Comparison of antibacterial effect of essential oils of rosemary (Rosmarinus officinalis) and basil (Ocimum basilicum) and some antibiotics on standard isolates of major bovine mastitis bacteria

Subject Areas : Veterinary Clinical Pathology

Reza Rahchamani ^{1 *} , Saman Zaroni ² , Farzad Ghanbari ³

1 - Assistant Professor, Department of Animal Sciences, Faculty of Agriculture and Natural Resources, University of Gonbad Kavous, Gonbad Kavous, Iran.
2 - M.Sc. Graduate, Department of Animal Sciences, Faculty of Agriculture and Natural Resources, University of Gonbad Kavous, Gonbad Kavous, Iran.
3 - Assistant Professor, Department of Animal Sciences, Faculty of Agriculture and Natural Resources, University of Gonbad Kavous, Gonbad Kavous, Iran.

Received: 2024-11-10 Accepted : 2025-03-16 Published : 2025-08-20

Keywords: Antibacterial effect, Basil, Essential oil, Mastitis, Rosemary.,

Abstract :

According to the side effects of antibiotic use, there is a need for new and natural antibacterial substances, one of which is the essential oils of medicinal plants. This study investigated antibacterial activity of Rosmarinus officinalis (rosemary) and Ocimum basilicum (basil) EOs in comparison with gentamicin and amoxicillin/clavulanate antibiotics on Escherichia coli, Streptococcus agalactiae, and Staphylococcus aureus. Analysis of EOs was done with GC/MS. The minimum bactericide concentration (MBC) and minimum inhibitory concentration (MIC) were obtained with macrodilution method and the antibacterial effects of EOs in comparison with antibiotics were done by disk diffusion method. The effects of EOs on growth curve were investigated at 0, 6, 10 and 24 h. Major components of rosemary EO were carene (45.11%), eucalyptol (1,8- cineol) (20.62%), and those of basil were estragol (70.42%), carene (17.99%). MIC and MBC were in rosemary 0.078-0.312% and 0.312-0.625% and in basil 0.039-0.312% and 0.078-0.625%, respectively. In disk diffusion, the effect of two EOs on Staphylococcus aureus and Streptococcus agalactiae did not significantly differ from gentamicin (p>0.05) and lower than amoxicillin/clavulanate (p<0.05) but the effect of two EOs on Escherichia coli was significantly lower than gentamicin and amoxicillin/clavulanate (p<0.05). At 24 hour, two EOs significantly decreased the count of Staphylococcus aureus and Escherichia coli bacteria and basil significantly decreased the Streptococcus agalactiae bacterium count (p<0.05). Generally, the EOs of rosemary and basil had antibacterial effects and the effect on Staphylococcus aureus and Streptococcus agalactiae bacteria was not significantly different with gentamicin.

Full-Text:



آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی                                                                                                            دوره 19، شماره 2، پیاپی 74، تابستان 1404، صفحات: 103-89

 

 

 DOI: 10.71499/jvcp.2025.3111443"مقاله پژوهشی"                                                                                                               

ارزیابی مقایسه­ای اثرات ضد‌باکتریایی اسانس گیاهان‌ رزماری (Rosmarinus officinalis) و ریحان (Ocimum basilicum) و برخی از آنتی­بیوتیک­ها بر سویه­های استاندارد باکتری‌های اصلی ایجادکننده ورم‌پستان گاو

 

رضا راه­چمنی1*، سامان ضرونی2، فرزاد قنبری1

 

1-  استادیار گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه گنبد کاووس، گنبد کاووس، ایران.

2- دانش‌آموخته گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه گنبد کاووس، گنبد کاووس، ایران.

*نویسنده مسئول مکاتبات: [e-mail]

(تاریخ دریافت: 20/8/1403 تاریخ پذیرش: 26/12/1403)

 

چکیده

با توجه به عوارض جانبی مصرف آنتی‌بیوتیک‌ها، نیاز به مواد ضد‌باکتریایی جدید و طبیعی مطرح است که یک دسته از این نوع مواد، اسانس گیاهان دارویی می­باشد، مطالعه حاضر به‌منظور بررسی اثرات ضد‌باکتریایی اسانس گیاهان رزماری و ریحان و مقایسه آن­ها با اثرات آنتی‌بیوتیک‌های جنتامایسین و آموکسی‌سیلین/کلاولونات علیه باکتری‌های اصلی ایجادکننده ورم پستان گاوها شامل استافیلوکوکوس آرئوس، استرپتوکوکوس آگالاکتیه و اشریشیاکولای انجام شد. ابتدا شناسایی ترکیبات شیمایی اسانس­های مذکور به‌روش گاز کروماتوگرافی انجام شد. همچنین حداقل غلظت مهاری و حداقل غلظت کشندگی اسانس‌ها به روش رقیق‌سازی لوله‌ای و حساسیت باکتری­های مورد مطالعه به اسانس‌ها و آنتی‌بیوتیک‌ها با استفاده از روش انتشار دیسک در آگار تعیین گردید. تاثیر اسانس‌ها بر منحنی رشد باکتری­ها در ساعت‌های 0، 6، 10 و 24 بررسی شد. مهمترین ترکیبات گیاه رزماری، شامل کارن ( 11/45 درصد) و اکالیپتول (62/20 درصد) و مهم­ترین ترکیبات گیاه ریحان، شامل استراگول (42/70 درصد) و کارن (99/17 درصد) بودند. محدوده حداقل غلظت مهاری و کشندگی به­ترتیب در مورد اسانس­های رزماری 312/0-078/0 و 625/0-312/0 درصد و ریحان 312/0-039/0 و 625/0-078/0 درصد تعیین شد. در روش انتشار دیسک در آگار اثر ضد­باکتریایی هر دو اسانس بر استافیلوکوکوس آرئوس و استرپتوکوکوس آگالاکتیه به طور معنی‌داری کمتر از آموکسی‌سیلین/ کلاولونات (05/0>p) و بدون تفاوت معنی‌دار با جنتامایسین بود (05/0<p) ولی اثرات مذکور بر اشریشیاکولای به­طور معنی‌داری کمتر از اثر جنتامایسین و آموکسی‌سیلین/کلاولونات بود (05/0>p). در ساعت 24 منحنی رشد باکتری­ها، اسانس رزماری و ریحان تعداد باکتری­های اشریشیاکولای و استافیلوکوکوس آرئوس و اسانس ریحان تعداد باکتری استرپتوکوکوس آگالاکتیه را به­صورت معنی‌داری کاهش دادند (05/0>p). به­طور کلی، اسانس رزماری وریحان اثرات ضد باکتریایی داشتند و اثر آنها بر استافیلوکوکوس آرئوس و استرپتوکوکوس آگالاکتیه تفاوت معنی‌داری با جنتامایسین نداشت.

 

کلیدواژه­ها: ورم پستان، خاصیت ضد باکتریایی، اسانس­، رزماری، ریحان.

