The importance and characteristics of sperm diluents

Subject Areas : Veterinary Clinical Pathology

Gholam ali moghaddam ¹ (Professor, Department of Animal Science, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz, Iran.)
parisa shafaati ² (Physiology Graduate, Department of Animal Science, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz, Iran.)

Received: 2024-01-16 Accepted : 2024-05-12 Published : 2024-05-19

Keywords: Additives, Cooled preservation, Cryopreservation, Seminal plasma, Sperm.,

Abstract :

Despite the significant progress in sperm cryopreservation methods in recent years, research has proven that long-term storage of sperm in freezing and cold storage causes serious damage to sperm. The occurrence of fat peroxidation and the metabolism of spermatozoids results in destruction of spermatozoa during freezing and storage. Temperature shock, the formation of intracellular ice crystals, cellular dehydration, increased salt concentration and osmotic shock may occur during the freezing and thawing process. In addition, cryopreservation causes harmful structural changes in the plasma membrane. Changes in membrane permeability to some ions such as calcium during the freezing and thawing process have been reported. Also, during cryopreservation, the formation of intracellular and extracellular ice causes cell destruction and death. The sperm plasma membrane is the main site of damage during the freezing and thawing process and is very sensitive to lipid peroxidation due to the presence of many unsaturated fatty acids. These changes may have a role in the accumulation of toxic products of metabolism, mainly reactive oxygen species (ROS) that are generated through lipid peroxidation of sperm membranes. Small amounts of ROS play an important role in sperm capacitation, increased sperm motility, acrosome reaction, and oocyte fertilization in humans, cows, horses, pigs, and rams. Therefore, to solve these problems, various antioxidants, preservatives and chelators are used in sperm extenders.

Full-Text:



آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی                                                                                                                  دوره 18، شماره 1، پیاپی 69، بهار 1403، صفحات: 67-45

 

"مقاله مروری"                                                             DOI: 10.30495/jvcp.2024.1984584.1411

 

اهمیت و خصوصیات رقیق‌کننده‌های اسپرم

 

غلامعلی مقدم1*، پریسا شفاعتی‌علیشاه2

 

1- استاد گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران.

2- دانش­آموخته كارشناسي ارشد فیزیولوژی دام، گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران.

*نویسنده مسئول مکاتبات:  [e-mail]

(تاریخ دریافت: 26/10/1402 تاریخ پذیرش: 23/2/1403)

 

 

چکیده

با وجود پیشرفت​های چشمگیری که در روش­های نگه­داری انجمادی اسپرم در طول سال­های اخیر صورت گرفته است، تحقیقات ثابت کرده که نگه­داری طولانی مدت اسپرم در حالت انجماد و نگه­داری سرمایی آسیب جدی به اسپرم وارد می​کند. به­وجود آمدن پراکسیداسیون چربی و متابولیسم خود اسپرماتوزوئیدها در هنگام انجماد و نگه­داری، سبب از بین رفتن اسپرماتوزوئیدها می‌شود. شوک دمایی، شکل کریستال­های یخ داخل سلولی، دهیدراتاسیون سلولی، افزایش غلظت نمک­ها و شوک اسموتیک در طول فرآیند انجماد و یخ‌گشایی ممکن است صورت گیرد. علاوه بر این، نگه­داری انجمادی تغییرات مضر ساختاری در غشای پلاسما ایجاد می​کند. تغییرات در نفوذپذیری غشاء نسبت به برخی از یون‌ها مثل کلسیم در طول فرآیند انجماد و یخ‌گشایی گزارش شده است. همچنین در هنگام نگه­داری انجمادی، تشکیل یخ داخل و خارج سلولی سبب تخریب و مرگ سلولی می‌شود. غشای پلاسمایی اسپرم محل اصلی آسیب در طی فرآیند انجماد و ذوب است و به دلیل دارا بودن اسیدهای چرب غیراشباع  زیاد، در مقابل پراکسیداسیون لیپیدها بسیار حساس است. این تغییرات ممکن است در تجمع محصولات سمی ناشی از متابولیسم، به طور عمده از گونه­های فعال اکسیژن (reactive oxygene species) که از طریق پراکسیداسیون لیپیدی غشاهای اسپرم ایجاد می­شوند، نقش داشته باشد. گونه‌های فعال اکسیژن در  مقادیر کم، نقش مهمی در کاپاسیته شدن اسپرم، افزایش تحرک اسپرم، واکنش آکروزوم و لقاح تخمک را در قوچ‌ دارد. بدین منظور جهت رفع این مشکلات از مواد مختلف آنتی‌اکسیدانی، حفاظت‌کننده‌ها و همچنین کلاتورها در رقیق­کننده­های اسپرم استفاده می‌شود.

 

کلیدواژه­ها: افزودنی­ها، نگه‌داری انجمادی، نگه‌داری سرمایی، اسپرم، سمینال­پلاسما.

 

 

 

 

مقدمه

-تلقیح مصنوعی

تلقيح مصنوعي برای ارتقاء ژنتیکی حیوانات مزرعه‌‌ای ابداع گردیده است (Salamon and Maxwell, 1995).در تلقيح مصنوعي به دليل عدم تماس مستقیم تولید مثلی، از انتقال بیماری­های مقاربتی جلوگیری می­شود (Shafaati Alishah et al., 2021). همچنين با انتخاب چند حیوان نر، اسپرم کافی برای تلقیح حدود هزار حیوان ماده در سال فراهم می‌شود. تلقیح مصنوعی در پرورش گاوهای شیری کابرد زیادی داشته، ولی هنوز پذیرش جهانی را در پرورش گوسفند دریافت ننموده است (Shafaati Alishah et al., 2020). تلقیح مصنوعی موفق، تحت تأثیر پارامترهای متعددی است که یکی از اصلی‌ترین پارامترها دسترسی به اسپرم‌های بارور است که این امر تنها در یک فرآیند انجماد موفق حاصل می‌شود. همچنین بستگی به توانایی جمع‌آوری مؤثر، ارزیابی و نگه‌داری منی از نرهای باکیفیت برای استفاده دزهای بیشتر تلقیح نيز می‌باشد (Ferdinand et al., 2012 : Watson, 2000 )­، البته کیفیت اسپرم قوچ، تحت تاثیر فصول سال هم می­باشد، چون جفت­گیری فصلی دارد (Moghaddam et al., 2012).

-ترکیبات و خصوصیات سمینال‌پلاسما

ترکیب بیوشیمیایی مایع منی در بین گونه‌ها بسیار متغیر است. برخی از ترکیبات سمینال‌پلاسما برای متابولیسم اسپرم، همچنین عملکرد، زنده‌مانی و انتقال اسپرم در دستگاه تناسلی ماده بسیار ضروری است. pH آن در قوچ و گاو نر کمی اسیدی و در شترها کمی بازی است. ترکیبات بیوشیمیایی سمینال‌پلاسمای حاصله از رته‌تستیس، اپیدیدیم و غدد جنسی ضمیمه‌ء مجرای تناسلی نر ناشناخته است (Mann and Lutwak-Mann, 1981). تشخیص و شناسایی چندین ماده در ترشحات غدد ضمیمه‌‌ء جنسی مثل اسید سیتریک، پروستات فسفاتاز، فروکتوز و فسفریل کولین، راه را برای درک و مطالعه‌‌‌ء فعالیت‌های مختلف شیمیایی ترشحی و نقش احتمالی غدد برای اسپرم، باز کرده است (Mann and Lutwak-Mann, 1981). استفاده از مایع منی رقیق‌سازی  و حذف سمینال‌پلاسما در تلقیح مصنوعی گونه‌های اهلی منجر به پایین آمدن نرخ باروری در مقایسه با جفت‌گیری طبیعی می‌شود (Tummaruk et al., 2000).

-ترکیبات بیوشیمیایی سمینال‌پلاسما و عملکردهای آن­ها

سمینال‌پلاسما از یون­ها (Na+، K+، Zn+، Ca2+، Mg+ و Cl ̶)، ترکیبات انرژی‌زا (فروکتوز، سوربیتول، گلیسریل فسفوکولین)، ترکیبات آلی (اسید سیتریک، اسیدهای آمینه، پپتیدها، پروتئین‌های با وزن مولکولی کم و زیاد، لیپیدها، هورمون‌ها و سیتوکین‌ها) تشکیل شده است. ترکیبات نیتروژنی مثل آمونیاک، اوره، اسیداوریک و کراتینین و ترکیبات کاهنده مثل اسید آسکوربیک و هیپوتائورین نیز در سمینال‌پلاسمای نشخوارکنندگان وجود دارد (Juyana and Stella, 2012).

