Manuscript ID : PLANT-2309-1100 (R1) Visit : 169 Page: 77 - 88

Article Type: Original Research

Molecular basis of interactions between fungal effectors and host plants

Subject Areas : Plant Pathology

1 - Plant Protection-univesity of Tehran
2 - Plant protection Department, Tehran university, Iran

Received: 2023-10-21 Accepted : 2023-12-17 Published : 2024-08-07

Keywords: Biological function, Effector, Interaction, Plant Pathogen,

Abstract :

Molecular interactions between fungal pathogens and host plants is a very complex and dynamic process that manifests itself in two different ways such as adaptive and incompatible responses. In the adaptive state, plants become diseased as a result of pathogen attack. On the other hand, through the incompatibility state, plants show resistance after pathogen attack. One of the key aspects in these interactions is the secretion of small protein molecules by fungal pathogens. These small molecules, commonly known as effectors, are acquired during evolution by fungal pathogens. These effectors play a very vital role in changing the physiology of host plants and suppressing their defense responses. This review article examines the genetic basis of these molecular interactions between the effectors of fungal pathogens and host plants, emphasizing the patho-system consisting of the fungal pathogen Cladosporium fulvum and the tomato plant. This study can help to better understanding how the disease occurs or the resistance of host plants against fungal pathogens and provides a basis for the development of new approaches to control plant diseases.

Graphical Abstract:

highlight:

References:

