بررسی هیستوپاتولوژیکی بافت¬های کلیه و قلب موش¬های صحرایی نر و ارزیابی آپوپتوزیس¬ در سلول¬های میوکارد متعاقب¬ ایسکمی– بازخونرسانی کلیوی وابسته به زمان
محورهای موضوعی : آسیب شناسی درمانگاهی دامپزشکی
مهبد باژبان
1
,
یوسف دوستار
2
,
میرعلیرضا نورآذر
3
1 - دانش¬آموخته دامپزشکی، دانشکده دامپزشکی، علوم پزشکی تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.
2 - دانشیار گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، علوم پزشکی تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.
3 - استادیار گروه علوم پایه، دانشکده دامپزشکی، علوم پزشکی تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.
کلید واژه: ایسکمی- بازخونرسانی, کلیه, قلب, موش¬صحرایی, آپوپتوزیس.,
چکیده مقاله :
آسیب ایسکمی- بازخونرسانی (Ischemia-Reperfusion; I/R) کلیه یکی از مهم‌ترین عوامل نارسایی حاد کلیوی و متعاقب آن آسیب به اندام‌های دیگر همچون قلب به شمار می‌رود. هدف از انجام مطالعه حاضر، بررسی وقوع آسیب و آپوپتوزیس در سلولهای بافت قلب متعاقب آسیب ایسکمی– بازخونرسانی کلیوی وابسته به زمان در موش صحرایی بود. بدین منظور 32 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار به طور تصادفی به 4 گروه مساوی تقسیم شدند. در گروه اول (Sham) فقط محل جراحی باز و بسته شد. در گروه دوم (30-I/R) پس از القاء ایسکمی کلیوی 30 دقیقه بعد، در گروه سوم (45-I/R) 45 دقیقه بعد و در گروه چهارم (60-I/R) 60 دقیقه بعد، عمل بازخونرسانی انجام شدند. پس از 24 ساعت همه حیوانات آسانکشی شده و از بافت کلیه و قلب آنها جهت انجام مطالعات ریزبینی، نمونه‌برداری شد. واکاوی آماري دادهها توسط آزمون تحلیل واریانس یکطرفه (ANOVA) و پسآزمون توكي (Tukey) انجام و مقادیر 05/0p<، معني‌دار تلقی شد. یافته‌های‌هیستوپاتولوژی، آسیب در بافت کلیه متعاقب I/R را بهشکل تغییرات دژنراتیو و نکروز توبولهای پروگزیمال و دیستال، آسیبهای گلومرولی و بافت بینابینی به صورت وابسته به زمان نشان داد. همچنین I/R منجر به آسیب در بافت قلب حیوانات همه گروهها شامل تغییرات دژنراتیو، نکروز و آپوپتوزیس کاردیومیوسیتها شد، اما شدت آسیب بافتی و آپوپتوز کاردیومیوسیتها در موشهای گروه 60-I/R به طور معنیداری بیشتر از سایر گروهها بود (05/0p<). نتایج مطالعه حاضر نشان داد که با کاهش مدت زمان ایسکمی در کلیه، آسیب خود بافت کلیه، بافت قلب و آپوپتوزیس کاردیومیوسیتها کمتر خواهد بود.
Kidney ischemia-reperfusion injury (I/R) is one of the most important causes of acute renal failure and subsequent damage to other organs such as the heart. was to investigate the occurrence of damage and apoptosis in the heart following renal ischemia-reperfusion time-dependent injury in rats. For this purpose, 32 male Wistar rats were randomly divided into 4 equal groups. In the first group (Sham), only the surgical site was opened and closed. In the second group (30-I/R) after the induction of renal ischemia, reperfusion was performed 30 minutes later, in the third group (45-I/R) 45 minutes later, and in the fourth group (60-I/R) 60 minutes later. After 24 hours, all animals were euthanized and their kidney and heart tissues were sampled for microscopic study. Statistical analysis of the data was done by one-way analysis of variance (ANOVA) and Tukey's post-test, and values of p<0.05 were considered significant.Histopathological findings showed renal damage following I/R in the form of degenerative changes and necrosis of proximal and distal tubules, glomerular and interstitial tissue damage in a time-dependent manner. Also, renal I/R resulted in heart tissue damage including degenerative changes and necrosis along with apoptosis of cardiomyocytes in all groups, but the severity of tissue damage and apoptosis of cardiomyocytes in the 60-I/R group was significantly higher than other groups (p<0.05). The results of the study showed that by reducing the duration of renal ischemia, the damages to the kidney tissue and subsequently heart tissue as well as apoptosis of cardiomyocytes will be less.
آسیبشناسی درمانگاهی دامپزشکی دوره 18، شماره 4، پیاپی 72، زمستان 1403، صفحات: 350-331
"مقاله پژوهشی" DOI: 10.71499/jvcp.202.1118584
بررسی هیستوپاتولوژیکی بافتهای کلیه و قلب موشهای صحرایی نر و ارزیابی آپوپتوزیس در سلولهای میوکارد متعاقب ایسکمی– بازخونرسانی کلیوی وابسته به زمان
مهبد باژبان1، یوسف دوستار2*، میرعلیرضا نورآذر3
1- دانشآموخته دامپزشکی، دانشکده دامپزشکی، علوم پزشکی تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.
2- دانشیار گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، علوم پزشکی تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.
3- استادیار گروه علوم پایه، دانشکده دامپزشکی، علوم پزشکی تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.
نویسنده مسئول مکاتبات: vetdoustar@gmail.com
(تاریخ دریافت: 11/2/1403 تاریخ پذیرش: 3/6/1403)
چکیده
آسیب ایسکمی- بازخونرسانی (Ischemia-Reperfusion; I/R) کلیه یکی از مهم‌ترین عوامل نارسایی حاد کلیوی و متعاقب آن آسیب به اندام‌های دیگر همچون قلب به شمار می‌رود. هدف از انجام مطالعه حاضر، بررسی وقوع آسیب و آپوپتوزیس در سلولهای بافت قلب متعاقب آسیب ایسکمی– بازخونرسانی کلیوی وابسته به زمان در موش صحرایی بود. بدین منظور 32 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار به طور تصادفی به 4 گروه مساوی تقسیم شدند. در گروه اول (Sham) فقط محل جراحی باز و بسته شد. در گروه دوم (30-I/R) پس از القاء ایسکمی کلیوی 30 دقیقه بعد، در گروه سوم (45-I/R) 45 دقیقه بعد و در گروه چهارم (60-I/R) 60 دقیقه بعد، عمل بازخونرسانی انجام شدند. پس از 24 ساعت همه حیوانات آسانکشی شده و از بافت کلیه و قلب آنها جهت انجام مطالعات ریزبینی، نمونه‌برداری شد. واکاوی آماري دادهها توسط آزمون تحلیل واریانس یکطرفه (ANOVA) و پسآزمون توكي (Tukey) انجام و مقادیر 05/0p<، معني‌دار تلقی شد. یافته‌های‌هیستوپاتولوژی، آسیب در بافت کلیه متعاقب I/R را بهشکل تغییرات دژنراتیو و نکروز توبولهای پروگزیمال و دیستال، آسیبهای گلومرولی و بافت بینابینی به صورت وابسته به زمان نشان داد. همچنین I/R منجر به آسیب در بافت قلب حیوانات همه گروهها شامل تغییرات دژنراتیو، نکروز و آپوپتوزیس کاردیومیوسیتها شد، اما شدت آسیب بافتی و آپوپتوز کاردیومیوسیتها در موشهای گروه 60-I/R به طور معنیداری بیشتر از سایر گروهها بود (05/0p<). نتایج مطالعه حاضر نشان داد که با کاهش مدت زمان ایسکمی در کلیه، آسیب خود بافت کلیه، بافت قلب و آپوپتوزیس کاردیومیوسیتها کمتر خواهد بود.