عملکرد سمینال‌پلاسما در فیزیولوژی طبیعی با انزال اسپرم و بقای آن در دستگاه تولیدمثلی ماده همراه است. نقش سمینال‌پلاسما در بلوغ اسپرم در گونه‌های مختلف بررسی شده است. مهم‌ترین نقش‌های مختلف سمینال‌پلاسما شامل:

فعال­سازی و افزایش تحرک اسپرم،بافرینگ جهت بهبود محیط مغذی و اسمزی مطلوب، جلوگیری از فعال‌شدن قبل از بلوغ در طی انتقال فیزیولوژیکی اسپرم و تثبیت غشای پلاسما با مهارکننده‌های ظرفیت‌پذیری، حفاظت از اسپرم‌ها از فاگوسیتوز در التهاب ، تنظیم انتقال و زدودگی، تخمک‌گذاری سزیع در گاو و القای آن در خوک و شتر،کمک به فعل و انفعالات اسپرم-تخمک، فعال‌سازی بیان سیتوکین‌های جنینی و کمک به آماده‌سازی رحم برای رشدامبریو و تأثیر بر باروری. افزودن سمینال‌پلاسما یا ترکیبات آن به اسپرم پس از یخ‌گشایی جذب اکسیژن و جنبندگی اسپرم را افزایش داده و بعضی از پروتئین‌های سطحی بهبود یمی دهد (Domı´nguez et al. 2008)، آسیب سرمایی غشای پلاسمایی اسپرم قوچ را ترمیم داده و تمامی پارامترهای کیفی اسپرم را افزایش می‌دهد (Maxwell et al., 2007). 

- پروتئین‌ها

پروتئین‌های سمینال‌پلاسما  حاصل ترشح اپیدیدیم و وزیکول‌های سمینال هستند (Chandonnet et al., 1990). افزودن و حذف انواع پروتئین‌های سمینال‌پلاسما در طول بلوغ در اپیدیدیم و زمان انزال نقش مهمی در حفظ پایداری سمینال‌پلاسما، جنبایی، ظرفیت‌پذیری و اثر متقابل تخمک-اسپرم و باروری بازی می‌کند (The´rie´n et al., 1998). همچنین پروتئین‌های سمینال‌پلاسما می‌توانند نفوذ اسپرم به اووسیت را افزایش دهند (El-Hajj Ghaoui et al., 2007). بین مقدار پروتئین کل و توانایی انجماد منی قوچ یک همبستگی مثبت گزارش شده است (Barrios et al., 2000). اسپرم پستانداران جنبایی و توانایی تشخیص و باروری اووسیت‌ها را از طریق فعل و انفعالات توسط پروتئین‌های موجود در مایع اپیدیدیم به دست می‌آورند. پروتئین‌های مختلف اپیدییدم با تغییر سطح غشای اسپرم یا ترکیبات و یا کمک به حفظ یکپارچگی اسپرم، نقش‌های مختلفی را بر عملکرد اسپرم دارند (Juyana and Stella, 2012).

- اسیدهای آمینه و آنزیم‌ها

طیف وسیعی از اسیدهای آمینه در سمینال‌پلاسما بوده و بیشتر این­ها از بیضه‌یا اپیدیدیم نشأت گرفته­اند. غلظت آنها بعد از انزال به دلیل فعالیت گسترده‌ی پروتئولیتیک در مایع منی افزایش می‌یابد (Mann and Lutwak-Mann, 1981). اسیدهای آمینه به عنوان یک ماده شیمیایی به راحتی قابل اکسیداسیون برای انرژی هستند و منجر به فعل و انفعالات در منی می­شوند (Neumark H and Schindler, 1967). گلوتامیک اسید بیشترین غلظت  را در سمینال‌پلاسما داشته که با سطح بالای فعالیت گلوتامیک اگزالواستیک ترانسفراز همراه است (Flipse, 1960). L- آرژنین در سمینال‌پلاسمای نشخوارکنندگان به عنوان منبع انرژی برای حرکت نرمال اسپرم‌ها در شکل آرژینین فسفریک اسید فعالیت می‌کند. سایر آنزیم‌های سمینال‌پلاسما شامل آسپارتات آمینوترانسفراز، گلوتامین پیروات ترانس­آمیناز، آلانین آمینوترانسفراز، آلکالین فسفاتاز و لاکتات دهیدروژناز هستند. این آنزیم‌ها به عنوان شاخص‌های خوبی از کیفیت مایع منی هستند زیرا پایداری اسپرم را بیان می‌کنند (Patel et al., 1998. : Sirat et al., 1996).

- آنتی‌اکسیدان­ها

اسپرم­ها در برابر پراکسیداسیون لیپیدی توسط گونه‌های آزاد اکسیژن (ROS) مثل هیدروژن پراکسید (H2O2)، سوپراکسید آنیون (O2 ̶)، نیتریک اکسید و رادیکال هیدروکسیل (-OH) بسیار حساس هستند. در مایع منی گاو و قوچ، ROS‌ها به طور عمده توسط اسپرم‌های مرده از طریق واکنش اکسیداز-کاتالاز وآمینواسید آروماتیک تولید می‌شوند (Nateq et al., 2020). از لحاظ فیزیولوژیک ROS نقش مهمی در ظرفیت‌پذیری اسپرم ، واکنش آکروزومی و تثبیت میتوکندری کپسول در قطعه‌ی میانی در گاو دارندو اثرات مفید آنها روی عملکرد اسپرم به غلظت ROS خاص درگیر، بستگی دارد (De Lamirande and Gagnon, 1992).

برای حفظ فعالیت‌های فیزیولوژیکی، تعادل بین تولید ROSها و بازیافت آنها در محیط اطراف سلول‌های اسپرم ضروری است. در غیر این‌صورت هرگونه عدم تعادل باعث اختلال در عملکرد اسپرم از طریق استرس اکسیداتیو خواهد شد (Behnam et al., 2022). برای محافظت اسپرماتوزوا از استرس اکسیداتیو، اسپرماتوزئیدها و سمینال‌پلاسما دارای آنزیم‌هایی هستند که به نام سوپراکسید دیسموتاز (Superoxide dismutase; SOD)، گلوتاتیون ردوکتاز (Glutathione reductase; GR)، گلوتاتین پراکسیداز (Glutathione peroxidases; GPX) و سوبستراهای آن (Glutathione; GSH و GPx–Se− plus oxidized glutathione; GSSG) و کاتالاز (Catalase; CAT) شناخته می‌شوند (Mann and Lutwak-Mann, 1981).

کاتالاز که یک آنزیم اپیدیدیمی است، اسپرماتوزوا را از آسیب اکسیداتیو در لومن اپیدیدیم محافظت می‌کند درحالی‌که SOD و GPx ترشح شده از وزیکول سمینال بعد از انزال از اسپرم حفاظت می‌کند (Zubkova and Robaire, 2004). محل تجمع SOD در آکروزوم، پس‌آکروزم و دم، GPX در پس‌آکروزم و ابتدای سر و GR در دم اسپرم نشان داده شده است. SOD خودبه‌خود O2 ̶ را از شکل O2 و H2O2 دیسموتاز می‌کند، درحالی‌که کاتالاز، H2O2 را به O2 و H2O تبدیل می‌کند (Alvarez et al., 1987).

یکی از ویژگی‌های پاک‌کنندگی آنتی‌اکسیدان سمینال‌پلاسما در رابطه با غلظت بالای GSH است. گلوتاتیون یک سوبسترا برای آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز حاوی سلنیوم (آنزیم اصلی در حذف پراکسیدهای هیدروژن) و گلوتاتیون ترانسفراز (آنزیمی که واکنش‌های کووالانتی گلوتاتیون را با مواد الکتروفیلیک کاتالیز می‌کند) است. گلوتاتیون به عنوان دهنده‌ی الکترون عمل می‌کند و می‌تواند از طریق گروه تیولیک با هیدروژن پراکسید، سوپراکسید آنیون و رادیکال‌های هیدروکسیل و گروه سولفیدیریل آن و همچنین با رادیکال‌های آلکوکسیل و هیدروپراکسی‌ها واکنش نشان دهد (Lenzi et al., 1996). گلوتاتیون ردوکتاز، GSH را از گلوتاتیون اکسیدشده (GSSG) احیاء می‌کند. در طول عملکرد آنتی‌اکسیدانی، گلوتاتیون در فروکتولیز اسپرماتوزویید نیز درگیر است. این یک کوآنزیم از 1و3- دی فسفو گلیسیریک آلدئید دهیدروژناز است که منجر به اکسیداسیون تریوزفسفات به فسفوگلیسریک اسید می‌شود که به اسیدپیرویک و اسید لاکتیک تبدیل می‌شود که باعث بهبود فعالیت متابولیکی و جنبندگی اسپرماتوزوا می‌شود (Sinha et al., 1996).

عوامل ضد پراکسیداسیون در انزال به اسپرم‌ها متصل شده و آنها را از پراکسیداسیون لیپیدی در دستگاه تناسلی ماده محافظت می‌کنند. GPX و SOD به‌طور عمده در پیشگیری از شوک سرمایی دخالت دارند. سطوح آنتی‌اکسیدانی سیستم‌های دفاعی بسته به گونه، فصل و نوع انزال متفاوت است (Juyana and Stella, 2012).