 

مقدمه

بیماری‌های مختلفی توسط باکتری­های استافیلوکوکوس آرئوس، استرپتوکوکوس آگالاکتیه و اشریشیاکولای ایجاد می‌شود ولی هر سه باکتری مذکور از مهم‌ترین عوامل ایجاد کننده ورم پستان گاو نیز هستند (Contreras and Rodrigues, 2011). مهمترین و متداول­ترین درمان ورم‌پستان در دامداری‌ها تزریق داخل‌پستانی آنتی‌بیوتیک‌هاست که البته عوارضی مانند ایجاد سویه‌های مقاوم و باقیماندن دارو در شیر دارد (Alekish et al., 2017; Rahimian et al., 2021).

ورم پستان شایع‌ترین بیماری با خسارات اقتصادی زیاد در صنعت گاو شیری در سراسر جهان است (Zhu et al., 2016). استفاده از آنتی‌بیوتیک‌های داخل‌پستانی مهمترین درمان ورم‌پستان­ها هستند ولی استفاده از آنتی‌بیوتیک‌ها منجر به مقاوم شدن باکتری‌های معمول و همچنین نگرانی‌های بهداشت عمومی شده‌است. در سال­های اخیر، ظهور سریع سویه‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک و کاهش اثرات نسل‌های جدید آنتی‌بیوتیک‌ها، منجر به تلاش‌های زیادی برای یافتن منابع جدید مواد ضد‌میکروبی مثل اسانس‌های گیاهان شده‌است (Sharifi-Rad et al., 2020). گزارش شده که بدنبال استفاده طولانی مدت از اسانس‌های گیاهی، افزایش سویه‌های مقاوم باکتریایی و عوارض جانبی در انسان مشاهده نشده‌است، بنابراین در حال حاضر استفاده از اسانس­های مذکور در مبارزه علیه بیماری‌های باکتریایی، به عنوان یک سلاح قوی مطرح می­باشد (Ananda Baskaran et al., 2009; Hasanpour et al., 2014). گزارش شده که با توجه به افزایش  مقاومت آنتی‌بیوتیکی در بین باکتری‌ها و وجود باقیمانده آنتی‌بیوتیک‌ها در مواد غذایی از جمله شیر، تحقیقات زیادی برای استفاده از جایگزین‌های مناسب برای آنتی‌بیوتیک‌ها انجام شده­است. در این بین اسانس‌های گیاهی با توجه به اثرات ضد‌باکتریایی وسیع الطیف و عوارض جانبی کمتر یکی از بهترین جایگزین‌ها هستند (Park et al., 2012).

گیاه ریحان(Basil) با نام علمیOcimum basilicum ، خصوصیات درمانی متعدد داشته و در طب سنتی در موارد مختلف از جمله درمان عفونت‌های تنفسی استفاده شده‌است (Al Abbasy et al., 2015) و در چندین مطالعه هم اثرات ضد‌باکتریایی آن نشان داده شده‌است (De Moraes Peixoto et al., 2015; Rezzoug et al., 2019; De Martino et al., 2021; Da Silva et al., 2022).

قسمت‌های هوایی گیاه رزماری (Rosemary) با نام علمیRosmarinus officinalis ­، دارای اثرات ضد‌باکتریایی و ضد‌ویروسی است. ترکیبات مهم اسانس رزماری شامل 1و8-سینئول، کامفور و بتاکاریوفیلن می­باشد (Oliveira et al., 2019; Rathore et al., 2022).

با توجه به مسائل ذکر شده و ممنوع بودن استفاده از آنتی‌بیوتیک در گاوداری‌های ارگانیک، نیاز به سایر روش‌های درمانی احساس می‌شود. از طرف دیگر با توجه به این­که طبق بررسی نویسندگان مقاله حاضر، درباره اثرات ضد‌باکتریایی اسانس گیاهان ریحان و رزماری بر باکتری­ استرپتوکوکوس آگالاکتیه پژوهش‌های بسیار کمی انجام شده است، لذا در تحقیق حاضر باکتری‌های استافیلوکوکوس آرئوس و اشریشیاکولای نیز برای بررسی مورد نظر انتخاب شدند تا با توجه به این که هر سه باکتری از مهم‌ترین عوامل ایجاد کننده ورم‌پستان گاو هستند، احتمالا بتوان از نتایج مطالعه حاضر در پژوهش‌های بالینی مربوط به درمان ورم‌پستان گاو و همچنین دیگر بیماری‌های مرتبط با باکتری­های مذکور استفاده کرد.

 

مواد و روش‌ها

تحقیق آزمایشگاهی حاضر  از نوع مطالعه تلقیحی (Inoculation study) بوده که در سال 1399 در دانشگاه گنبد‌کاووس انجام شده­است.

- آنالیز شیمیایی اسانس‌ها:  ابتدا اسانس‌ گیاهان رزماری و ریحان از شرکت درین گلاب کاشان تهیه شدند و برای اطمینان از عدم آلودگی اسانس‌ها به میکروارگانیسم‌های قارچی و باکتریایی، بلافاصله اسانس‌های مذکور، در آزمایشگاه از فیلترهای مخصوص با اندازه­­ 2/0 میکرومتر (­BT103001, Membrane solution, USA) عبور داده شدند. در ادامه برای آنالیز اسانس‌ها از دستگاه گاز کروماتوگرافی متصل به طیف‌سنج جرمی (GC/MS) (Gas chromatography/mass spectrophotometry) (Model 5977A, Agilent Technologies, USA) با ستون موئینه60 DB به طول 30 متر، قطر 25/0 میلی­متر و ضخامت فیلم 25/0 میکرومتر استفاده شد. برنامه دمایی ستون از 50 تا 250 درجه سلسیوس با سرعت 4 درجه سلسیوس در دقیقه تنظیم شد و دمای محفظه تزریق 260 درجه سلسیوس و گاز حامل هلیوم بود. پس از تزریق اسانس به محل مربوطه در دستگاهGC/MS  و مشاهده طیف کروماتوگرام، با استفاده از زمان بازداری (Retention time)، اندیس کواتس (Kovats index)، طیف جرمی و مقایسه با ترکیب‌های استاندارد موجود در کتابخانه اطلاعات کامپیوتری، شناسایی ترکیبات اسانس و تعیین درصد کمی در آن‌ها انجام گردید.