كليدواژهها: ایسکمی- بازخونرسانی، کلیه، قلب، موشصحرایی، آپوپتوزیس.
مقدمه
آسیب حاد کلیوی (Acute Kidney Injury; AKI) فرآیندی میباشد که با کاهش عملکرد کلیه در مدت زمان کوتاهی تشخیص داده میشود و معمولاً با مرگ و میر بالایی همراه است. آسیب در بازخونرسانی کلیه در مواردی از جمله پیوند کلیه (kidney transplantation)، نفرکتومی پارشیال (partial nephrectomy)، جـراحی‌های عروقی بزرگ کلـــیوی (major vascular surjery) مثل آنژیوپلاستی ســرخرگ کلـــیه (renal artery angioplasty) و جراحی آنوریسم آئورت (aortic aneurism surgery)، اعمال جراحی انتخابی اورولوژیک (elective urologic operations)، شوک هموراژیک (hemorrhagic shock) و موارد خاص افت فشار خون
(certain hypotensive states) پدیدهای معمول میباشد (Thurman 2007; Legrand et al., 2008). یکی دیگر از عوامل AKI، ایسکمی کلیه میباشد که باعث استرس اکسیداتیو شده و منجر به پاسخهای شدید و طولانی التهابی پس از بازخونرسانی میشود ( Mohsen et al., 2010). فرآیند ايسكمی يك معضل حیاتی میباشد و مهمتر اینکه خونرسانی مجدد متعاقب آن، منجر به مرگ برنامه‌ریزی شده سلولی يا آپوپتوز میشود. مطالعات بسیاری نشان دادهاند که برقراري مجدد جريان خون در بافتی که دچار ايسكمی شده است، باعث آسيب بيشتر به آن بافت مي شود. اين فرآيند را به نام آسيب ايسكمي- بازخونرساني مجدد (Ischemia-Reperfusion Injury) ناميده‌اند. در این فرآیند، علت اصلی آسیب میتوان به استرس اکسیداتیو و یا شکل‌گیری راديكالهاي آزاد اكسيژني (Reactive Oxygen Species; ROS) مانند سوپراكسيد و راديكال هيدروكسيل اشاره نمود. در (Ischemia-Reperfusion; IR) بافتها متحمل آسيبهای ساختاري مختلفی می‌شوند. میتوان علت را اینگونه توجیه کرد که برقراری مجدد جریان خون، سبب فراهم آوردن میزان زیاد اکسیژن برای ارگان میشود. این افزایش غلظت اکسیژن سبب فعالسازی ماکروفاژها در دیواره عروق شده و به دنبال آن رادیکال‌های مزبور آزاد می‌شوند. مرگ سلولی به دنبال آسیب IR در ارتباط نزدیک با تولید ROS و پراکسیداسیون لیپیدی ناشی از آن میباشد. بدین ترتیب که با برقراري مجدد خون، گلبول‌های سفيدخون آزادسازي فاكتورهاي التهابی مانند اينترلوكين و راديكال‌های آزاد در بافت ضايعه را موجب میشود (Thurman, 2007; Legrand et al., 2008; Mohajeri et al., 2013). AKIاغلب منجر به اختلالات در چند عضو دیگر نیز میشود که آن را آسیب اندام دور نامگذاری کردهاند ( Miyazawa et al., 2002; Grams and Rabb, 2012; Yap et al., 2012; Doi and Rabb, 2016; Husain-Syed, et al., 2020). در مدل تجربی حیوانی نیز نشان داده شده که IR کلیوی باعث آسیب به سایر اندام‌ها از جمله قلب، ریه، مغز، روده و کبد میشود ( Kelly, 2003; Hassoun et al., 2007; Liu et al., 2008; Grams and Rabb, 2012; Lane et al., 2013; Druml, 2014; Ologunde et al., 2014; Shang et al., 2016). ایسکمی-بازخونرسانی مجدد و آسیب حاد کلیوی با بالارفتن سطح اوره پلاسمای خون، کراتینین و آسیب حاد ریوی و همچنین به علت تولید مقادیر قابل توجهی از سایتوکاینهای متعدد که با اثر بر میزان اکسیژنرسانی مغز، آسیبی مضاعف بر بافت مغز اعمال میکند، همراه است (Park et al., 2011). بیماران مبتلا به آسیب حاد کلیوی از آنسفالوپاتی اورمیک رنج میبرند، که معمولاً با کاهش هوشیاری وتشنج و کما همراه میباشد (Scaini et al., 2010). تغییرات در آزادسازی نوروترانسمیترهای مغزی و اختلال عملکردی در سد خونی-مغزی بهدنبال نارسایی حاد کلیوی و ریوی تامین انرژی مغز را مختل میکند، و در نهایت تغییرات پاتولوژیک آنسفالوپاتی اورمیک اتفاق میافتد (Kikuchi et al., 1983). با وجود این، مطالعات نشان میدهند که آسیب حاد کلیوی با افزایش سایتوکاین/کموکاینهای پلاسمایی و مولکولهای آماسی، فعالشدن سلولهای ایمنی و استرس اکسیداتیو باعث آسیب سلولی با الگوی آپوپتوزیس مخصوصاً در بافتهای قلب، مغز و کبد نیز میگردد (Liu et al., 2008; Karimi et al., 2017; Scheel et al., 2008).
با توجه به اینکه مخصوصا گزارش شده، تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن به مقدار زیاد در کلیهای که دچار ایسکمی – بازخونرسانی (I/R) شده، منجر به آسیب می‌شــود که روندی اجتنــاب‌ناپذیر در تروما، عفــونت و پیــوند کلیه میباشد (El-Abhar, 2003)، لذا با توجه به اهمیت بالای موارد ذکر شده، هدف از انجام مطالعه حاضر، ارزیابی آسیبهای احتمالی در بافتهای کلیه و قلب موشهای صحرائی نر و نیز بررسی وقوع آپوپتوزیس در کاردیومیوسیتها متعاقب ایسکمی – بازخونرسانی کلیوی وابسته به زمان بود.
مطالعه حاضر از نوع تجربي آزمايشگاهي بود که در سال 1401 در دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی علومپزشکی تبریز انجام شده و در كليه مراحل آن، همه ملاحظات اخلاقي و پروتكلهاي كار روي حيوانات آزمايشگاهي، منطبق بر اصول مورد تائيد كميته نظارت بر حقوق حيوانات آزمايشگاهي بودهاست.