Balesdent, M.H., Fudal, I., Ollivier, B., Bally, P., Grandaubert, J., Eber, F., Chèvre, A.M., Leflon, M. and Rouxel, T. 2013. The dispensable chromosome of L eptosphaeria maculans shelters an effector gene conferring avirulence towards Brassica rapa. New Phytologist 198(3): 887-898.
Ballance, G., Lamari, L. and Bernier, C. 1989. Purification and characterization of a host-selective necrosis toxin from Pyrenophora tritici-repentis. Physiological and Molecular Plant Pathology 35(3): 203-213.
Barlowe, C and Miller, E. 2013. Secretory protein biogenesis and traffic in the early secretory pathway. Genetics 193(2): 383-410.
Bart, P.H.J., Thomma, H., van Esse, P., Crous, P. and de Wit, P. 2005. Cladosporium fulvum (syn. Passalora fulva), a highly specialized plant pathogen as a model for functional studies on plant pathogenic Mycosphaerellaceae. Molecular Plant Pathology 6(4): 379-393.
Basse, C.W., Kolb, S. and Kahmann, R. 2002. A maize‐specifically expressed gene cluster in Ustilago maydis. Molecular Microbiology 43(1): 75-93.
Basse, C.W., Stumpferl, S. and Kahmann, R. 2000. Characterization of a Ustilago maydis gene specifically induced during the biotrophic phase: evidence for negative as well as positive regulation. Molecular and Cellular Biology 20(1): 329-339.
Bolton, M.D., Van Esse, H.P., Vossen, J.H., De Jonge, R., Stergiopoulos, I., Stulemeijer, I.J., Van Den Berg, G.C., Borrás‐Hidalgo, O., Dekker, H.L., De Koster, C.G. and De Wit, P.J. 2008. The novel Cladosporium fulvum lysin motif effector Ecp6 is a virulence factor with orthologues in other fungal species. Molecular microbiology 69(1): 119-136.
Ciuffetti, L.M., Manning, V.A., Pandelova, I., Betts, M.F. and Martinez, J.P. 2010. Host‐selective toxins, Ptr ToxA and Ptr ToxB, as necrotrophic effectors in the Pyrenophora tritici‐repentis–wheat interaction. New Phytologist 187(4): 911-919.
Cooke, M. 1883. New american fungi. Grevillea 12: 22-33.
de Jonge, R., Bolton, M.D., Kombrink, A., van den Berg, G.C., Yadeta, K.A. and Thomma, B.P. 2013. Extensive chromosomal reshuffling drives evolution of virulence in an asexual pathogen. Genome Research 23(8): 1271-1282.
de Jonge, R. and Thomma, B.P. 2009. Fungal LysM effectors: extinguishers of host immunity? Trends in Microbiology 17(4): 151-157.
De Jonge, R., Peter van Esse, H., Kombrink, A., Shinya, T., Desaki, Y., Bours, R., Van Der Krol, S., Shibuya, N., Joosten, M.H. and Thomma, B.P. 2010. Conserved fungal LysM effector Ecp6 prevents chitin-triggered immunity in plants. Science 329(5994): 953-955.
de Wit, P.J. 1992. Molecular characterization of gene-for-gene systems in plant-fungus interactions and the application of avirulence genes in control of plant pathogens. Annual Review of Phytopathology 30(1): 391-418.
de Wit, P.J.G.M. 2016. Cladosporium fulvum Effectors: Weapons in the Arms Race with Tomato. Annual Review of Phytopathology 54(1):1-23.
de Wit, P.J.G.M., Mehrabi, R., Van Den Burg, H. and Stergiopoulos, I. 2009. Fungal effector proteins: past, present and future. Molecular Plant Pathology 10(6): 735–747.
Dean, R.A., Talbot, N.J., Ebbole, D.J., Farman, M.L., Mitchell, T.K., Orbach, M.J., Thon, M., Kulkarni, R., Xu, J.R., Pan, H. and Read, N.D. 2005. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature 434: 980–986.
Dodds, P. 2023. From Gene-for-Gene to Resistosomes: Flor's Enduring Legacy. MPMI 36(8): 461–467.
D'Silva, I. and Heath, M.C. 1997. Purification and characterization of two novel hypersensitive response-inducing specific elicitors produced by the cowpea rust fungus. Journal of Biological Chemistry 272(7): 3924-3927.
Duplessis, S., Cuomo, C.A., Lin, Y.C., Aerts, A., Tisserant, E., Veneault-Fourrey, C., Joly, D.L., Hacquard, S., Amselem, J., Cantarel, B.L. et al. 2011. Obligate biotrophy features unraveled by the genomic analysis of rust fungi. PNAS 108(22): 9166-9171.
Friesen, T.L., Meinhardt, S.W. and Faris, J.D. 2007. The Stagonospora nodorum‐wheat pathosystem involves multiple proteinaceous host‐selective toxins and corresponding host sensitivity genes that interact in an inverse gene‐for‐gene manner. The Plant Journal 51(4): 681-692.
Ghiasi Noei, F., Imami, M., Didaran, F., Ghanbari, M.A., Zamani, E., Ebrahimi, A., Aliniaeifard, S., Farzaneh, M., Javan-Nikkhah, M., Feechan, A. and Mirzadi Gohari, A. 2022. Stb6 mediates stomatal immunity, photosynthetic functionality, and the antioxidant system during the Zymoseptoria tritici-wheat interaction. Frontier in Plant Science 13: 1004691.
Hetmann, A. and Kowalczyk, S. 2019. Suppression of PAMP-triggered immunity (PTI) by effector proteins synthesized by phytopathogens and delivered into cells of infected plant. Postepy Biochemii 22: 65(1): 58-71.
Joosten, M.H. and de Wit, P.J. 1999. The tomato– Cladosporium fulvum interaction: A versatile experimental system to study plant-pathogen interactions. Annual Review of Phytopatholog 37(1): 335-367.
Joosten, M., Vogelsang, R., Cozijnsen, T.J., Verberne, M.C. and de Wit, P.J. 1997. The biotrophic fungus Cladosporium fulvum circumvents Cf-4-mediated resistance by producing unstable AVR4 elicitors. The Plant Cell 9(3): 367-379.
Kämper, J., Kahmann, R., Bölker, M., Ma, L.J., Brefort, T., Saville, B.J., Banuett, F., Kronstad, J.W., Gold, S.E., Müller, O. and Perlin, M.H. 2006. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature 444: 97–101.
Kema, G.H.J., Mirzadi Gohari, A., Aouini, L., Hay, G., Ware, S.B., Van Den Bosch, F., Manning-Smith, R., Alonso-Chavez, V., Helps, J., Ben M'Barek, S., Mehrabi, R., Diaz-Trujillo, C., Zamani, E., et al. 2018. Stress and sexual reproduction affect the dynamics of the wheat pathogen effector AvrStb6 and strobilurin resistance. Nature Genetics 50: 375-380.
Kruger, J., Thomas, C.M., Golstein, C., Dixon, M.S., Smoker, M., Tang, S., Mulder, L. and Jones, J.D. 2002. A tomato cysteine protease required for Cf-2-dependent disease resistance and suppression of autonecrosis. Science 296(5568): 744-747.
Lo Presti, L., Lanver, D., Schweizer, G., Tanaka, S., Liang, L., Tollot, M., Zuccaro, A., Reissmann, S. and Kahmann, R. 2015. Fungal effectors and plant susceptibility. Annual Review of Plant Biology 66: 513-545.
Luderer, R., Takken, F.L., de Wit, P.J.d. and Joosten, M.H. 2002. Cladosporium fulvum overcomes Cf‐2‐mediated resistance by producing truncated AVR2 elicitor proteins. Molecular Microbiology 45(3): 875-884.
Ma, L.J., Van Der Does, H.C., Borkovich, K.A., Coleman, J.J., Daboussi, M.J., Di Pietro, A., Dufresne, M., Freitag, M., Grabherr, M., Henrissat, B. and Houterman, P.M. 2010. Comparative genomics reveals mobile pathogenicity chromosomes in Fusarium. Nature 464(7287): 367-373.
Mapuranga, J., Zhang, L., Zhang, N. and Yang Wenxiang, Y. 2022. The haustorium: The root of biotrophic fungal pathogens. Plant Pathogen Interactions 13(29): 963705.
Marshall, R., Kombrink, A., Motteram, J., Loza-Reyes, E., Lucas, J., Hammond-Kosack, K.E., Thomma, B.P. and Rudd, J.J. 2011. Analysis of two in planta expressed LysM effector homologs from the fungus Mycosphaerella graminicola reveals novel functional properties and varying contributions to virulence on wheat. Plant Physiology 156(2): 756-769.
Mendgen, K. and Hahn, M. 2002. Plant infection and the establishment of fungal biotrophy. Trends in plant science 7(8): 352-356.
Mentlak, T.A., Kombrink, A., Shinya, T., Ryder, L.S., Otomo, I., Saitoh, H., Terauchi, R., Nishizawa, Y., Shibuya, N., Thomma, B.P. and Talbot, N.J. 2012. Effector-mediated suppression of chitin-triggered immunity by Magnaporthe oryzae is necessary for rice blast disease. The Plant Cell 24(1): 322-335.
Gohari, A.M., Ware, S.B., Wittenberg, A.H., Mehrabi, R., M'Barek, S.B., Verstappen, E.C., Van der Lee, T.A., Robert, O., Schouten, H.J., De Wit, P.P. and Kema, G.H. 2015. Effector discovery in the fungal wheat pathogen Zymoseptoria tritici. Molecular Plant Pathology 16(9): 931-945.
Mukhi, N., Gorenkin, D. and Banfield, M.J. 2020. Exploring folds, evolution and host interactions: understanding effector structure/function in disease and immunity. New Phytologist 227 (2): 326–333.
Pedersen, C., ver Loren van Themaat, E., McGuffin, L.J., Abbott, J.C., Burgis, T.A., Barton, G., Bindschedler, L.V., Lu, X., Maekawa, T., Wessling, R., Cramer, R., Thordal-Christensen, H., Panstruga, R. and Spanu, P.D. 2012. Structure and evolution of barley powdery mildew effector candidates. BMC Genomics 13: 694.
Oerke, E.C. 2006. Crop losses to pests. The Journal of Agricultural Science 144(1): 31-43.
Rivas, S. and Thomas, C.M. 2005. Molecular interactions between tomato and the leaf mold pathogen Cladosporium fulvum. Annual Review of Phytopathology 43: 395-436.
Rooney, C.E., Van`t Klooster, J.W., van der Hoom, R.A., Joosten, M.H., Jones, J.D., de Wit, P.J. 2005. Cladosporium Avr2 inhibits tomato Rcr3 protease required for Cf-2-dependent disease resistance Science 308(5729): 1783-1786.
Raffaele, S., Farrer, R.A., Cano, L.M., Studholme, D.J., MacLean, D., Thines, M., Jiang, R.H., Zody, M.C., Kunjeti, S.G., Donofrio, N.M., Meyers, B.C., Nusbaum, C. and Kamoun, S. 2010. Genome evolution following host jumps in the Irish potato famine pathogen lineage.SCIENCE 330(6010): 1540-1543.
Sánchez-Vallet, A., Fouché, S., Fudal, I., Hartmann, F.E., Soyer, J.L., Tellier, A. and Croll, D. 2018. The genome biology of effector gene evolution in filamentous plant pathogens. Annual Review of Phytopathology 56: 21-40.
Schottens-Toma I.M. and de Wit, P.J. 1988. Purification and primary structure of a necrosis-inducing peptide from the apoplastic fluids of tomato infected with Cladosporium fulvum (syn. Fulvia fulva). Physiological and Molecular Plant Pathology 33(1): 59-67.
Schirawski, J., Mannhaupt, G., Münch, K., Brefort, T., Schipper, K., Doehlemann, G. Di Stasio, M., Rössel, N., Mendoza-Mendoza, A., Pester, D. and Müller, O. 2010. Pathogenicity determinants in smut fungi revealed by genome comparison. Science 330(6010): 1546-1548.
Song, J., Win, J., Tian, M., Schornack, S., Kaschani, F., Ilyas, M., van der Hoorn, R.A. and Kamoun, S. 2009. Apoplastic effectors secreted by two unrelated eukaryotic plant pathogens target the tomato defense protease Rcr3. PANS 106(5): 1654-1659.
Sperschneider, J., Dodds, P.N., Gardiner, D.M., Singh, K.B. and Taylor, J.M. 2018. Improved prediction of fungal effector proteins from secretomes with EffectorP 2.0. Molecular Plant Pathology 19(9): 2094-2110.
Strange, R.N. and Scott, P.R. 2005. Plant disease: a threat to global food security. Annual Review of Phytopathology. 43: 83-116.
Stephenson, S.A., Hatfield, J., Rusu, A.G., Maclean, D.J. and Manners, J.M. 2000. CgDN3: an essential pathogenicity gene of Colletotrichum gloeosporioides necessary to avert a hypersensitive-like response in the host Stylosanthes guianensis. Molecular Plant-Microbe Interactions 13(9): 929-941.
Stergiopoulos, I., de Kock, M.J., Lindhout, P. and de Wit, P.J. 2007. Allelic variation in the effector genes of the tomato pathogen Cladosporium fulvum reveals different modes of adaptive evolution. Molecular Plant-Microbe Interactions 20(10): 1271-1283.
Stergiopoulos, I. and de Wit, P.J. 2009. Fungal effector proteins. Annual Review of Phytopathology 47: 233-263.
Takken, F.L., Luderer, R., Gabriëls, S.H., Westerink, N., Lu, R., De Wit, P.J. and Joosten, M.H. 2000. A functional cloning strategy, based on a binary PVX‐expression vector, to isolate HR‐inducing cDNAs of plant pathogens. The Plant Journal 24(2): 275-283.
Thomas, C.M., Dixon, M.S., Parniske, M., Golstein, C. and Jones, J.D. 1998. Genetic and molecular analysis of tomato Cf genes for resistance to Cladosporium fulvum. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B: Biological Sciences 353(1374): 1413-1424.
Thomma, B.P., van Esse, H.P., Crous, P.W. and de Wit, P.J. 2005. Cladosporium fulvum (syn. Passalora fulva), a highly specialized plant pathogen as a model for functional studies on plant pathogenic Mycosphaerellaceae. Molecular Plant Pathology 6(4): 379-393.
Tuori, R., Wolpert, T. and Ciuffetti, L. 1995. Purification and immunological characterization of toxic components from cultures of Pyrenophora tritici-repentis. Molecular Plant-Microbe Interactions 9(43): 10.3.
Van Kan, J.A. 2006. Licensed to kill: the lifestyle of a necrotrophic plant pathogen. Trends in plant science 11(5): 247-253.
Van den Burg, H.A., Harrison, S.J., Joosten, M.H., Vervoort, J. and de Wit, CP.J. 2006. ladosporium fulvum Avr4 protects fungal cell walls against hydrolysis by plant chitinases accumulating during infection. Molecular Plant-Microbe Interactions 19(12): 1420-1430.
Van der Does, H.C., Duyvesteijn, R., Goltstein, P., Schie, C., Manders, E., Cornelissen, B and Rep, M. 2008. Expression of effector gene SIX1 of Fusarium oxysporum requires living plant cells. Fungal Genetics Biology 45(9): 1257-1264.
van Esse, H.P., Bolton, M.D., Stergiopoulos, I., de Wit, P.J. and Thomma, B.P. 2007. The chitin-binding Cladosporium fulvum effector protein Avr4 is a virulence factor. Molecular Plant-Microbe Interactions 20(9): 1092-1101.
Vleeshouwers, V.G. and Oliver, R.P. 2014. Effectors as tools in disease resistance breeding against biotrophic, hemibiotrophic, and necrotrophic plant pathogens. Molecular pLant-Microbe Interactions 27(3): 196-206.
Wollenberg, T. and Schirawski, J. 2014. Comparative genomics of plant fungal pathogens: The Ustilago sporisorium paradigm. PLoS Pathogy 10(7): e1004218.
Yoshida, M., Takayanagi, Y., Inoue, K., Kimura, T., Young, L.J., Onaka, T. and Nishimori, K. 2009. Evidence that oxytocin exerts anxiolytic effects via oxytocin receptor expressed in serotonergic neurons in mice. Journal of Neuroscience 29(7): 2259-2271.
Yu, I., Parker. J. and Bent A.F. 1998. Gene-for-gene disease resistance without the hypersensitive response in Arabidopsis dnd1 mutant. PNAS 95(13): 7819-7824.
Zhao, T., Pei, T., Jiang, J., Yang, H., Zhang, H., Li, J. and Xu, X. 2022. Understanding the mechanisms of resistance to tomato leaf mold: A review. Horticultural Plant Journal 8(6): 667-675.

