اثرات ماده Trichostatin A، بازدارنده هيستون دی استیلاز، بر ریخت شناسی، کنیدیوم‌زایى و رشد رویشی Fusarium graminearum عامل بلایت فوزاريومي سنبله گندم
محورهای موضوعی : بیماری شناسی گیاهی
شیوا امین
1
,
سعید رضائى
2
,
امیر موسوی
3
,
حمیدرضا زمانی‌زاده
4
1 - گروه گیاهپزشکی، دانشکده علوم کشاورزی و صنایع غذایی، واحد علوم و تحقیقات تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران.
2 - عضو هیأت علمی گروه گیاهپزشکی، دانشکده علوم کشاورزی و صنایع غذایی، واحد علوم و تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران.
3 - گروه زيست فناوری مولکولی گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران
4 - گروه گیاهپزشکی، دانشکده علوم کشاورزی و صنایع غذایی، واحد علوم و تحقیقات تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
کلید واژه: اپی‌ژنتیک, دی‌استیلاسیون, کروماتین, Triticum aestivum, TSA,
چکیده مقاله :
استیلاسیون یکی از مکانیسم‌های مهم تنظیم بیان ژن در سطح پس از ترجمه می‌باشد که توسط آنزیم‌های هیستون استیل ترنسفراز و هیستون دی استیلاز کنترل می‌شود. آنزیم‌های هیستون دی استیلاز قارچی در بیماری‌زایی، پاسخ‌گویی به تنش‌های محیطی و تولید متابولیت‌های ثانویه اهمیت دارند. بنابراین در این مطالعه، اثرات احتمالی بازدارنده هیستون دی‌استیلازTrichostatin A (TSA) بر ریخت‌شناسی Fusarium graminearum، عامل بیماری بلایت فوزاریومی، مورد بررسی قرار گرفت. قارچ روی محیط‌کشت سیب‌زمینی-دکستروز-آگار حاوی TSA (5/1، سه و 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر) کشت و سپس رشد رویشی و ریخت‌شناسی آن در روزهای سوم، پنجم و هفتم پس از کشت ارزیابی شد. رشد شعاعی قارچ پس از سه روز در حضور TSA کاهش یافت. کمترین میزان رشد ریسه‌ها نسبت به شاهد، در روز هفتم در محیط کشت حاوی 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر از TSA رخ داد. بهعلاوه، TSA موجب القای رشد ریسه‌های هوایی قارچ شد. در آزمون کنیدیومزایی، مقایسه تیمار با شاهد نشان دهنده کاهش تولید کنیدیوم در پاسخ به تمام غلظت‌های TSA بود. کمترین میزان کنیدیومزایی در حضور 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر از ماده بازدارنده اتفاق افتاد. نتایج نشان دهنده نقش تغییرات اپی ژنتیکی در تنظیم بیان ژنهای F. graminearum می‌باشند و ممکن است در ارائه راهکارهای جدید برای مدیریت بیماری بلایت فوزاریومی کمک کنند.
Acetylation is an important mechanism to regulate gene expression at a post-translational level. The process is catalyzed by histone acetyltransferases (HATs) and histone deacetylases (HDACs). HDACs play an essential role in fungal pathogenesis, response to environmental stress, and production of secondary metabolites. Therefore, this study aims to investigate the possible effects of Trichostatin A (TSA), a histone deacetylase inhibitor, on the morphology of Fusarium graminearum, the causal agent of Fusarium Head Blight disease. The fungus was grown on PDA medium supplemented with TSA at different dosages of 1.5, 3, and 10 µg mL-1. The vegetative growth and morphological characteristics of the fungi were evaluated on days 3, 5, and 7 after inoculation. Radial growth of the fungi was significantly suppressed by TSA after three days of exposure. Compared to the control, the lowest mycelial growth was observed in culture media supplemented with 10 µg mL-1 TSA on day seven. Additionally, TSA caused aerial hyphae formation. Conidia production decreased in response to all concentrations of TSA, and the minimum conidiation occurred in the highest concentration (10 µg mL-1). The results showed the role of epigenetic modifications in F. graminearum gene expression and may help to provide new strategies to manage Fusarium head blight disease.
بصیرنیا، ط. 1392. مطالعه مولکولی و بیوشیمیایی نقش histone deacetylases در قارچ Aspergillus flavus عامل آلودگی پسته. پایان¬نامه دکتری، دانشکده کشاورزی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران، تهران. 151 صفحه.
رستمی، ا. و صارمی، ح. 1397. بررسی تأثیر عامل¬های مؤثر در میزان تشکیل پروتوپلاست در قارچ F. oxysporum با هدف استفاده در امتزاج پروتوپلاست. دانش گیاهپزشکی ایران 49(1): 155-164.
Alisaac, E. and Mahlein, A.K. 2023. Fusarium head blight on wheat: Biology, modern detection and diagnosis and integrated disease management. Toxins 15(3): 192. doi: 10.3390/toxins15030192.
Amin, S., Rezaee, S., Mousavi, A. and Zamanizadeh, H. 2024. The histone deacetylase inhibitor Trichostatin-A modifies the expression of trichothecene mycotoxin regulatory gene Tri5 in Fusarium graminearum. Iranian Journal of Biotechnology 22(3): 90-100. doi: 10.30498/ijb.2024.437331.3872.
Baidyaroy, D., Brosch, G., Graessle, S., Trojer, D. and Walton, J. 2002. Characterization of inhibitor resistant histone deacetylase activity in plant pathogenic fungi. Eucaryotic Cell 1(4): 538-547. doi: 10.1128/EC.1.4.538-547.
Basimia, T., Rezaee, S., Zamanyzadeh, H. and Mousavi, A. 2013. SAHA, histone deacetylase inhibitor causes reduction of aflatoxin production and conidiation in the Aspergillus flavus. Iranian Journal of Biotechnology 3(12): 9-12.
Bauer, I., Varadarajan, D., Pidroni, A., Gross, S., Vergeiner, S., Faber, B., Hermann, M., Tribus, M., Brosch, G. and Graessle, S. 2016. A class 1 histone deacetylase with potential as an antifungal target. mBio 7(6): e00831-16. doi: 10.1128/mBio.00831-16.
Brandfass, C. and Karlovsky, P. 2008. Upscaled CTAB-Based DNA extraction and Real-Time PCR assays for Fusarium culmorum and F. graminearum DNA in plant material with reduced sampling error. International Journal of Molecular Science 9: 2306-2321. doi: 10.3390/ijms9112306.
Brando, F., Derengoski, L., Albuquerque, R., Nicola, A., Silva-Pereria, I. and Pocas-Fonseca, M.J. 2015. Histone deacetylases inhibitors effect on Cryptococcus neoformans major virulence phenotypes. Virulence 6(6): 618-30. doi: 10.1080/21505594.2015.1038014.
Brauer, E.K., Subramaniam, R. and Harris, L.J. 2020. Regulation and dynamics of gene expression during the life cycle of Fusarium graminearum. Phytopathology 110(8): 1368-1374. doi: 10.1094/PHYTO-03-20-0080-IA.
Chen, Y., Kistler, H.C. and Ma, Z. 2019. Fusarium graminearum trichothecene mycotoxins: biosynthesis, regulation, and management. Annual Review of Phytopathology 57: 15–39. doi: 10.1146/annurev-phyto-082718-100318.
Ding, S., Mehrabi, R., Koten, C., Kang, Z.,Wei, Y., Seong, K., Kistler, H. and Xu, J. 2009. Transducin Beta-like gene FTL1 is essential for pathogenesis in Fusarium graminearum. Eucaryotic Cell 8(6): 867-876. doi:10.1128/EC.00048-09.
Elias-Villalobos, A., Fernandez-Alvarez, A., Moreno-Sanchez, I., Helmlinger, D.I. and Ibeas, J. 2015. The Hos2 histone deacetylase controls Ustilago maydis virulence through direct regulation of mating-type genes. Pathogens 11(8): e1005134. doi: 10.1371%2Fjournal.ppat.1005134.
Furumai, K., Komatu, Y., Nishino, N., Khochbin, S., Yoshida, M. and Horinouchi, S. 2001. Potent histone deacetylase inhibitors built from Trichostatin A and cyclic tetrapeptide antibiotics inducing Trapoxin. PANS 98(1): 87-92. doi: 10.1073/pnas.98.1.87.