برای انجام پژوهش مورد نظر، از تعداد 32 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار خریداریشده از محل نگهداری و پرورش حیوانات آزمابشگاهی دانشکده دامپزشکی دانشگاه علوم پزشکی آزاد اسلامی تبریز در سن 10 هفتگی و با وزن 220±۲۰ گرم استفاده شد. شرایط تغذیه و وضعیت نگهداری برای تمام گروههای مورد مطالعه یکسان و به صورت ۱۲ ساعت روشنایی/ تاریکی و دمای 2±21 درجه سلسیوس در نظر گرفته شد. جیره غذایی آماده یکسان و آب نیز به طور آزادانه در دسترس حیوانات قرار گرفت. پس از یک هفته و عادت کردن به محیط جدید، آزمایش روی موشها شروع شد. بدین منظور ابتدا موشها به طور تصادفی به 4 گروه مساوی تقسیم شدند:
موشهای گروه اول (Sham) به عنوان شاهد در نظر گرفته شدند و در آنها فقط محل جراحی باز و بسته شد.
در حیوانات گروه دوم (30-I/R) پس از القاء ایسکمی کلیوی، 30 دقیقه بعد، عمل بازخونرسانی انجام گردید.
در مورد موشهای گروه سوم (45-I/R) پس از القاء ایسکمی کلیوی، 45 دقیقه بعد، عمل بازخونرسانی انجام شد.
در حیوانات گروه چهارم (60-I/R) هم پس از القاء ایسکمی کلیوی، 60 دقیقه، عمل بعد بازخونرسانی انجام گردید.
لازم به ذکر است که قبل از ایجاد ایسکمی و برقراری مجدد خونرسانی، حیوانات همه گروهها توسط تزریق داخل صفاقی کتامین و زایلازین (Alfasan, Holland) به ترتیب با دزهای mg/kg 90 و mg/kg 10 بیهوش شدند (Sancaktutar et al., 2014) و بلافاصله پس از ضدعفونی، خط وسط در قسمت میانی شکم (ناحیه مورد نظر برای جراحی) برش داده شد. همچنین در مورد موشهای گروه شاهد (Sham) فقط به دست‌کاری عروق کلیه چپ اکتفا کرده ولی در خصوص حیوانات سایر گروهها، عروق کلیهء چپ به ترتیب به مدت 30، 45 و 60 دقیقه به‌وسیله گیره غیرضربه‌ای (non traumatic) عروقی مسدود شد (Kirkby et al., 2007). در ادامه و پس از برداشتن گیره و رفع انسداد، در حفره شکمی بخیه زده و حیوانات به قفس‌های خود بازگردانده شدند. همچنین همه تیمارهای مورد نظر در گروههای مختلف تحقیق، بین ساعات 14 تا 19 روزهای تحقیق انجام گردید.
در نهایت 24 ساعت پس از انجام عمل بازخونرسانی، همه موشها با تزریق داخل صفاقی کتامین (mg/kg 90) و زایلازین (mg/kg 10)، بیهوش گردیده و در ادامه همگی با ایجاد دررفتگی در مهره‌های گردن (cervical dislocation)، آسانکشی شدند(Wang et al., 2013). بلافاصله قلب موشها جدا گردیده و برای بررسی آسیبهای سلولی احتمالی، در درون فرمالین بافری (Merck, Germany) 10 درصد به آزمایشگاه پاتولوژی دانشکده دامپزشکی انتقال داده شدند. در ادامه از نمونه‌هاي قلب و کلیهء پايدارشده در فرمالین، با استفاده از شيوه‌هاي معمول پاساژ و تهيه مقاطع بافتی، بلوکهای پارافینی و سپس برش‌هايي با ضخامت 5 ميكرون تهیه و در ادامه برشهای حاصله، پس از رنگ آميزي با رنگهای هماتوكسيلين- ائوزين، آماده بررسی شدند. در نهایت هم مشاهدات ریزبینی بافتی، با استفاده ار ميكروسكوپ نوري Nikon (مدلECLIPSE E200، ساخت كشور ژاپن) انجام گردید.
- بررسی آسیبشناختی بافتهای کلیه و قلب موشهای مورد آزمایش
لازم به ذکر است که برای آسيب‌شناسي بافت کلیه، مقاطع بافتی مربوط به هر نمونههای گروههای مختلف تحقیق، جداگانه و توسط يك مقياس نيمهكمّي (Semiquantitative scale) و بهصورت دوسو كور، بر اساس روش ارائهشده توسط بالودیا و همکاران در سال 2009 به صورت عدم وجود آسیب (-)، وجود آسیب جزئی (+)، آسیب ملایم (++)، آسیب متوسط (+++) و آسیب شدید (++++) ارزیابی، رتبهبندی و مقایسه گردیدند. همچنین آسیب گلومرولها به شکل گلومرولیت، آتروفی گلومرولی، نکروز گلومرولی، اتساع فضای ادراری و گسیختگی کپسول بومن، آسيب بينابيني به شکل پرخونی، خونریزی، ادم، ارتشاح بینابینی سلولهای آماسی و فیبروز بينابيني و نیز آسيب توبولي به شکل اتساع توبولی، تغییرات دژنراتیو و نکروز سلولهای توبولی، پهن و مسطح شدن سلولهای توبولی، مشاهده کستهای هیالنی داخل توبولها، مورد مطالعه و ارزیابی قرار گرفتند (Bhalodial, et al., 2009).
بررسي مقاطع آسيب‌شناسي نمونههای بافت قلب موشهای گروههای مختلف پژوهش حاضر نیز توسط يك مقياس نيمه كمّي (Semiquantitative scale) و بهصورت دوسو كور طبق روش ارائه شده توسط جوکار و همکاران (2012) انجام شد (Joukar et al., 2012) که براساس شیوه فوق، شدت آسیبها از لحاظ فرایند التهابی، خونریزی، تغییرات دژنراتیو و نکروز، از صفر تا 4 (صفر: عدم وجود آسیب، 1: حداقل آسیب، 2: آسیب ملایم، 3: آسیب متوسط و 4: آسیب شدید) رتبه‌بندي شدند.
- ارزیابی آپوپتوزیس در سلولهای میوکارد قلب موشهای مورد آزمایش: بدین منظور از روش آنکسین وی-فلوئورسین ایزوتیوسیانات (Annexin V- Fluorescein isothiocyanate; Annexin V-FITC) استفاده گردید. بدین منظور ابتدا از بلوکهای پارافینی نمونههای بافت قلب موشها، برش‌هايي با ضخامت 5 ميكرون برای رنگآميزي اختصاصی FITC تهیه گردید. در ادامه مشاهدات میکروسکوپیک جهت شمارش سلولهای آپوپتوتیک، با بزرگنمايي40× و در 5 ميدان ميکروسکوپي از هر برش بافتی بهطور تصادفي و با استفاده از ميكروسكوپ نوري Nikon (مدلECLIPSE E200، ساخت كشور ژاپن) انجام و تعداد سلولهای آپوپتوتیک مشخص شده و میانگین آنها بهصورت نسبت سلولهای آپوپتوتیک به کل سلولهای شمارش شده ارائه گردید. لازم به ذکر است که تشخیص سلول‌هاي آپوپتوتيك با استفاده از تكنيك اختصاصي و بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده كيت (BioActs Co., Ltd., Korea)، به شرح مراحل زیر انجام گرفت:
1- شفافسازی) اسلایدها در یک لوله مخروطی 50 میلیلیتری حاوی زایلن (Merck, Germany) به مدت 5 دقیقه غوطهور گردیدند تا پارافین متصل به لام جدا شده، زایلن جایگزین گردد و سپس یک بار دیگر شستشو دادهشدند. پس از آن، لامها به مدت 5 دقیقه در یک لوله مخروطی 50 میلیلیتری حاوی اتانول 100 درصد غوطهور شدند.