- یون‌ها

عملکرد اسپرم به شدت وابسته به محیط یونی بوده و سطوح مواد معدنی رژیم غذایی می‌تواند غلظت یونهای سمینال‌پلاسما  اثربگذارد. کاتیون‌هایی مثل  Na، K، Ca و Mg  در ایجاد تعادل اسمزی و اجزای بسیاری از آنزیم‌ها نقش دارند (Cevik et al., 2007).

سدیم کاتیون اصلی در سمینال‌پلاسما به استثنای گاو بوده که در آن غلظت Ca بسیار بالاست (Setchell and Brooks, 1988). پتاسیم یک عنصر طبیعی و مهارکننده است و غلظت بالای K در سمینال‌پلاسما متابولیسم اسپرم را کاهش داده و درنتیجه حرکت اسپرم نیز کاهش می­یابد (Massa´nyi et al., 2003). کلسیم واکنش آکروزومی را در پستانداران راه انداخته و با جنبندگی اسپرم در ارتباط است (Kaya et al., 2002). منیزیم تقریبا در تمامی سیستم‌های آنزیمی یافت می‌شود و به عنوان یک نشانگر ترشح وزیکول سمینال است و می‌تواند در جنبندگی اسپرم نقش ایفا کند (Jobim et al., 2004). یک همبستگی منفی بین اسپرم‌های غیرطبیعی با غلظت‌های فسفر، کلسیم و سدیم و همچنین یک همبستگی مثبت با غلظت K در منی گاو دیده شده است. مس برای بسیاری از آنزیم‌ها مثل CuZn-SOD لازم است. اخیرا چندین محقق بین محتوای مس و جنبندگی اسپرم در سمینال‌پلاسمای بوفالو همبستگی مثبتی مشاهده کرده اند (Eghbali et al., 2008). عنصر روی یک فعالیت آنتی‌اکسیدانی محافظتی را اعمال می‌کند و عامل اصلی فعالیت ضدباکتریایی سمینال‌پلاسما است. روی نقش مهمی در کنترل حرکت با کنترل مصرف انرژی از طریق سیستم‌های آدنوزین تری فسفات و تنظیم ذخایر انرژی فسفولیپیدی ایفا می‌کند (Hidiroglou and Knipfel, 1984).

توزیع یون­های عمده بین اسپرم و سمینال‌پلاسما ممکن است مبنایی برای تغییرات در کیفیت منی انزال‌های متوالی مختلف باشد و باید در تفسیر و ارزیابی باروری در نظر گرفته شود. بسیاری از مطالعات انجام شده بر روی خواص یون­های سمینال پلاسما، در منی انسان انجام گرفته است (Juyana and Stella, 2012).

- قندهای احیاءکننده

فروکتوز اصلی‌ترین ساکارید موجود در سمینال‌پلاسمای نشخوارکنندگان است. غدد ضمیمه‌ی جنسی با نحریک تستوسترون فروکتوز  را از گلوکز خون تولید و غلظت آن در طول فصل تولیدمثل افزایش می‌یابد اسپرماتوزوا فروکتوز را برای تولید ATP استفاده می‌کند (Matsuoka et al., 2006). غلظت فروکتوز در سمینال‌پلاسما اغلب به عنوان شاخصی از وضعیت آندروژنی حیوان استفاده می‌شود، زیرا ترشح آن تحت کنترل سطح آندروژن خون است (Mann and Lutwak-Mann, 1981). ثبت غلظت فروکتوز در سمینال‌پلاسمای گونه‌های مختلف می‌تواند در تعیین مقدار ان جهت اضافه کردن  به رقیق‌کننده‌ کمک کند (Juyana and Stella, 2012).

یک قند احیاءکننده‌ی دیگر به نام سوربیتول در سمینال‌پلاسمای نشخوارکنندگان وجود دارد. اسپرم قوچ دارای آنزیم سوربیتول دهیدروژناز است که تبدیل سوربیتول به فروکتز را ممکن می‌سازد. ترکیب قند سمینال‌‌پلاسما  با توجه  به تولید انرژی با باروری ارتباط دارد (Garner et al., 2001).

- لیپیدها

یکی از ویژگی‌های کلیدی در عملکرد اسپرماتوزوئید، ترکیب چربی در غشای پلاسمایی و سمینال‌پلاسما است. پروفیل‌های لیپیدی شامل کلسترول، فسفولیپیدها، دی‌گلیسریدها، تری‌گلیسریدها و استرهای مومی است. منبع احتمالی لیپید اپیدیدیم و خود اسپرم میباشد. لیپیدهای سمینال به ویژه فسفولیپیدها و کلسترول، ارتباط خاصی در ساختار و عملکرد غشای پلاسمایی اسپرم دارند و ممکن است نقش مهمی در ساختار اسپرم، متابولیسم، ظرفیت‌پذیری اسپرم و باروری گامت‌های ماده داشته باشد (Cross, 1998). انواع مختلف فسفولیپیدهای موجود در سمینال‌پلاسما شامل فسفاتیدیل کولین (کولین پلاسموژن)، فسفاتیدیل اتانولامین، اسفینگومیلین، فسفاتیدیل سرین، فسفاتیدیل اینوزیتول، لایزوفسفاتیدیل اتانولامین، لایزوفسفاتیدیل کولین، دی فسفاتیدیل گلیسرول و فسفاتیدیک اسید می‌باشد که پلاسمینوژن فسفولیپید اصلی سمینال‌پلاسمای نشخوارکنندگان است (Juyana and Stella, 2012).

اگرچه فروکتوز اصلی‌ترین ماده‌ی تولیدکننده‌ی انرژی است، اسپرم‌ها ممکن است از فسفولیپیدها برای تولید انرژی در صورت عدم وجود کربوهیدرات‌ها استفاده کنند (Scott T W and Dawson, 1968). مطالعات روی منی قوچ نشان داد که کاهش غلظت اسپرم و جنبنایی با کاهش محتوای لیپید سمینال‌پلاسما همراه است (Taha et al., 2000). بررسی‌ها بر روی عملکردهای واقعی لیپیدهای سمینال‌پلاسما در اسپرم نشخوارکنندگان ممکن است فرآیند نگه­داری سرمایی را بهبود ببخشد زیرا انتقال پروتئین‌ها از طریق غشای اسپرم به وسیله‌ی توزیع لیپیدها در امتداد غشا تنظیم می‌شود (Parks and Graham, 1992).

- هورمون‌ها و سیتوکین‌ها

هورمون‌هایی مانند استروژن­ها، پروژسترون، تستوسترون، هورمون لوتئینه­کننده (LH)، پرولاکتین و پروستاگلندین‌ها در سمینال‌پلاسمای نشخوارکنندگان وجود دارد. عملکرد خاص این هورمون‌ها در سمینال‌پلاسما ناشناخته است (Juyana and Stella, 2012). هورمون‌های استروئیدی و پروستاگلندین نتیجه‌ی فعالیت سلول‌های لایدیگ، اپیدیدیم، وزیکول سمینال و پروستات وهمچنین خود اسپرم‌ها هستند زیرا سلول اسپرم هم حاوی آروماتاز و هم سیکلواکسیژناز است (Hess et al., 2001). پروفیل‌ هورمونی سمینال‌پلاسما در گونه‌های مختلف متفاوت است. سمینال‌پلاسمای قوچ حاوی مقادیر پایین غلظت‌های استروژن و تستوسترون در مقایسه با سمینال‌پلاسمای گاو نر است. مایع منی قوچ مقدار مناسبی پروستاگلندین دارد که برای تحریک فعالیت انقباضی سرویکس و رحم و بهبود انتقال اسپرم در میش‌ بوده و سطح پروستاگلاندین وابسته به فصل است (Shore et al., 2003).  

-روش­های نگه‌داری اسپرم

-نگهداری اسپرم به شکل مایع (نگه‌داری سرمایی)

در این روش ابتدا منی در دمای 30 درجه سانتی‌گراد با رقیق‌کننده مخلوط می­شود و حدود 30 دقیقه در این دما نگه می­شود تا اثر آنتی­بیوتیکی رقیق‌کننده اعمال شود و سپس به تدریج تا 5 درجه سلسیوس خنک می‌گردد. رقیق‌کننده‌ای که برای رقیق‌کردن منی می­توان استفاده نمود شامل زرده تخم مرغ، گلوکز، سیترات یا شیر گاو (چربی گرفته یا نگرفته) و شیر با قابلیت نگه‌داری مدت طولانی می‌باشد. این رقیق­کننده­ها اسپرماتوزوییدها را تا حد امکان در مقابل شوک سرمایی، در مدت سردکردن محافظت می­نمایند. برای کنترل رشد میکروبی، باید 1000 واحد بین­المللی پنی‌سیلین و 1 میلی­گرم استرپتومایسین به هر میلی­لیتر رقیق­کننده اضافه گردد (Soultanpour et al., 2014). منی جمع­آوری­شده بدون افزودن زرده تخم‌مرغ را می­توان در داخل ظرف­ آب در یخچال بدون نیاز به رقیق­کننده به مدت24 الی 48 ساعت نگه‌داری کرد (Nateq et al., 2020). 