Full-Text:

گیاهپزشکی کاربردی، جلد 12، شماره 2، سال 1402

بررسی اثر بازدارندگی عصاره آبی گیاه اکالیپتوس Eucalyptus camaldulensis بر نماتد ریشهگرهی Meloidogyne incognita در گیاه توتون

Investigating the inhibitory effect of aqueous extract of Eucalyptus camaldulensis on root-knot nematode Meloidogyne incognita in tobacco

مرضیه شازده احمدی*

دریافت: 19/9/1402 پذیرش: 16/12/1402

چکیده

نماتدهاي ريشه‌گرهی، Meloidogyne spp.، از مهمترين نماتدهاي انگل گياهي در جهان هستند و به علت پراکنش و تنوع ميزباني وسیع از بيمارگرهاي مهم در گياهان به شمار ميروند. استفاده از ترکيبات طبيعي موجود در عصارههاي گياهي به دليل ارزانی، قابل دسترس بودن و عدم وجود آثار سوء، براي کنترل نماتدهاي انگل گياهي مناسب ميباشند. در این تحقیق، اثر بازدارندگی عصاره آبی برگ و ساقه اکالیپتوس، Eucalyptus camaldulensis، روی نماتد ریشهگرهی توتون Meloidogyne incognita در شرایط آزمایشگاه مورد بررسی قرار گرفت. آزمایشات زیستسنجی، جهت بررسی اثر عصارهها بر میانگین تفریخ تخم و نرخ مرگ و میر لارو سن دوم نماتد M. incognita با پنج غلظت متفاوت از هر دو عصاره، در قالب طرح کاملاً تصادفی با چهار تکرار انجام شد. غلظت کشنده 50 درصد (LC50) پس از 24 ساعت با استفاده از برنامه پروبیت محاسبه شد. عصاره برگ اکالیپتوس با LC50 معادل 768 و 2150 پیپیام، به ترتیب علیه لارو سن دوم و تخم نماتد، مؤثرتر از عصاره ساقه بود. در بالاترین غلظت مورد آزمایش 20 درصد، میزان بازدارندگی از تفریخ تخم و مرگ و میر لارو سن دوم نماتد تحت تأثیر عصاره برگ اکالیپتوس به ترتیب، 5/94 و 100 درصد محاسبه گردید. در مجموع، نتایج بهدست آمده از این تحقیق نشان داد که عصاره هر دو اندام گیاهی بهویژه عصاره برگ اکالیپتوس از قدرت بازدارندگی خوبی علیه نماتد ریشهگرهی توتون برخوردار میباشند.

واژگان کلیدی: نماتدکش، کنترل زیستی، عصاره، اکالیپتوس، Meloidogyne

مقدمه

در بین نماتدهای انگل گیاهی، نماتدهای ریشه‌گرهی جنس Meloidogyne، یکی از مهمترین محدودیتهای کشت محصول در سراسر جهان محسوب میشود و سالانه خسارتهای چشمگیری از لحاظ کمی و کیفی به محصولات مختلف کشاورزی وارد میکند (ایزدپناه و همکاران، 1389). این نماتدها با پراکنش جهانی، انگل اجباری هستند و دامنه میزبانی وسیعی دارند که بیش از 3000 گونه گیاهی را شامل میشوند (Sikora and Fernandez, 2005). تقریباً تمامی محصولات زراعی، باغی و علفهای هرز، مورد حمله یک یا چند گونه از نماتدهای جنس Meloidogyne قرار میگیرند (Sasser, 1979). تاکنون هفت گونه از این جنس در ایران از گیاهان میزبان مختلف جمعآوری، شناسایی و گزارش شدهاند. در بسیاری از مناطق کشور، گونههای M. hapla، M. javaniva، M. arenaria و M. incognita به دامنه وسیعی از میزبانها در باغات، مزارع و گلخانهها خسارت میزنند (قادری و همکاران، 1391). گونههای مختلف نماتدهای انگل گیاهی، سالانه خسارات زیادی را به انواع محصولات کشاورزی وارد می‌کنند که در یک بررسی این مقـدار حدود 173 میلیارد دلار آمریـکـا در سـال بـرآورد شده

محقق، بخش بیوتکنولوژی، مرکز تحقیقات و آموزش توتون تیرتاش، بهشهر، مازندران، ایران

نویسنده مسئول مکاتبات: noshinshazdeahmadi@yahoo.com

است (Elling, 2013).

میزان خسارت وارده به محصولات زراعی توسط این نماتدها، حدود 50-30 درصد گزارش شده است. کنترل نماتدهای ریشه گرهی، به دلیل دامنه وسیع میزبانی، دوره کوتاه چرخه زندگی، نرخ تولید مثل زیاد و نیز انگل داخلی بودن، دشوار میباشد (Siddiqui et al., 2001). نماتدهای ریشه گرهی، انگل داخلی ساکن بوده و رابطه تغذیهای با میزبان خود برقرار کرده و آن را وادار به تولید ساختارهای تغذیهای تخصص یافتهای به نام سلولهای غولآسا میکنند که برای تغذیه و رشد نماتد ضروری میباشد (Dropkin, 1989). خسارت این نماتدها هم بهصورت مستقیم در اثر تغذیه نماتد از بافتهای گیاهی و هم بهصورت غیرمستقیم در اثر تعامل و برهمکنش نمـاتد در خـاک با عوامـل بـیماری‌زای خـاکزی در گیـاهـان مـیباشد (Abbas et al., 2009). خسارتهای مستقیم و غیرمستقیم ناشی از این نماتدها، به میزان قابل توجهی موجب کاهش کیفیت و کمیت تولیـدات کشاورزی میشـود، بهطـوریکه موجب طراحی پروژه بینالـمـلـلی نـماتـدهای ریشه گرهی (International Meloidogyne Project= IMP) گردید. خسارت این نـماتد در مـزارعی که کـاشـت مـداوم مـحصولات حساس صورت گیرد، بیشتر خواهد بود و در صورت عدم کنترل مؤثر، موجـب از بین رفتن کل محصول میگردد (Pakeerathan et al., 2009).

روش‌های مدیریت نماتدها عبارتند از کاربرد روشهای مختلف فیزیکی مانند غرقاب زمین، شخم عمیق، استفاده از گیاهان تله و بازدارنده، بخاردهی و آفتابدهی؛ اما سه روش اصلی کنترل نماتدهای انگل گیاهی استفاده از ارقام مقاوم، تناوب زراعی و سموم نماتدکش است (Ripoll et al., 2003). متأسفانه استفاده از سموم شیمیایی به عنوان یکی از روشهای اصلی مبارزه با بیمارگرهایی مانند نماتدها است. به طوری که امروزه به میزان زیاد از نماتدکشهای شیمیایی استفاده میشود. با توجه به این که کاربرد وسیع نماتدکشها ممکن است باعث ایجاد مقاومت گردد و از طرفی اثرات مضر سموم بر محیط زیست و موجودات زنده اجتناب ناپذیر است، بسیاری از این ترکیبات منسوخ شده و یا مصرف آنها توصیه نمیشود. بنابراین، ضروری است که روشهای جدید و مؤثری جایگزین این ترکیبات شوند تا از اثرات نامطلوب آنها به محیط زیست جلوگیری شود (هاشمی و همکاران، 1396).

اخیراً، دانشمندان باتوجه به مسائل اقتصادی و زیست محیطی، استفاده از فرآوردههای گیاهی را مورد توجه قرار دادهاند. استفاده از مهار زیستی، از روشهای نوین برای مدیریت نماتدها میباشد که دارای مکانیسم عمل اختصاصی، کاربرد آسان، بدون خطرات آلودگی محیط زیست و توانایی تأثیر مفید در ساختار و مواد مغذی خاک میباشد (Jatala, 1986). گیاهان، حاوی طیف وسیعی از متابولیتهای ثانویه از جمله فنلها، فلاونوئیدها، کینونها، تاننها، اسانسها، آلکالوئیدها، ساپونینها و استرولها میباشند. این مواد به دلیل داشتن منشأ طبیعی، زیست‌تجزیه‌پذیر بوده ومعمولاً بقایای سمی یا فرآوردههای جانبی آلوده کننده محیط زیست بر جا نمیگذارند. بسیاری از متابولیتهای موجود در گیاهان در دفاع گیاه در مقابل آفات و بیماریها مؤثر هستند. با توجه به این که ترکیبات فعال با منشأ گیاهی در محیط پایداری کمتری داشته و روی پستانداران و موجودات غیرهدف نیز معمولاً اثر سوء ندارند (Ibrahim et al., 2006). بهطور کلی، گیاهان آنتاگونیست، خاصیت نماتدکشی مستقیم ندارند، بلکه با اختلال در چرخههای آنزیمی بهویژه آنزیمهای گروه استراز سبب ایجاد اختلال در فرایندهای طبیعی نماتدها شده و در اثر کاهـش تحرك و میزبانیابی، کاهش تغذیه و تولید مثل، سبب کاهش خسارات نماتد میگردند (سعیدیزاده و همکاران، 1400الف).

طبق تعریف، گیاهان آنتاگونیست نماتدها، گیاهانی هستند که ترکیبهایی تولید میکنند که با نفوذ به خاك یا تمرکز در بافت گیاهی، از رشد نماتد جلوگیري میکنند یا اثر نماتدکشی دارند و در نهایت موجب کاهش تراکم جمعیت نماتد میشوند (شعلهورفرد و همکاران، 1391). یکی دیگر از موارد، واکنش فوقحساسیت است که پس از حمله نماتد و تخریب بافت ریشه اتفاق میافتد، در نتیجه ترکیبهاي نماتدکش مثل آلکالوییدها، ترپنها، فنلها و آمینواسیدها آزاد میشوند. گیاهان ضد نماتد میتوانند به صورت تناوب با گیاه اصلی، بهصورت کشت مخلوط و همراه با محصول اصلی و یا قبل از کاشت محصول بهصورت کود سبز استفاده شده و یا عصارهها و محصولات تجاری سازی شده آنها مورد استفاده قرار گیرند. استفاده از ترکیبات آلی با منشأ گیاهی، به دلیل عوارض جانبی کمتر، عدم مقاومت بیمارگر، پایین بودن نسبی هزینه تولید، تجزیه شدن در خاک و عدم آلودگی زیست محیطی، میتواند بهعنوان جایگزین مناسب سموم شیمیایی مطرح شود (Ripoll et al., 2003).