Gaikwad, A., Sagar, V. and Pandey, A. 2015. Natural HDAC Inhibitors: Nature’s answer to the cancer. Journal of Pharmaceutical Science and Technology 1(1): 26-36.
Hu, Y., Zhou, Y., Mao, Z., Chen, F. and Shao, Y. 2017. NAD+-dependent HDAC inhibitor stimulates Monascus pigment production but inhibits citrinin. AMB Express 7(1): 166. doi:10.1186/s13568-017-0467-1.
Ibeagha-Awemu, E.M., Kiefer, H., Mckay, S.E. and Liu, G. 2022. Editorial: Epigenetic variation influences on livestock production and disease traits. Frontiers in Genetic 13: 942747. doi: 10.3389/fgene.2022.942747.
Izawa, M., Takekawa, O., Arie, T., Teraoka ,T., Yoshida, M., Kimura, M. and Kamakura, T. 2009. Inhibition of histone deacetylase causes reduction of appressorium formation in the rice blast fungus Magnaport oryzae. Journal of General and Applied Microbiology 55: 489-498. doi.org/10.2323/jgam.55.489.
Li, Y., Wang, C., Liu, W., Wang, G., Kang, Z., Kistler, H. and Xu, J. 2011. The HDF1 histone deacetylase gene is important for conidiation, sexual reproduction, and pathogenesis in Fusarium graminearum. Molecular Plant Microbe Interactions 24(4): 487-496. doi: 10.1094/MPMI-10-10-0233.
Lin, C., Cao, X., Qu, Z., Zhang, S., Naqvi, N. and Deng, Y. 2021. The histone deacetylases MoRpd3 and MoHst4 regulate growth, conidiation, and pathogenicity in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. mSphere 6: e00118-21. doi: 10.1128/mSphere.00118-21.
Liu, S., Wang, Q., Liu, N., Luo, H., He, C. and An, B. 2022. The histone deacetylase Hos2 controls pathogenicity through regulation of melanin biosynthesis and appressorium formation in Colletotrichum gloeosporioide. Phytopathological Research 4(1): 1-13. doi: 10.1186/s42483-022-00126-0.
Nicholson, P., Simpson, D.R., Wilson, A.H., Chandler, E. and Thomsett, M. 2004. Detection and differentiation of trichothecene and enniatin-producing Fusarium species on small grain cereals. European Journal of Plant Pathology 110: 503-514. doi: 10.1023/B:EJPP.0000032390.65641.a7.
Pang, N., Sun, J., Che, S. and Yang, N. 2022. Structural characterization of fungus-specific histone deacetylase Hos3 provides insights into developing selective inhibitors with antifungal activity. Journal of Biological Chemistry 298(7): 102068. doi: 10.1016/j.jbc.2022.102068.
Pidroni, A., Faber, B., Brosch, G., Bauer, I. and Graessle, S. 2018. A class 1 histone deacetylase as a major regulator of secondary metabolite production in Aspergillus nidulans. Frontier in Microbiology 29: 2212. doi: 10.3389/fmicb.2018.02212.
Ranjan, K., Brandao, F.V., Morais, J., Muehlmann, L., Silva-Pereira, I., Bocca, A., Matos, L. and Pocas-Fonseca, M. 2021. The role of Cryptococcus neoformans histone deacetylase genes in the response to antifungal drugs, epigenetic modulators and to photodynamic therapy mediated by an aluminium phthalocyanine chloride nanoemulsion in vitro. Journal of Photochemistry and Photobiology 216: 112-131. doi: 10.1016/j.jphotobiol.2021.112131.
Reyes-Dominguez, Y., Boedi, S., Sulyok, M., Wiesenberger, G., Stoppacher, N., Krska, R. and Strauss, J. 2012. Heterochromatin influences the secondary metabolite profile in the plant pathogen Fusarium graminearum. Fungal Genetics and Biology 49: 39-47. doi: 10.1016/j.fgb.2011.11.002.
Rezaeian Doloei, R., Rezaee, S., Mirabolfathy, M., Zamanizadeh, H., Razavi, M. and Karami-Osboo, R. 2015. Genetic analysis of Deoxynivalenol and Nivalenol chemotypes of Fusarium graminearum on wheat in Iran. Applied Entomology and Phytopathology 83(1): 1-11.
Sanches-Torres, P. 2021. Molecular mechanisms underlying fungicide resistance in Citrus Postharvest Green Mold. Journal of Fungi 7(9): 783. doi: 10.3390/jof7090783.
Song, H., Shen, R., Liu, X., Yang, X. and Xie, K. 2023. Histone post-translational modification and the DNA damage response. Genes and Diseases 10(4): 1429-1444. doi: 10.1016/j.gendis.2022.04.002.
Tamame, M., Antequera, F.R., Villanueva, J. and Santos, T. 1983. High-frequency conversion to a "Fluffy" developmental phenotype in Aspergillus spp. by 5-Azacytidine treatment: Evidence for involvement of a single nuclear gene. Molecular and Cellular Biology. 3(12): 2287-2297. doi: 10.1128/mcb.3.12.2287-2297.1983.
Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J.C., Faircloth, B., Remm, M.G. and Rosen, S. 2012. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research 40(15): e115. doi: 10.1093/nar/gks596.
Villota-Salazar, N., Ramos-Garcia, V., Gonzales-Prieto, G. and Hernandez-Delgado, S. 2023. Effects of chemical inhibition of histone deacetylase proteins in the growth and virulence of Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. Revista Argentina de Microbiologia. 55(4): 296-306. doi: 10.1016/j.ram.2023.04.002.
Yao, G., Han, N., Zheng, H. and Wang, L. 2023. The histone deacetylase HstD regulates fungal growth, development, and secondary metabolite biosynthesis in Aspergillus terreus. International Journal of Molecular Science 24: 12569. doi:10.3390/ijms241612569.
Zhang, N., Yang, Z., Zhang, Z. and Liang, W. 2020. BcRPD3-mediated histone deacetylation is involved in growth and pathogenicity of Botrytis cinereal. Frontier in Microbiology 11: 1832. doi: 10.3389/Ffmicb.2020.01832.
Zutz, C., Gacek, A., Sulyok, M., Wanger, M., Strauss, J. and Rychli, K. 2013. Small chemical chromatin effectors alter secondary metabolite production in Aspergillus clavatus. Toxins 5: 1723-1741. doi: 10.3390/toxins5101723.
گیاهپزشکی کاربردی، جلد 13، شماره 1، سال 1403
اثرات ماده Trichostatin A، بازدارنده هيستون دی استیلاز، بر ریخت شناسی، کنیدیوم‌زایى و رشد رویشی Fusarium graminearum عامل بلایت فوزاريومي سنبله گندم
Effects of the histone deacetylase inhibitor Trichostatin A on morphology, conidiation and vegetative growth of Fusarium graminearum, the causal agent of wheat Fusarium head blight
شیوا امین1، سعید رضائی2*، امیر موسوی3 و حمیدرضا زمانی‌زاده4
دریافت: 3/4/1403 پذیرش: 21/6/1403
چکیده
استیلاسیون یکی از مکانیسم‌های مهم تنظیم بیان ژن در سطح پس از ترجمه می‌باشد که توسط آنزیم‌های هیستون استیل ترنسفراز و هیستون دی استیلاز کنترل می‌شود. آنزیم‌های هیستون دی استیلاز قارچی در بیماری‌زایی، پاسخ‌گویی به تنش‌های محیطی و تولید متابولیت‌های ثانویه اهمیت دارند. بنابراین در این مطالعه، اثرات احتمالی بازدارنده هیستون دی‌استیلازTrichostatin A (TSA) بر ریخت‌شناسی Fusarium graminearum، عامل بیماری بلایت فوزاریومی، مورد بررسی قرار گرفت. قارچ روی محیط‌کشت سیب‌زمینی-دکستروز-آگار حاوی TSA (5/1، سه و 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر) کشت و سپس رشد رویشی و ریخت‌شناسی آن در روزهای سوم، پنجم و هفتم پس از کشت ارزیابی شد. رشد شعاعی قارچ پس از سه روز در حضور TSA کاهش یافت. کمترین میزان رشد ریسه‌ها نسبت به شاهد، در روز هفتم در محیط کشت حاوی 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر از TSA رخ داد. بهعلاوه، TSA موجب القای رشد ریسه‌های هوایی قارچ شد. در آزمون کنیدیومزایی، مقایسه تیمار با شاهد نشان دهنده کاهش تولید کنیدیوم در پاسخ به تمام غلظت‌های TSA بود. کمترین میزان کنیدیومزایی در حضور 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر از ماده بازدارنده اتفاق افتاد. نتایج نشان دهنده نقش تغییرات اپی ژنتیکی در تنظیم بیان ژنهای F. graminearum می‌باشند و ممکن است در ارائه راهکارهای جدید برای مدیریت بیماری بلایت فوزاریومی کمک کنند.