-نگه‌داری اسپرم به شکل منجمد (نگه‌داری انجمادی)

ذخیره‌ی اسپرم راه مفیدی جهت نگه‌داری منابع ژنتیکی برای برخی از گونه‌های در خطر است. اولین کوشش جهت نگه‌داری سرمایی اسپرم پستانداران در چند دهه‌ی قبل صورت گرفته است. وقتی که منی منجمدشده و در دمای خیلی پایین، یعنی در ازت مایع در 196- درجه‌ء سلسیوس نگه‌داری شود، واکنش‌های متابولیکی اسپرماتوزوا متوقف می‌شود. این کار امکان نگه‌داری منی برای مدت طولانی و در نتیجه ذخیره‌ی ژن­ها برای استفاده‌‌ء آینده و استفاده از نرهای منحصربفرد را مهیا می‌نماید. همچنین حمل و نقل داخلی و بین‌المللی منی آسان شده و می‌توان آن را خارج از دوره‌ی تولیدمثل، جمع‌آوری و ذخیره نمود (Behnam et al., 2022).

-اثرات مخرب سردسازی و انجماد اسپرم

فرآیند انجماد به دلیل ایجاد تنش­های اسمزی و اکسیداتیوی، اثرات مضری بر DNA، میتوکندری، ساختار غشای پلاسمایی و عملکرد اسپرم پستانداران، کاهش در جنبندگی و زنده‌مانی اسپرم، تغییرات در مورفولوژی اسپرم (در غشای پلاسمایی و تغییرات آکروزومی) و افزایش رادیکال‌های آزاد دارد (Shafaati Alishah et al., 2020). نخستین آسیب‌های ناشی از سرما یا انجماد اسپرم، در غشای آن بروز می‌کند. استرس‌های حرارتی در طی سردسای بر غشا وارد می‌شود. در نتیجه‌ی این امر، تغییراتی در توزیع فسفولیپیدهای سرتاسر هر دو لایه‌ی غشا ایجاد شده و علاوه بر این ممکن است باعث جداشدن ساختمان غشایی شود (Shafaati Alishah et al., 2020).

انجماد اسپرم حتی با تکنیک­های روز نیز روی عملکرد و باروری اسپرم اثر مخرب دارد به طور کلی قابلیت زیست اسپرم 50 درصد کاهش می­یابد در حالی که ظرفیت باروری ممکن است تا هفت برابر تحت تاثیر قرار بگیرد. اندامک­های مختلف اسپرم تحت تاثیر اثرات مخرب انجماد قرار می­گیرند. القای واکنش زودرس آکروزومی، تغییر عملکرد میتوکندری، کاهش تحرک و اختلال در تراکم کروماتین که همگی باروری و قابلیت زیست اسپرم را تحت تاثیر قرار می دهند (Alvarez et al., 1987) . جهت مقابله با این مشکلات در حین انجماد و یا بعد از پروسه‌ء یخ‌گشایی، استفاده از رقیق‌کننده‌ها و محافظت‌کننده‌های مناسب بسیار ارزشمند و مهم می‌باشد (Shafaati Alishah et al., 2020).

-انواع افزودنی‌ها به مایع منی برای نگه‌داری اسپرم مایع (نگه‌داری در یخچال در دمای 5 درجه­ی سلسیوس) و انجماد (نگه‌داری در ازت مایع در دمای 196- درجه­ی سلسیوس)

ذخیره­سازی موفق اسپرم (به صورت مایع و منجمد) نیاز به کاهش متابولیسم سلولی دارد تا طول عمر سلول افزایش یابد. برای رسیدن به این هدف و بهبود کیفیت اسپرم، استفاده از یک رقیق­کننده­ی مناسب ضروری می­باشد. برای حفظ حرکت و ظرفیت باروری و یکپارچگی غشای اسپرم ترکیبات گوناگونی به رقیق‌کننده افزوده می­شود (Allai et al., 2018).

رقیق­کننده­‌ء اسپرم از اجزایی تشکیل شده است که از اسپرم در برابر عوامل مخرب محیطی در خارج از دستگاه تولید­مثل جلوگیری می­کند. اسپرم در منی رقیق‌نشده، برای مدت کوتاهی زنده می­ماند و سرد کردن آهسته منی تا دمای 5 درجه سانتی‌گراد سبب مرگ بسیاری از اسپرم ها می­شود. بنابراین، مایع رقیق‌کننده، افزون بر این که باید برای رقیق­کردن مناسب باشد، لازم است که اسپرم­ها را در خلال سرد­شدن حفظ کند و دوره­ی زنده­مانی آنها را افزایش دهد. رقیق‌کننده باید خاصیت بافری داشته باشد تا بتواند لاکتیک اسید ناشی از متابولیسم سلولی را خنثی کند و pH را ثابت نگه دارد. همچنین رقیق­کننده باید از اسپرم در برابر شوک سرمایی محافظت کند و از رشد و تکثیر باکتری­ها جلوگیری کند و مواد غذایی لازم برای فعالیت سلول را مهیا کند (Rigby et al., 2001). محققین استرالیایی پس از مقایسه­ی تعدادی از رقیق­کننده­های اسپرم قوچ، استفاده از بافر تریس، فروکتوز و زرده تخم مرغ را برای نگه‌داری در شرایط مایع و اضافه‌کردن 5 درصد گلیسرول به بافر تریس را برای نگه‌داری در شرایط انجماد، پیشنهاد نمودند (Salamon and Maxwell, 2000).

- افزودنی‌ها به عنوان محافظت‌کننده در برابر سرما و انجماد

یکی از علل اصلی تخریب و مرگ سلولی در طی انجماد، تشکیل یخ داخل و خارج سلولی می­باشد. عمل اولیه­ی حفاظت­کننده­ها کاهش سرعت تشکیل یخ و اندازه­ی کریستال یخ می‌باشد. با مقدار کافی حفاظت­کننده، تخریب انجمادی می­تواند حداقل شود. در حالی‌که غلظت بالای آن می­تواند موجب تخریب و مسمومیت اسمزی شود (Shafaati Alishah et al., 2020).

زرده تخم­مرغ یکی از اجزای اساسی رقیق­کننده منی است که به عنوان یک محافظت­کننده سرمایی عمل می­کند و از آسیب غشا جلوگیری می­کند (Anand et al., 2017). همچنین مقادیر پروتئین، فسفولیپیدها و کلسترول را تنظیم کرده و متعاقباً از غشای پلاسمایی در برابر آسیب ناشی از دما محافظت می­کند (Ferreira et al., 2014). اگرچه افزودن زرده تخم­مرغ  ترکیبات یونی رقیق­کننده را تغییر می­دهد، با این وجود به دلیل محافظت عالی از اسپرم توصیه می­شود. همچنین، تأثیرات مفیدی بر روی زنده­ماندن اسپرم به عنوان محافظ غشای پلاسمایی و آکروزوم در برابر شوک سرما دارد (Celeghini et al.,2008). فسفولیپیدها، کلسترول و لیپوپروتئین­هایی با چگالی کم زرده تخم­مرغ به طور خاص به عنوان اجزای محافظ شناخته شده­اند. عمل محافظتی زرده تخم­مرغ ممکن است به فسفولیپیدها، کلسترول و لیپوپروتئین­هایی با چگالی بالا (HDL) و محتوای لیپوپروتئین­هایی با چگالی کم (LDL) نسبت داده شود که باعث حفظ موثر اسپرم در برابر شوک سرما و همچنین در فرآیند انجماد - ذوب می‌شود (Anand et al., 2017). از این نظر، وجود زرده تخم‌مرغ در رقیق­کننده تریس (هیدروکسی متیل‌آمینو متان) در هنگام انجماد به علت محافظت، آسیب کمتری به اسپرم وارد می­شود (Khumran et al., 2017). زرده تخم­مرغ حاوی برخی آنتی­اکسیدان­های مؤثر مانند فسوویتین و آلفا توکوفرول است که سبب کاهش اکسیداسیون واکنش زنجیره­ای و پراکسیداسیون لیپید غشای اسپرم می­شود (Alcay et al., 2015).

بسیاری از ترکیبات برای بررسی اثربخشی به عنوان محافظت‌کننده‌ی سرمایی اسپرم، مورد آزمایش قرار گرفتند ولی بسیاری از پروتکل‌های محافظتی منی هنوز استفاده از گلیسرول را در رقیق‌کننده، مناسب‌تر می‌دانند. در برخی موارد، احتمالا سایر محافظت‌کننده‌ها مثل دی‌متیل سولفوکساید برای اسپرم فیل ترجیح داده شده است (Jones, 1973).