گزارشهای بسیاری، فعالیت نماتدکشی گیاهان علیه نماتدهای انگل گیاهی را نشان داده‌اند. تأثیر اسانس‌های گیاهان خانواده Asteraceae در سرکوب نماتدهای ریشهگرهی به اثبات رسیده است (Perez et al., 2003). اثرات عصاره حاصل از 55 گیاه بومی از جمله گیاهان تیره Myrtaceae، علیه لاروهای سن دوم نماتد M. incognita در شرایط آزمایشگاه بررسی گردید. نتایج نشان داد که عصاره گیاه Eugenia winzerlingji در بین گیاهان مورد آزمایش، بهترین اثر را در مرگ و میر لاروها داشتند (علی کرمی و همکاران، 1395). در پژوهش دیگری، عصاره آبی گیاهان زیره سبز، زیره سیاه، رازیانه و زنیان علیه نماتد M. javanica مورد استفاده قرار گرفت. عصاره آبی زیره سبز، بهترین اثر را در کاهش تعداد لارو سن دوم نماتد و همچنین، کاهش نرخ تولید مثل نماتد نشان داد (صادقی و همکاران، 1391). اثرات حفاظتی و درمانی فرمولاسیون عصاره چریش، علیه نماتد M. javanica در ریشههای گیاه گوجهفرنگی گزارش شده است (Javed et al., 2007). بر اساس گزارش صادقی و همکاران (1389)، اسانس گیاهان زیره سیاه Bunium persicum، زیـره سـبـز Cuminum cyminum، زنـیان Carum copticum و رازیانه Foeniculum vulgare، سمیت قابل توجهی روی نماتد ریشه گرهی در شرایط آزمایـشگاه داشتهاند. در پژوهشی، ضمن بررسی اثر نماتدکشی اسانسها و ترکیبات حاصل از 27 گونه گیاهی روی نماتد ریشه گرهی گونه M. javanica، بالاترین اثر نماتدکشی در شرایط آزمایشگاهی در اسانس گیاهان رازیانه و زنیان از خانواده چتریان مشاهده شد (Oka et al., 2000b). در پژوهش انجام شده توسط کتولی و همکاران (1389)، فعالیت ضد نماتدی گیاهان کرچک و درمنه علیه نماتد ریشه گرهی خیار در شرایط آزمایشگاه و گلخانه مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج آزمایشگاه، بالاترین فعالیت ضدنماتدی مربوط به عصاره الکلی برگ کرچک با 33/61 درصد و برگ درمنه با 67/55 درصد در غلظت 1000 پیپیام، پس از گذشت 72 ساعت بوده است. همچنین، اضافه کردن عصاره به گلدانها، بهخوبی توانست که تعداد گالها و جمعیت نماتد را کاهش دهد. همچنین، در تحقیقی، اثر عصاره برگی چهار گیاه مختلف در سه زمان 3، 6 و 9 روز بر تفریخ تخم و مرگ و میر لاروهای سن دوم نماتد M. javanica مورد بررسی قرار داده و مشاهده نمودند که با گذشت زمان، از تفریخ تخم و مرگ و میر لاروها کاسته شد (Nandal and Bhatti, 1986).

در تحقیق دیگری، اثر غلظتهای مختلف گیاهی روی نماتدها بررسی و گزارش شد که غلظت بالاتر عصاره، در برابر لارو سن دوم و تفریخ تخم نماتد ریشه گرهی، دارای اثر بازدارندگی بیشتری میباشد (Sharma and Trivedi, 2002). همچنین، اثر مشتقات گیاه چریش Azadirachta indica علیه نماتد ریشه گرهی M. javanica در گوجهفرنگی بررسی شد و علیرغم مشاهده کاهش معنیدار در جمعیت نهایی، تعداد گال و تودههای تخم نماتد در همه تیمارهای چریش، بیشترین افزایش رشد گیاه در مقایسه با شاهد در تیمار پودر مغز دانه چریش گزارش شده است (حسینینژاد، 1383). در پژوهشی توسط فتحی و همکاران (1374)، پنج ترکیب گیاهی شامل گرد ضایعات توتون، گرد ضایعات چای، گرد کنجاله میوه درخت چریش، گیاه گل جعفری در مقابل نماتدکش کربوفوران در خاک آلوده به نماتد مورد بررسی قرار گرفت و اثر ترکیبات با منشأ گیاهی نظیر چریش و توتون در کاهش خسارت نماتد Meloidogyne sp. برتر از نماتدکش شیمیایی فورادان ذکر شد. در مطالعهای، تخمهای نماتد M. incognita در گیاه سویا، در معرض غلظتهای عصاره ریشه علفهرز سیام Chrmolaena odorata، چریش Azadirachta indica، کرچک Ricinus communis و علف لیمو Cymbopogon citratrus قرار داده شد و نتایج نشان داد که همه گیاهان مطالعه شده دارای خاصیت بازدارندگی از تفریخ تخم نماتد بودند (Adegbite and Adesiyan, 2005). اثر بازدارندگی عصاره متانولی سه گیاه دارویی شامل، سـداب Ruta graveolens، پـونه Mentha pulegium و ریـشـه انـار Punica granatum روی درصد مرگ و میر لارو سن دوم نماتد M. javanica در شرایط آزمایشگاه مورد بررسی قرار گرفت و بین تیمارهای مورد بررسی، اختلاف معنیدار در سطح یک درصد مشاهده گردید. در بین گیاهان مورد بررسی، بیشترین درصد مرگ و میر مربوط به گیاه سداب بوده و با افزایش غلظت عصاره، خواص نماتدکشی افزایش یافت (زارع بیدکی، 1389).

گیاه اکالیپتوس، E. camaldulensis، از درختان بومی استرالیا هستند و رشد بسیار سریعی دارند. اندازه اکالیپتوس متناسب با گونه‌های مختلف آن متفاوت است. برگ اکالیپتوس حاوی فلاوونوئیدها و تانن‌هاست. فلاونوئیدها آنتی اکسیدان‌های گیاهی هستند و تانن‌ها نیز ترکیباتی هستند که به کاهش التهابات کمک می‌کنند. خواص اکالیپتوس بسیار زیاد بوده و از جمله خواص اکالیپتوس می‌توان به مواردی مانند ضدنفخ، تببر، خلطآور، کاهش قند خون، درمان سرماخوردگی، درمان عفونت‌های تنفسی و داشتن خاصیت آنتیبیوتیکی اشاره نمود (خیاط و همکاران، 1393).

با توجه به اهمیت و خسارت بسیار زیاد نماتد ریشه گرهی در گیاه توتون و همچنین، محدودیتهای استفاده از نـمـاتدکشهای شیمیایی به دلیل سمیت بالا، میزان بالای مصرف و خطرات زیستمحیطی، بروز و ظهور گونههای مقاوم آفت و غیره ناشی از مصرف بیرویه سموم شیمیایی، استفاده از روشهای غیر شیمیایی و طبیعی جهت کنترل این نماتد، ضروری به نظر میرسد. لذا، تحقیق حاضر با هدف بررسی اثر بازدارندگی غلظتهای مخـتلف عصـاره آبـی برگ و سـاقه اکالیپتوس E. camaldulensis روی نرخ تفریخ تخم و میزان مرگ و میر لاروهای سن دوم نماتد ریشه گرهی M. incognita در گیاه توتون انجام شد.

مواد و روشها

تهیه جمعیت Meloidogyne incognita

ریشههای آلوده به نماتد ریشه گرهی از مزارع توتون در استان گلستان (شهرستانهای گرگان و علیآباد کتول)، جمعآوری شدند و پس از انتقال به آزمایشگاه بخش گیاهپزشکی مرکز تحقیقات و آموزش توتون تیرتاش، ریشههای آلوده با جریان ملایم آب شستشو داده شدند. پس از قطعه قطعه کردن ریشهها، با استفاده از استریومیکروسکوپ (ساخت شرکت Optika، مدل SZM-2)، از هـر یـک از ریشـههای آلـوده، چنـدین نمـاتد مـاده جدا گردید و از ناحیه شبکه کوتیـکـولی انتـهای بدن، اسلاید میکروسکوپی تهیه و بررسی شـد و با اسـتـفاده از کلـیدهای معتـبر شـناسـایی، اقـدام به تشخـیص گونه نماتد گـردید (Jepson, 1987). سپس، از توده تخم همان نماتدها برای خالصسازی و تکثیر نماتدها استفاده شد. برای خالصسازی نماتدها، از روش تک توده تخم (Single egg mass) استفاده شد. برای استخراج تخمهای نماتد، ریشههای آلوده شسته و قطعه قطعه شدند. 10 میلیلیتر از محلول هیپوکلریت سدیم یک درصد به ریشههای حاوی کیسه تخم درون مخلوطکن اضافه و به مدت 30 ثانیه با سرعت متوسط خرد شد. بعد از این مرحله، محتویات داخل خردکن به ترتیب از الک 100 مش و الک 500 مش عبور داده و محتویات سطح الک 500 مش جمع‌آوری شد (Hussey and Barker, 1973). برای تهیه لارو سن دوم نماتد، یک کاغذ صافی بر روی توری فلزی قرار داده و درون یک ظرف پتری گذاشته شد. سپس، سوسپانسیون تخم نماتد روی کاغذ صافی و در ظروف پتری حاوی آب مقطر ریخته شد و به مدت 5-4 روز در انکوباتور با دمای 28 درجه سلسیوس نگهداری شد. به این ترتیب، تخمها روی کاغذ صافی مرطوب تفریخ گردید و لاروهای سن دوم نماتد، پس از عبور از کاغذ صافی، در کف ظروف پتری قرار گرفتند (Vrain, 1977).

