ایجاد سویه مخمر حساس به تاکسول با القای جهش TUB2 -Asp26

محورهای موضوعی : زیست فناوری میکروبی

حامد عشوریون ¹ , شمس الضحی ابوالمعالی ² , زیبا فولادوند ³ , فاطمه رضاقلی ⁴

1 - دانشجوی کارشناسی ارشد، دانشگاه شهید بهشتی، دانشکده مهندسی انرژی و فناوری های نوین، گروه بیوتکنولوژی
2 - استادیار، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه سمنان
3 - دانشجوی کارشناسی ارشد، دانشگاه شهید بهشتی، دانشکده مهندسی انرژی و فناوری های نوین، گروه بیوتکنولوژی
4 - دانشجوی کارشناسی ارشد، دانشگاه شهید بهشتی، دانشکده مهندسی انرژی و فناوری های نوین، گروه بیوتکنولوژی

تاریخ دریافت : 1397/07/10 تاریخ پذیرش : 1397/08/24 تاریخ انتشار : 1398/06/01

کلید واژه: پاکلی تاکسل, توبولین, ساکارومیسس سرویزیه,

چکیده مقاله :

سابقه و هدف: پاکلی‌تاکسل، یک ترکیب ضد میکروتوبولی موثر بر سرطان‌های ریه، تخمدان و سینه است. تولید کم این دارو در درخت سرخدار و نیز مقاومت به آن در مراحل شیمی درمانی، ازعوامل محدودیت کاربردی پاکلی ‌تاکسل هستند. هدف این پژوهش، ایجاد سیستم غربالگری برای پیدا کردن منابع جدید تولید تاکسول، با استفاده از سویه جهش‌یافته ساکارومیسس سرویزیه حساس به تاکسول ‌می‌باشد.مواد و روش‌ها: برای ایجاد جهش در ژن TUB2 کروموزوم مخمر، آغازگرهای حاوی تغییر در کدون 26 از گلیسین به آسپارتیک اسید؛ ( GGT بهGAT) طراحی و با کمک واکنش زنجیره ای پلی مراز در سه مرحله تکثیر ژن TUB2 -Asp26 انجام گرفت. سپس ژن TUB2 از سویه مخمر هاپلویید در وکتور بیانی مخمری در پروموتر گالاکتوز همسانه‌سازی گردید. پس از تراریخت‌سازی مخمر هاپلویید با سازه Gal-TUB2، pZF58))، برای بار دوم با محصول PCR از ژن TUB2 -Asp26 و در محیط حاوی قند گالاکتوز تراریخت ‌سازی و علیه µM 40 تاکسول، غربالگری تراریخته‌ها انجام گرفت.یافته‌ها: در سویه مخمر YNHA1، حاصل از غربالگری 84 تراریخته، مقدار MBC علیه تاکسولµM 50 تعیین گردید. مخمری با نقص در ترابرهای غشایی و TUB2 که در محل اتصال تاکسول در4 امینواسید مشابه بتاتوبولین مغز و تنها در آمینواسید 26 مشابه مخمر بود، توانست µM 25 تاکسول را تحمل کند. اما در پژوهش حاضر به دلیل استفاده از میزبان مخمر که نقص در ترابرهای غشایی نداشت، میزان تحمل تا 2 برابر افزایش یافت.نتیجه گیری: این مخمر جهش‌یافته‌، می‌تواند برای پیدا کردن منابع جدید تولید کننده‌های تاکسول با توان تولید تا µM 50، در غربالگری‌ها به کار رود.

چکیده انگلیسی:

Background & Objectives: Paclitaxel is an effective anti-microtubule agent against lung, ovarian and breast cancers. The low production of taxol in the yew, as well as its resistance to chemotherapy, is limiting the use of paclitaxel. This study aimed to create a screening system for new sources of taxol using the taxol sensitive mutant strain of Saccharomyces cerevisiae.   Materials & Methods: To mutate the yeast chromosome TUB2 gene, primers containing a change in codon 26 from glycine to aspartic acid (GGT to GAT) were designed and TUB2-Asp26 gene amplified by three-step PCR method. The TUB2 gene was then cloned from the haploid strain into the yeast expression vector in the galactose promoter. After transplantation of haploid yeast with Gal-TUB2 construct (pZF58), transgenic screening was carried out for the second time by PCR product of the TUB2-Assp26 gene and in the medium containing galactose and against 40 μM taxol. Results: Of the 84 transgenes, the yeast strain YNAH1 was selected from the first screening and the integration of mutation in the chromosome was confirmed by the MBC value of 50 μM taxol. The formerly generated membrane-defective yeast strain with amino acid sequences similar to the brain beta-tubulin with an exception for amino acid 26, tolerated 25 µM taxol. However, in the present study, tolerance increased by up to 2-fold due to the use of yeast hosts that had no defects in membrane transporters. Conclusion: The mutant yeast strain can be used in screening to find new sources of taxol producers with production capacity up to 50 µM.