2- آبدهی مجدد) اسلایدها در یک لوله مخروطی حاوی به ترتیب 100، 95، 85، 70 و 50 درصد اتانول به مدت 3 دقیقه در دمای اتاق غوطهور شدند.
3- تثبیت اولیه) اسلایدها در یک لوله مخروطی 50 میلیلیتری حاوی PBS به مدت 5 دقیقه غوطهور شدند. سپس لامها در یک لوله مخروطی 50 میلیلیتری حاوی پارافورمالدئید 4 درصد در PBS(4/7=pH) به مدت 15 دقیقه قرار داده شدند.
4- تمیز کردن) اسلایدها در یک لوله مخروطی 50 میلیلیتری حاوی PBS به مدت 5 دقیقه غوطهور شده،PBS تازه جایگزین گردید. در ادامه عمل مذکور یک بار دیگر تکرار شد.
5- نفوذپذیری) محلول از برشهای بافتی زدوده شد و روی سطح صاف قرار دادهشد. برشهای بافت با 100 میکرولیتر 20 میکروگرم بر میلیلیتر پروتئیناز K در هر لام پوشانیده شد و به مدت 8 تا 10 دقیقه در دمای اتاق قرار داده شد.
6- تثبیت ثانویه) اسلایدها در یک لوله مخروطی 50 میلیلیتری حاوی PBS به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق فرو گردید. سپس لامها در یک لوله مخروطی 50 میلیلیتری حاوی پارافورمالدئید 4 درصد در PBS(4/7=pH)، به مدت 5 دقیقه قرار داده شد.
7- تمیز کردن) اسلایدها در یک لوله مخروطی 50 میلیلیتری حاوی محلول PBS به مدت 5 دقیقه غوطه ور شدند و PBS یک بار دیگر جایگزین شد.
8- تعادل بافر) PBS روی لامها، با ضربه زدن روی هر لام، جدا گردید، سلولها با 100 میکرولیتر بافر واکنش X1، پنج برابر بافر رقیقشده X5 پوشانیده شد و در دمای اتاق به مدت 10-5 دقیقه گرمخانهگذاری گردید. 9- آماده سازی محلول رنگ آمیزی) معرف رنگ آمیزی در طول فرآیند آماده شد.
10- رنگآمیزی) PBS باقی‌مانده از سلولها جدا گردیده و معرف رنگآمیزی (50 میکرولیتر در هر 5 سانتی‌متر مربع) به آن اضافه گردید. روی آن با ورقه پوششی پوشانیده شد و لام در یک محفظه مرطوب با دمای 37 درجه سلسیوس به مدت 1 ساعت در تاریکی قرار داده شد.
11- رنگآمیزی خاموش) بافر شستشو X2، تهیه شده از رقت 10 برابری بافر شستشوی X20، به یک لوله مخروطی 50 میلیلیتری اضافه شد. اسلاید رنگآمیزی به مدت 15 دقیقه در 25 درجه سلسیوس در لوله بافر شستشو X2 غوطهور شد.
12- تمیز کردن) اسلایدها به مدت 5 دقیقه در یک لوله مخروطی 50 میلیلیتری حاوی PBS قرار داده شد. رنگdUTP (2´-Deoxyuridine, 5´-Triphosphate) واکنش نداده، با دو بار دیگر تکرار عمل فوق، حذف شد.
رنگآمیزی PI(Propidium Iodide):
1- یک لوله مخروطی 50 میلیلیتری با محلول PI رقیق شده در 1 میکروگرم در میلیلیتر در PBS پر شد و به مدت 15 دقیقه در دمای 25 درجه سلسیوس در تاریکی قرار داده شد.
2- پس از رنگآمیزی، لام به مدت 5 دقیقه در آب مقطر با دمای 25 درجه سلسیوس فرو گردید. در ادامه آب مقطر جایگزین شده و عمل فوق سه بار تکرار گردید.
3- لام خشک گردیده و با میکروسکوپ (Nikon, Japan) مشاهدات لازم انجام شد.
-تحلیل آماری دادهها: داده‌هاي كمّي به‌دست آمده در تحقیق، به صورت میانگین± انحراف معیار (mean±SD) ارائه و معني‌داری اختلافات مشاهده شده بين گروهها، توسط آزمونهای آماري آنالیز واریانس یکطرفه (ANOVA) و تعقيبي توكي (Tukey) مورد بررسي قرارگرفت. همچنین به منظور تحليل داده‌های کمی جمعآوری شده، از نرم‌افزار SPSS-23 استفاده شد. برای مقایسه درجات آسیب در بافتهای قلب و کلیه، از آزمونهای غیرپارامتری (Nonparametric) کروسکال والیس (The Kruskal Wallis Test) و تعقیبی یومن وایتنی (Mann Witney U Test) استفاده شد. اختلافات در سطح 05/0p< معني‌دار تلقي شدند.
- نتایج آسیبشناسی بافت کلیه
در بررسیهای میکروسکوپیک، کلیههای موشهای صحرایی گروه شم (شاهد جراحی)، ساختار بافتی کاملاً سالم و طبیعی داشتند و تغییر پاتولوژیک قابل ملاحظهای در آنها دیده نشد (شکل 1).
شکل 1- نمای ریزبینی از منطقه قشری بافت کلیه موشهای گروه شم که نشان میدهد ساختار بافتی کلیه طبيعي بوده و تغییر پاتولوژیک قابل ملاحظهای در آن دیده نمیشود (رنگ آمیزی هماتوكسيلين-ائوزين، درشتنمایی 100×).
اما در گروه 30-I/R، تغييرات بافتی کلیه موشها شامل تغییرات ملایم تا متوسط دژنراتیو و نکروز پراکنده سلولهای پوششی توبولها بود. در فضای بینابینی نیز میزان هجوم سلولهای التهابی منونوکلئر، پرخونی، خونریزی و ادم، در حد ملایم تا متوسط بود. میزان آسیب در گلومرولها شامل تغییرات دژنراتیو و نکروز سلولهای لایههای جداری و احشایی کپسول بومن و کلافه مویرگی و پرخونی نیز در حد ملایم مشاهده شد (شکل 2).