گلیسرول به همراه موادی مانند متانول، اتیلن گلیکول، 1و2- پروپان دی اول (پروپیلن گلیکول)، بوتان دی‌اول، استامید و دی‌متیل سولفوکساید (DMSO) جزء گروهی هستند که به سیتوپلاسم سلول نفوذ می‌کند (Holt, 2000). همرستد و همکاران در سال 1992 اشاره کردند که از آنجا که گلیسرول به داخل سلول می‌رود، احتمالاً ویسکوزیته‌ی سیتوپلاسمی را تحت‌تأثیر قرار می‌دهد. شواهد نشان می‌دهد که ویسکوزیته‌ی سیتوپلاسمی در بین گونه‌ها متفاوت است. گلیسرول می‌تواند اثرات خاصی بر اسپرم گونه‌ها  بگذارد، البته این استدلال را می‌توان به سایر محافظت‌کننده‌های نفوذکننده مثل DMSO، اتیلن گلیکول و متانول نیز اعمال کرد. همچنین به طور تجربی نشان داده شده است که گلیسرول قادر به واردشدن بین دو لایه‌ی غشایی است (Hammerstedt et al., 1992). همرستد و همکاران در سال 1990 در مورد توان گلیسرول به عنوان سوبسترا بیان کرده‌اند که می‌تواند وضعیت بیوانرژتیک اسپرم را تغییر دهد. شاید گلیسرول تعادل بین سنتز ATP و مصرف آن را تغییر می‌دهد. در صورت  کمبود ATP در طول سردسازی ممکن است که کنترل متابولیسمی در فرآیندهای سلولی وابسته به یون به خطر بیفتد و سبب غیرفعال‌شدن فسفولیپازها و پروتئازها و آسیب غیرقابل برگشت سلولی شود (Hammerstedt et al., 1990). 

-آنتی­بیوتیک­ها

رقیق­کننده­‌ء استفاده‌شده برای ذخیره­سازی اسپرم حاوی مقادیر زیادی از مواد مغذی لازم برای ادامه­ی فعالیت اسپرم و زنده‌مانی آن در محیط آزمایشگاهی است اما این مواد مغذی به باکتری­ها هم اجازه­ی رشد می­دهند. برای جلوگیری از آلودگی میکروبی، باید تمام وسایلی که در کار اسپرم­گیری و رقیق­سازی استفاده می­شوند کاملاً استریل باشند. ولی نمی­توان جلوی برخی آلودگی­های میکروبی را گرفت چون میکرب می‌تواند از طریق خود اسپرم و انزال  نیز وارد رقیق‌کننده شده و باعث کاهش راندمان فرآیند انجماد از طریق تولید رادیکال­های آزاد شود و در نتیجه میزان زنده­مانی و باروری کاهش یابد. در قوچ­ها، منی معمولاً با واژن مصنوعي جمع­آوری مي­شود كه ممكن است به باكتري­هاي سطح آلت تناسلي آلوده شود. در نتیجه، باکتری­ها ممکن است کیفیت مایع منی را در حین ذخیره­سازی به خطر بیندازند و دستگاه تولیدمثل میش را آلوده کنند. برای کم کردن این عوارض جانبی، آنتی­بیوتیک­ها در رقیق­کننده­های منی اضافه می­کنند تا از رشد باکتری جلوگیری شود (Salamon and Maxwell, 2000)، که برای نزدیک به 40 سال پنی­سیلین (1000 واحد بین‌المللی) و استرپتومایسین (1 میلی­گرم) در رقیق­کننده استفاده می­شوند. پس از آن از پلی­میکسین B استفاده گردید و امروزه از جنتامایسین، تایلوزین، لینکومایسین و اسپکتینومایسین (6000 میکروگرم) نیز در رقیق­کننده استفاده می­شود (Nateq et al., 2020).

-افزودنی‌ها به عنوان گیرنده‌‌ء آب

انواع افزودنی‌ها که به عنوان گیرنده‌ی آب با حفظ تعادل اسمزی باعث حفاظت اسپرم‌ها در طی فرآیند سردسازی و انجماد می‌شوند شامل، گلوکز، فروکتوز، رافینوز و تره‌هالوز می‌باشند. عملکردهایی که قندها در رقیق­کننده منی ممکن است بر عهده داشته باشند عبارتند از: تأمین سوبسترایی که به آسانی قابل متابولیز باشد، کمک به  متابولیسم فروکتوز، نگه‌داری تعادل اسمزی، اثر بر روی ساختار اسپرم و کاهش صدمات اسپرم در دمای پایین (Lapwood and Martin, 1966).

-گلوکز 

ورستیجن و همکاران در سال 2005 گزارش کردند که کاهش گلوکز موجب  کاهش درصد اسپرم متحرک و افزایش اسپرم­های استاتیک در سگ می­شود (Verstegen et al., 2005).

- فروکتوز

فروکتوز قندی بوده که به راحتی به انرژی تبدیل می­شود. اضافه کردن فروکتوز می­تواند یک منبع انرژی اصلی برای اسپرم باشد. استفاده از قند­هایی مثل فروکتوز، سوکروز، گلوکز، ترهالوز و رافینوز در رقیق‌کننده منی می­تواند تحرک اسپرم را افزایش دهد. قند در رقیق­کننده منی می­تواند به عنوان نگه‌دارنده­ فشار اسمزی، منبع انرژی و حفاظت­کننده استفاده شود (Rasad and Simanjuntak, 2011).

- رافینوز

رافینوز برای جلوگیری از تشکیل یخ خارج سلولی، فراهم کردن هایپرتونیسیته و افزایش تشکیل حالت میکروکریستال استفاده می­شود. رافینوز تری­ساکاریدی شبیه دیگر قندهاست که از طریق واکنش با غشای لیپیدی و پروتئین­ها خطر تشکیل کریستال یخ را کاهش داده که موجب دهیدراسیون اسمزی در طول حفاظت انجمادی می­شود و همچنین موجب حفاظت DNA در برابر آسیب­های انجمادی می­شود (Bucak et al., 2013). ساری­اوزکان و همکاران در سال 2012 گزارش کردند که استفاده از قندها اثر مفیدی روی نگه‌داری تحرک، مورفولوژی سالم و یکپارچگی DNA اسپرم موش صحرایی در برابر آسیب خنک­سازی می­گذارد و رافینوز اثر محافظتی قوی­تری نسبت به ترهالوز و فروکتوز در حفظ تحرک اسپرم دارد (Dovlati et al., 2015).

- تره‌هالوز

تره­هالوز در ثبات غشاء و دیگر مجموعه­های ماکرومولکولی تحت شرایط حاد زیست محیطی نقش کلیدی دارد (Dovlati et al., 2016).

تره‌هالوز دی­ساکاریدی شناخته‌شده برای تثبیت پروتئین­ها و غشای بیولوژیکی در طی فرایند­هایی مثل انجماد می­باشد. نمونه­هایی از توانایی تره­هالوز شامل حفظ ساختار زیستی سلول­های قرمز خون لیوفیلیزشده، انجماد پوست جنین، اووسیت انسان، سلول­های هماتوپویتیک، جنین موش و اندام­های برنامه­ریزی‌شده برای پیوند می­باشد. تره­هالوز توسط موجودات مختلف در پاسخ به شرایط استرس مانند دهیدراسیون تولید می‌شود (Pérez et al., 2009) و از این طریق با انجام نقش حفاظت­کنندگی در برابر اثرات اسمزی و اشکال خاص واکنش با فسفولیپیدهای غشا، ایجاد محیط هایپرتونیک، باعث جلوگیری از دهیدراسیون اسمزی سلول قبل از انجماد شده و از این رو آسیب سلول را توسط کریستال یخ کاهش می­دهد و در بسیاری از گونه­های غیرآبزی در غلظت بالا یافت می­شود (Motta et al., 2014). این ترکیب نسبت به دیگر قندها حفاظت بهتری را در برابر خشکی ایجاد می­کند، زیرا توانایی بالایی برای جایگزینی آب و کریستاله‌شدن دارد (Watanabe et al., 2003). شواهد نشان می­دهد که تره­هالوز با کاهش دمای فاز انتقال لیپید خشک اسپرم­ها را در فاز کریستال مایع در عدم حضور آب محافظت می­کند. همچنین از پروتئین­های حساس در حین خشک شدن محافظت می­کند و احتمالاً به طور مستقیم با پروتئین خشک از طریق اتصال هیدروژن بین گروه هیدروکسیل و باقیمانده­های قطبی واکنش می­دهد (Elbein et al., 2003). سه مکانیسم برای تره­هالوز در رابطه با عمل پایداری غشا ذکر شده است: 1- واکنش با فسفولیپید و افزایش سطح این مولکول­ها در یک لایه­ی فسفولیپید 2- افزایش سیالیت غشاء و 3- کاهش شرکت در فاز انتقال ژل به مایع در محلول­های حجیم (Rudolph et al., 1986).