واژگان کلیدی: اپی‌ژنتیک، دی‌استیلاسیون، کروماتین، Triticum aestivum، TSA
مقدمه
در سلول‌های یوکاریوت، اطلاعات ژنتیکی علاوه بر فاکتورهای نسخه‌برداری و توالی‌های تنظیمی در پروموتور ژن‌ها، توسط کروماتین نیز کنترل می‌شوند (Liu et al., 2022). کروماتین از DNA و کمپلکس‌های پروتئینی به نام نوکلئوزوم تشکیل شده است. دو تا از چهار هسته هیستونی H2A، H2B، H3 و H4 در یک اوکتامر قرار می‌گیرند و همراه با 147 جفت باز DNA تشکیل یـک نوکلئـوزوم می‌دهـند. تغییـرات پـس از ترجـمه هیسـتون‌ها که در اثـر تحـریکـات درون و بـرون سـلولی آغـاز
1- دانشجوی دکتری، گروه گیاهپزشکی، واحد علوم و تحقیقات تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
2 و 4- به ترتیب استادیار و استاد، گروه گیاهپزشکی، واحد علوم و تحقیقات تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
3- دانشیار، گروه زيست فناوری مولکولی گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران
نویسنده مسئول مکاتبات: srezaee@srbiau.ac.ir
می‌شوند در بسیاری از فعالیت‌های زیسـتی دخیل بوده و ارتباط نزدیـکی با نـسخه‌بـرداری ژن، تکـثیر DNA، تـراکم کروماتین و بازسازی آسیـب DNA دارند (Song et al., 2023). استـیلاسیون یکی از اشکال رایج تغیـیرات برگـشت‌پذیر هیـستونی در سطح پس از ترجمه می‌باشد که با فعالیت آنتاگونیستی آنزیم‌های Histone acetyltransferases (HATS) و Histone deacetylases (HDACS) کنترل می‌شود (Ranjan et al., 2021). مطـالعـات مخـتلف نشـان می‌دهـد کـه آنـزیم‌های HDACS از طریق اثرگذاری بر تنظیم فعالیت نسخه‌برداری ژن‌ها، در فرآیندهای متنوع زیستی قارچ‌ها شامل بقا، رشـد، بیـمـاری‌زایی و تـولیـد مـتابولیـت‌های مهم ماننـد توکسـین‌ها و آنتی‌بیوتیـک‌ها نقـش بارز و مـهمی را بر عـهده دارند (Hu et al., 2017). لذا ژنهای HDACS می‌توانند برای ترکیبات بازدارنده هیستون دی‌استیلاز بهعنوان گروهی از داروهای جدید برای درمان بیماری‌ها، هدف بسیار مناسبی باشند. این بازدارنده‌ها با اثرگذاری روی پروموتورها و افکتورهای پایین دست بهصـورت انتخابی، بیان ژن‌ها را تغـییر داده و مـوجب القـای آپوپتـوز، توقـف چرخـه سـلولی، توقف توسعه سلولی و تمایز می‌شوند (Furumai et al., 2001؛ Baidyaroy et al., 2002؛ Basimia et al., 2013؛ Brando et al., 2015؛ Bauer et al., 2016؛ Pidroni et al., 2018).
Trichostatin A یـک آنتـی‌بیوتیـک طبیـعی بـا فـعـالیت ضـد قارچی است که بهصورت تجاری از باکتری Streptomyces hygroscopicus جداسازی می‌شود (Gaikwad et al., 2015). این ماده با تقلید از لیزین و کلاته کردن اتم روی (Zn) از فعالیت آنزیم‌های هیستون دی‌استیلاز کلاس I و P جلوگیری می‌کند (Villota-Salazar et al., 2023). در گذشته دیده شده است که با اضافه کردن TSA به محیط‌کشت Aspergillus fumigatus، رشد و کنیدیومزایی قارچ با تأخیر انجام می‌شود (Bauer et al., 2016).
قارچ Schwabe [teleomorph: Giberella zeae (Schweinitz) Petch] Fusarium graminearum در سراسر جهان عامل مهم بیماری بلایت فوزاریومی سنبله در گندم می‌باشد (Alisaac and Mahlein, 2023). این قارچ نه تنها می‌تواند موجب کاهش 30 تا 70 درصدی محصول گندم شود، بلکه می‌تواند توکسین‌های بسیار خطرناکی همچون Deoxynivalenol (DON) و Nivalenol (NIV) را تولید کند که باعث بروز بیماری‌های جدی در انسان و دام می‌شوند (Rezaeian Doloei et al., 2015). ژنوم این قارچ فاقد ترانسپوزون فعال و حاوی کمتر از 5/0 درصد عناصر تکراری می‌باشد. همچنین این ژنوم دارای مناطق غنی از ژنهای منحصر به فردی است که در طول آلودگی میزبان، سطح بیان بالایی دارند. تعدادی از این ژن‌ها در واکنش‌های گیاه میزبان- قارچ بیمارگر درگیرند. این امر نشان می‌دهد که ساختار کروماتین و تغییرات آن در تنظیم بیان ژنهای مرتبط با آلودگی در این قارچ نیز نقش مهمی دارند (Li et al., 2011). در تحقیقات پیشین، ژنهای هیستون دیاستیلازی FTL1، HDF1 و HP1 در ژنوم F. graminearum شناسایی شدند و مشاهده گردید که با حذف آن‌ها تولیدمثل جنسی و غیرجنسی قارچ مختل می‌شود. همچنین در این جهش یافته‌ها میزان تولید DON کاهش یافت، در حالیکه میزان تولید Aurofusarin سه تا چهار برابر افزایش پیدا کرد (Ding et al., 2009؛ Li et al., 2011؛ Reyes-Dominguez et al., 2012). حذف ژن Hep1 در این گـونـه موجـب کاهش سـطح نسـخه‌بـرداری ژنهای Tri5 و Tri6 و در نتیـجه کاهـش تولـید توکسیـن DON می‌شود (Chen et al., 2019).
بنابراین با توجه به خسارت اقتصادی و بهداشتی بیماری بلایت فوزاریومی سنبله به محصول استراتژیک گندم، لزوم توسعه سموم زیستی جدید و مؤثر و توانایی تغییرات اپی‌ژنتیکی در مدیریت بیماری‌ها، باروری، بهره‌وری و سازگاری محیطی سلـول‌های یوکاریـوتیک (Ibeagha-Awemu et al., 2022)، در این تحقیـق به بررسـی اثرات احتـمالی TSA (دارای پتـانسـیل معرفی شدن بهعنوان یک ترکیب زیستی ضد قارچی) روی رشد، کنیدیومزایی و ریخت‌شناسی قارچ عامل این بیماری پرداخته شد.
مواد و روش‌ها
جدایه‌های قارچی و شرایط کشت
پانزده جدایه قارچ F. graminearum از کلکسیون قارچ شناسی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات تهران تهیه گردیدند. به منظور تأیید شناسایی مولکولی گونه، جدایه‌ها پس از تک اسپور شدن، روی محیط‌کشت سیب‌زمینی-دکستروز-آگار کشت و به مدت هفت روز در دمای 25 درجه سلسیوس داخل انکوباتور قرار گرفتند.