شکل 2- نماي ریزبینی از منطقه قشری بافت کلیه یک سر موش صحرايي از گروه 30-I/R. بهشکل تغییرات ملایم تا متوسط دژنراتیو همراه با نکروز ملایم تا متوسط سلولهای اپیتلیال توبولی (پیکان ضخیم) و تغییرات خفیف تا ملایم دژنراتیو در گلومرولها همراه با پرخونی ملایم در کلافه مویرگی گلومرولی (پیکان نازک) توجه شود (رنگ آمیزی هماتوكسيلين-ائوزين، درشتنمایی 100×).
همچنین در گروه 45-I/R، تغییرات پاتولوژیک مشاهدهشده در بافت کلیه موشها، شامل تغییرات متوسط دژنراتیو و نکروز در سلولهای پوششی توبولها بود. میزان هجوم سلولهای التهابی منونوکلئر نیز در حد متوسط مشاهده شد. آسیب گلومرلها شامل تغییرات دژنراتیو و نکروز سلولهای لایههای جداری و احشایی کپسول بومن و کلافه مویرگی و پرخونی در حد متوسط بود. پرخونی و ادم در فضای بینابینی نیز در حد متوسط بود (شکل 3).
شکل 3- نمای ریزبینی از منطقه قشری بافت کلیه یک سر موش صحرايي از گروه 45-I/R. تغییرات متوسط دژنراتیو و نکروز در سلولهای اپیتلیال توبولی (پیکان ضخیم) و تغییرات متوسط دژنراتیو در گلومرولها همراه با پرخونی کلافه مویرگی گلومرولی در حد متوسط (پیکان نازک) و همچنین پرخونی و خونریزی همراه با ادم متوسط در فضای بینابینی (نوک پیکان) مشاهده میشود (هماتوكسيلين-ائوزين، درشتنمایی 100×).
در گروه 60-I/R هم، آسیب در منطقه قشری کلیه بهصورت تغییرات شدید دژنراتیو سلولهای اپیتلیال توبولی بهشکل دژنراسیون هیدروپیک شدید سیتوپلاسم، نکروز حاد و شدید سلولهای پوششی توبولی، ادم و هجوم شدید سلولهای التهابی منونوکلئر توأم با پرخونی و خونریزی شدید در مناطق بینابینی مشاهده شد. در گلومرولها نیز تغییرات شدید دژنراتیو و نکروز سلولهای لایههای احشایی و جداری کپسول بومن همراه با آتروفی کلافه مویرگی گلومرولی و افزایش فضای ادراری و گاهاً پارگی کپسول بومن، همراه با پرخونی و خونریزی گسترده در کلافه گلومرولها مشخص بود (شکل 4).
شکل 4- نمای ریزبینی از منطقه قشری بافت کلیه یک سر موش صحرايي از گروه 60-I/R. تغییرات دژنراتیو و نکروز گسترده و شدید سلولهای پوششی توبولی (پیکان ضخیم) قابل مشاهده است. تغییرات شدید دژنراتیو و نکروز و آتروفی گلومرولی همراه با پرخونی و خونریزی در کلافه مویرگی گلومرولی (پیکان باریک) نیز مشاهده ميشود. همچنین ادم و آماس شدید در فضای بافت بینابینی بافت کلیه (نوک پیکان) قابل مشاهده است (رنگ آمیزی هماتوكسيلين-ائوزين، درشتنمایی 100×).
از طرف دیگر، درجه‌بندي و مقایسه آسيبهای بافت کلیه در تمامي گروههای مورد مطالعه در جدول 1 ارائه گرديدهاست.
جدول 1- مقایسه آسیبهای بافتی در کلیه موشهای گروههای مختلف مورد مطالعه متعاقب ایسکمی– بازخونرسانی وابسته به زمان
گروه | آسیب مشاهده شده | آسیب گلومرولی | تغییرات دژنراتیو سلولهای توبولی | تغییرات نکروز سلولهای توبولی | پرخونی و خونریزی | آماس |
شم | - | - | - | - | - | |
30-I/R | ++ | ++/+++ | ++/+++ | ++/+++ | ++ | |
45-I/R | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | |
60-I/R | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | |
(-) عدم وجود آسیب، (+) آسیب پاتولوژیک جزئی، (++) آسیب ملایم، (+++) آسیب متوسط و (++++) آسیب شدید.
- نتایج آسیبشناسی بافت قلب
در بررسیهای آسيب‌شناختي، مشخص شد که ساختار ریزبینی بافت قلب موشهای صحرایی گروه شم، طبیعی و سالم میباشد (شکل 5).
شکل5- نمای ریزبینی از بافت قلب موش مربوط به گروه شم که مشاهده میگردد که ساختار میکروسکوپیک بافت قلب سالم بوده و تغییر پاتولوژیک قابل توجهی در آن دیده نمیشود (رنگآمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی 40×).
اما در گروه 30-I/R، تغییرات بافتی مشاهدهشده در قلب موشها، عمدتاً به شکل پرخونی و خونریزی ملایم تا متوسط و ادم بینابینی متوسط و تغییرات دژنراتیو و نکروز ملایم تا متوسط کاردیومیوسیتها بود (شکل 6).
شکل 6- نمای ریزبینی از بافت قلب موش مربوط به گروه 30-I/R که در آن تغییرات دژنراتیو و نکروز ملایم میوسیتها (پیکان ضخیم) و ادم بینابینی ملایم (پیکان نازک) مشاهده میشود (رنگآمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی 40×).
در گروه 45-I/R هم عمده آسیب قابل مشاهده در بافت قلب موشها، شامل پرخونی و خونریزی متوسط و ادم بینابینی متوسط و تغییرات دژنراتیو و نکروز متوسط کادیومیوسیتها بود (شکل 7).
شکل 7- نمای ریزبینی از بافت قلب موش گروه 45-I/R. به تغییرات دژنراتیو و نکروز متوسط تارهای عضلانی قلب (پیکان ضخیم) و ادم بینابینی و پرخونی و خونریزیهای متوسط و پراکنده در فضاهای میانبافتی (پیکان نازک) توجه شود (رنگآمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی 40×).
اما در بافت قلب موشهای صحرایی گروه 60-I/R، تغییرات دژنراتیو و نکروز شدید تارهای عضلانی قلب، ارتشاح سلولهای آماسی و پرخونی و خونریزی و ادم بینابینی شدید، مشاهده شد (شکل 8).
شکل 8- نمای ریزبینی از بافت قلب موش مربوط به گروه 60-I/R که در آن تغییرات دژنراتیو و نکروز وسیع و شدید تارهای عضلانی قلب، نفوذ منتشر سلولهای آماسی، پرخونی (نوک پیکان)، ادم بینابینی و خونریزیهای گسترده در فضای بین تارهای عضلانی (پیکان نازک) مشاهده میشود (رنگآمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی 40×).
از طرف دیگر، تغييرات و شدت آسيبهای بافتي مشاهده شده در قلب موشهای گروههای مختلف مورد مطالعه هم در جدول 2، درجه‌بندي و مقايسه گرديدهاست.