-افزودنی‌ها به عنوان آنتی‌اکسیدان

استرس اکسیداتیو و نیتروزاتیو زمانی اتفاق می‌افتد که مقدار اکسیدان‌ها (گونه‌های فعال اکسیژن و گونه‌های نیتروژن فعال یا RNS) افزایش یافته و آنتی‌اکسیدان ها کاهش یابند. زمانی که نمونه‌های اسپرم به مدت معینی در دمای پایین نگه‌داری می­شوند، ROSها افزایش یافته و آنتی­اکسیدان­ها کاهش می­یابند. استفاده از آنتی‌اکسیدان­ها در رقیق­کننده می­تواند تا حدود زیادی از این امر جلوگیری کند. به طور گسترده اثر مکمل آنتی‌اکسیدانی خوراکی روی گامت­های نر و ماده در انسان مورد بحث شده است. ، همچنین آنتی‌اکسیدان  به محیط های مورد استفاده در فن آوری های کمک باروری، عمدتا در رقیق­کننده­ها برای نگه‌داری منی استفاده می­شود. در این زمینه، استفاده از آنتی­اکسیدان­ها در فرآیند انجماد-یخ­گشایی به طور گسترده عمیقاً مورد بحث قرار گرفته است (Pezo et al., 2021).

در طی نگه‌داری در دمای یخچال، معمولاً از 4 تا 17 درجه­ی سلسیوس، اسپرم ها دستخوش تغییراتی می­شوند که می‌تواند توانایی لقاح آنها را به خطر بیندازد و متابولیسم اسپرم را کاهش ­داده اما آن را به طور کامل متوقف نمی­کند (Maxwell and Stojanov, 1996). در دمای 5 درجه­ی سلسیوس، پمپ Na+/K+ به اندازه کافی کار نمی­کند و غلظت Na+ درون سلولی را افزایش می­دهد. علاوه بر این، در طول نگه‌داری سرمایی، جریان کلسترول افزایش می­یابد و ممکن است ظرفیت­پذیری زودرس یا اگزوسیتوز آکروزوم رخ دهد (Peruma et al., 2013). 

- آنتی­اکسیدان­های آنزیمی

آنزیم­های آنتی­اکسیدانی حاضر در اسپرم یا سمینال­پلاسما شامل SOD، GPx و CAT هستند. آنتی­اکسیدان­ SOD مهم‌ترین آنزیم آنتی­اکسیدانی در سمینال­پلاسما است و سلول را در برابر O2- از طریق کاتالیز تغییر شکل آنیون H2O2 محافظت می­کند. علاوه بر آن، این عمل از واکنش OH-، که بسیار واکنش­پذیر است، با O2- که منجر به تولید H2O2 می­شود، جلوگیری می­کند. افزودن SOD به رقیق­کننده در حضور یا عدم حضور دیگر آنتی­اکسیدان­ها موجب بهبود جنبایی و زنده­مانی اسپرم­ها در مقایسه با گروه شاهد گونه­های مختلف شده است ولی در سگ و گوسفند این اثرات همیشه مشاهده نگردیده است (Miguel et al., 2021).

آنتی­اکسیدان CAT با کاتالیز H2O2 به آب از سلول محافظت می­کند. نشان داده شده است که افزودن CAT به همراه SOD به رقیق­کننده­های اسپرم حیوانات اهلی تأثیر به‌سزایی در افزایش میزان جنبایی خواهد داشت ولی اثر آن روی اسب اثبات نشده است (Ball et al., 2001).

آنزیم GPx اثرات آنتی­اکسیدانی خود را با استفاده از شکل کاهش­یافته‌ی گلوتاتیون (GSH) به عنوان دهنده الکترون برای کاهش  H2O2 به آب اعمال می­کند. به سبب این واکنش،GSH  به گلوتاتیون دی­سولفید (GSSG) اکسید می‌شود، بنابراین در نهایت یکی دیگر از اعضای خانواده آنزیم­های GSH، گلوتاتیون ردوکتاز (GR) مسئولیت بازسازی GSH  را با انتقال یک پروتون از NADPH به GSSG  انجام می­دهد (Agarwal and Aponte-Mellado, 2012). علی‌رغم اهمیت آن در کاهش H2O2، در 25 سال گذشته مطالعات اندکی با استفاده از GPx به تنهایی در نگه‌داری سرمایی اسپرم استفاده شده است و تنها در چند مطالعه از آن در ترکیب با سایر آنتی‌اکسیدان‌ها در سگ‌ها و اسب‌ها و گوسفند استفاده شده است (Del Prete et al., 2019). مطالعات دیگری در مورد تأثیر GPx بر پارامترهای کیفیت اسپرم پس از انجماد/یخ‌گشایی گزارش شده است، اما نتایج آن قطعی نیست (Mousavi et al., 2019).

- آنتی­اکسیدان­های غیر آنزیمی

- اسیدهای آمینه و پپتیدهای کوچک

اثرات آنتی­اکسیدانی بسیاری از اسیدهای آمینه و پپتیدهای کوچک مثل گلوتاتیون (GSH)، سیستئین، هیپوتائورین، تائورین، کارنیتین، گلوتامین، پرولین یا متیونین در بسیاری از مطالعات مربوط به نگه‌داری سرمایی در فاز مایع گزارش شده است. تیول­ها (-SH) مثل سیستئین، به همراه گلوتامات و گلایسین یکی از اجزای GSH که گروه -SH را به این پپتید کوچک می‌رساند. در میان همه این‌ها، GSH گسترده­ترین آنتی­اکسیدان مورد مطالعه در مایع منی سردسازی‌شده، عمدتاً در خوک، گوسفند و گاو است (Miguel et al., 2021). GSH یک ترکیب با وزن مولکولی پایین است که از اسید آمینه­های سیستئین، گلوتامات و گلایسین تشکیل شده است. این پپتید کوچک عمل آنتی­اکسیدانی خود را به دو صورت انجام می­دهد:

1. خنثی­کننده مستقیم ROS، عمدتاً به دلیل وجود -SH ناشی از باقی­مانده سیستئین

2. حفظ سایر آنتی­اکسیدان­ها مانند ویتامین C یا E در فرم فعال آنها 

علاوه بر این،GSH  با ترمیم پروتئین‌های آسیب‌دیده، اسیدهای نوکلئیک و لیپیدهای پراکسید شده و حفظ حالت کاهشی گروه‌های سولفیدریل پروتئین‌ها، از سلول‌ها محافظت می‌کند (Miro´nczuk et al., 2018). به ویژه در قوچ­ها، اکثر مطالعات هیچ اثر مثبتی از رقیق­کننده حاوی GSH پیدا نکردند. این امکان وجود دارد که در مورد GSH، غلظت ممکن است تعیین­کننده باشد و ممکن است بسته به گونه متغیر باشد. در گاو و خوک، به نظر می­رسد غلظت بهینه بین 5/0 تا 5/1 میلی­مولار متغیر باشد (Zhang et al., 2016) ، اما در گوسفند، غلظت­های مورد مطالعه بسیار بیشتر از سایر گونه‌ها بود (Shi et al., 2020).

آمینواسید دیگری که مرتبط با GSH است سیستئین می­باشد. سطوح بالای این اسید آمینه برای اطمینان از سطوح کافی GSH ضروری است، زیرا تحت شرایط استرس اکسیداتیو/نیتروزاتیو دسترسی بیشتر به سیستئین ممکن است نیاز باشد. زمانی­که سیستئین اکسید می­شود در یک واکنش برگشت­پذیر به سیستین تبدیل می­شود. سیستین، GSH را افزایش داده و به دنبال آن ظرفیت آنتی­اکسیدانی را هم در اسپرم تازه و هم انجماد-یخ­گشایی‌شده افزایش می­یابد (Miguel et al., 2021).

تائورین یک سولفونیل اسید آمینه از سیستئین است و هیپوتائورین واسط آن به عنوان آنتی­اکسیدان در رقیق‌کننده­های اسپرم استفاده می­شود. به طور کلی تائورین از کاهش میزان جنبندگی و تحرک اسپرم، زنده­مانی و یکپارچگی آکروزوم در طول نگه‌داری سرمایی در گونه­های مختلف جلوگیری می­کند. با این حال اثرات مفیدی در قوچ گزارش نشده است (Li  et al., 2017).

کارنیتین یک ترکیب قطبی است که به شدت در بدن پراکنده شده و به ویژه در بافت‌های نیازمند انرژی بالا مانند اپیدیدیم متمرکز می­شود (Heidari et al., 2022). از آنجایی که این ترکیب نقش مهمی در انتقال اسیدهای چرب به داخل میتوکندری اسپرم دارد، نقش کلیدی در تحرک اسپرم ایفا می­کند که مقادیر زیادی انرژی از طریق بتا اکسیداسیون فراهم می­کند. در واقع افزایش تحرک اسپرم در مایع اپیدیدیم با غلظت کارنیتین مرتبط است. با این حال، کارنیتین یک آنتی­اکسیدان موثر است، که: 1- با اجازه دادن به اسیدهای چرب برای عبور از غشاهای میتوکندری، دسترسی لیپیدها را برای پراکسیداسیون کاهش می­دهد، 2- محافظت از سیستم آنتی­اکسیدانی آنزیم های آنتی­اکسیدانی CAT، SOD  و GPx  و جلوگیری از آسیب پراکسیداتیو و 3- دارای عمل مهار مستقیم رادیکال­های آزاد مانند O2- یا H2O2  است (Gülçin, 2006). 

