب 4/44 و 100 درصد و در ماست و پنیر سنتی به ترتیب 9/90 و 7/85 درصد بود. ²

در مطالعه Malini و Raghav (2021)، نمونه‌های شیر شتر تولید شده در مزرعه ایالت راجستان هند برای جداسازی باکتری‌های پروبیوتیک LAB جمع آوری شد. فرآیند جداسازی توسط نمونه غنی شده روی محیط کشت MRS آگار تکمیل شد و باکتری‌های جدا شده در شرایط بی هوازی 37 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. کشت‌های باکتریایی جدا شده با استفاده از روش توالی‏یابی DNA مشخص و شناسایی شدند. روش شناسایی بستگی به شباهت توالی ژن S rRNA16 دارد. پس از غربالگری آزمایشگاهی، از 11 نمونه شیر شتر و 5 نمونه شیر خام، 40 سویه گرم مثبت، اکسیداز منفی و باکتری کاتالاز منفی و غیر اسپورساز که به عنوان سویه باکتری اسید لاکتیک در نظر گرفته شدند، جداسازی شدند. جدایه‌ها بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی و بیولوژیکی به پنج جنس LAB به شرح زیر تمایز یافتند: انتروکوک، لاکتوباسیلوس پلانتاروم، لاکتوباسیلوس کازئی، لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و بیفیدوباکتریوم.  DNAجدا شده با پرایمر اختصاصیrRNA  S161492R) و (8F تکثیر شد (Malini and Raghav, 2021). این مطالعه حضور LAB را در شیر شتر تایید کرد. در مطالعه حاضر از محیط کشت TOS-MUP برای جداسازی بیفیدوباکتریوم در محصولات ماست و پنیر سنتی و صنعتی استفاده شد؛ بنابراین در این مطالعه، برخلاف مطالعه Malini و Raghav (2021)، فقط بیفیدوباکتریوم شناسایی شد. ژن استفاده شده در هردو مطالعه یکسان بود، اما از پرایمرهای متفاوتی استفاده شد.

از آنجایی که هیچ یک از روش های مبتنی بر کشت به اندازه کافی برای شناسایی بیفیدوباکتری‏ها انتخابی نیستند، باید از PCR - یک تکنیک مولکولی که به دلیل کارایی، سرعت و دقت بالا شناخته شده است - برای تأیید تعلق سویه‌های جدا شده به جنس بیفیدوباکتریوم استفاده شود. با توجه به مطالعات انجام شده، شناسایی بیفیدوباکتریوم از انواع محصولات مانند: ماست، پنیر، شیر، کشک زرد، روغن و کره و عسل؛ با روش PCR به وسیله‏ی ژن‏های مختلفی از جمله 16S rRNA، tuf، hsp60 و سایر ژن‌ها و انواع پرایمرها انجام می‏شود. در مطالعه حاضر، باکتری‌های بیفیدوباکتریوم، از ماست و پنیر پروبیوتیک صنعتی و ماست و پنیر سنتی 3 شهر خراسان رضوی با استفاده از کشت و روش PCR،  ژن SrRNA16جداسازی و شناسایی شدند. 

نتیجه‏گیری

جداسازی موفقیت‌آمیز بیفیدوباکتریوم‌ها از ماست و پنیر سنتی نشان می‌دهد که این محصولات ممکن است به عنوان منابع امیدوارکننده‌ای از سویه‌های پروبیوتیک عمل کنند. در آینده، بررسی سویه‌های بومی می‌تواند توسعه کشت‌های آغازگر منطقه‌ای را که با میکروفلور دستگاه گوارش جمعیت محلی سازگارتر هستند، تسهیل کند. با این حال، توجه به این نکته مهم است که گونه‌های موجود در محصولات لبنی ممکن است متفاوت از گونه‌های طبیعی موجود در میکروبیوتای انسان رفتار کنند. مطابق با یافته‌های این مطالعه، سویه‌های پروبیوتیک بومی متنوعی نیز ممکن است از محصولات لبنی سنتی در سایر استان‌ها جدا شوند. پس از جداسازی و کشت، این سویه‌ها می‌توانند در کاربردهای صنعتی، از جمله تولید لبنیات تجاری، مورد استفاده قرار گیرند. تحقیقات بیشتر در این زمینه می‌تواند از کاربرد تکنیک‌های اضافی مبتنی بر PCR یا روش‌های پیشرفته تعیین توالی بهره‌مند شود. با توجه به تعداد محدود مطالعات انجام شده در زمینه جداسازی و شناسایی گونه‌های بیفیدوباکتریوم از محصولات لبنی در استان خراسان رضوی، تحقیقات جامع‌تری برای شناسایی کامل این سویه‌ها در سطح گونه و ارزیابی پتانسیل پروبیوتیکی آنها مورد نیاز است.