جدول 2- مقایسه تغييرات و شدت آسيب بافتي قلب موشهای گروههای مورد مطالعه متعاقب ایسکمی-بازخونرسانی وابسته به زمان
گروه | آسیب مشاهده شده | درجه آسيب بافت | نتیجه آزمون کروسکال والیس |
شم | a0/0±0/0 | 01/0> p | |
30-I/R | b52/0±85/3 | ||
45-I/R | c36/0±68/2 | ||
60-I/R | d22/0±95/1 | ||
a,b,c,d: حروف انگلیسی غير مشابه نشانگر اختلاف آماری معني‌دار مي‌باشد (01/0p<).
-نتایج حاصله از بررسی آپوپتوزیس سلولهای میوکارد قلب
در مشاهدات ریزبینی کاردیومیوسیتهای آپوپتوتیک با رنگآمیزی فلوروسین ایزوسیانید ایمنوفلوروسانس تانل، بهرنگ سبز درخشان قابل رویت بودند. البته در بافت قلب موشهای گروه شم تعداد کاردیومیوسیتهای آپوپتوتیک بسیار اندک و معدود بوده و به ندرت قابل مشاهده بود (شکل 9).
اما مطابق شکل 10، در بافت قلب موشهای گروه 30-I/R، کاردیومیوسیتهای آپوپتوتیک در مقایسه با گروه شاهد افزایش معنیداری را نشان داد (05/0p<).
شکل 10- نمای ریزبینی از بافت قلب موش صحرائی گروه 30-I/R. سلولهای تانل مثبت (پیکانها) قابل رویت می‌باشند (رنگ آمیزی فلوروسین ایزوسیانید ایمنوفلوروسانس تانل، درشتنمایی 40×).
همچنین در بافت قلب موشهای گروه 45-I/R، تعداد کاردیومیوسیتهای آپوپتوتیک بهطور معنیداری نسبت به تعداد آن در قلب حیوانات گروههای شاهد (01/0p<) و 30-I/R (05/0p<) افزایش داشت (شکل 11).
شکل 11- نمای ریزبینی از بافت قلب موش صحرائی گروه 45-I/R که در آن سلولهای تانل مثبت (پیکانها) قابل رویت می‌باشند (رنگ آمیزی فلوروسین ایزوسیانید ایمنوفلوروسانس تانل، درشتنمایی 40×).
در بافت قلب موشهای گروه 60-I/R هم، تعداد کاردیومیوسیتهای آپوپتوتیک به شدت زیاد شدهبود بهطوری که نسبت به تعداد آنها در بافت قلب حیوانات گروههای شاهد (001/0p<) و 45-I/R (05/0p<) بهطور معنیداری افزایش نشان داد (شکل 12). مقایسه میزان وقوع آپوپتوزیس در سلولهای عضلانی قلب به روش فلوئورسین ایزوتیوسیانات ارتقاءیافته بین گروههای مورد مطالعه در جدول 3 ارائه شده است.
شکل 12- نمای ریزبینی از بافت قلب موش صحرائی گروه 60-I/R. سلولهای تانل مثبت (پیکانها) قابل رویت می‌باشند (رنگ آمیزی فلوروسین ایزوسیانید ایمنوفلوروسانس تانل، درشتنمایی 40×).
جدول 3- مقایسه میزان وقوع آپوپتوزیس در سلولهای عضلانی قلب به روش فلوئورسین ایزوتیوسیانات ارتقاءیافته بین گروههای مورد مطالعه (میانگین±انحراف معیار)
گروهها | تیمار | سلولهای آپوپتوتیک (درصد) |
1 | شاهد | 15/0±35/0 |
2 | I/R | a16/1±28/5 |
3 | I/R +ورزش هوازی به مدت 2 هفته | b11/2±28/8 |
4 | I/R +ورزش منظم و فزاینده هوازی به مدت 8 هفته | c19/4±75/14 |
a: وجود اختلاف آماری معنیدار در مقایسه با گروه شاهد (05/0p<).
b: وجود اختلاف آماری معنیدار در مقایسه با گروه شاهد (01/0p<).
c: وجود اختلاف آماری معنیدار در مقایسه با گروه شاهد (001/0p<).
بحث و نتیجه‌گیری
در مطالعه حاضر تاثیر I/R کلیوی در زمان‌های30، 45 و 60 بر آسیب بافتهای کلیوی و عضله قلب بررسی شد. آسیب کلیوی متعاقب I/R، شامل تغییرات دژنراتیو و نکروز توبولهای پروگزیمال و دیستال، حضور کستهای پروتئینی در توبولهای کلیوی، خونریزی، از بین رفتن رأس مسواکی توبولهای پروگزیمال و همچنین آسیب بافت قلب شامل تغییرات دژنراتیو و نکروز کاردیومیوسیتها همراه با ادم، پرخونی و خونریزی در بافت همبند بینابینی به صورت وابسته به زمان افزایش شدت نشان داد . یافتههای ایمنوهیستوشیمی (Annexin V-FITC) بافت قلب موشها هم دال بر وقوع آپوپتوزیس در سبولهای بافت پوششی توبولهای پروگزیمال دارد. نتایج مشاهدات هیستوپاتولوژی بافتهای کلیه و قلب حیوانات گروههای مختلف تحقیق هم تغییرات شدت آسیب را در گروههای مذکور تایید میکند بهطوری که شدت تغییرات مذکور در بافتهای موشهای گروه 60-I/R به طور معنیداری بیشتر از بقیه گروهها بود.
در شرایط بالینی یکی از عوامل نارسایی حاد کلیوی، آسیب I/R میباشد که می‌تواند موجب آسیب غیرقابل برگشت کلیه، اختلال در عملکرد ارگان‌های دور همچون کبد، مغز و قلب و همچنین مرگ و میر شود. از آنجایی که استرس اکسیداتیو و التهاب در اندام‌ها از مشخصات آسیب ناشی از I/R میباشد، مداخلاتی که این فرآیندها را هدف قرار میدهند، در کنترل اثرات مضر I/R مفید خواهد بود (Patschan, 2012). یکی از این مداخله‌ها کاهش مدت زمان I/R میباشد. طبق نتایج مطالعه حاضر با کاهش مدت زمان ایسکمی، آسیبهای ایجادشده در کلیه و قلب از جمله میزان وقوع آپوپتوزیس در سلولهای عضلانی بافت قلب، به مراتب کاهش یافت، طوری که طبق نتایج مشخص شد که میزان آپوپتوزیس در زمان 30 دقیقه، کمتر از زمان 45 و 60 دقیقه میباشد که نشانگر آسیب بیشتر به دنبال افزایش مدت زمان ایسکمی میباشد.