همچنین سایر اسیدهای آمینه مانند گلوتامین و پرولین به طور کلی اثرات شامل افزایش تحرک اسپرم، زنده ماندن و کاهش ROS در طول نگه‌داری سرمایی در مقایسه با گروه های شاهد نشان دادند. در این راستا، گلوتامین یک پیش‌ساز اسید آمینه GSH است و پرولین بر اساس ساختار آمین ثانویه خود دارای خواص آنتی‌اکسیدانی است. متیونین آمینواسیدی است که قادر است با عمل به عنوان یک اسیدآمینه پیش­ساز برای سیستئین و همچنین به دلیل ظرفیت آن در واکنش با اکسیدان­ها برای تشکیل متیونین سولفوکسید از سلول­ها در برابر آسیب اکسیداتیو محافظت کند (Levine et al., 1999).

- ویتامین­ها، کاروتنوئیدها و پلی­فنل­ها

ویتامین Eو C، پلی­فنل­ها و کاروتنوئیدها به عنوان آنتی­اکسیدان­های طبیعی شناخته می­شوند که جهت محافظت از تخریب اسپرم در طی نگهداری سرمایی و انجماد استفاده می­شوند (Safa et al., 2016). ویتامین E به مجموعه­ای از توکوفرول­ها (α، β، γ، δ) و توکوترینول­ها (α، β، γ، δ) اشاره دارد. در میان آنها، آلفا توکوفرول قوی­ترین آنتی­اکسیدان محلول در چربی است و می­تواند زنجیره واکنش لیپوپراکسیداسیون را با اهدای یک الکترون به یک رادیکال لیپیدی یا هیدروپراکسید لیپیدی مسدود کند و خود را به رادیکال توکوفروکسیل نسبتاً پایدار تبدیل کند. توکوفروکسیل را می­توان با واکنش با سایر آنتی‌اکسیدان‌ها مانند ویتامین C یا GSH به شکل فعال توکوفرول تبدیل کرد (Amorini et al., 2021). ترولوکس یک آنالوگ صناعی محلول در آب ویتامین E می­باشد. تأثیر ویتامین E چه به شکل آلفا توکوفرول و چه به شکل ترولوکس در بسیاری از مطالعات نگه‌داری سرمایی در اکثر گونه­های حیوانات اهلی (اسب، قوچ، بز و خوک) به اثبات رسیده است (Nateq et al., 2020).

ویتامین C به عنوان یک کاهنده عمل کرده و می­تواند یک یا دو الکترون اهداء کند و خود را به ترتیب به رادیکال آسکوربیل یا دهیدروآسکوربیک اسید (DHA) اکسید کند. سپس DHA را می­توان با اکسیداسیونGSH  به GSSG  به شکل احیاء تبدیل کرد. عمل آنتی­اکسیدانی ویتامین C شامل یک عمل مهار مستقیم طیف گسترده‌ای از RONS (reactive oxygen and nitrogen species) از جمله رادیکال­های هیدروکسیل، سوپراکسید و پراکسی­نیتریت و یک اثر مهار غیر مستقیم رادیکال­های چربی دوست با کاهش رادیکال توکوفروکسیل به شکل فعال آن توکوفرول است. نشان داده شده است که ویتامین C در فاز نگه‌داری سرمایی تأثیر معنی­داری روی پارامترهای اسپرم نداشت (Michael et al., 2009) و بایستی توجه کرد که غلظت­های بالا سمی هستند (Aurich et al., 1997). افزودن ویتامین B12 یه رقیق‌کننده اسپرم قوچ توانست درصد جنبایی و زنده مانی را نسبت به گروه شاهد افزایش و درصد اسپرم های غیر طبیعی را کاهش دهد (Asadpour et al,. 2012).

پلی­فنل­ها مثل رسوراتول، کوئرستین، پروسی‌آنیدین، هیدروکسی­تروزول و 3و4 هیدروکسی‌فنیل گلیکول به عنوان آنتی­اکسیدان در نگه‌داری سرمایی و انجماد اسپرم استفاده می­شوند. پلی‌فنل­ها متابولیت­های ثانویه مشتق‌شده از گیاهان هستند که با واحدهای فنلی متعدد مشخص می‌شوند. این ترکیبات از نظر ساختاری بسیار متنوع هستند و شامل چهار کلاس اصلی هستند: اسیدهای فنولیک، فلاوونوئیدها (مانند کوئرستین)، استیلبن­ها (مانند رسوراترول) و لیگنان­ها. به دلیل ساختار شیمیایی آنها، این ترکیبات آنتی­اکسیدان­های طبیعی هستند که تمایل به اکسیداسیون دارندو رادیکال­های آزاد را رهگیری کرده و از آسیب اکسیداتیو  سلولی جلوگیری می کنند. برخی از پلی­فنل­ها دارای یک اثر آنتی­اکسیدانی آنزیمی هستند زیرا می­توانند آنزیم­های آنتی­اکسیدانی را تنظیم کنند (Amidi et al., 2016).

- سایر مواد آنتی­اکسیدانی

ملاتونین علاوه بر نقشی که در تنظیم چرخه شبانه­روزی یا تولیدمثل فصلی در پستانداران دارد، عملکرد آنتی­اکسیدانی قابل توجهی نیز دارد. گیرنده­های ملاتونین در اسپرم انسان، همستر و قوچ وجود دارد، اما در اسپرم اسب نر یافت نشده است (Balao et al., 2011; Chainy and Sahoo, 2020 ).ملاتونین هم اثر آنتی­اکسیدانی مستقیم در از بین بردن برخی از گونه­های فعال اکسیژن و نیتروژن (reactive oxygen and nitrogen species; RONS) مانند –OH، O2-، ONOO- و –NO و هم اثر آنتی­اکسیدانی غیرمستقیم با تحریک فعالیت آنتی­اکسیدان­های درونی مانند CAT، SOD یا GPx نشان داده است (Chainy and Sahoo, 2020). ملاتونین به عنوان یک آنتی­اکسیدان در رقیق­کنندهای اسپرم گاو، گوسفند، خرگوش و اسب مورد استفاده شده و افزایش قابل توجهی در تحرک اسپرم، زنده­مانی و کاهش لیپیدپراکسیداسیون نسبت به گروه‌های شاهد گردیده است (Jang et al., 2010).

لیکوپن (کاروتنوئید قرمزرنگ) گوجه‌فرنگی، هویج و گریپ­فروت به عنوان یک آنتی‌اکسیدان قوی با اثربخشی دو برابر کاروتن و ۱۰ برابر توکوفرول  می باشد(Rao et al., 2006). لیکوپن می­تواند ONOO-، دی اکسید نیتروژن و همچنین رادیکال­های تیول و سولفونیل را از بین ببرد (Muzandu et al., 2006). اخیراً شیخ‌الاسلامی و همکاران مشاهده کردند که افزودن لیکوپن به رقیق­کننده باعث افزایش تحرک و زنده مانی و کاهش لیپید پراکسیداسیون اسپرم سگ شد (Sheikholeslami et al., 2020).

سلنیوم کوفاکتور یا فعال­کننده­ی آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز است که یکی از قوی­ترین آنتی­اکسیدان­های طبیعی می­باشد و تجزیه­ی پراکسیدازهای لیپیدی و هیدروژن پراکسید را کاتالیز می­کند. آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز رادیکال­های آزاد درون سیتوپلاسم را نابود می­کند (Ozbal et al., 2008). به طور معمول، غلظت اکثر عناصر در کبد بالاتر از سایر اندام ها است اما در مورد سلنیوم، بیشترین غلظت آن در بیضه ها است. غلظت بالای سلنیوم در بیضه­ها نشان دهنده­ی نقش حفاظتی این عنصر و آنزیم­های مرتبط با آن در اسپرماتوژنز می­باشد. کمبود سلنیوم در حیوانات مزرعه ای باعث تغییر و شکنندگی بخش میانی اسپرم، میتوکندری­های بخش میانی و پیچیدگی دم اسپرم می‌شود (Nateq et al., 2020). در مطالعه­ای که بر روی خوکچه­ها انجام شده است، مشخص شده است که کمبود طولانی مدت سلنیوم در جیره­ی غذایی خوکچه‌های هندی، باعث کاهش غلظت و تحرک اسپرم و بروز قطرات سیتوپلاسمی در اسپرم می‌شود (Agarwal and Sekhon, 2010). بین فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز سمینال پلاسما و تراکم اسپرم ارتباط مثبت و معنی­داری وجود دارد و با افزایش فعالیت این آنزیم درصد اسپرماتوزوئیدهای با مورفولوژی طبیعی و درصد اسپرم­های زنده در کل نمونه افزایش می­یابد (Mohammadi et al., 2008). برای تاثیر بیشتر و جلوگیری از مسمومیت سلنیومی، بیشتر از فرم نانوسلنیوم در رقیق‌کننده‌ها استفاده می‌شود (Nateq et al., 2020).