منابع و مأخذ:

1. Majidi M. A review on taxol production through biotechnological approaches. J Med Plant
   Res. 2018; 4(68): 1-14.
   2. Croteau R, Ketchum RE, Long RM, Kaspera R, Wildung MR. Taxol biosynthesis and
   molecular genetics. Phytochem Rev. 2006; 5(1): 75-97.
   3. Entwistle RA, Winefield RD, Foland TB, Lushington GH, Himes RH. The paclitaxel site in
   tubulin probed by site-directed mutagenesis of Saccharomyces cerevisiae β-tubulin. FEBS
   Lett. 2008; 582(16): 2467-2470.
   4. Fooladvand Z, Abolmaali S, Saidi A, Ashourion H. Characterization of β-tubulin cDNA (s)
   from Catharanthus roseus. J Biodiver Environ Sci. 2015; 6(1): 351-360.
   5. Jost W, Baur A, Nick P, Reski R, Gorr G. A large plant beta-tubulin family with minimal
   C-terminal variation but differences in expression. Gene. 2004; 340(1): 151-160.
   6. Drukman S, Kavallaris M. Microtubule alterations and resistance to tubulin-binding agents. Int
   J Oncol. 2002; 21(3): 621-628.
   7. Adachi Y, Toda T, Niwa O, Yanagida M. Differential expressions of essential and nonessential
   alpha-tubulin genes in Schizosaccharomyces pombe. Mol Cell Biol. 1986; 6(6): 2168-2178.
   8. Castrillo JI, Oliver SG. Yeast as a touchstone in post-genomic research: strategies for
   integrative analysis in functional genomics. BMB Rep. 2004; 37(1): 93-106.
   9. Replansky T, Koufopanou V, Greig D, Bell G. Saccharomyces sensu stricto as a model system
   for evolution and ecology. Trends Ecol Evolut. 2008; 23(9): 494-501.
   10. Menacho-Marquez M, Murguia J. Yeast on drugs: Saccharomyces cerevisiae as a tool for
   anticancer drug research. Clin Transl Oncol. 2007; 9(4): 221-228.
   11. Suter B, Auerbach D, Stagljar I. Yeast-based functional genomics and proteomics
   technologies: the first 15 years and beyond. Biotechniques. 2006; 40(5): 625-644.
   12. Stein A, Aloy P. A molecular interpretation of genetic interactions in yeast. FEBS Lett. 2008;
   582(8): 1245-1250.
   13. Akbari V, Moghim S, Mofid MR. Comparison of epothilone and taxol binding in yeast
   tubulin using molecular modeling. Avicenna J Med Biotechnol. 2011; 3(4): 167.
   14. Gietz RD, Woods RA. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier
   DNA/polyethylene glycol method. Methods in enzymology. Elsevier; 2002. p. 87-96.
   15. Sherman F. Getting started with yeast. Methods in enzymology. Elsevier; 1991. p. 3-21.
   16. Sikorski RS, Hieter P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient
   manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 1989; 122(1): 19-27.
   17. Li B-J, Wang H, Gong T, Chen J-J, Chen T-J, Yang J-L, et al. Improving 10-deacetylbaccatin
   III-10-β-O-acetyltransferase catalytic fitness for Taxol production. Nat. Commun.
   2017;8:15544.
   
   18. Gupta ML, Bode CJ, Georg GI, Himes RH. Understanding tubulin–Taxol interactions:
   mutations that impart Taxol binding to yeast tubulin. Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100(11):
   6394-6397.
   19. Yang C-P, Horwitz S. Taxol®: the first microtubule stabilizing agent. Int J Mol Sci. 2017;
   18(8): 1733.
   20. Winefield RD, Entwistle RA, Foland TB, Lushington GH, Himes RH. Differences in
   paclitaxel and docetaxel interactions with tubulin detected by mutagenesis of yeast tubulin.
   Chem Med Chem. 2008; 3(12): 1844-1847.
   21. Howes SC, Geyer EA, LaFrance B, Zhang R, Kellogg EH, Westermann S. Structural and
   functional differences between porcine brain and budding yeast microtubules. Cell Cycle.
   2018; 17(3): 278-287.
   22. Foland TB, Dentler WL, Suprenant KA, Gupta Jr ML, Himes RH. Paclitaxel‐induced
   microtubule stabilization causes mitotic block and apoptotic‐like cell death in a paclitaxel‐
   sensitive strain of Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 2005; 22(12): 971-978.
   23. Nientiedt C, Heller M, Endris V, Volckmar A-L, Zschäbitz S, Tapia-Laliena MA. Mutations
   in BRCA2 and taxane resistance in prostate cancer. Sci Rep. 2017; 7(1): 4574.