- آماده­سازی باکتری‌های تحقیق: سویه‌های استاندارد باکتری‌های استرپتوکوکوس آگالاکتیه (Streptococcus agalactiae; PTCC:­1768)، استافیلوکوکوس آرئوس (Staphylococcus aureus; PTCC:­­1113) و اشریشیاکولای ­ (Escherichia coli; PTCC:­­1399) از طریق سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران (تهران- ایران) تهیه شد و پس از انتقال استاندارد به آزمایشگاه میکروب­شناسی، هر سه باکتری‌ دوبار در دمای 37 درجه سلسیوس  گرمخانه (BD115, Binder, Germany) به مدت 24 ساعت در محیط کشت تریپتیک سوی­براث (Biolife, Milano, Italy) کشت داده شدند. در ادامه از محتویات لوله­های مذکور به مقدار لازم، جداگانه برداشت کرده و به نسبت 1 به 5 با گلیسیرین استریل مخلوط کرده و در حجم‌های 100 میکرولیتری در میکروتیوب‌های استریل در دمای 20- درجه سلسیوس فریزر آزمایشگاهی (مدل FRZNF170 ، پارس، ایران) ذخیره­سازی شد. همچنین برای تهیه نمونه­های کار هم پس از یخ­زدائی استاندارد از کشت ذخیره و انجام دوبار تجدید کشت در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت 24 ساعت و تهیه جمعیت میکروبی جوان، نهایتا کشت چند­خطی منطقه­ای در محیط کشت شیبدار تریپتیک سوی آگار (Biolife, Milano, Italy) انجام می­شد تا پرگنه­های جدا و خالص از هر یک از باکتری­های مورد تحقیق حاصل شود. در طول انجام تحقیق، کشت‌های مذکور در دمای 4 درجه سلسیوس یخچال آزمایشگاهی (مدل R-1298، سایوان، ایران) نگهداری شده و در صورت نیاز، هر ماه یکبار تجدید کشت می­شدند (Basti et al., 2007).

­- تعیین و تنظیم میزان تلقیح از هر یک از باکتری­های مورد مطالعه: بدین منظور ابتدا از کشت ذخیره هریک از باکتری‌های تحقیق، جداگانه به داخل محیط کشت تریپتیک سوی براث انتقال داده و در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت 24 ساعت گرمخانه‌گذاری (BD115, Binder, Germany) شد. در ادامه، عمل تجدید کشت از نتیجه کشت اول نیز در دمای 37 درجه سلسیوس به‌مدت 24 ساعت و عینا مطابق با شرایط کشت اول انجام گردید. سپس مقادیر مختلفی از نتایج کشت دوم هریک از باکتری­های تحقیق، جداگانه به لوله کووت حاوی ۳ میلی‌لیتر محیط کشت تریپتیک سوی براث استریل، تا مادامی انتقال داده ­شد که میزان جذب نوری با استفاده از دستگاه طیف‌سنج جرمی (Spectrophotometry) (Libra S12, Biochrom Ltd., Cambridge, London) در طول‌ موج ۶۰۰ نانومتر، به ۱/۰ برسد. در ادامه و بعد از تهیه رقت‌های متوالی با استفاده از آب پپتونه 0۱/۰ درصد استریل و انتقال جداگانه مقدار ۱۰۰ میکرولیتر از هر رقت به پلیت‌های حاوی محیط کشت تریپتیک سوی آگار و گرمخانه گذاری آن­ها به‌مدت ۲۴­ساعت در دمای ۳۷ درجه سلسیوس، تعداد کلی باکتری‌ها شمارش شد. کارهای آزمایشگاهی ذکر شده 2 مرتبه تکرار شد و میانگین تعداد باکتری در کووت با جذب نوری 1/0 برای اشریشیاکولای معادل ­cfu/ml ۱۰6 × ۶/۳، استافیلوکوکوس آرئوس معادل cfu/ml ۱۰8 ­× 2/1 و برای استرپتوکوکوس آگالاکتیه معادل cfu/ml ۱۰7­× 1/4 محاسبه‌شد. لازم به ذکر است که با مشخص شدن مقادیر مذکور، در طی تحقیق حاضر زمانی که سوسپانسیون باکتریایی هر یک از باکتری­های تحقیق برمبنای جذب نوری 1/0 تهیه می­شد، تعداد باکتری در هر یک از آن­ها معادل اعداد محاسبه‌شده بود و می‌توانستیم از این سوسپانسیون­ها غلظت‌‌های دلخواه و لازم را تهیه نمائیم (Basti et al., 2007).

- نحوه تعیین حداقل غلظت مهاری و حداقل غلظت کشندگی اسانس گیاهان مورد تحقیق: بدین منظور از روش تهیه رقت­های سریال در لوله آزمایش (ماکرودایلوشن براث) استفاده­شد که برای انجام آن ماده دی­متیل­سولفوکساید (DMSO) هم به عنوان امولسیفایر بکار گرفته­شد. بدین منظور بعد ازتهیه محیط کشت تریپتیک سوی­براث حاوی 5 درصد دی متیل سولفوکساید، ابتدا غلظت‌های کاهشی از اسانس‌های رزماری و ریحان در 10 لوله آزمایش شامل مقادیر 10، 5، 5/2، 25/1، 625/0، 312/0، 156/0، 078/0، 039/0 و 019/0 درصد در محیط کشت مذکور تهیه شد. سپس به هر لوله 100 میکرولیتر از رقت 250­:1 سوسپانسیون میکروبی(با غلظت نهایی مشخص شده با طول موج 600 نانومتر و جذب 1/0 برای هر یک از باکتری­های تحقیق) تلقیح شد و بعد از آن همه لوله‌ها به مدت ۲۴ ساعت در دمای۳۷ درجه سلسیوس گرمخانه­گذاری گردیدند. لازم به ذکر است که در این مرحله، برای آزمایش رقت‌های مختلف هر اسانس، 10 لوله و برای کنترل منفی (حاوی اسانس و محیط کشت)، کنترل مثبت (حاوی باکتری و محیط کشت) و شاهد (محیط کشت خالی)، هر کدام یک لوله جداگانه در نظر گرفته می­شد. نهایتاً هم برای هرکدام از اسانس‌ها آخرین رقتی که در آن هیچ گونه کدورتی مشاهده نگردید (عدم رشد باکتری مورد تحقیق) به‌عنوان حداقل غلظت بازدارندگی هر اسانس نسبت به هر یک از باکتری­ها، جداگانه در نظر گرفته می­شد. در ادامه هم از محتویات تمام لوله‌های بدون کدورت، در محیط کشت تریپتیک سوی آگار کشت داده شد. پس از گذشت مدت 24 ساعت گرمخانه‌گذاری در دمای 37 درجه سلسیوس، بالاترین رقتی از هر اسانس‌ که قادر به مرگ 99 درصد از هر یک باکتری‌های زنده اولیه مورد تحقیق بود، به‌عنوان حداقل غلظت کشندگی هر اسانس ثبت می­گردید (CLSI, 2015). 