I/R در کلیه ممکن است اثرات مخرب شدیدی بر بافتهای اندام دور همچون قلب ایجاد کند. برخی از مکانیسمهای آسیبهای اندام دور ناشی از I/R کلیه شامل اختلالات میکروواسکولار، اختلال متابولیسم، آسیب اکسیداتیو، افزایش آسیب سلولهای اندوتلیال و التهابات موضعی میباشد. این فرآیندها به دنبال ایسکمی- بازخونرسانی، باعث آسیب به یکپارچگی عملکردی و ساختاری اندام‌هائی غیر از کلیه نیز میشود (Quoilin et al., 2014). در مطالعه علیهمتی و همکاران در سال 2017، متعاقب ایسکمی بازخونرسانی کلیه، آپوپتوزیس سلولهای میوکارد و به همراه آن دژنراسیون میوفیبریلهای میوکارد به همراه خونریزی و حتی ادم مشهود بود. همچنین به دنبال آسیبهای قلبی ناشی از I/R کلیوی، افزایش سلولهای التهابی و افزایش عوامل القاءگر آپوپتوزیس دیده شدهاست. طبق نظر نامبردگان، آسیب ایسکمی منجر به التهاب سیستمیک شده و نهایتاً باعث افزایش میزان وقوع آپوپتوزیس در میوکارد میشود (Alihemmati et al., 2018). ملاحظه میشود که یافتههای مذکور با نتایج تحقیق حاضر در یک راستا میباشد. لذا با توجه به همراستا بودن نتایج مشاهده شده در مطالعه حاضر با یافتههای مطالعه علیهمتی و همکاران، به نظر میرسد که مکانیسمهای فوق را میتوان به یافتههای مطالعه حاضر هم تعمیم داد. همچنین در این خصوص، شیل و همکاران در سال 2008 به این نتیجه رسیدند که یکی از فرضیات در مورد علت وقوع آسیب قلبی به دنبال I/R کلیوی، آنسفالوپاتی اورمیک میباشد که می‌تواند منجر به افزایش سیتوکاینهای التهابی IL-1 و TNF-α و ارتشاح بیشتر نوتروفیلها، افزایش وقوع آپوپتوزیس و کاهش ظرفیت بطن چپ در فشار سیستولی گردد (Scheel et al., 2008). همچنین گزارش شده که یکی دیگر از مکانیسمهای آسیب رسان این است که ایسکمی باعث افزایش بیان مولکولهای چسبندگی و تولید واسطه‌های التهابی مثل سایتوکاین‌ها و کموکاین‌ها توسط اندوتلیوم عروق و توبولها شده که منجر به جذب لوکوسیت‌ها به بافت می‌شوند. مولکولهای چسبندگی سلولی (cellular adhesion molecules; CAMs) مولکول‌هایی هستند که بافتهای بدن را در کنار هم نگه میدارند و در اتصال لوکوسیت‌ها به سلولهای اندوتلیال نقش دارند. مولکول‌های‌چسبندگی مثل اینتگرین و سلکتین در کنار سایتوکاینهای پیشالتهابی آسیب سلولی را افزایش میدهند (Garcia-Criado et al., 1998; Thurman, 2007; Li et al., 2016). بنابراین، پاسخ التهابی نقش مهمی در آسیب بافتی ناشی از IR دارد (Thurman, 2007). در هنگام IR کلیه، سیتوکینهای پیشالتهابی تولیدشده در کلیه به عنوان عامل اصلی در التهاب موضعی و سیستمیک در نظر گرفته می‌شوند (Wang et al., 2013; Ologunde et al., 2014; Lee et al., 2011; Akcay et al., 2009; Sung et al., 2002). فاکتور هستهای-کاپا B (Nuclear factor kappa B; NF-kB) یکی از عوامل اصلی رونویسی است که بیان سیتوکینهای پیشالتهابی و پاسخ ایمنی را تنظیم میکند (Sung et al., 2002; Lawrence, 2009; Liu et al., 2017). طبق مطالعه انجام شدهای در این خصوص بیان کردهاند که IR بیان کموکاین (Monocyte chemoattractant protein-1; MCP-1) را از طریق فعالسازی NF-kB در کلیه تحریک میکند (Sung et al., 2002; Wang et al., 2013). دویی و راب در سال 2016 طی یک مطالعه بیان نمود که بهدنبال نارسایی حاد کلیوی متعاقب ایسکمی-بازخونرسانی، با ایجاد ناهماهنگی دینامیکی غشای میتوکندریای سلولهای میوکارد قلب، بیان ژن وابسته به Drp-1 (Dynamic-related protein-1) افزایش یافته و از این طریق باعث القاء آپوپتوزیس سلولی میگردد. دینامیک میتوکندریایی همان پیوستگی یا Fusion و گسستگی یا Fission در غشاء میتوکندری میباشد که توسط گوانوزین تری فسفات واسطهگری میگردد. شکاف در غشاء باعث خروج سیتوکرومC از میتوکندری و فعال شدن آنزیمهای کسپازی و در نتیجه آپوپتوزیس سلولهای میوکارد میگردد (Doi and Rabb, 2016).
بر اساس یافتههای تحقیق حاضر میتوان بیان کرد که با کاهش مدت زمان ایسکمی در آسیب I/R کلیه و رخداد فرآیندهای التهابی و سیتوکاینهای القاءگر آپوپتوزیس و فعال شدن مسیرهای درونزاد آپوپتوزیس کاردیومیوسیتها، آسیب در بافت قلب به دنبال کاهش مدت زمان ایسکمی کلیه، کمتر میشود. در مجموع، طبق نتایج مطالعه ما و یافتههای تحقیقات قبلی، کاهش مدت زمان ایسکمی کلیه، با حداقل آسیب قلبی همراه است.
سپاسگزاری
این مقاله برگرفته از پایاننامه دوره دکترای حرفهای (کد: 102213756486911400162427673) میباشد. بدینوسیله از معاونت پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی علوم پزشکی تبریز قدردانی میگردد.
تعارض منافع
نویسندگان اعلام میدارند که هیچ گونه تضاد منافعی ندارند.
منابع
· Akcay, A., Nguyen, Q. and Edelstein, C.L. (2009). Mediators of inflammation in acute kidney injury. Mediators of inflammation, 200: 137072.
· Alihemmati, A., Yousefi, H., Ahmadiasl, N. and Habibi, P. (2018). Apoptosis and histopathology of the heart after renal ischemia-reperfusion in male rat running title: ischemia-reperfusion injury. Brazilian Archives of Biology and Technology, 60.
· Bhalodia, Y., Kanzariya, N., Patel, R., Patel, N., Vaghasiya, J., Jivani, N., et al. (2009). Renoprotective activity of benincasa cerifera fruit extract on ischemia/reperfusion-induced renal damage in rat. International Journal of Kidney Diseases, 2009, 3(2): 80
· Doi, K. and Rabb, H. (2016). Impact of acute kidney injury on distant organ function: recent findings and potential therapeutic targets. Kidney international, 89(3): 555-564.
· Druml, W. (2014). Systemic consequences of acute kidney injury. Current opinion in critical care, 20(6): 613-619.
· El-Abhar, H.S., Abdallah, D.M. and Saleh, S. (2003). Gastroprotective activity of Nigella sativa oil and its constituent, thymoquinone, against gastric mucosal injury induced by ischaemia/reperfusion in rats. Journal of ethnopharmacology, 84(2-3): 251-258.
· Garcia-Criado, F.J., Eleno, N., Santos-Benito, F., Valdunciel, J.J., Reverte, M., Lozano-Sanchez, F.S., et al. (1998). protective effect of exogenous nitric oxide on the renal function and inflammatory response in a model of ischemia-reperfusion. Transplantation, 66(8): 982-990.