تهیه عصارههای گیاهی

براي تهیه عصاره آبی، برگ و ساقه گیاه اکالیپتوس، خشک شده و آسیاب گردید و 10 گرم از پودر بخشهاي خشک شده به تفکیک درون کیسه پارچهاي ململ دو لایه ریخته شد. کیسهها در ارلن شیشهاي حاوي 100 میلیلیتر آب مقطر قرار گرفت و به مدت 48 ساعت در دماي 28 درجه سلسیوس روی شیکر با دور 150 قرار داده شدند. پس از 48 ساعت، عصاره از کاغذ صافی واتمن شماره یک عبور داده شد تا ناخالصیهاي عصاره گرفته شود. مایع شفاف بهعنوان محلول پایه 10 درصد (وزن به حجم) در نظر گرفته شد. عصارههای تهیه شده در درون بالن شیشهاي با روپوش آلومینیومی در دماي چهار درجه سلسـیوس در داخـل یخـچال نگهـداري شـدند و در زمان مـصرف، با افزودن آب مقطر، بقیه غلظتهای مورد نیاز تهیه گردید (Grewal, 1989).

آزمایشات زیستسنجی

بررسي اثر عصارهها بر مرگ و مير لارو سن دوم نماتـد M. incognita در شـرايط آزمايشگاه

بررسی اثر نماتدکشی عصارهها روی لارو سن دوم نماتد بر اساس روش (Abbas et al., 2009) صورت گرفت. بدین منظور، حدود 500 میکرولیتر از عصاره ساقه و برگ اکالیپتوس، در میکروتیوب ریخته و 500 میکرولیتر سوسپانسیون حاوی 200 عدد لارو سن دوم نماتد M. incognita به هر میکروتیوب اضافه شد. عصارههای آبی برگ و ساقه اکالیپتوس، هر کدام در پنج غلظت مختلف با مقادیر غلظتهای یک، پنج، 10، 15 و 20 درصد مورد استفاده قرار گرفتند. آب مقطر استریل بهعنوان شاهد در نظر گرفته شد. برای هر تیمار، چهار تکرار در نظر گرفته شد. پس از قرار دادن لارو نماتدها در معرض غلظتهای مختلف عصارهها، میکروتیوب حاوی عصاره و لارو سن دوم نماتد داخل انکوباتور با دمای 2±27 درجه سلسیوس قرار گرفت. شمارش لاروهای نماتد زنده (فعال) و مرده بعد از گذشت 24 و 48 ساعت، با استفاده از لام شمارش و میکروسکوپ انجام و درصد مرگ و میر لاروهای سن دوم نماتد محاسبه شد. نماتدهایی که در اثر تحریک با نوک سوزن، واکنش و حرکتی نشان نمیدادند، بهعنوان مرده ثبت شدند. ارتباط بین غلظتهای مختلف عصاره و مرگ و میر لارو سن دوم نماتد، تحت آنالیز پروبیت قرار گرفت و سطح غلظت LC50 بهدست آمد (خیاط و همکاران، 1393).

بررسی اثر عصارهها بر تفریخ تخم نماتد M. incognita در شرایط آزمایشگاه

بررسی اثر عصارهها بر تفریخ تخم نماتد بر اساس روش (Costa et al., 2004) انجام شد. بدین منظور، حدود 500 میکرولیتر سوسپانسیون نماتد حاوی 500 عدد تخم در چاهکهای پلیت 24 خانهای پلاستیکی ریخته و سپس 500 میکرولیتر از رقتهای مختلف عصارههای گیاهی (پنج غلظت از هر عصاره) به هر چاهک اضافه شد تا به غلظتهای مورد نظر برسند. از آب مقطر بهعنوان شاهد استفاده شد. برای هر تیمار، چهار تکرار در نظر گرفته شد. درب ظروف پلیت پوشانده شد و داخل انکوباتور با دمای 2±27 درجه سلسیوس قرار داده شد. تعداد تفریخ تخمها طی 24 و 48 ساعت بعد از انجام آزمایش شمارش شد. در نهایت، درصد تفریخ تخمها برای هر غلظت محاسبه شد. ارتباط بین غلظتهای مختلف عصاره و میزان تفریخ تخم نماتد، تحت آنالیز پروبیت قرار گرفت و سطح غلظت LC50 بهدست آمد (خیاط و همکاران، 1393).

تجزیه و تحلیل آماری

آزمایشات در قالب طرح کاملاً تصادفی در شرایط آزمایشگاه انجام شد. دادههای حاصله پس از وارد کردن در نرمافزار excel، توسط نرمافزار SAS ver. 9.1 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون حداقل اختلاف معنیدار (LSD) انجام گرفت. از روش تجزیه پروبیت و نرم افزار POLO-PC برای تخمین LC50 استفاده شد.

نتایج

تشخیص گونه نماتد مورد بررسی

با بررسی نقوش کوتیکولی ناحیه انتهای بدن نماتد ماده (Perineal pattern)، گونه نماتد مورد مطالعه، M. incognita تشخیص داده شد (شکل 1 و 2؛ Jepson, 1987).

تأثیر بازدارندگی عصارهها روی عدم تفریخ تخم و مرگ و میر لاروهای سن دوم نماتد M. incognita

نتایج نشان داد که در هر دو عصاره برگ و ساقه، با افزایش غلظت عصارهها، میزان مرگ و میر لارو سن دوم نماتد افزایش یافت.

$C:\Users\Click\Desktop\Pictur.jpg$

شکل 1- نماتد ماده ریشه گرهی M. incognita با بزرگنمایی × 40 (A)، الگوی انتهای بدن نماتد ماده گونه ‌incognita M. (B)

Fig. 1. Root-Knot nematode, M.. incognita X40 (A), Perineal pattern on female M. incognita nematodes (B)

طبق آنالیز پروبیت، شاخص LC50 عصارهها، نشان دهنده اثر کشندگی بالاتر عصاره برگ اکالیپتوس در مقایسه با عصاره ساقه علیه تخم و لاروهای سن دوم نماتد M. incognita بود. میزان LC50 عصاره برگ و ساقه اکالیپتوس روی لاروهای سن دوم نماتد به ترتیب، به میزان 768 و 1012 پیپیام بود. میزان LC50 عصاره برگ و ساقه اکالیپتوس روی تخم نماتد به ترتیب، به میزان 2150 و 3605 پیپیام بود (جدول 1).

جدول 1- آنالیز پروبیت مرگ و میر- غلظت در آزمایشات زیستسنجی جهت بررسی اثر بازدارندگی عصاره ساقه و برگ اکالیپتوس علیه لارو سن دوم و تخم نماتد ریشه گرهی توتون (Meloidogyne incognita)

Table 1. Mortality-concentration probit analysis in bioassay experiments to investigate the inhibitory effect of Eucalyptus stem and leaf extract against second-stage juvenile (J2) and eggs of tobacco root-knot nematode (Meloidogyne incognita).

مرحله سنی Age	نام عصاره اکالیپتوس	Eucalyptus Extract	X2	P-value	Slope ± SE	LC50 (ppm)
تخم Egg	عصاره برگ اکالیپتوس	(Leaf extract)	0.35	0.92	0.6 ± 1.8	2150
تخم Egg	عصاره ساقه اکالیپتوس	(Stem extract)	1.06	1.31	0.3 ± 1.2	3605
لارو سن دوم Second-stage juvenile (J2)	عصاره برگ اکالیپتوس	(Leaf extract)	4.2	0.72	0.7 ± 2.1	768
لارو سن دوم Second-stage juvenile (J2)	عصاره ساقه اکالیپتوس	(Stem extract)	2.13	0.98	0.4 ± 1.9	1012

نتایج تجزیه واریانس درصد مرگ و میر لاروهای سن دوم، نشان دهنده وجود اختلاف معنیدار (P≤ 0.01) بین عصارههای گیاهی مورد مطالعه علیه نماتد M. incognita بود (جدول 2). مقایسه میانگین بین عصارههای گیاهان مورد مطالعه نشان داد که عصاره برگ اکالیپتوس، بیشترین درصد مرگ و میر را ایجاد کرده و دارای اختلاف معنیدار (P≤ 0.01) با عصاره ساقه اکالیپتوس بود. میانگین اثر نماتدکشی عصاره برگ و ساقه اکالیپتوس در بالاترین غلظت (20 درصد) بعد از گذشت 24 ساعت، روی مرگ و میر لارو سن دوم نماتد M. incognita به ترتیب، 15/96 و 3/68 درصد بوده است. میانگین اثر نماتدکشی عصاره برگ و ساقه اکالیپتوس در بالاترین غلظت (20 درصد) بـعد از گذشـت 48 سـاعت، روی مرگ و میر لارو سـن دوم نماتد M. incognita به ترتیب، 100 و 1/72 درصد بوده است.