- بررسی خاصیت ضدباکتریائی اسانس­ها و آنتی­بیوتیک­های تحقیق به روش انتشار دیسک در آگار:  طبق روش انتشار در آگار به صورت دیسک دیفیوژن (Disk diffusion) به شیوه کربی بائر (Kirby- Bauer)، ابتدا با استفاده از سوسپانسیون میکروبی مربوط به هریک از باکتری­های مورد تحقیق (با غلظت نهایی مشخص­شده با طول موج 600 نانومتر و جذب1/0 برای هر باکتری)، در سطح محیط کشت تریپتیک سوی آگار، کشت بصورت پخش­کردن (کشت چمنی) انجام ­شد. در ادامه مقدار20 میکرولیتر از محلول رقیق نشده هر اسانس و رقیق‌شده با نسبت 1:1 با DMSO از هر اسانس، جداگانه بر روی دیسک‌های کاغذی استریل بلانک ساخت شرکت پادتن طب (تهران-ایران) ریخته­شد که بعد از مدت 20 تا 40 دقیقه گرمخانه­گذاری در دمای حدود 40 درجه (BD115, Binder, Germany)، دیسک‌ها خشک شدند. سپس دیسک‌ها با فاصله معین از یکدیگر و از لبه پلیت، روی محیط کشت مذکور قرار داده شدند. برای مقایسه فعالیت ضد‌باکتریایی اسانس‌ها هم دیسک‌های آنتی‌بیوتیک آموکسی‌سیلین/ کلاوولونات با غلظت 10/20 میکروگرم/دیسک، با شماره 20103 و جنتامایسین با غلظت10 میکروگرم/دیسک، با شماره 20309 (پادتن طب- تهران-ایران) تهیه و به‌ عنوان کنترل مثبت استفاده شدند. بعد از گرمخانه­گذاری همه محیط کشت‌های حاوی باکتری­های تحقیق به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس، قطر منطقه عدم رشد مربوط به هریک از اسانس­ها و آنتی­بیوتیک­ها که در محیط کشت هر یک از باکتری­های تحقیق حاصل می­شد اندازه‌گیری گردیده(Fu et al., 2007) و نتایج با جداول CLSI مقایسه می­گردید. ­لازم به ذکر است که جهت حصول اطمینان بیشتر، آزمایشات مذکور برای هر باکتری دو بار تکرار شده و میانگین حاصله ثبت می­گردید.

- بررسی اثر اسانس‌‌های تحقیق بر منحنی رشد هر یک باکتری­ها: بدین منظور، به محیط کشت استریل حاوی پنج درصد DMSO، غلظت Sub-MIC (sub-minimum inhibitory concentration) (یک رقت کمتر از MIC) اسانس مورد نظر اضافه شد، سپس 100 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتریایی هر یک از باکتری­های تحقیق (با غلظت نهایی مشخص­شده با طول موج600  نانومتر و جذب1/0) جداگانه به هر لوله آزمایش اضافه می­شد. بعد از گرمخانه­گذاری لوله‌ها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس در ساعت‌های صفر، 6، 10 و 24، رقت‌های متوالی تهیه و با شمارش تعداد پرگنه­های حاصله، تعداد کل باکتری‌ها محاسبه و نمودار رشد هر باکتری بصورت جداگانه و بر اساسlog10 cfu/ml  در واحد زمان (ساعت) رسم می­شد (Jiang et al., 2011). در این مرحله هم آزمایشات مذکور برای هر باکتری دو بار تکرار شده و میانگین حاصله ثبت می­گردید.

- تحلیل آماری داده‌ها: تحلیل آماری داده­های به­دست آمده، با استفاده از نرم‌افزارSPSS 22  و آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه (One- way ANOVA) با سطح معنی داری 05/0>p انجام شد. اختلاف میانگین‌ها نیز توسط آزمون توکی (Tukey) مورد بررسی قرار گرفت.

 

یافته‌ها

- اجزای شیمیایی اسانس رزماری:  نتایج آنالیز شیمیائی اسانس رزماری نشان داد که از بین ترکیبات شناسایی‌شده، کارن با 11/45 درصد، اکالیپتول با 62/20 درصد و لووربنون با 91/5 درصد، عمده‌ترین ترکیبات موجود در آن را تشکیل داده­اند (جدول 1).

 

جدول 1- ترکیبات شیمیایی موجود در اسانس رزماری
ردیف	نام ترکیب موجود	زمان بازداری (دقیقه)	درصد ترکیب
1	3-Caren	11/4	11/45
2	Camphen	41/4	34/4
3	Cymene	89/5	15/3
4	D-Limonen	00/6	94/3
5	Eucalyptol	08/6	62/20
6	Linalool	63/7	29/2
7	(+)-2-Bornanone	87/8	01/5
8	Endo-borneol	52/9	2/5
9	L-alpha-terpineol	11/10	22/2
10	Levoverbenone	42/10	91/5
11	Thymol	80/12	21/2

 

 

- اجزای شیمیایی اسانس ریحان:  با توجه به نتایج آنالیز شیمیائی، عمده‌ترین ترکیبات موجود در اسانس ریحان هم شامل استراگول با 42/70 درصد، کارن با 99/17 درصد و اکالیپتول با 61/8 درصد بودند (جدول 2).

 

جدول 2- ترکیبات شیمیایی اسانس ریحان
ردیف	نام ترکیب موجود	زمان بازداری (دقیقه)	درصد ترکیب
1	3-Caren	10/4	99/17
2	O-Cymene	89/5	97/0
3	D-Limonen	00/6	29/1
4	Eucalyptol	07/6	61/8
5	Linalool	64/7	71/0
6	Estragole	246/10	42/70

 

- حداقل غلظت مهاری و حداقل غلظت کشندگی اسانس‌ گیاهان رزماری و ریحان: در تحقیق حاضر، محدوده حداقل غلظت مهاری(minimum inhibitory concentration; MIC) و حداقل غلظت باکتری­کشی (minimum bactericidal concentration; MBC) علیه باکتری‌های مورد مطالعه مطابق جدول ­3، به ترتیب در مورد اسانس رزماری 312/0-078/0 و 625/0-312/0 درصد و در مورد اسانس ریحان 312/0-039/0 و 625/0-078/0 درصد محاسبه گردید. همچنین نتایج نشان داد که بیشترین تأثیر اسانس رزماری بر باکتری استرپتوکوکوس­آگالاکتیه و بیشترین تأثیر اسانس ریحان بر باکتری اشریشیاکولای بوده­است.

 

 

جدول 3- حداقل غلظت­های مهاری و کشندگی اسانس‌های تحقیق بر باکتری­های مورد آزمایش برحسب درصد
ماده تحقیق	باکتری مورد نظر	حداقل غلظت مهاری (درصد)	حداقل غلظت کشندگی (درصد)
اسانس گیاه رزماری	استافیلوکوکوس آرئوس	312/0	625/0
	اشریشیاکولای	312/0	625/0
	استرپتوکوکوس آگالاکتیه	078/0	312/0
اسانس گیاه ریحان	استافیلوکوکوس آرئوس	156/0	312/0
	اشریشاکولای	039/0	078/0
	استرپتوکوکوس آگالاکتیه	312/0	625/0

 

 

- نتایج آزمون انتشار دیسک در آگار: اثر اسانس‌های رزماری، ریحان و دو آنتی‌بیوتیک جنتامایسین و آموکسی‌سیلین/کلاوولانات علیه باکتری‌های مورد آزمایش در جدول 4 نشان داده شده است. طبق جداول CLSI هر سه باکتری به آنتی‌بیوتیک‌ها حساس بودند. اثر ضدباکتریایی هر دو اسانس (رقیق نشده و رقیق شده 1:1 ) و جنتامایسین بطور معنی‌داری کمتر از آموکسی سیلین/کلاولونات بود (05/0>p).  اثر هر دو اسانس بر استافیلوکوکوس آرئوس و استرپتوکوکوس آگالاکتیه به طور معنی‌داری کمتر از آموکسی‌سیلین/کلاولونات (05/0>p) و بدون تفاوت معنی‌دار با جنتامایسین بود (05/0<p). ولی اثر ضد باکتریایی بر اشریشیاکولای بطور معنی‌داری کمتر از جنتامایسین و آموکسی‌سیلین/کلاولونات بود (05/0>p). اثر اسانس رقیق شده رزماری بر هر سه باکتری تفاوت معنی‌داری با جنتامایسین نداشت (05/0<p) ولی اثر اسانس رقیق شده ریحان بر هر سه باکتری کمتر از جنتامایسین بود (05/0>p).