شناسایی گونه Fusarim graminearum به روش مولکولی
ابتدا قرص‌هایی به قطر پنج میلی‌متر از حاشیه کشت سه روزه جدایه‌ها برداشته و روی محیط‌کشت سیب‌زمینی-دکستروز-آگار قرار داده شدند. تشتک‌های پتری به مدت هفت روز در انکوباتور با دمای 25 درجه سلسیوس قرار گرفتند. ریسه‌های قارچ در هاون سترون به کمک ازت مایع پودر شدند. سپس DNA ژنومی از ریسه‌های پودر شده با استفاده از روش مبتني بر CTAB (Brandfass and Karlovsky, 2008) استخراج گرديد. واكنش زنجيره‌ای پليمراز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی Fg16F و Fg16R (Nicholson et al., 2004) در دستگاه Thermal Cycler مدل T100 ساخت Bio-Rad (California, USA) مطابق 30 چرخه حرارتی، شامل 30 ثانیه در 94 درجه سلسیوس، 30 ثانیه در 54 درجه سلسیوس و یک دقیقه در 72 درجه سلسیوس و سپس پنج دقیقه در 72 درجه سلسیوس، انجام شد. برای هر نمونه، واکنش زنجيره‌ای پليمراز سه بار تکرار شد. محصول واکنش روی ژل آگارز یک درصد بارگذاری و با استفاده از الکتروفورز جداسازی شد. جهت بررسی اندازه قطعات از نشانگر مولکولی 100 جفت باز (Thermo Scientific, USA) استفاده گردید. رنگ آمیزی محصول واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با رنگ اتیدیوم بروماید صورت گرفت و سپس عکس‌برداری زیر نور UV در دستگاه ژل داک (Bio-Rad, USA) انجام شد.
بررسی وجود ژن HDAC در جدایه‌ها و انتخاب جدایه برای بررسیهای بعدی
با توجـه به نقـش ژن‌هـای هیستـون دی‌استـیلاز در فرآینـدهای زیـسـتی قارچ‌هـا، در ایـن پژوهش برای تأیید وجود ژن HDAC در جـدایـه‌های F. graminearum و انتـخـاب جدایـه مناسـب برای بررسی اثـرات احتمالی TSA بر ویژگی‌های مورد نظر قارچ، ابتدا آغازگرهای اختصاصی به شرح زیر بر اساس ترادف ژن مورد نظر (شماره دسترسی: NC_026474) در پایگاه NCBI و با استفاده از نـرم‌افزارهـای MEGA X و Primer3 (v.0.4.0) طراحی شدند (Untergrasser et al., 2012؛ Elias-Villalobos et al., 2015 ):
HDAC-Forward: 5’-GCGACGACATTCGTGTTGAG-3’
HDAC-Reverse: 5’-TCTGGCGTGACTTTTTGCAG-3’
سپس واکنش زنجيره‌ای پليمراز شامل 30 ثانیه در 94 درجه سلسیوس و سپس 30 چرخه حرارتي با 30 ثانیه در 95 درجه سلسیوس، 30 ثانیه در 55 درجه سلسیوس و یک دقیقه در 72 درجه سلسیوس و در انتها، سه دقیقه در 72 درجه سلسیوس انجام شد. برای هر نمونه، واکنش زنجيره‌ای پليمراز سه بار تکرار و محصول آن روی ژل آگارز یک درصد الکتروفورز شد.
آمادهسازی و بررسی اثر غلظت‌های TSA بر رشد شعاعی قارچ
در ایـن تـحـقـیـق از (TSA) Trichostatin A بـه شـمــاره کــالانــمــای T8552، تــولــیــد شــده تـوســط Sigma-Aldrich (St. Louise, USA)، استفاده گردید. طبق توصـیه شـرکـت سـازنــده و بـا تـوجـه بـه جـرم مولکولی TSA ( g mol-14/302)، میزان 333/3 میلی‌لیتر از حلال Dimethyl sulphoxide (DMSO) به ویال یک گرمی TSA تزریق و محلول پایه در دمای 20- درجه سلسیوس نگهداری شد.
به منظور ارزیابی اثر TSA بر رشد شعاعی قارچ، غلظت‌های 5/1، 3 و 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر از این ماده با استناد به پژوهش انجام شده توسط براندو و همکاران (Brando et al., 2015) انتخاب شدند. سپس با توجه به حجم محیط کشت پایه (45 میلی‌لیتر محیط‌کشت سیب‌زمینی-دکستروز-آگار) و غلظت مورد نظر، مقدارهای مناسبی از محلول پایه TSA و همچنین حلال DMSO (بهعنوان شاهد) محاسبه و به محیط کشت‌ها در دمای 50 درجه سلسیوس اضافه شدند. محیط‌کشت‌های آماده شده بین تشتک‌های پتری سترون تقسیم شدند. برای هر غلظت سه تکرار در نظر گرفته شد. جهت بررسی دقیق‌تر تغییرات، سه تشتک پتری شاهد فاقد DMSO نیز تهیه شدند. سپس قرص‌هایی به قطر پنج میلی‌متر از حاشیه کشت سه روزه جدایه منتخب برداشته و روی محیط‌کشت‌های مذکور قرار داده شدند. تشتک‌های پتری در دمای 25 درجه سلسیوس در انکوباتور نـگـهـداری شـدند. در روزهـای سـوم، پنجـم و هفتم پس از کشـت، رشـد شعاعی جدایه مذکور انـدازه‌گیری شد (Brando et al., 2015) و سپس درصد تغییرات رشد آن در هر روز نسبت به شاهد فاقد DMSO (با توجه به عدم تفاوت آن با شاهد حاوی DMSO) طبق فرمول زیر محاسبه گردید:
C: رشد شعاعی جدایه در تشتک شاهد T: رشد شعاعی جدایه در تشتک حاوی TSA
بررسی اثر غلظت‌های TSA بر ریخت‌شناسی قارچ
جهت تعیین اثر غلظت‌های مختلف TSA بر ریخت‌شناسی قارچ، قرص‌هایی به قطر پنج میلی‌متر از حاشیه کشت سه روزه آن برداشته و روی محیط‌کشت‌های سیب‌زمینی-دکستروز-آگار حاوی غلظت‌های 5/1، 3 و 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر از ماده TSA و DMSO، تهیه شده مطابق با روش ذکر شده، قرار داده شدند. جهت بررسی دقیق‌تر تغییرات، سه تشتک پتری شاهد فاقد DMSO نیز تهیه شدند. برای هر غلظت سه تکرار در نظر گرفته شد. تشتک‌های پتری به مدت هفت روز در دمای 25 درجه سلسیوس در انکوباتور نگهداری شدند. رشد قارچ در محیط کشت‌های حاوی غلظت‌های مختلف DMSOو فاقد DMSO، در روزهای سوم، پنجم و هفتم پس از کشت مورد مقایسه قرار گرفت. سپس با توجه به متفاوت نبودن رشد قارچ در محیط کشت‌های دارا و فاقد DMSO، این ویژگی در تشتک‌های پتری حاوی غلظت‌های مختلف TSA با تشتک‌های پتری حاوی غلظت‌های متناظر DMSO مقایسه شد (بصیرنیا، 1392).
بررسی اثر غلظت‌های TSA بر کنیدیومزایی قارچ
جهت تعیین اثر غلظت‌های مختلف TSA بر کنیدی‌زایی، ابتدا قارچ روی محیط‌کشت سیب‌زمینی-دکستروز-آگار به مدت سه هفته در دمای 25 درجه سلسیوس نزدیک نور UV قرار گرفت. سپس سوسپانسیون اسپور با غلظت 106 اسپور بر میلی‌لیتر تهیه شد. از این سوسپانسیون روی محیط‌کشت‌های سیب‌زمینی-دکستروز-آگار حاوی غلظت‌های 5/1، 3 و 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر از ماده TSA و DMSO کشت داده شد. جهت بررسی دقیق‌تر تغییرات، سه تشتک پتری شاهد فاقد DMSO نیز تهیه شدند. برای هر غلظت سه تکرار در نظر گرفته شد (بصیرنیا، 1392). تشتک‌های پتری به مدت سه هفته در دمای 25 درجه سلسیوس نزدیک نور UV قرار گرفتند. پس از گذشت 21 روز، یک میلی‌لیتر آب مقطر سترون به سطح تشتک‌ها اضافه شد. با استفاده از یک لوپ سترون سطح تشتک شسته و تعداد کنیدیومدر یک میلی‌لیتر از سوسپانسیون با استفاده از لام هماسیتومتر محاسبه گردید (رستمی و صارمی، 1397).