مقایسه میانگین غلظتهای مختلف عصارهها نشان دهنده بیشترین درصد مرگ و میر لاروها در غلظت 20 درصد عصارهها بعد از گذشت 48 ساعت بود. به طوریکه، بیشترین میزان مرگ و میر لارو نماتد، مربوط به غلظت 20 درصد عصاره برگ اکالیپتوس بعد از گذشت 48 ساعت با 100 درصد و کمترین میزان آن، مربوط به غلظت یک درصد عصاره ساقه اکالیپتوس با 2/35 درصد، بعد از گذشت 24 ساعت بود (جدول 3).

جدول 2- تجزیه واریانس اثر بازدارندگی غلظتهای مختلف عصاره ساقه و برگ اکالیپتوس روی درصد مرگ و میر لارو سن دوم نماتد ریشهگرهی توتون (Meloidogyne incognita) در شرایط آزمایشگاه

Table 2. Variance analysis of the inhibitory effect of different concentrations of Leaf and Stem extracts of E. camaldulensis on mortality of second-stage juvenile (J2) of Meloidogyne incognita in laboratory condition.

منابع تغییرات S. O. V	درجه آزادی (df)	میانگین مربعات (MS)
منابع تغییرات S. O. V	درجه آزادی (df)	24 ساعت (24 h)	48 ساعت (48 h)
تیمار Treatment	10	** 317.07	** 591.8
خطا Error	33	5.73	4.12
ضریب تغییرات (درصد) CV %		3.76	2.19

**: معنیدار در سطح احتمال یک درصد

**: Significant at the 1% probability level.

نتایج تجزیه واریانس روی درصد جلوگیری از تفریخ تخم نماتد M. incognita نشان داد که بین عصارههای گیاهی مورد مطالعه، اختلاف معنیداری در سطح احتمال یک درصد وجود داشت (P≤ 0.01) (جدول 4). مقایسه میانگینها نشان داد که اثر بازدارندگی از تفریخ تخم عصارههای گیاهی مورد مطالعه در غلظتهای مختلف، بعد از گذشت زمان و با افزایش غلظت، افزایش یافت، بهطوریکه عصاره برگ اکالیپتوس با غلظت 20 درصد، بعد از گذشت 48 ساعت، با 5/94 درصد، دارای بیشترین تأثیر و عصاره ساقه اکالیپتوس با غلظت یک درصد، بعد از گذشت 24 ساعت، با 2/34 درصد، دارای کمترین میزان تأثیر روی عدم تفریخ تخم نماتد M. incognita بوده است. عصاره برگ اکالیپتوس با غلظت 20 درصد با 100درصد تأثیر، بیشترین اثر را بر عدم تفریخ تخـم نـمـاتد M. incognita داشته است و اختلاف معنیداری با سایر غلظتهای مـورد آزمـایـش داشت (P≤ 0.01) (جدول 5).

جدول 3- مقایسه میانگین اثر غلظتهای مختلف عصاره برگ و ساقه اکالیپتوس بر مرگ و میر لاروهای سن دوم نماتد ریشه گرهی توتون (Meloidogyne incognita) در شرایط آزمایشگاه

Table 3. Mean comparison of different concentrations of leaf and stem extracts of E. camaldulensis on mortality of second-stage juvenile (J2) of Meloidogyne incognita in laboratory condition

تیمار Treatment	غلظت Concentration	درصد مرگ و میر لاروهای سن دوم (%) Percentage of mortality of second stage juveniles (%)
تیمار Treatment	غلظت Concentration	24 ساعت 24 hours	48 ساعت 48 hours
برگ اکالیپتوس Eucalyptus leaf	20%	96.15 a	100 a
	15%	91.3 ab	94.2 a
	10%	83.8 b	88.4 b
	5%	80.09 c	81.2 bc
	1%	76.8 d	81.5 c
ساقه اکالیپتوس Eucalyptus stem	20%	68.3 e	72.1 de
	15%	60.1 f	65 ef
	10%	50.1 gh	54.2 g
	5%	43.6 h	48.9 h
	1%	35.2 i	39.8 i
آب مقطر (شاهد) Control		j 0	j 0

حروف مشابه در هر ستون، بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح احتمال یک درصد میباشد.

Similar letters in each column indicate no significant difference at the 1% probability level.

جدول 4- تجزیه واریانس اثر بازدارندگی غلظتهای مختلف عصاره ساقه و برگ اکالیپتوس بر تفریخ تخم‌های نماتد ریشه گرهی توتون (Meloidogyne incognita) در شرایط آزمایشگاه

Table 2. Variance analysis of the inhibitory effect of different concentrations of leaf and stem extracts of E. camaldulensis on egg hatching of Meloidogyne incognita in laboratory conditions

منابع تغییرات S. O. V	درجه آزادی (df)	میانگین مربعات (MS)
منابع تغییرات S. O. V	درجه آزادی (df)	24 ساعت (24 h)	48 ساعت (48 h)
تیمار Treatment	10	** 452.03	** 814.3
خطا Error	33	3.12	5.9
ضریب تغییرات (درصد) CV %		4.63	3.28

**: معنیدار در سطح احتمال یک درصد

**: Significant at the 1% probability level

نتایج نشان داد که در هر دو عصاره برگ و ساقه اکالیپتوس، در پنج غلظت مورد بررسی (1، 5، 10، 15 و 20 درصد)، با افزایش غلظت عصارهها و با گذشت زمان، درصد مرگ و میر لاروهای سن دوم نماتد و همچنین، درصد عدم تفریخ تخم نماتد افزایش یافته است. مقایسه میانگین بین غلظتهای عصاره گیاهان نشان داد که عصاره برگ اکالیپتوس در بالاترین غلظت (20 درصد) و بعد از گذشت 48 ساعت، با ایجاد 5/94 درصد عدم تفریخ تخم و 100 درصد مرگ و میر لاروهای سن دوم نماتد و عصاره ساقه اکالیپتوس در کمترین غلظت (یک درصد) و بعد از گذشت 24 ساعت، با ایجاد 2/34 درصد عدم تفریخ تخم و 2/35 درصد مرگ و میر لاروهای سن دوم نماتد، به ترتیب بیشترین و کمترین تأثیر را روی تخم نماتد M. incognita داشتند.

جدول 5- مقایسه میانگین اثر غلظتهای مختلف عصاره برگ و ساقه اکالیپتوس بر تفریخ تخم نماتد ریشه گرهی توتون (Meloidogyne incognita) در شرایط آزمایشگاه

Table 3. Mean comparison of different concentrations of leaf and stem extracts of E. camaldulensis on egg hatching of Meloidogyne incognita in laboratory conditions

تیمار Treatment	غلظت Concentration	درصد بازدارندگی از تفریخ تخم (%) Suppression rate of egg hatching (%)
تیمار Treatment	غلظت Concentration	24 ساعت (24 h)	48 ساعت (48 h)
عصاره برگ اکالیپتوس Eucalyptus leaf extract	20%	90.1 a	94.5 a
	15%	91.3 ab	91.2 a
	10%	84.8 b	88.1 b
	5%	80.09 c	82.3 bc
	1%	73.8 d	78.5 c
عصاره ساقه اکالیپتوس Eucalyptus stem extract	20%	68.5 e	75.1 de
	15%	60.8 f	63 ef
	10%	49.1 gh	53.2 g
	5%	41.6 h	45.9 h
	1%	34.2 i	38.8 i
شاهد (آب مقطر) Control		j 0	j 0

حروف مشابه در هر ستون، بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح احتمال یک درصد میباشد.

Similar letters in each column indicate no significant difference at the 1% probability level.

بحث

نماتدهای ریشهگرهی، با نفوذ به داخل ریشه و با ترشح برخی آنزیمها از جمله پروتئاز، متابولیسم میزبان را به نفع خود تغییر میدهند. اطراف نماتدهای مهاجم را سلولهای زیادی احاطه میکنند که منجر به تشکیل غده روی ریشه میشوند. در نتیجه، ریشه گیاه میزبان نمیتواند وظایف اصلی خود، یعنی تأمین مواد غذایی از طریق جذب مواد در خاک را به خوبی انجام دهد (اسکندرزاده و همکاران، 1399). با توجه به مخاطرات بسیار زیاد ترکیبات شیمیایی، امروزه ترکیبات و عصارههای گیاهی، جایگزین مناسبی برای سموم شیمیایی محسوب میشوند. استفاده از فرآوردههای گیاهی نماتدکش، به جای ترکیبات شیمیایی در کنترل نماتدها، عوارض جانبی بسیار کمتری به دنبال خواهد داشت و میتواند فواید اقتصادی نیز به همراه داشته باشد. در تحقیق حاضر، عصاره آبی برگ و ساقه اکالیپتوس، اثر نماتدکشی مطلوبی را در شرایط آزمایشگاهی نشان دادند. بهطوریکه عصاره برگی، در بالاترین غلظت بهکار رفته (20 درصد)، دارای 100 درصد تأثیر در مرگ و میر لارو سن دوم و 5/94 درصد تأثیر در عدم تفریخ تخم نماتد M. incognita داشتند. با توجه به اینکه عدم تفریخ تخم و نیز مرگ و میر لاروهای سن دوم نماتد در تیمار شاهد، صفر درصد بوده، لذا استفاده از عصاره گیاه دارویی مذکور باعث شده که عدم تفریخ تخم و مرگ و میر لاروهای سن دوم نماتد، نسبت به شاهد، افزایش یابند.