 

  

 

 

 

 

 

 

جدول 4- اثر اسانس­ها  و آنتی بیوتیک­ها بر قطر منطقه عدم رشد باکتری­های تحقیق برحسب میلی­متر (میانگین± انحراف معیار)
ترکیب آزمایش شده	قطر منطقه عدم رشد هر یک از باکتری­های مورد آزمایش(میلی­متر)
	اشریشیاکولای	استافیلوکوکوس اورئوس	استرپتوکوکوس آگالاکتیه
اسانس خالص رزماری	d37/0±97/12	b90/1±36/18	c49/0±80/17
*اسانس رقیق شده رزماری(1:1)	bc55/1±10/19	bd82/1±11/16	dc89/1±08/16
اسانس خالص ریحان	d37/0±31/13	bd69/0±95/15	dc40/1±95/15
*اسانس رقیق شده ریحان (1:1)	d44/0±68/11	dc20/0±29/11	d53/0±06/13
جنتامایسین	c51/0±60/17	b65/0±16/18	bc36/0±75/19
آموکسی‌سیلین/کلاولونات	a26/0±60/22	a37/0±06/24	a51/0±44/25
سطح معنی‌داری	002/0	000/0	000/0
میانگین استاندارد	87/0	93/0	80/0
abcd­: حروف نامشابه، نشان‌دهنده وجود اختلاف آماری معنی‌دار در هر ستون می‌باشد(05/0p<). *: اسانس رقیق شده به نسبت مساوی با دی متیل سولفوکساید.

 

- اثر اسانس گیاهان رزماری و ریحان بر نمودار رشد باکتری‌های مورد مطالعه:

در نمودار‌های 1، 2 و 3 اثرات اسانس گیاهان رزماری و ریحان بر تعداد کلی باکتری­های اشریشیاکولای­، استافیلوکوکوس ­آرئوس و استرپتوکوکوس آگالاکتیه، طی زمان‌های صفر، 6، 10 و 24 ساعت ارائه شده­است. مشاهده می‌شود که در ساعات 6 و 10 بین تیمار شاهد و اسانس‌ها تفاوت آماری معنی‌داری وجود نداشته­است. اما در ساعت 24 آزمایش، اسانس گیاهان رزماری و ریحان تعداد باکتری­های اشریشیاکولای و استافیلوکوکوس آرئوس و فقط اسانس گیاه ریحان تعداد باکتری استرپتوکوکوس آگالاکتیه را به­صورت معنی‌داری کاهش دادند (05/0>p).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 1- نشان­دهنده اثر غلظت‌های صفر (شاهد:■) و Sub-MIC اسانس گیاهان ریحان (▲) و رزماری (●) بر منحنی رشد باکتری اشریشیاکولای می­باشد.

a,b,…: حروف نامشابه نشان‌دهنده اختلاف آماری معنی‌دار در زمان مورد نظر دوره آزمایش می‌باشد(05/0>p).

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار  2- نشان­دهنده اثر غلظت‌های صفر (شاهد: ■) و Sub-MIC اسانس گیاهان ریحان (▲) و رزماری (●) بر منحنی رشد باکتری استافیلوکوکوس آرئوس می­باشد.

a,b,…: حروف نامشابه نشان‌دهنده اختلاف آماری معنی‌دار در زمان مورد نظر دوره آزمایش می‌باشد(05/0>p).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار ­3- نشان­دهنده اثر غلظت‌های صفر (شاهد: ■) و Sub-MIC اسانس ریحان (▲) و رزماری (●) بر منحنی رشد باکتری استرپتوکوکوس آگالاکتیه می­باشد.

a,b,…: حروف نامشابه نشان‌دهنده اختلاف آماری معنی‌دار در زمان مورد نظر دوره آزمایش می‌باشد(05/0>p).

 

 

بحث و نتیجه‌گیری

در پژوهش حاضر 11 ترکیب در اسانس گیاه رزماری شناسایی شد که کارن با 11/45 درصد، اکالیپتول با 62/20 درصد و لووربنون با 91/5 درصد عمده‌ترین ترکیبات موجود بودند. در این ارتباط در طی مطالعه­ای در اسپانیا،­ ترکیبات عمده اسانس رزماری، کامفور (9/21 درصد)، آلفا-پینن (8/14 درصد)، اکالیپتول ( 6/11 درصد) (Melero-Bravo et al., 2022) و در مطالعه دیگری مربوط به نواحی مختلف مراکش، کامفور (8/53-7/41 درصد)­­، اکالیپتول (­5/13-2/1 درصد) و آلفا-ترپینن (1/5 درصد) اعلام شده­است (Diass et al., 2021). همچنین در پژوهشی در این خصوص در ایتالیا، بیشترین ترکیبات اسانس گیاه مذکور شامل آلفا-پینن (4/75-2/11 درصد) و اکالیپتول (6/15-5/3 درصد) گزارش شده­است (Serralutzu et al., 2020). در یک گزارش از ایران نیز فراوان‌ترین ترکیبات اسانس رزماری، پیپریتون (7/23 درصد)، لینانول ( 9/14 درصد) و آلفا-پینن ( 9/14 درصد) (Gachkar et al., 2007) و در مطالعه دیگری از ایران بیشترین ترکیبات موجود در اسانس رزماری، اکالیپتول (89/26-63/5 درصد)­، کامفور (­82/24- 66/1 درصد) و آلفا-پینن ( 81/20-69/14 درصد) اعلام شده­است (Bajalan et al., 2017). ملاحظه می­شود که در پژوهش حاضر (جدول1) و نیز مطالعات فوق، اکالیپتول به عنوان یکی از ترکیبات اصلی گزارش شده ولی کامفور و آلفا-ترپینن که در اکثر مطالعات گزارش شده، در پژوهش حاضر دیده نشد.