تجزیه و تحلیل آماری
برای تحلیل آماری داده‌های حاصل از بررسی اثر مقادیر مختلف TSA بر رشد شعاعی و کنیدیومزایی قارچ به ترتیب از نرم‌افزارهای SPSS و SAS استفاده شد. تجزیه واریانس بر اساس طرح کاملاً تصادفی در قالب فاکتوریل با دو فاکتور غلظت‌های مختلف TSA و روزهای اندازهگیری هر کدام در سه سطح انجام شد و میانگین‌ها با استفاده از آزمون چند دامنه‌ای دانکن در سطح احتمال یک درصد مقایسه شدند.
نتایج
شناسایی گونه F. graminearum به روش مولکولی
استفاده از آغازگرهاي اختصاصي گونه موجب تکثير قطعات هدف در محدوده 500-400 جفت بازي در تمامی جدایه‌ها گرديد که از طريق مقایسه آن با نتایج بهدست آمده در گذشته (Nicholson et al., 2004)، هویت تمامی جدایه‌ها بهعنوان گونه F. graminearum مورد تأیید قرار گرفت (شکل 1).
شکل 1- الگوي الکتروفورزي محصولات واکنش زنجيره‌ای پليمراز حاصل از جدایه‌های F. graminearum با استفاده از آغازگرهای اختصاصی Fg16F/Fg16R. L: نشانگر وزن مولکولي 100 جفت باز (Thermo Scientific, SM0243)؛ N: کنترل منفی (فاقد دیانای الگو)؛ 1-15: جدایه‌های مختلف F. graminearum
Fig. 1. Electrophoretic pattern of Polymerase Chain Reactions products for F. graminearum isolates using Fg16F/Fg16R primers. L: 100bp molecular weight marker (Thermo Scientific, SM0243); N: Negative control (without DNA template); 1-15: Different isolates of F. graminearum
تأیید وجود ژن HDAC در جدایه‌ها
با هدف تأیید وجود ژن HDAC در جدایه‌ها، تکثير اختصاصي قطعه هدف با اندازه 347 جفت باز از طريق واکنش زنجيره‌اي پليمراز در تمام 15 جدایه حاصل گرديد که نشاندهنده وجود ژن مورد نظر در جدایه‌ها بود (شکل 2). با توجه به حضور ژن HDAC در تمام جدایه‌ها، جدایه 13 برای انجام آزمون‌های بعدی انتخاب شد.
شکل 2- الگوي الکتروفورزي محصولات واکنش زنجيره‌ای پليمراز ژن HDAC در جدایه‌های F. graminearum.L : نشانگر وزن مـولـکـولي 100 جـفـت باز (Thermo Scientific, SM0243)؛ N: کنترل مـنـفی (فاقد دياناي الـگـو)؛ 15-1: جدایـه‌هـای مـخـتلف F. graminearum
Fig. 2. Electrophoretic pattern of Polymerase Chain Reactions products for HDAC gene in F. graminearum isolates. L: 100 bp molecular weight marker (Thermo Scientific, SM0243); N: Negative control (without DNA template); 1-15: Different isolates of F. graminearum
بررسی اثر غلظت‌های TSA بر رشد شعاعی قارچ
در جدول تجزیه واریانس (جدول 1) دیده می‌شود که چون مقدار صفر برای متغیر غلظت از مقدار 01/0 کمتر است، فرض صفر مبنی بر برابر بودن اثر بازدارندگی غلظت‌های 5/1، 3 و 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر از TSA روی رشد شعاعی قارچ رد شده است. به عبارت دیگر واکنش قارچ به غلظت‌های مذکور متفاوت بوده است. همچنین چون مقدار 015/0 برای متغیر زمان از مقدار 01/0 کمتر است، فرض صفر مبنی بر برابر بودن اثر زمان بر رشد شعاعی F. graminearum مردود گردیده است. بنابراین واکنش قارچ در پاسخ به زمان‌های در نظر گرفته شده یکسان نبوده است. در بررسی نتایج اثر تعاملی بین زمان و غلظت، تفاوت معنیداری وجود نداشت (01/0 Sig>) و اثر متقابل بین این دو فاکتور اثبات نشد.
جدول 1- تجزیه واریانس رشد شعاعی F. graminearum در محیط‌کشت حاوی 5/1، 3 و 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر از ماده Trichostatin A در روزهای سوم، پنجم و هفتم پس از کشت
Table 1. Analysis of variance for radial growth changes of F. graminearum in culture medium containing 1.5, 3, and 10 µg mL-1 of Trichostatin A on days 3, 5, and 7 after inoculation
معنیداری Sig. | آزمون F FF-static | میانگین مربعات Mean square | درجه آزادی df. | مجموع مربعات Sum of squares | منبع Source |
0.000 | 26.878 | 5.662 | 2 | 11.324 | Day روز |
0.015 | 4.652 | 0.980 | 2 | 1.960 | Concentrationغلظت |
0.858 | 0.327 | 0.069 | 4 | 0.276 | Concentration×Day روز×غلظت |
|
| 0.211 | 45 | 9.480 | Errorخطا |
|
|
| 53 | 23.040 | Total مجموع |
a. R Squared = .589 (Adjusted R Squared = .515) | |||||
مقایسه روند بازدارندگی TSA در غلظت‌های 5/1، 3 و 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر (شکل 3) نشان داد که این ماده اثر بازدارندگی خود را از روز سوم به بعد بر رشد شعاعی قارچ اعمال کرده است. در روز سوم در مقایسه با شاهد، غلظت 5/1 میکروگرم بر میلی‌لیتر از ماده TSA، بیشترین اثر بازدارندگی را از خود نشان داد و رشد شعاعی قارچ حدود 7 درصد بود. در حالیکه رشد شعاعی میسیلیوم‌ها در حضور غلظت 3 میکروگرم بر میلی‌لیتر از ماده TSA در حدود 30 درصد و در غلظت 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر در حدود 10 درصد بود.
شکل 3- درصد تغییر رشد شعاعی ریسه F. graminearum نسبت به شاهد در پاسخ به غلظت‌های مختلف Trichostatin A
Fig. 3. Percentage change in the radial growth of F. graminearum hyphae in response to varying concentrations of Trichostatin A, compared to the control
از روز سوم تا پنجم، رشد شعاعی قارچ در پاسخ به حضور هر سه غلظت TSA در محیط‌کشت، نسبت به شاهد، کاهش یافت. اگرچه در طی مدت زمان ذکر شده کاهش میزان رشد شعاعی میسیلیوم در غلظت‌های 5/1 و 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر با شیب تندی رخ داد، در غلظت 3 میکروگرم بر میلی‌لیتر روند کاهش بهصورت تدریجی بود. در روز پنجم، TSA همچنان در غلظت 5/1 میکروگرم بر میلی‌لیتر، نسبت به دو غلظت دیگر دارای بیشترین اثر بازدارندگی روی رشد شعاعی قارچ بود. در این روز، رشد شعاعی ریسه‌ها در غلظت 5/1 میکروگرم بر میلی‌لیتر تقریباً متوقف گردید ولی در غلظت‌های 3 و 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر از TSA به ترتیب در حدود 55 و 15 درصد بود.
از روز پنجم تا هفتم، همچنان رشد شعاعی میسیلیوم‌های قارچ در غلظت‌های 3 و 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر از TSA کاهش یافت. اما در طی این زمان، غلظت 5/1 میکروگرم بر میلی‌لیتر از ماده بازدارنده باعث شد که رشد شعاعی ریسه‌ها کمی روند افزایشی پیدا کند و در روز هفتم، نسبت به شاهد، به حدود 10 درصد برسد. همچنین در روز هفتم، TSA در غلظت 3 میکروگرم بر میلی‌لیتر دارای کمترین و در غلظت 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر دارای بیشترین اثر مهارکنندگی روی رشد شعاعی قارچ بود.
بررسی اثر غلظت‌های TSA بر ریخت‌شناسی قارچ
با بررسی پرگنه‌ها روی محیط‌کشت‌های شاهد و تیمار در روزهای سـوم، پنجم و هـفتم پس از کـشت، دیده شـد کـه در حضـور غلـظت 10 میکروگـرم بر میلـی‌لیتر از مـاده بازدارنده TSA، تراکـم ریسـه‌های هوایـی نسبت به شاهد بیشتر است (شکل 4).