اكاليپتوس، يكي از گياهان معروف خانواده Myrtaceae اسـت كـه موطن اصلي آن استراليا بوده و از آنجا بـه سـاير نقـاط دنيـا، از جمله ايران برده شده است. درختان جوان دارای برگ‌های نوک تیز و نازک هستند، در حالی که درختان مسن‌تر و شاخه‌های آن‌ها برگ‌های پهن‌تر و گسترده‌تری دارند. این تنوع در شکل برگ‌ها، به درختان اکالیپتوس کمک می‌کند تا در شرایط محیطی مختلف به خوبی سازگار شوند. برگ‌های این گیاه به‌طور معمول مورد استفاده قرار می‌گیرند. پودر اکالیپتوس، که به رنگ سبز روشن و با بویی تند و مشخص همراه با مزه‌ای کمی تلخ است، از ویژگی‌های بارز این گیاه محسوب می‌شود. مهم‌ترین ترکیبات شیمیایی موجود در اکالیپتوس، شامل 1 و 8 سینئول بوده که این ترکیب به اکالیپتوس کمک می‌کند تا خواص دارویی و درمانی مؤثری از خود نشان دهد و به عنوان یک گیاه دارویی ارزشمند در درمان انواع بیماری‌ها مورد استفاده قرار گیرد. ترکیب 8 و 1- سینئول موجود در اسانس روغنی اکالیپتوس، با ایجاد خواص دورکنندگی و حشرهکشی و دفع آفات، میتواند بهعنوان جایگزین امن و مؤثر برای حشره کشهای شیمیایی در برنامههای مدیریت آفات مورد استفاده قرار گیرد (میری، 1400).

فرآوردههای گیاهی مختلف، اثرات بازدارندگی متفاوتی بر روی نماتدها دارند. از آن جمله، میتوان به تأثیر عصارههای دو گونه از گیاه داتوره Datura stramonium، Datura metelو بنگدانه Hyoscyamus nigerدر برابر جمعیت بومی نماتد ریشه‌گرهی گونه M. javanica اشاره کرد. ارزیابی‌ها بر اساس تأثیر عصارهها در تفریخ تخم نماتد و مرگ و میر لارو سن دوم در شرایط آزمایشگاهی بود. با افزایش غلظت عصارهها، این تأثیرگذاری نیز بیشتر و غلظت 50 درصد عصاره 30 به 1، بیشترین تأثیر را در کاهش تفریخ تخم داشته و غلظت 25 درصد نیز پس از آن، بیشترین تأثیر را داشت. تأثیر عصارهها بر روی مرگ و میر لاروهای سن دوم نماتد نیز قابل توجه بوده و هر سه گیاه بهویژه در غلظتهای بالاتر سبب مرگ و میر درصد قابل توجهی از لاروها در مقایسه با شاهد شدند. از این میان، غلظت 25 درصد عصاره 30 به 1 هر سه گیاه تأثیر بالایی در مرگ و میر لاروها داشت (اسکندرزاده و همکاران، 1399).

در آزمایشی دیگر، فعالیت نماتدکشی اسانس گیاهان اکالیپتوس، کما و باریجه روی نماتد ریشهگرهی M. javanica در شرایط آزمایشگاه مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که میزان بازدارندگی از تفریخ تخم و مرگ و میر لاروهای سن دوم نماتد، با افزایش غلظت اسانس‌ها رابطه مستقیم داشت. اسانس اکالیپتوس با LC50 معادل 839 پیپیام و 2122 پیپیام، به ترتیب علیه لارو سن دوم و تخم نماتد، مؤثرتر از سایر اسانسهای مورد بررسی بود (خیاط و همکاران، 1393). که با نتایج حاصل از تحقیق حاضر، مبنی بر تأثیر بالای عصاره اکالیپتوس بر نماتد M. incognita مطابقت داشت.

طی یک مطالعه در مورد اثرات ضد نماتدی داتوره گونه D. stramonium، تأثیر آزمایشگاهی عصاره بذری دو گیاه داتوره و تاجریزی علیه نماتد M. javanica بررسی شده و مشاهده گردید که هر دو گیاه در غلظتهای مختلف سبب کاهش تفریخ تخم نماتد و افزایش مرگ و میر لاروها شدند (فیاض، 1393). تأثیر غلظت‌های مختلف عصاره آبی برگ گیاهان پنیرک Malva sylvestris، شقایق Papaver rhoeas و پوست سبز میوۀ گردو Juglanse regiaدر جلوگیری از تفریخ تخم و مرگ ومیر لارو سن دوم نماتد M. javanica در شرایط آزمایشگاهی بررسی شد. نتایج نشان داد که همه‌ عصارههای گیاهی مورد بررسی اثر نماتدکشی خوبی داشتند. افزایش غلظت عصارههای گیاهی بهطور معنی‌داری باعث افزایش تـأثـیر عـلیه نماتد M. javanica گردید (علی کرمی و همکاران، 1395). که با نتایج حاصل از تحقیق حاضر، مطابقت داشت. همچنین، تأثیر بازدارندگی قـسـمتهای مختلف درخت چریش Azadirachta indica و زیـتـون تـلـخ Melia azadirach بر روی نـماتـد M. incognita در گیاه گوجهفرنگی گزارش شده است (Siddiqui and Alam, 2001).

علاوه بر این، فعاليت ضد نماتدی عصاره برگ درمنه و کرچک، عليه نماتد M. incognita در گیاه خيار در شرایط آزمايشگاه و گلخانـه مـورد بررسـي قـرار گرفت. نتـايج بررسی آزمايشـگاه، بالاترين فعاليت ضدنماتدي را در عصاره الكلي برگ كرچك با 33/61 درصد و برگ درمنه بـا 67/55 درصـد در غلظـت 1000 پـيپـيام پـس از 72 ساعت نشان داد. همچنين مشاهده شد كه اضافه كردن عصاره به گلدانها، به خوبي تعداد گالها و جمعيت نماتد را كاهش داده است (کتولی و همکاران، 1389).

بررسیهای صادقی و همکاران (1389)، نشان داد که اسانس برخی از گیاهان خانواده چتریان، از جمله زیره سیاه، زیره سبز، رازیانه و میخک هندی در غلظت 2000 پیپیام، تأثیری بیش از 90 درصد در مرگ و میر لارو و عدم تفریخ تخم نماتد ریشه گرهی داشتند. در پژوهش دیگری، نیز گزارش شده است که اسانس برخی از گیاهان خانواده چتریان، در غلظتهای بالاتر از 4000 میکرولیتر در لیتر، منجر به افزایش مرگ و میر لاروهای نماتد M. javanica شدند (Perez et al., 2003). بر اساس گزارش (Oka et al., 2000a)، اسانس گیاه زیره سیاه اروپایی Carum carvi حاوی 48 درصد لیمونن، در غلظت 1000 پیپیام، تأثیری بیش از 90 درصد در مرگ و میر لارو سن دوم و عدم تفریخ تخمهای نماتد ریشه گرهی داشته است.

با توجه به تنوع ترکیبات ضدمیکروبی موجود در عصارههای گیاهی، مکانیسمهای متفاوتی نیز برای این ترکیبات وجود دارد. این ترکیبات، در اثر فعالیت مشترک و همپوشانی ترکیبات گوناگون دیواره و غشای سلولی بیمارگرها را تخریب و نفوذپذیری و نشت یونی سلول را افزایش میدهند. در پی تجزیه لیپیدهای دیواره سلولی، میتوکندریها و پروتئینهای سلولهای غشا و نیز لخته شدن سیتوپلاسم، مرگ سلولهای آسیب دیده اتفاق میافتد (فیاض، 1393). اثر بازدارندگی عصارههای گیاهی، ممکن است به دلیل وجود مواد شیمیایی موجود در عصاره باشد که دارای خواص کشندگی برای جنین و تخم باشد. این مواد شیمیایی، روی رشد جنین، تأثیر گذاشته یا موجب کشته شدن جنین موجود در تخمها شده و یا حتی توده تخمها را در خود حل میکنند (Adegbite and Adesiyan, 2005).

منابع References

اسکندرزاده خیاوی، ن.، مصلحی، ش. و واعظ، ا. 1399. بررسی آزمایشگاهی تأثیر دو گیاه داتوره و بنگدانه در تفریخ تخم و مرگ و میر لاروهای نماتد گرهریشه (Meloidogyne javanica). پژوهشهای کاربردی در گیاهپزشکی 9(2): 60 – 45.

ایزدپناه، ک.، رحیمیان، ح.، اشکان، س. م.، میناسیان، و. و بنی هاشمی، ض. 1389. بیماریشناسی گیاهی. نشر آییژ. جلد 3، 358 صفحه.

حسینینژاد، ع. 1383. اثر مشتقات چریش Azadirachta indica بر نماتد ریشهگرهی Meloidogyne javanica در گوجهفرنگی. مجله آفات و بیماریهای گیاهی 73(1): 69-89.