همچنین در مطالعه حاضر مشخص گردید که استراگول با 42/70 درصد، کارن با 99/17 درصد و اکالیپتول (متیل­کاویکول) با 61/8 درصد، عمده‌ترین ترکیبات موجود در اسانس ریحان را تشکیل داده­اند که این نتایج متفاوت با گزارش دیگری از ایران است که ترکیبات عمده را متیل کاویکول (4/52 درصد) و لینالول (1/20 درصد) در اسانس رقم‌های ارغوانی گیاه ریحان و متیل کاویکول (5/40 درصد)، گرانیال (6/27 درصد) و نرال (5/18 درصد) را در اسانس رقم‌های سبز گیاه مذکور اعلام کرده­است (Sajjadi, 2006). همچنین در پژوهشی از اردن، ترکیبات عمده اسانس ریحان، لینالول (1/52 درصد) و لینالیل استات (1/19 درصد) ( Rezzong et al., 2019) و در پژوهش دیگری از ارمنستان که در مورد اسانس سه رقم مختلف گیاه ریحان انجام گرفته، در یک رقم متیل‌کاویکول (3/57 درصد)، در رقم دیگر لینالول (68 درصد) و در رقمی دیگر نرول (23 درصد) بیشترین ترکیب تشکیل دهنده بوده­است (Avetisyan et al., 2017). در تحقیقی در کشور ایتالیا هم در اسانس ریحان­های جمع‌آوری شده در ماه می و اکتبر بیشترین ترکیب به ترتیب لینالول (1/48 درصد) و اگنول (8/76 درصد) گزارش شده­است (De Martino et al., 2021). 

به احتمال زیاد اختلافات مشاهده شده در ترکیبات عمده تشکیل دهنده اسانس­ها در مطالعات مختلف، می‌تواند ناشی از شرایط آب و هوایی، جغرافیایی و نور آفتاب باشد (Bajalan et al., 2017).

 در تحقیق حاضر، MIC و MBC علیه باکتری‌های مورد مطالعه، به ترتیب در مورد اسانس رزماری 312/0-078/0 و 625/0-312/0 درصد و در مورد اسانس ریحان 312/0-039/0 و 625/0-078/0 درصد محاسبه گردید (جدول ­3­) و با توجه به این­که برای طبقه‌بندی قدرت ضد­باکتریایی عصاره‌های گیاهی از MIC (میکروگرم/ میلی لیتر) به­دست­آمده به روش ماکرودیلوشن یا میکرودایلوشن استفاده می‌شود که به درجات بسیار موثر (کمتر از  μg/m100)، موثر (μg/ml 500-100)، متوسط (μg/ml 1000-500)، کم اثر (μg/ml 2000-1000) و غیر‌موثر (بیشتر از  μg/ml2000) تقسیم می‌شوند (Sharifi-Rad et al., 2020)، لذا طبق این تقسیم‌بندی و با توجه به نتایج حاصله در این خصوص در تحقیق حاضر (جدول 3) اسانس‌های مطالعه حاضر بر باکتری­ها­ی تحقیق، بسیار موثر بوده­اند.

در مورد حداقل غلظت مهاری (MIC) و حداقل غلظت باکتری کشی (MBC) اسانس گیاهان رزماری و ریحان علیه باکتری­ها در مطالعات مختلف مقادیر متفاوتی گزارش شده‌است. مثلا در یک مطالعه مقدار MIC وMBC برای اسانس رزماری علیه  باکتری استافیلوکوکوس آرئوس مقاوم به چند دارو، 156 میلی‌گرم بر میلی‌لیترگزارش شده­است (Esmael et al., 2020). اما در یک مطالعه دیگر مقادیر MIC و MBC اسانس رزماری علیه استافیلوکوکوس آرئوس مقاوم به چند دارو به ترتیب 03/0 درصد و 1/0 درصد و علیه اشریشیاکولای 3/0 درصد و 5/0 درصد بوده­است (Jiang et al., 2011). همچنین مقدار MIC و MBC اسانس ریحان بر باکتری­های استافیلوکوکوس آرئوس و اشریشیاکولای در یک پژوهش، 128میلی‌گرم بر میلی‌لیتر اعلام شده­است (Rezzong et al., 2019). در پژوهشی دیگر هم از ارمنستان، MIC اسانس دو واریته متفاوت از گیاه ریحان بر باکتری استافیلوکوکوس آرئوس 125/3 و 25/6 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر و علیه باکتری اشریشیاکولای، 13 و 26 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر گزارش شده­است (Avetisyan et al., 2017). همچنین در یک مطالعه دیگر هم در ایتالیا، مقدار MICاسانس ریحان جمع آوری شده در ماه­های می و اکتبر بر باکتری اشریشیاکولای، 6 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر و علیه باکتری استافیلوکوکوس آرئوس، 4و5 میلی‌گرم بر‌ میلی‌لیتر گزارش شده­است (De Martino et al., 2021).

به‌نظر می­رسد که مقادیر متفاوت گزارش شده برای MIC و MBC اسانس گیاهان ریحان و رزماری در مطالعات مختلف می‌تواند به علت سویه‌های مختلف باکتریایی و ترکیبات مختلف موجود در اسانس­ها باشد  (Burt, 2004).­ 

ازطرف‌دیگر در مطالعه حاضر، نتایج حاصله از آزمون آنتی­بیوگرام (جدول 4) که به روش انتشار دیسک در آگار انجام گرفته­، مشخص کرد که اثرات ممانعت از رشد هر دو اسانس تحقیق بر سویه استاندارد باکتری­های استافیلوکوکوس آرئوس و استرپتوکوکوس آگالاکتیه، تفاوت آماری معنی‌‌داری با آنتی­بیوتیک جنتامایسین نداشت  ولی اثر مذکور بر سویه استاندارد باکتری اشریشیاکولای بطور معنی‌داری کمتر از جنتامایسین بود (002/0p=). از طرف دیگر مشاهده گردید که اثرات ممانعت از رشد اسانس­های رقیق نشده، به مراتب قوی‌تر از اثرات اسانس­های رقیق شده (1:1) (البته به غیر از اثر اسانس رزماری بر باکتری اشریشیاکولای) بود (جدول 4). در این ارتباط، در طی مطالعه­ای در سال 2015، قطر منطقه عدم رشد باکتری استافیلوکوکوس آرئوس در قبال اسانس ریحان  9­ میلی­متر و برای باکتری اشریشیاکولای 11 میلی‌متر گزارش شده­است (Al Abbasy et al., 2015). همچنین در مطالعات مختلف که به روش انتشار دیسک در آگار انجام شده، اعداد متفاوتی برای قطر منطقه عدم رشد باکتری­ها در قبال اسانس رزماری ذکر شده، به­طوری که در مورد  استافیلوکوکوس آرئوس 14-­5 میلی‌متر (Rathore et al., 2022)، 26-44 میلی‌متر (Jordan et al., 2013)­، 33/8 میلی‌متر (Gachkar et al., 2007) و در مورد سویه­های مقاوم به چند دارو باکتری استافیلوکوکوس آرئوس، 5/12 میلی‌متر (Esmael et al., 2020)­، 22 میلی‌متر (Irahal et al., 2020) و در مورد باکتری اشریشیاکولای، 5/19 میلی‌متر (Irahal et al., 2020)، 18-10 میلی‌متر (Bajalan et al., 2017) و 67/16 میلی‌متر (Gachkar et al., 2007) گزارش شده­است. به­نظر می­رسد که اختلافات مشاهده شده در خصوص قطر منطقه عدم رشد باکتری­ها در مطالعات مختلفی که بر اساس روش انتشار دیسک در آگار انجام شده، می‌تواند به علت سویه‌های مختلف باکتری­های آزمایش­شده، اختلاف در مقدار و غلظت اسانس­ها و آنتی‌بیوتیک‌های موجود در هر دیسک و همچنین اختلاف در ترکیبات شیمیایی موجود در اسانس‌ها باشد (Burt, 2004). البته در مورد این­که کدام ترکیب یا ترکیبات عامل اثرات ضد‌باکتریایی اسانس­های گیاهی هستند، نظرات مختلفی بیان شده، به­طوری­که در بعضی مطالعات گزارش گردیده که فقط ترکیبات اصلی عامل اثرات ضدباکتریایی اسانس‌ها نبوده و تمام ترکیبات در اعمال این اثرات نقش دارند و برای اثرات ضد‌باکتریایی وجود ترکیبات با مقدار کم هم ضروی بوده و اثر سینرژیست دارند و اثر کل اسانس بیشتر از اثر انفرادی ترکیبات اصلی می­باشد (2017 et al.,  Bouyahya Moosavi-Nasab et al., 2016;).