شکل 4- تأثیر Trichostatin A (10 میکروگرم بر میلی‌لیتر) بر خصوصیات ریخت‌شناسی F. graminearum در روز پنجم پس از کشت. A: شاهد (فاقد DMSO)، B: شاهد (دارای DMSO)، C: تیمار
Fig. 4. Effects of Trichostatin A (10 µg mL-1) on F. graminearum morphology characters on the fifth day after inoculation. A: Control (without DMSO), B: Control (with DMSO), C: Treatment
بررسی اثر غلظت‌های TSA بر کنیدیومزایی قارچ
تجزیه واریانس داده‌های مربوط به کنیدیومزایی مشخص کرد که بین غلظت‌های مختلف TSA در سطح احتمال یک درصد تفاوت معنیدار وجود دارد. مقایسه میانگین‌ها با استفاده از آزمون دانکن نشان داد که غلظت‌های مورد بررسی درگروه‌های مختلف A، AB، BC، CD و D قرار گرفتند.
در شکل 5 نیز اثر غلظت‌های متفاوت TSA بر کنیدیومزایی قارچ در مقایسه با شاهد حاوی DMSO نشان داده شده است. هرچند که در تشتک‌های حاوی DMSO کنیدیومزایی نسبت به تشتک‌های فاقد DMSO کاهش یافته بود (در نمودار نشان داده نشده است) اما بر اساس شکل، قدرت کنیدیومزایی F. graminearum در محیط‌کشت‌های حاوی TSA در مقایسه با شاهد حاوی DMSO نیز کاهش یافته است و کمترین میزان اسپور‌زایی در حضور TSA با غلظت 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر رخ داد. مقایسه کنیدیومزایی این گونه در تشتک‌های شاهد حاوی DMSO و سایر تیمارها نشان داد که در این آزمایش، غلظت 10 میکروگرم بر‌میلی‌لیتر TSA در جلوگیری از کنیدیومزایی مؤثرتر بود.
شکل 5- اثر غلظت‌های مختلف Trichostatin A بر کنیدیومزایی F. graminearum. DMSO: Dimethyl sulfoxide (شاهد)، TSA: Trichostatin A (تیمار)
Fig. 5. Effects of different Trichostatin A concentrations on F. graminearum conidiation. A-D: Statistical significance groups. DMSO: Dimethyl sulfoxide (Control), TSA: Trichostatin A (Treatment)
بحث
استفاده بی‌رویه و مداوم از قارچکش‌ها در کشاورزی جهت تضمین تولید محصولات سالم و با کیفیت منجر به ظهور جدایه‌های مقاوم در قارچهای بیماری‌زای گیاهی شده است که نسـبت به سموم شیمیایی حسـاسـیت کمتری را نشان می‌دهند. برای گریز از این امر و مقابله با چالش امنیت غذایی، توسعه ترکیبات ضد قارچی طبیعی و مؤثر که آنزیم‌ها و فاکتورهای بیماری‌زایی مهمی را در بیمارگر مورد هدف قرار دهند، بدون این که در میزبان گیاهی اثر منفی ایجاد کنند، ضروری به نظر می‌رسد (Brauer et al., 2020؛ Sanches-Torres, 2021).
مطالعات گوناگون نشان داده است در قارچ‌ها استیلاسیون پروتئین‌ها بهصورت گسترده انجام شده و فرآیندهای چندگانه سلولی و تمام چرخه سلولی را تحت تأثیر قرار می‌دهد. همچنین بیان شده است که بازداری از عملکرد ژنهای HDACs می‌تواند دارای اثـرات مثبت و هم افزایشی مانند کاهش بیماری‌زایی، رشد یا کاهش مقاومت به داروهای ضد قارچی ایجاد کند (Pang et al., 2022). اولین بار در سال 2001 نقش HDACS در بیماری‌زایی قارچ‌ها مشخص گردید و اینطور بیان شد که حذف ژن HDC1 در قارچCochliobolus carbonum منجر به کاهش بیان دی‌پلیمرازهای خارج سلولی و در نتیجه کاهش بیماری‌زایی روی ذرت می‌شود (Bauer et al., 2016). در سال‌های بعد عملکرد این ژن‌ها در سایر گونه‌های قارچی نیز مورد بررسی قرار گرفت. بهعنوان مثال در گونه Magnaport oryzae دو ژن MoRpd3 و MoHst4 شناسایی شدند که در تنظیم رشد ریسه‌ها، توسعه غیرجنسی و بیماری‌زایی مشارکت داشتند (Lin et al., 2021).
در تحقیق حاضر به بررسی اثرات احتمالی ماده TSA بر رشد، ریخت‌شناسی و کنیدیومزایی قارچ F. graminearum پرداخته شد. نتایج نشان دادند که TSA بر خصوصیات این گونه اثر می‌گذارد، ولی عملکرد آن کاملاً تحت تأثیر زمان و غلظت مورد استفاده قرار دارد. در محیط‌کشت سیب‌زمینی-دکستروز-آگار حاوی ماده بازدارنده TSA، رشد شعاعی ریسه‌ها در مقایسه با شاهد کاهش یافت. در حضور TSA با غلظت 5/1 میکروگرم بر میلی‌لیتر، رشد شعاعی قارچ در روزهای سوم و پنجم، نسبت به شاهد، بسیار کند بود ولی از روز پنجم به بعد کمی افزایش یافت. این افزایش رشد شاید نشان دهد که نیمه عمر ماده بازدارنده در محیط‌کشت سیب‌زمینی-دکستروز-آگار با گذشت زمان کاهش می‌یابد. محققین مشاهده کرده‌اند بوتیرات که امروزه بهعنوان یک داروی ضد سرطان استفاده می‌شود، نیز در بیماران دارای نیمهعمر کوتاه می‌باشد (Zutz et al., 2013). در روزهای مورد بررسی، غلظت 3 میکروگرم بر میلی‌لیتر از TSA دارای کمترین اثر مهارکنندگی بر رشد شعاعی میسیلیوم‌های F. graminearum بود. شاید بتوان نتیجه گرفت که در این پژوهش، غلظت 3 میکروگرم بر میلی‌لیتر از TSA، غلظت آستانه تحریککننده نمی‌باشد. همچنین در این تحقیق مشاهد گردید که بیشترین اثر بازدارندگی TSA روی رشد شعاعی قارچ مربوط به غلظت 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر در روز هفتم پس از کشت بوده است. این امر شاید نشان دهد که TSA در غلظت 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر دارای اثر مهارکنندگی قوی است اما برای بروز اثر خود نیاز به گذشـت زمان دارد. یافتـه‌های حاصل از بررسی اثرات TSA بر رشد شعاعی قارچ با مطالعات گذشته همسو می‌باشد. بهعنوان مثال، در مـحیط‌کـشت سـیب‌زمینی-دکستروز-آگار در حضور ماده بازدارنده Dihydrocomarin، رشد پرگنه قارچ M. ruber روند کاهشی از خود نشان داد (Hu et al., 2017). در قارچ F. pseudograminearum حذف ژن FpDeP1 بهعنوان عضوی از کمپلکس هیستون دیاستیلازی Rpd3L، منجر به اخـتلال در فعالـیت درون‌بـری سلولی، تولید گونه‌های اکسیـژن فعال در مـراحل اولیه آلـودگی، کاهش رشد رویشی و کاهـش تشکیل ریسه‌های هوایی در محیط‌کشت سیب‌زمینی-دکستروز-آگار پس از سه روز شد (Zhang et al., 2020). خاموشی ژن cgHos2 در Colletotrichum gloeosporioides، کاهش رشد رویشی و تحمل نسبت به تنش‌ها و تولید کنیدیوم‌های غیر‌طبیعی را به همراه داشت. بهعلاوه به دلیل نقش مـؤثر و مـهم cgHos2 در بیوسنتز ملانین، در جدایه‌های جهش یافته با کـاهش سـطح سنتز مـلانین قـدرت تـشکیل اپـرسـوریوم و بیـمـاری‌زایی کاهـش یـافت (Liu et al., 2022). همچنین مشاهـده شـده اسـت که اسـتفاده از TSA باعـث کاهش رشـد رویـشی، تـولیـد رنگـدانه و انـدازه مـیـکـرواسـکلـروت‌های قـارچ Macrophomina phasseolina در مـحیـط کشـت جـامد نسـبت به شـاهد می‌گـردد (Villota-Salazar et al., 2023).