· Grams, M.E. and Rabb, H. (2012). The distant organ effects of acute kidney injury. Kidney international, 81(10): 942-948.
· Hassoun, H.T., Grigoryev, D.N., Lie, M.L., Liu, M., Cheadle, C., Tuder, R.M., et al. (2007). Ischemic acute kidney injury induces a distant organ functional and genomic response distinguishable from bilateral nephrectomy. American Journal of Physiology-Renal Physiology, 293(1): F30-F40.
· Husain-Syed, F., Rosner, M.H. and Ronco, C. (2020). Distant organ dysfunction in acute kidney injury. Acta Physiologica, 228(2): e13357.
· Joukar, S., Bashiri, H., Dabiri, S., Ghotbi, P., Sarveazad, A., Divsalar, K., et al. (2012): Cardiovascular effects of black tea and nicotine alone or in combination against experimental induced heart injury. Journal of physiology and biochemistry. 68(2): 271-279.
· Karimi, N., Haghani, M., Noorafshan, A. and Moosavi, S.M.S. (2017). Structural and functional disorders of hippocampus following ischemia/reperfusion in lower limbs and kidneys. Neuroscience, 358: 238-248.
· Kelly, K.J. (2003). Distant effects of experimental renal ischemia/reperfusion injury. Journal of the American Society of Nephrology, 14(6): 1549-1558.
· Kikuchi, S., Matsumoto, H. and Ito, M. (1983). Free amino acid changes in the cerebral cortex of experimental uremic rat. Neurochemical Research, 8(3): 313-318.
· Kirkby, K., Baylis, C., Agarwal, A., Croker, B., Archer, L. and Adin, C. (2007). Intravenous bilirubin provides incomplete protection against renal ischemia-reperfusion injury in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology, 292(2): F888-F894.
· Lane, K., Dixon, J.J., MacPhee, I.A. and Philips, B.J. (2013). Renohepatic crosstalk: does acute kidney injury cause liver dysfunction?. Nephrology dialysis transplantation, 28(7): 1634-1647.
· Lawrence, T. (2009). The nuclear factor NF-κB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor perspectives in biology, 1(6): a001651.
· Lee, D.W., Faubel, S. and Edelstein, C. (2011). Cytokines in acute kidney injury (AKI). Clinical nephrology, 76(3): 165-173.
· Legrand, M., Mik, E.G., Johannes, T., Payen, D. and Ince, C. (2008). Renal hypoxia and dysoxia after reperfusion of the ischemic kidney. Molecular medicine, 14(7-8): 502-516.
· Li, J., Hong, Z., Liu, H., Zhou, J., Cui, L., Yuan, S., et al. (2016). Hydrogen-rich saline promotes the recovery of renal function after ischemia/reperfusion injury in rats via anti-apoptosis and anti-inflammation. Frontiers in pharmacology, 7: 106.
· Liu, M., Liang, Y., Chigurupati, S., Lathia, J.D., Pletnikov, M., Sun, Z., et al. (2008). Acute kidney injury leads to inflammation and functional changes in the brain. Journal of the American Society of Nephrology: JASN, 19(7): 1360.
· Liu, Y., Shi, B., Li, Y. and Zhang, H. (2017). Protective effect of luteolin against renal ischemia/reperfusion injury via modulation of pro-inflammatory cytokines, oxidative stress and apoptosis for possible benefit in kidney transplant. Medical science monitor: international medical journal of experimental and clinical research, 23: 5720-5727.
· Miyazawa, S., Watanabe, H., Miyaji, C., Hotta, O. and Abo, T. (2002). Leukocyte accumulation and changes in extra-renal organs during renal ischemia reperfusion in mice. Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 139(5): 269-278.
· Mohajeri, D., Gharamaleki, M.N., Hejazi, S.S. and Nazeri, M. (2013). Preventive effects of turnip (Brassica rapa L.) on renal ischemia-reperfusion injury in rats. Life Science Journal, 10(1): 1165-1170.
· Mohsen, N., Mahmoud, P., Pejman, S., Mohammed, G., Masoud, S., Ali, T., et al. (2010). Effects of stem cells and granulocyte colony stimulating factor in reperfusion injury. Iranian Journal of Kidney Diseases 4 (3): 207-13.
· Ologunde, R., Zhao, H., Lu, K. and Ma, D. (2014). Organ cross talk and remote organ damage following acute kidney injury. International urology and nephrology, 46(12) :2337-2345.
· Park, S.W., Chen, S.W., Kim, M., Brown, K.M., Kolls, J.K., D D'Agati, V., et al. (2011). Cytokines induce small intestine and liver injury after renal ischemia or nephrectomy. Laboratory investigation, 91(1): 63-84.
· Patschan, D., Patschan, S. and Müller, G.A. (2012). Inflammation and microvasculopathy in renal ischemia reperfusion injury. Journal of transplantation, 2012: 1-7.
· Quoilin, C., Mouithys-Mickalad, A., Lécart, S., Fontaine-Aupart, M.P. and Hoebeke, M. (2014). Evidence of oxidative stress and mitochondrial respiratory chain dysfunction in an in vitro model of sepsis-induced kidney injury. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 1837(10): 1790-1800.
· Sancaktutar, A.A., Bodakci, M.N., Hatipoglu, N.K., Soylemez, H., Basarılı, K. and Turkcu, G. (2014). The protective effects of pomegranate extracts against renal ischemia-reperfusion injury in male rats. Urology annals, 6(1): 46.
· Scaini, G., Ferreira, G.K. and Streck, E.L. (2010). Mechanisms underlying uremic encephalopathy. Revista Brasileira de terapia intensiva, 22: 206-211.
· Scheel, P.J., Liu, M. and Rabb, H. (2008). Uremic lung: new insights into a forgotten condition. Kidney international, 74(7): 849-851.
· Shang, Y., Siow, Y.L. and Isaak, C.K. (2016). Downregulation of glutathione biosynthesis contributes to oxidative stress and liver dysfunction in acute kidney injury. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2016, 1-13.
· Sung, F.L., Zhu, T.Y., Au-Yeung, K.K., Siow, Y.L. and Karmin, O. (2002). Enhanced MCP-1 expression during ischemia/reperfusion injury is mediated by oxidative stress and NF-κB. Kidney international, 62(4): 1160-1170.
· Thurman, J.M. (2007). Triggers of inflammation after renal ischemia/reperfusion. Clinical immunology, 123(1): 7-13.
· Wang, P., Zhu, Q., Wu, N., Siow, Y.L., Aukema, H. and O, K. (2013). Tyrosol Attenuates Ischemia–Reperfusion-Induced Kidney Injury via Inhibition of Inducible Nitric Oxide Synthase. Journal of agricultural and food chemistry, 61(15): 3669-3675.
· Yap, S.C., Lee, H.T. and Warner, D.S. (2012). Acute kidney injury and extrarenal organ dysfunction: new concepts and experimental evidence. The Journal of the American Society of Anesthesiologists, 116(5): 1139-1148.