نکته قابل توجه دیگر در مطالعه حاضر، مشاهده اثر ضد باکتریایی قوی‌تر از اسانس‌های تحقیق بر باکتری­های گرم­ مثبت (استافیلوکوکوس آرئوس و استرپتوکوکوس آگالاکتیه) نسبت به باکتری گرم منفی اشریشیاکولای بود که البته با توجه به نتایج تحقیقات گذشته، مورد انتظار ما بود به­طوری که علت اصلی آن ممانعت از نفوذ اسانس‌ها و آنتی‌بیوتیک‌ها به داخل سلول توسط غشای خارجی(پرده بیرونی) دیواره سلولی باکتری­های گرم منفی اعلام شده و همچنین علاوه بر آن گزارش شده که آنزیم‌های ناحیه پری‌پلاسم باکتری­های گرم منفی‌ ممکن است ترکیبات شیمیائی با خاصیت ضد‌باکتریایی که در اسانس‌ها موجود هستند را غیر‌فعال کنند (Bouyahya et al., 2017).

اما در مورد اثرات اسانس­های تحقیق حاضر بر منحنی رشد باکتری­های آزمایش شده، مشاهده گردید که فقط در ساعت 24، اسانس رزماری و ریحان تعداد کلی باکتری­های اشریشیاکولای (نمودار 1) و استافیلوکوکوس آرئوس (نمودار 2) و اسانس ریحان تعداد کلی استرپتوکوکوس آگالاکتیه (نمودار 3) را به­صورت معنی‌داری کاهش دادند (05/0>p). در مطالعه جیانگ و همکاران در سال 2011، گزارش شده که غلظت ½ MIC و  MIC اسانس رزماری ابتدا باعث کاهش جمعیت باکتری استافیلوکوکوس آرئوس در ساعت هشتم دوره آزمایش شده ولی بعد از آن رشد باکتری تا ساعت 30 افزایش یافته، درحالی­که غلظت 2MIC(MBC) اسانس مذکور در ساعت هشتم­­، جمعیت باکتریایی را به صفر رساند  (Jiang et al., 2011). در مطالعه دیگری اسانس رزماری در غلظت ½ MIC و MICباعث کاهش اندک رشد در 8-4 ساعت اول تحقیق شده ولی بعد از آن تا ساعت 30­، جمعیت باکتری­های استافیلوکوکوس زواپیدرمیکوس و اشریشیاکولای افزایش یافته­ و تنها غلظت 2MIC اسانس فوق باعث نابودی هر دو باکتری در ساعت 12 پژوهش شده­است (Fu et al., 2007). به نظر می­رسد که اختلافات گزارش­شده در ساعت­های مهار رشد باکتری­ها می‌تواند به علت اختلاف در ترکیبات اسانس در مطالعات مختلف باشد. البته بایستی توجه کرد که اثرات ذکر شده در تحقیق حاضر، مربوط به مقادیر تحت حداقل غلظت مهاری رشد بوده و اگر غلظت مهاری و یا حتی غلظت­های چند برابر مهاری استفاده می‌شد به احتمال زیاد اثرات ضدباکتریایی، خیلی قوی‌تر می‌بود.

براساس یافته­های تحقیق حاضرمشخص گردید که ‌به­طور کلی اسانس رزماری و ریحان در مطالعه آزمایشگاهی (in vitro) حاضر، اثرات ضد باکتریایی قابل قبولی داشتند، به­طوری­که اثرات آن­ها بر استافیلوکوکوس آرئوس و استرپتوکوکوس آگالاکتیه تفاوت آماری معنی‌داری با اثر آنتی‌بیوتیک جنتامایسین نداشت (000/0p= ، جدول 4). لذا پیشنهاد می­گردد اثرات اسانس­های فوق در درمان بیماری ورم پستان باکتریایی، بر روی دام­های زنده (in vivo) مطالعه گردد.

 

سپاسگزاری

یافته­های ارائه­شده در تحقیق حاضر برگرفته از طرح پژوهشی مصوب دانشگاه گنبد کاووس با کد 183/6  می­باشد که با­ حمایت معاونت محترم پژوهشی انجام شده­است، لذا نویسندگان بدین وسیله مراتب تشکر و قدردانی خود را اعلام می­دارند.

 

 

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده­است.

 

 

 

 

منابع

● Al Abbasy, D.W., Pathare, N., Al-Sabahi, J.N. and Khan, S.A. (2015). Chemical composition and antibacterial activity of essential oil isolated from Omani basil (Ocimum basilicum Linn.). Asian Pacific Journal of Tropical Disease, 5(8): 645–649.

● Alekish, M.O., Ismail, Z.B., Awawdeh, M.S. and Shatnawi, S. (2017). Effects of intramammary infusion of sage (Salvia officinalis) essential oil on milk somatic cell count, milk composition parameters and selected hematology and serum biochemical parameters in Awassi sheep with subclinical mastitis. Veterinary World, 10(8): 895–900.

● Ananda Baskaran, S., Kazmer, G. W., Hinckley, L., Andrew, S.M. and Venkitanarayanan, K. (2009). Antibacterial effect of plant-derived antimicrobials on major bacterial mastitis pathogens in vitro. Journal of Dairy Science, 92(4): 1423–1429.

● Avetisyan, A., Markosian, A., Petrosyan, M., Sahakyan, N., Babayan, A., Aloyan, S., et al. (2017). Chemical composition and some biological activities of the essential oils from basil Ocimum different cultivars. BMC Complementary and Alternative Medicine, 17(1): 1–8.

● Bajalan, I., Rouzbahani, R., Ghasemi, A. and Maggi, F. (2017). Antioxidant and antibacterial activities of the essential oils obtained from seven Iranian populations of Rosmarinus o ffi cinalis. Industrial Crops and Products, 107(February): 305–311.

● Basti, A.A., Misaghi, A. and Khaschabi, D. (2007). Growth response and modelling of the effects of Zataria multiflora Boiss. essential oil, pH and temperature on Salmonella Typhimurium and Staphylococcus aureus. LWT - Food Science and Technology, 40(6): 973–981.