آزمون کنیدیومزایی در مطالعه حاضر نشان داد که تولید مـثـل غیرجنسی F. graminearum در محیط‌کشت سیب‌زمینی-دکستروز-آگار حاوی TSA نسبت به شاهد کاهش یافت. کمترین میزان تولید کنیدیوم در غلظت 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر از ماده TSA رخ داد؛ لذا ممکن است در غلظت بالای TSA (10 میکروگرم بر میلی‌لیتر)، ماده به جای اثرگذاری مستقیم بر کنیدیومزایی بر زیستایی قارچ اثر گذاشته باشد. بدیهی است درستی این گمان نیاز به مطالعات بیشتر و کامل‌تر دارد. مشاهدات مشابه نتایج بهدست آمده در این آزمون را پشتیبانی می‌کند. محققین مشاهده کردند که در محیط کشت سـیب‌زمیـنی-دکسـتروز-آگـار حـاوی غلـظـتهای دو مـیـکـرومول، 10 میکـرومول و 50 مـیکـرومول از تـرکیـب بـازدارنده Suberanilohydroxamic acid (SAHA)، کمترین میزان تولـید کنـیدی گـونه A. flavus متـعـلق بـه غـلـظت 50 میکرومول بوده است. دلیل این امر به کاهش بیان ژنهای هیستـون دیاستیلازی HosA، HosB و Rpd1 نسـبت داده شد (Basimia et al., 2013). جهش ژنهای HOS2 و HDA1 باعث کاهش نرخ کنیدیومزایی و رشد در جدایه‌های M. oryzae روی محیط‌کشتOatmeal agar ،Yeast glucose agar و Yeast glucose می‌شـود (Izawa et al., 2009). تیمـار جدایه‌های A. fumigatus توسط بازدارنده هیستون دی‌استیلاز TSA موجب کاهش تعداد کنـیدیوم‌ها بـه دلـیل تحـت تـأثـیر قرار گرفتن ژن Rpd3 گردید (Bauer et al., 2016). همچنین حذف ژن NAD+-dependent histone deacetylase (HstD) در گـونه Aspergillus terreus هـمراه با کـاهـش کنیـدیـوم‌زایـی، رشـد رویـشی و منشـعـب شدن ریـسه‌ها نسـبت بـه شاهد بود (Yao et al., 2023).
در بررسی تأثیر TSA بر ریخت‌شناسی F. graminearum دیده شد که این ماده موجب افزایش تراکم ریسه‌های هوایی قارچ در محیط‌کشت سیب‌زمینی-دکستروز-آگار می‌شود. این احتمال وجود دارد که TSA روی ژن مسئول تمایز سلولی ریسه‌ها اثر گذاشته و موجب ظهور فنوتیپی شبیه به فنوتیپ Fluffy شده باشد. در فنوتیپ Fluffy، ریسه‌های تمایز نیافته، بلند و غیرکنیدی‌زا تشکیل می‌شوند که روی ریسه‌های کوتاه کـنیدیوم‌زا را می‌پوشانند (Tamame et al., 1983). ظهور فنوتیپ Fluffy در محیط‌کشت قارچ A. flavus در پاسخ به حضور ماده SAHA گزارش گردید (Basimia et al., 2013).
با توجه به مطالب ذکر شده، شاید بتوان نتیجه گرفت که در F. graminearumژن HDAC بهصورت مستقیم و غیرمستقیم از طریق دی‌استیلاسیون پروتئین‌های هیستونی یا غیرهیستونی موجب القای بیان ژنهای درگیر در رشد ریسه و تولید کنیدیوم می‌شود، زیرا آنزیم‌های دی‌استیلاز علاوه بر نقش کلاسیک خود در سرکوب بیان ژن‌ها، می‌تواند از طریق دی‌استیله کردن هیستون‌های استیله شده باعث القای نسخه‌برداری شوند. همچنین اثبات شده است که این آنزیم‌ها می‌توانند موجب تغییر پروتئین‌های غیرهیستونی مانند فاکتورهای نسخه‌برداری شوند (Pidroni et al., 2018). نتایج بهدست آمده می‌تواند نشان دهنده اهمیت پدیده استیلاسیون در بیان ژنهای F. geminearum باشد. داده‌های مولکولی بهدست آمده توسط نویـسندگان پژوهش پیشرو، نتایج ایـن مطـالعه را تأیـید کردند. در جدایه‌های F. geminearum بیان ژنهای HDAC و Tri5 (کد کننده Trichodiene synthase در مسیر سنتز تریکوتسن‌ها) در محیط‌کشت‌های مایع سیب‌زمینی-دکستروز-براث حاوی غلظت‌های 3 و 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر از TSA تغییر یافت. در این آزمون، اثر بازدارندگی TSA نیز تحت تأثیر غلظت و زمان قرار داشت (Amin et al., 2024).
نتیجه‌گیری کلی
بررسي و کنترل تغییرات پس از ترجمه هیستون‌ها در تنظیم بیان ژنهای قارچهای بیمارگر گیاهی در طول فرآیند آلوده‌‌سازی میزبان، زمینه‌ای در حال رشد است و هنوز در مراحل اولیه توسعه خود قرار دارد. نتایج این تحقیق گویای نقش احتمالی مکانیسم‌های اپی‌ژنتیکی در تنظیم بیان ژنهای بیماری‌زایی گونه F. graminearum می‌باشد. این مطالعه شاید بتواند منجر به افزایش اطلاعات لازم برای تولید سموم زیستی جدید جهت کنترل بیماری بلایت فوزاریومی سنبله گندم شود.
سپاسگزاری
این تحقیق نتایج بخشی از رساله دکتری نگارنده اول است که با حمایت مالی واحد علوم و تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی انجام شده است. همچنین از زحمات آقای مهندس شهاب حاج منصور، مسئول آزمایشگاه بیماری شناسی گیاهی، مجتمع آزمایشگاهی زکریای رازی، واحد علوم و تحقیقات تهران، دانشگاه آزاد اسلامی قدردانی می‌گردد.
بصیرنیا، ط. 1392. مطالعه مولکولی و بیوشیمیایی نقش histone deacetylases در قارچ Aspergillus flavus عامل آلودگی پسته. پایاننامه دکتری، دانشکده کشاورزی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران، تهران. 151 صفحه.
رستمی، ا. و صارمی، ح. 1397. بررسی تأثیر عاملهای مؤثر در میزان تشکیل پروتوپلاست در قارچ F. oxysporum با هدف استفاده در امتزاج پروتوپلاست. دانش گیاهپزشکی ایران 49(1): 155-164.
Alisaac, E. and Mahlein, A.K. 2023. Fusarium head blight on wheat: Biology, modern detection and diagnosis and integrated disease management. Toxins 15(3): 192. doi: 10.3390/toxins15030192.
Amin, S., Rezaee, S., Mousavi, A. and Zamanizadeh, H. 2024. The histone deacetylase inhibitor Trichostatin-A modifies the expression of trichothecene mycotoxin regulatory gene Tri5 in Fusarium graminearum. Iranian Journal of Biotechnology 22(3): 90-100. doi: 10.30498/ijb.2024.437331.3872.
Baidyaroy, D., Brosch, G., Graessle, S., Trojer, D. and Walton, J. 2002. Characterization of inhibitor resistant histone deacetylase activity in plant pathogenic fungi. Eucaryotic Cell 1(4): 538-547. doi: 10.1128/EC.1.4.538-547.
Basimia, T., Rezaee, S., Zamanyzadeh, H. and Mousavi, A. 2013. SAHA, histone deacetylase inhibitor causes reduction of aflatoxin production and conidiation in the Aspergillus flavus. Iranian Journal of Biotechnology 3(12): 9-12.
Bauer, I., Varadarajan, D., Pidroni, A., Gross, S., Vergeiner, S., Faber, B., Hermann, M., Tribus, M., Brosch, G. and Graessle, S. 2016. A class 1 histone deacetylase with potential as an antifungal target. mBio 7(6): e00831-16. doi: 10.1128/mBio.00831-16.