 

سپاسگزاري

از معاونت غذا و دارو دانشگاه علوم پزشکی مشهد و دانشگاه علوم پزشکی گناباد به خاطر در اختيار قراردادن امكانات پژوهشي اين تحقيق، تقدير و تشكر مي‏گردد.

 

منابع

Abiri, R., Aliabadi, M., Kadivarian, S., Borji, S., Moradi, J. & Alvandi, A. )2021(. Potentially probiotic bacteria isolated from preparation stages of Kermanshahi traditional fat. Iranian Journal of Medical Microbiology, 15, 352-360.

Ebogie, O. O. )2016(. A comparison of Probiotic and Standard yogurt based on branding (premium and basic brands), consumer preference, sensory evaluation,

---

[1]  mupirocin lithium salt

[2] 1 mupirocin lithium salt

microbiological and nutritional analysis. University of Central Lancashire.

Elobaid, R., Kaur, B. & Vijayalakshmi, N. )2020). Isolation and identification of Bifidobacterium from dairy products and screening its antibacterial activity. Quest International Journal of Medical and Health Sciences, 3, 38-43.

Fontana, L., Bermudez-brito, M., Plaza-diaz, J., Munoz-quezada, S. & GIL, A. (2013). Sources, isolation, characterisation and evaluation of probiotics. British journal of nutrition, 109, S35-S50.

Ho, P. H., Pham, T. A., Truong, Q. P., Nguyen, L. H., Nguyen, T. T., Dam, H. T., Nguyen, C. N., Nguyen, H. A., Phi, Q. T. & Nguyen, H. A. (2022). Isolation, identification and characterization of beneficial microorganisms from traditional fermented foods. Probiotics, Prebiotics and Synbiotics: Technological Advancements Towards Safety and Industrial Applications, 14-56.

Hotel, A. C. P. & Cordoba, A. (2001). Health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria. Prevention, 5, 1-10.

ISO (2024). ISO 29981: 2024 [IDF 220: 2024] Milk products — Enumeration of bifidobacteria — Colony-count technique. 2 ed.

Kim, H.-B., Kim, E., Yang, S.-M., Lee, S., Kim, M.-J. & Kim, H.-Y. (2020). Development of real-time PCR assay to specifically detect 22 Bifidobacterium species and subspecies using comparative genomics. Frontiers in Microbiology, 11, 569822.

Koushki, V., Vatandost, J., Mortazavi, S. A., Jannatabdi, A. & Hosseini, S. A. (2014). Isolation, biochemical and molecular identification of probiotic bacteria from traditional dairy products of Sabzevar. Journal of Sabzevar University of Medical Sciences, 726-737.

Madigan, M. T., Martinko, J. M. & Parker, J. (2004). Brock. Biología de los microorganismos.

Malini, N. & Raghav, P. K. (2021). Isolation and identification of potential probiotic lactic acid bacteria (Lactobacillus casei and Bifidobacterium) from raw and fermented camel milk during storage. Journal of Postharvest Technology, 9, 40-46.

Mashak, Z. (2016). Identification of Bifidobacterium Strains Isolated from Kashk-e Zard: A Traditional Iranian Fermented Cereal-Dairy Based Food.

Mianzhi, Y. & Shah, N. P. (2017). Contemporary nucleic acid-based molecular techniques for detection, identification, and characterization of Bifidobacterium. Crit Rev Food Sci Nutr, 57, 987-1016.

Perry, J. J. & Staley, J. T. (1997). Microbiology: dynamics and diversity. (No Title).

ROY, D. 2001. Media for the isolation and enumeration of bifidobacteria in dairy products. Int J Food Microbiol, 69, 167-82.

Saleh, N. Z., Saleh, F. M., Eldrwy, Y., Fasil, R. & Elfarash, A. E. (2024). Molecular Characterization and Genetic Improvement of Some Bifidobacterium Isolates for Yogurt Manufacture use. Assiut Journal of Agricultural Sciences, 55, 111-121.

Satokari, R. M., Vaughan, E. E., Smidt, H., Saarela, M., Mättö, J. & De vos, W. M. (2003). Molecular approaches for the detection and identification of bifidobacteria and lactobacilli in the human gastrointestinal tract. Systematic and applied microbiology, 26, 572-584.

Saxelin, M., Korpela, R. & Mäyrä-Mäkinen, A. (2003). Introduction: classifying functional dairy products. Functional dairy products, 1-16.

Taye, Y., Degu, T., Fesseha, H. & Mathewos, M. (2021). Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria from Cow Milk and Milk Products. ScientificWorldJournal, 4697445.

Tesfaye, W., Suarez-lepe, J., Loira, I., Palomero, F. & Morata, A. (2019). Dairy and nondairy-based beverages as a vehicle for probiotics, prebiotics, and symbiotics: Alternatives to health versus disease binomial approach through food. Milk-based beverages. Elsevier.

 

 

 

 

59