● Bouyahya, A., Et-Touys, A., Abrini, J., Talbaoui, A., Fellah, H., Bakri, Y., et al. (2017). Lavandula stoechas essential oil from Morocco as novel source of antileishmanial, antibacterial and antioxidant activities. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 12(September): 179–184.

●Burt, S. ( 2004). Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods—a review. International Journal of Food Microbiology, 119 (1): 223–253.

● CLSI. (2015). Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement (M100-S25). 9th ed., Wayne, pp:44-90.

● Contreras, G. A. and Rodríguez, J. M. (2011). Mastitis: Comparative etiology and epidemiology. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia, 16(4): 339–356.

● Da Silva, W.M.F., Kringel, D.H., de Souza, E.J.D., da Rosa Zavareze, E. and Dias, A.R.G. (2022). Basil Essential Oil: Methods of Extraction, Chemical Composition, Biological Activities, and Food Applications. Food and Bioprocess Technology, 15(1): 1–27.

● De Martino, L., Amato, G., Caputo, L., Nazzaro, F., Scognamiglio, M.R. and De Feo, V. (2021). Variations in composition and bioactivity of Ocimum basilicum cv ‘Aroma 2’ essential oils. Industrial Crops and Products, 172: 114068.

● de Moraes Peixoto, R., de Moraes Peixoto Araújo, R., e Silva Peixoto, L.J., Gonçalves Bomfim, S.A., Guedes da Silva, T.M., Sarmento Silva, T.M., et al. (2015). Treatment of goat mastitis experimentally induced by Staphylococcus aureus using a formulation containing Hymenaea martiana extract. Small Ruminant Research, 130(2015): 229–235.

● Diass, K., Brahmi, F., Mokhtari, O., Abdellaoui, S. and Hammouti, B. (2021). Biological and pharmaceutical properties of essential oils of Rosmarinus officinalis L. And Lavandula officinalis L. In Materials Today: Materials Today Proceedings, 45(2): 7768–7773.

● Esmael, A., Hassan, M.G., Amer, M.M., Abdelrahman, S., Hamed, A.M., Abd-raboh, H.A., et al. (2020). Antimicrobial activity of certain natural-based plant oils against the antibiotic-resistant acne bacteria. Saudi Journal of Biological Sciences, 27(1): 448–455.

● Fu, Y.J., Zu, Y.G., Chen, L.Y., Shi, X.G., Wang, Z., Sun, S., et al. (2007). Antimicrobial activity of clove and rosemary essential oils alone and in combination. Phytotherapy Research, 21(10): 989–994.

● Gachkar, L., Yadegari, D., Rezaei, M.B., Taghizadeh, M., Astaneh, S.A. and Rasooli, I. (2007). Chemical and biological characteristics of Cuminum cyminum and Rosmarinus officinalis essential oils. Food Chemistry, 102(3): 898–904.

● Hasanpour, A., Zakhireh, S. and Ebadi, A.R. (2014). Investigating the antibacterial effects of the non-polar extract of Malva sylvestis L with methods of diffusion from wells and tube dilution. Journal of Clinical Pathology, 8(4): 645-651. [In Persian]

● Irahal, N., Fouzia, H., Fatima, L., Ahmed, E., Santé, L., Esmaeil, G., et al. (2020). Chemical composition , antibacterial and antioxidant activities of some essential oils against multidrug resistant bacteria. European Journal of Integrative Medicine, 35: 101074.

● Jiang, Y., Wu, N., Fu, Y.J., Wang, W., Luo, M., Zhao, C.J., et al. (2011). Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil of Rosemary. Environmental Toxicology and Pharmacology, 32(1): 63–68.

● Jordán, M.J., Lax, V., Rota, M.C., Lorán, S. and Sotomayor, J.A. (2013). Effect of bioclimatic area on the essential oil composition and antibacterial activity of Rosmarinus officinalis L . Food Control, 30(2): 463–468.

● Melero-Bravo, E., Ortiz de Elguea-Culebras, G., Sánchez-Vioque, R., Fernández-Sestelo, M. and Herraiz-Peñalver, D. (2022). Variability of essential oil in cultivated populations of Rosmarinus officinalis L. in Spain. Euphytica, 218(6): 1–12.

● Moosavi-Nasab, M., Saharkhiz, M.J., Ziaee, E., Moayedi, F., Koshani, R. and Azizi, R. (2016). Chemical compositions and antibacterial activities of five selected aromatic plants essential oils against food-borne pathogens and spoilage bacteria. Essential Oil Research, 83(3): 607–613.

● Oliveira, J. R. De, Esteves, S. and Oliveira, L. (2019). Rosmarinus officinalis L . ( rosemary ) as therapeutic and prophylactic agent. Journal of Biomedical Science, 29(5): 1–22.

● Park, Y.K., Fox, L.K., Hancock, D.D., McMahan, W. and Park, Y.H. (2012). Prevalence and antibiotic resistance of mastitis pathogens isolated from dairy herds transitioning to organic management. Journal of Veterinary Science, 13(1): 103–105.

● Rahimiyan, J., Shayegh, J. and Golzari, A. (2021). Therapeutic effect of marbofloxacin on Escherichia coli-induced mastitis in dairy cows. Journal of Clinical Pathology, 14(56): 381-388. [In Persian]

● Rathore, S., Mukhia, S., Kapoor, S., Bhatt, V., Kumar, R. and Kumar, R. (2022). Seasonal variability in essential oil composition and biological activity of Rosmarinus officinalis L. accessions in the western Himalaya. Scientific Reports, 12(1): 1–13.

● Rezzoug, M., Bakchiche, B., Gherib, A., Roberta, A., Guido, F., Kilincarslan, et al. (2019). Chemical composition and bioactivity of essential oils and ethanolic extracts of Ocimum basilicum L. and Thymus algeriensis Boiss. and Reut. from the Algerian Saharan Atlas. BMC Complementary and Alternative Medicine, 19(1): 1–10.

● Sajjadi, S.E. (2006). Analysis of the essential oils of two cultivated basil (Ocimum basilicum L.) from Iran. Daru, 14(3): 128–130. [In Persian]

● Serralutzu, F., Stangoni, A. Pietro, Amadou, B., Tijan, D., Re, G.A., et al. (2020). Essential oil composition and yield of a Rosmarinus officinalis L. natural population with an extended flowering season in a coastal Mediterranean environment and perspectives for exploitations. Genetic Resources and Crop Evolution, 67(7): 1777–1793.

● Sharifi-Rad, J., Ezzat, S.­M., El Bishbishy, M.­H., Mnayer, D., Sharopov, F., Kılıç, C.S., et al. (2020). Rosmarinus plants: Key farm concepts towards food applications. Phytotherapy Research, 34(7): 1474–1518.

● Zhu, H., Du, M., Fox, L. and Zhu, M.J. (2016). Bactericidal effects of Cinnamon cassia oil against bovine mastitis bacterial pathogens. Food Control, 66 (2016): 291–299.

101