Brandfass, C. and Karlovsky, P. 2008. Upscaled CTAB-Based DNA extraction and Real-Time PCR assays for Fusarium culmorum and F. graminearum DNA in plant material with reduced sampling error. International Journal of Molecular Science 9: 2306-2321. doi: 10.3390/ijms9112306.
Brando, F., Derengoski, L., Albuquerque, R., Nicola, A., Silva-Pereria, I. and Pocas-Fonseca, M.J. 2015. Histone deacetylases inhibitors effect on Cryptococcus neoformans major virulence phenotypes. Virulence 6(6): 618-30. doi: 10.1080/21505594.2015.1038014.
Brauer, E.K., Subramaniam, R. and Harris, L.J. 2020. Regulation and dynamics of gene expression during the life cycle of Fusarium graminearum. Phytopathology 110(8): 1368-1374. doi: 10.1094/PHYTO-03-20-0080-IA.
Chen, Y., Kistler, H.C. and Ma, Z. 2019. Fusarium graminearum trichothecene mycotoxins: biosynthesis, regulation, and management. Annual Review of Phytopathology 57: 15–39. doi: 10.1146/annurev-phyto-082718-100318.
Ding, S., Mehrabi, R., Koten, C., Kang, Z.,Wei, Y., Seong, K., Kistler, H. and Xu, J. 2009. Transducin Beta-like gene FTL1 is essential for pathogenesis in Fusarium graminearum. Eucaryotic Cell 8(6): 867-876. doi:10.1128/EC.00048-09.
Elias-Villalobos, A., Fernandez-Alvarez, A., Moreno-Sanchez, I., Helmlinger, D.I. and Ibeas, J. 2015. The Hos2 histone deacetylase controls Ustilago maydis virulence through direct regulation of mating-type genes. Pathogens 11(8): e1005134. doi: 10.1371%2Fjournal.ppat.1005134.
Furumai, K., Komatu, Y., Nishino, N., Khochbin, S., Yoshida, M. and Horinouchi, S. 2001. Potent histone deacetylase inhibitors built from Trichostatin A and cyclic tetrapeptide antibiotics inducing Trapoxin. PANS 98(1): 87-92. doi: 10.1073/pnas.98.1.87.
Gaikwad, A., Sagar, V. and Pandey, A. 2015. Natural HDAC Inhibitors: Nature’s answer to the cancer. Journal of Pharmaceutical Science and Technology 1(1): 26-36.
Hu, Y., Zhou, Y., Mao, Z., Chen, F. and Shao, Y. 2017. NAD+-dependent HDAC inhibitor stimulates Monascus pigment production but inhibits citrinin. AMB Express 7(1): 166. doi:10.1186/s13568-017-0467-1.
Ibeagha-Awemu, E.M., Kiefer, H., Mckay, S.E. and Liu, G. 2022. Editorial: Epigenetic variation influences on livestock production and disease traits. Frontiers in Genetic 13: 942747. doi: 10.3389/fgene.2022.942747.
Izawa, M., Takekawa, O., Arie, T., Teraoka ,T., Yoshida, M., Kimura, M. and Kamakura, T. 2009. Inhibition of histone deacetylase causes reduction of appressorium formation in the rice blast fungus Magnaport oryzae. Journal of General and Applied Microbiology 55: 489-498. doi.org/10.2323/jgam.55.489.
Li, Y., Wang, C., Liu, W., Wang, G., Kang, Z., Kistler, H. and Xu, J. 2011. The HDF1 histone deacetylase gene is important for conidiation, sexual reproduction, and pathogenesis in Fusarium graminearum. Molecular Plant Microbe Interactions 24(4): 487-496. doi: 10.1094/MPMI-10-10-0233.
Lin, C., Cao, X., Qu, Z., Zhang, S., Naqvi, N. and Deng, Y. 2021. The histone deacetylases MoRpd3 and MoHst4 regulate growth, conidiation, and pathogenicity in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. mSphere 6: e00118-21. doi: 10.1128/mSphere.00118-21.
Liu, S., Wang, Q., Liu, N., Luo, H., He, C. and An, B. 2022. The histone deacetylase Hos2 controls pathogenicity through regulation of melanin biosynthesis and appressorium formation in Colletotrichum gloeosporioide. Phytopathological Research 4(1): 1-13. doi: 10.1186/s42483-022-00126-0.
Nicholson, P., Simpson, D.R., Wilson, A.H., Chandler, E. and Thomsett, M. 2004. Detection and differentiation of trichothecene and enniatin-producing Fusarium species on small grain cereals. European Journal of Plant Pathology 110: 503-514. doi: 10.1023/B:EJPP.0000032390.65641.a7.
Pang, N., Sun, J., Che, S. and Yang, N. 2022. Structural characterization of fungus-specific histone deacetylase Hos3 provides insights into developing selective inhibitors with antifungal activity. Journal of Biological Chemistry 298(7): 102068. doi: 10.1016/j.jbc.2022.102068.
Pidroni, A., Faber, B., Brosch, G., Bauer, I. and Graessle, S. 2018. A class 1 histone deacetylase as a major regulator of secondary metabolite production in Aspergillus nidulans. Frontier in Microbiology 29: 2212. doi: 10.3389/fmicb.2018.02212.
Ranjan, K., Brandao, F.V., Morais, J., Muehlmann, L., Silva-Pereira, I., Bocca, A., Matos, L. and Pocas-Fonseca, M. 2021. The role of Cryptococcus neoformans histone deacetylase genes in the response to antifungal drugs, epigenetic modulators and to photodynamic therapy mediated by an aluminium phthalocyanine chloride nanoemulsion in vitro. Journal of Photochemistry and Photobiology 216: 112-131. doi: 10.1016/j.jphotobiol.2021.112131.
Reyes-Dominguez, Y., Boedi, S., Sulyok, M., Wiesenberger, G., Stoppacher, N., Krska, R. and Strauss, J. 2012. Heterochromatin influences the secondary metabolite profile in the plant pathogen Fusarium graminearum. Fungal Genetics and Biology 49: 39-47. doi: 10.1016/j.fgb.2011.11.002.
Rezaeian Doloei, R., Rezaee, S., Mirabolfathy, M., Zamanizadeh, H., Razavi, M. and Karami-Osboo, R. 2015. Genetic analysis of Deoxynivalenol and Nivalenol chemotypes of Fusarium graminearum on wheat in Iran. Applied Entomology and Phytopathology 83(1): 1-11.
Song, H., Shen, R., Liu, X., Yang, X. and Xie, K. 2023. Histone post-translational modification and the DNA damage response. Genes and Diseases 10(4): 1429-1444. doi: 10.1016/j.gendis.2022.04.002.
Tamame, M., Antequera, F.R., Villanueva, J. and Santos, T. 1983. High-frequency conversion to a "Fluffy" developmental phenotype in Aspergillus spp. by 5-Azacytidine treatment: Evidence for involvement of a single nuclear gene. Molecular and Cellular Biology. 3(12): 2287-2297. doi: 10.1128/mcb.3.12.2287-2297.1983.
Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J.C., Faircloth, B., Remm, M.G. and Rosen, S. 2012. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research 40(15): e115. doi: 10.1093/nar/gks596.
Villota-Salazar, N., Ramos-Garcia, V., Gonzales-Prieto, G. and Hernandez-Delgado, S. 2023. Effects of chemical inhibition of histone deacetylase proteins in the growth and virulence of Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. Revista Argentina de Microbiologia. 55(4): 296-306. doi: 10.1016/j.ram.2023.04.002.
Yao, G., Han, N., Zheng, H. and Wang, L. 2023. The histone deacetylase HstD regulates fungal growth, development, and secondary metabolite biosynthesis in Aspergillus terreus. International Journal of Molecular Science 24: 12569. doi:10.3390/ijms241612569.
Zhang, N., Yang, Z., Zhang, Z. and Liang, W. 2020. BcRPD3-mediated histone deacetylation is involved in growth and pathogenicity of Botrytis cinereal. Frontier in Microbiology 11: 1832. doi: 10.3389/Ffmicb.2020.01832.
Zutz, C., Gacek, A., Sulyok, M., Wanger, M., Strauss, J. and Rychli, K. 2013. Small chemical chromatin effectors alter secondary metabolite production in Aspergillus clavatus. Toxins 5: 1723-1741. doi: 10.3390/toxins5101723.