خیاط، ف.، مهدیخانی مقدم، ع.، روحانی، ح. و عزیزی، م. 1393. بررسی فعالیت نماتدکشی اسانسهای اکالیپتوس، کما و باریجه روی نماتد ریشهگرهی (Meloidogyne incognita) در شرایط آزمایشگاه. نشریه حفاظت گیاهان (علوم و صنایع کشاورزی) 28(3): 345-338.

زارع بیدکی، ا. 1389. اثرات بازدارندگی عصاره چند گیاه دارویی در کنترل نماتد مولد گره ریشه در گوجهفرنگی. پایاننامه کارشناسی ارشد رشته بیماریشناسی گیاهی. دانشکده کشاورزی دانشگاه زابل. 183 صفحه.

سعیدی زاده، آ.، فتوکیان، م.ح. و نیاستی، ف. 1400الف. اثر عصاره آبی گیاهان بر تفریخ تخم نماتد ریشهگرهی Meloidogyne javanica در شرایط آزمایشگاه، یازدهمین همایش سراسری محیط زیست، انرژی و منابع طبیعی پایدار، تهران.

سعیدی زاده، آ.، فتوکیان، م.ح. و نیاستی، ف. 1400ب. اثر عصاره گیاهی بر جمعیت لارو سن دوم نماتد ریشه گرهی Meloidogyne javanica در شرایط آزمایشگاه. هشتمین کنگره ملی زیستشناسی و علوم طبیعی ایران، تهران.

شعلهور فرد، ع.، موسوی، م. ر. و شررهای، ع. 1391. بررسی اثر نماتدکشی عصاره آبی برخی گیاهان در کنترل نماتد مولد گره ریشه گوجهفرنگی (Meloidogyne javanica) در شرایط آزمایشگاهی. سومین همایش ملی علوم کشاورزی و صنایع غذایی ایران.

صادقی، ز.، مهدیخانی مقدم، ع. و عزیزی، م. 1389. بررسی اثر نماتدکشی تعدادی گیاهان دارویی خانواده چتریان بر نماتد ریشه گرهی (Meloidogyne javanica) در شرایط آزمایشگاه. نشریه حفاظت گیاهان 34(1): 82 –62.

فیاض، م. 1393. بررسی آزمایشگاهی اثر نماتدکشی عصاره آبی دو گیاه دارویی از خانواده بادنجانیان روی نماتدMeloidogyne javanica . دومین همایش ملی گیاهان دارویـی و کشاورزی پایدار، دانشگاه شهید مفتح همدان. ص: 8-1.

فتحی، ق.، اشتیاقی، ح.، رسولیان، غ. و ارومچی، س. 1374. بررسی تأثیر چند فرآورده گیاهی در کنترل نماتد مولد گره ریشه بهطور همزمان. مقالات دوازدهمین کنگره گیاهپزشکی ایران. صفحه 386.

قادری، ر.، کاشی نهنجی، ل. و کارگربیده، ا. 1391. نماتدهای ایران. انتشارات آموزش و ترویج کشاورزی.

کتولی، ن.، مهدیخانی مقدم، ع. و مقصودلو، ر. 1389. بررسی اثر عصاره برگ درمنه و کرچک در کاهش جمعیت نماتد ریشهگرهی خیار (Meloidogyne incognita). نشریه بومشناسی کشاورزی 2(4): 592-587.

علی کرمی، م.، چارهگانی، ح. ا.، عبداللهی، م. و قانع جهرمی، م. 1395. بررسی اثر بازدارندگی عصاره برخی گیاهان بر نماتد ریشه گرهی (Meloidogyne incognita) در شرایط آزمایشگاه. خلاصه مقالات بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران. صفحه 371.

میری، ا. 1400. اهمیت اکالیپتوس در گیاهپزشکی. خلاصه مقالات هفتمین همایش بینالمللی دانش و فناوری علوم کشاورزی، منابع طبیعی و محیط زیست ایران، تهران.

هاشمی، ث.، عبداللهی، م. و چاره گانی، ح.ا. 1396. اثر بازدارندگی عصاره بلـوط (Quercus brantii L.) بر نماتد ریشه گرهی (Meloidogyne javanica) در گیاه گوجهفرنگی. مجله تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران 33(1): 39-50.

Abbas, S., Dawar, S., Tariq, M. and Javed-Zaki, M. 2009. Nematicidal activity of spices against Meloidogyne javanica (Treub) Chitwood. Pakistan Journal Botany 41: 2625-2632.

Adegbite, A.A. and Adesiyan, S.O. 2005. Root extracts of plants to control root- knot nematode on edible soybean. World Journal of Agricultural Sciences 1(1): 18-21.

Dropkin, V.H. 1989. Introduction to Plant Nematology. 2nd. Edition. John Wiley and Sons Inc. Publications, New York.

Costa, S., Santos, M.N. and Ryan, M. 2004. Effect of Artemisia vulgaris rhizome extracts on hatching, mortality and plant infectivity of Meloidogyne megadora. Journal of Nematology 35: 437-442.

Elling, A.A. 2013. Major emerging problems with minor Meloidogyne species. Phytopathology 103(11): 1092–1102.

Grewal, P.S. 1989. Nematicidal effects of some plant- extracts to Aphelenchoides composticola (Nematoda) infesting mushroom, Agaricus bisporus. Revue Nematology 12: 317-322.

Hussey, R.S. and Barker, K.R. 1973. A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp. including a new technique. Plant Disease Reporter 57(12): 1025-1028.

Ibrahim, S.K., Traboulsi, A.F. and El-Haj, S. 2006. Effect of essential oils and plant extracts on hatching, migration and mortality of Meloidogyne incognita. Phytopathologia Mediterranea 45: 238–246.

Jatala, P. 1986. Biological control of plant parasitic nematodes. Annual Review of Phytopathology 24: 453-489.

Jepson, S.B. 1987. Identification of Root-Knot Nematodes. Wallingford, UK, CAB International.

Javed, N., Qureshi, F.F., Ahmad, R. and Ashfaq, M. 2001. Evaluation of products of bionature against root-knot nematode Meloidogyne javanica on tomato. Pakistan Journal of Phytopathology 13(2): 155-159.

Nandal, S.N. and Bhatti, D.S. 1986. Influence of four plant extracts on the hatching of Meloidogyne javanica and invasion of host roots. Nematologia Mediterranea 14: 291-294.

Oka, Y., Kaltai, H., Bar-Eyal, M., Mor, M., Sharon, E., Chet, I. and Spiegel, Y. 2000a. New strategies for the control of plant parasitic nematodes. Pest Management Science 56(11): 983-988.

Oka, Y., Nacar, S., Putievsky, E., Ravid, U., Yaniv, Z. and Spiegel, Y. 2000b. Nematicidal activity of essential oil components against the root-knot nematode M. javanica. Phytopathology 90(7): 710-715.

Pakeerathan, K., Mikunthan, G. and Tharsani, N. 2009. Effect of different animal manures on Meloidogyne incognita (Kofoid and White) on tomato. World Journal of Agricultural Sciences 5(4): 432-435.

Perez, M.P., Navas-Cortes, J.A., Pascual-Villalobos, M.J. and Castillo, P. 2003. Nematicidal activity of essential oils and organic amendments from Asteraceae against root-knot nematodes. Plant Pathology 52: 395-401.

Ripoll, C., Favery, B., Lecomte, P., Van Damme, E., Peumans, W., Abad, P. and Jouanin, L. 2003. Evaluation of the ability of lectin from Snowdrop (Galanthus invalid) to protect plants against root- knot nematodes. Plant Science 164: 517-523.

Sasser, J.N., 1979. Economic importance of Meloidogyne to tropical countries. Pp. 359-374. In: Lamberti, F. and Taylor, C.E. (eds.). Root-Knot Nematodes (Meloidogyne spp.) Systematics Biology and Control. Academic Press, New York, London, San Francisco.

Sasser J.N., and Carter C.C. 1985. Overview of the international Meloidogyne project 1975-1984. Pp. 19-24. In: Sasser J.N., and Carter C.C.(eds.). An advanced treatise on Meloidogyne, vol. 1, Raleigh, USA, North Carolina State University Graphics.

Sharma, N. and Trivedi, P.C. 2002. Screening of leaf extract of some plants for their nematicidal and fungicidal properties against Meloidogyne incognita and Fusarium oxysporium. Asian Journal of Experience Science 16: 21-28.

Sikora, R.A. and Fernandez, E. 2005. Nematode parasites of vegetables. Pp. 319-392. In: Luc, M., Sikora. R.A. and Bridge, J. (eds.). Plant Parasitic Nematodes in Subtropical and Tropical Agriculture., 2nd. edition, CABI Wallingford, UK.

Siddiqui, I.A., Amer Zareen, M., Javad Zaki, M. and Shaukat, S.S. 2001. Use of Trichoderma species in the control of Meloidogyne javanica, root-knot nematode in the okra and mungbean. Pakistan Journal of Biological Sciences 4(7): 846–848.

Vrain, T.C. 1977. A technique for the collection of larvae of Meloidogyne spp. and a comparison of eggs and larvae as inocula. Journal of Nematology 9(3): 249-251.

Share To

Article Url

Molecular basis of interactions between fungal effectors and host plants