سیلیمارین فلاونوئیدی است که به عنوان یک آنتی­اکسیدان قوی تنظیم­کننده­ی مقدار گلوتاتیون درون سلولی و تثبیت‌کننده­ی غشای سلولی مطرح است (Momeni et al., 2015). مکانیسم عمل سیلیمارین از طریق تحریک RNA ریبوزومی و محافظت از غشای سلولی از آسیب اکسیداتیو است. همچنین فعالیت آنزیم­های SOD و GPx را تحریک می­کند (Wellington and Jarvis, 2001). سیلیمارین به عنوان افزودنی طبیعی به منی، آن را طی انجماد و سردسازی محافظت می­کند و علاوه بربهبود زنده­مانی بعد از یخ­گشایی، درصد اختلالات اسپرم را کاهش داده و درصد اسپرم سالم و درصد تحرک را بهبود می­بخشد (Behnam et al., 2022).

- افزودنی­ها تحت عنوان کلاتور و گیرنده‌ء یون­ها

کلسیم یک نقش حیاتی در جنبندگی اسپرم و همچنین فرآیند اتصال غشاء در طول واکنش آکروزومی بازی می​کند. اتصال به شکاف زونا یا پروژسترون یک افزایش در غلظت کلسیم داخل‌سلولی ناشی از بازشدن کانال‌های کلسیمی یا آزادشدن کلسیم از ذخایر داخل‌سلولی را ایجاد می​کند. افزایش در غلظت کلسیم داخل‌سلولی باعث فعال‌شدن فسفاتیدیل اینوزیتول 4و5 بیس فسفات (PIP2) می​شود که فسفولیپاز آن را هیدرولیز کرده و دو پیامبر ثانویه به نام دی‌آسیل گلیسرول و اینوزیتول 1و4و5 تری فسفات (IP3) را به‌وجود می​آورد. IP3 آزاد شدن کلسیم از ذخایر داخل‌سلولی را تحریک کرده و دی‌آسیل گلیسرول پروتئین‌کیناز سیتوپلاسمیک و فسفولیپاز A2 را فعال می​کند. این وقایع یک بار دیگر باعث یک افزایش در غلظت کلسیم می​شوند. سرانجام مقادیر بالای کلسیم که قبل از واکنش آکروزومی رخ می‌دهد با هم PIP2 را هیدرولیز کرده و فرآورده​ی حاصله از فعالیت فسفولیپاز A2، دپلیمریزاسیون و اتصال غشاء را سبب می​شود که اتفاق نهایی واکنش آکروزومی است. بر این اساس کلاتورهای کلسیم مثل EDTA (اتیلن دی آمین تترا استیک اسید) و EGTA (اتیلن گلیکول بیس آمینواتیلن اتر تترا استیک اسید) در برخی از مطالعات عملکرد اسپرم را بهبود بخشیده​اند (Shafaati Alishah et al., 2020).

افزودن EDTA و EGTA در رقیق‌کننده‌ی منی کلسیم را کلات می‌کند و غلظت آن را در غشای پلاسمایی کاهش می‌دهد. EDTA یون‌های دیگر را نیز کلات می‌کند و همچنین ممکن است در مهار پراکسیداسیون لیپیدی نقش داشته باشد (Holt, 2000).

-افزودنی­های طبیعی به رقیق­کننده

استفاده از صمغ­ها در رقیق­کننده­ی اسپرم پیشنهاد شده است. پلی­ساکاریدهای گیاهی و مشتقات اصلاح‌شده آن‌ها به طور گسترده در پزشکی استفاده می‌شوند. پلی­ساکاریدها اصلاح­کننده‌های بالقوه واکنش‌های بیوشیمیایی هستند. آن‌ها دارای فعالیت‌های نرم‌کنندگی، پوشش‌دهنده، تنظیم سیستم ایمنی، ضد سرفه، ضد التهاب، ضد اسپاسم، ضد آلرژی، آنتی‌اکسیدان و ضد میکروب هستند. صمغ­ها از درختان هلو، زردآلو، گیلاس و بادام می­توانند ترشح شوند. صمغ درخت زردآلو نسبت به سایر صمغ­ها pH نزدیک‌تری به منی قوچ دارد (Samaei et al., 1396). در ترکیب خود دارای آرابینوز است که از قندهای احیاءکننده است که خاصیت آنتی­اکسیدانی دارد. دارای ترکیبات فنولیک است که این ترکیبات از عوامل آنتی‌اکسیدانی هستند و به­عنوان پایان­دهنده­های رادیکال­های آزاد عمل می­کنند (Mahmoudi et al., 2010). صمغ­ها به علت ساختمان پلی­ساکاریدی که دارند بسیار هیدروفیل هستند و به­راحتی تا 400 برابر خود آب جذب کرده و ذخیره می­کنند که می­توانند تشکیل کریستال یخ داخل سلول اسپرم را کاهش دهند. صمغ­ها به دلیل داشتن گلوکز در ترکیبات خود می­توانند انرژی اسپرم را نیز تأمین کنند. همچنین به‌دلیل داشتن ترپنوئیدها که دارای خاصیت ضدباکتریایی هستند، می‌توانند با کاهش باکتری­ها در رقیق­کننده هم از رقابت باکتری­ها با اسپرم­ها جلوگیری کنند و هم با کاهش مواد زاید حاصل از متابولیسم باکتری­ها از اسیدی‌شدن pH محیط جلوگیری کرده و زنده­مانی اسپرم­ها را افزایش دهند. همچنین با کاهش تراکم باکتری­ها مصرف مواد مغذی توسط باکتری­ها را کاهش داده و در نتیجه تولید ROSها را نیز کاهش می­دهد. صمغ زردآلو به دلیل داشتن دی­ساکاریدها و پلی­ساکاریدها، که نمی­توانند از غشای اسپرم عبور کنند ولی با فسفولیپازهای غشای اسپرم تقابل کرده واز به­هم خوردن نظم غشاء جلوگیری می کند و باعث زنده­مانی بهتر اسپرم می­شوند اسیدگلوکرونیک صمغ درخت زردآلو با ترکیب با مواد سمی آن­ها را بی­خطر می­سازد و احتمالاً از این طریق می­تواند در رقیق­کننده مواد زاید را پاک‌سازی کند (Khanzadeh et al., 2021). افزودن کافئین به رقیق‌کننده اسپرم قوچ درصد صفات حرکتی و زنده­مانی و مقادیر گلوتاتیون پراکسیداز و ظرفیت اکسیدانی کل را نسبت به گروه شاهد افزایش داد (Alipour et al., 2018).

 

بحث و نتیجه­گیری

انجماد منی پستانداران، تحولی اساسی در نگه‌داری و حفاظت سلول اسپرم به‌وجود آورده و راهی برای حفظ پروتوپلاسم سلول جنسی می­باشد که می­تواند با حفظ DNA گونه­ها، در دامپروری، آبزی­پروری و حفظ تنوع زیستی کاربرد زیادی داشته باشد و بانک­های ذخیره­ی اسپرم می­توانند همراه با دیگر تکنولوژی­های تولید­مثلی، در بهبود نژادها و حفظ گونه های وحشی و بومی در حال انقراض نقش مهمی داشته باشند. همچنین با انجماد اسپرم، امکان انتقال به فاصله­های خیلی دور، کنترل بیماری­ها و حفظ بانک­های ژنتیکی ممکن می‌گردد. با استفاده از انجماد اسپرم­ها و تکنیک­های تولیدمثلی، بسیاری از مشکلات باروری حیوانات آزمایشگاهی، دامی و انسانی قابل حل می­باشد. به طورکلی، کیفیت اسپرم یخ‌گشایی‌شده از روی فاکتورهای مهمی مانند تحرک، درصد اسپرم­های زنده و سلامت آکروزوم آنها ارزیابی می­شود. استفاده از سطوح مختلف انواع افزودنی­ها به رقیق‌کننده‌ی اسپرم منجمد و سرمایی در    حیوانات سبب شده که  توانایی زنده­مانی، جنبایی، یکپارچگی آکروزوم و سایر پارامترهای کیفی اسپرم را تا حدود زیادی بهبود ببخشد.

 

سپاسگزاری

از تمامی نویسندگان مقالاتی که در تهیه این مقاله استفاده‌شده قدردانی می‌گردد.

 

تعارض منافع

نویسندگان اعلام می­دارند که هیچ‌گونه تضاد منافعی ندارند.

 

 

 

 

 

منابع

·       Agarwal, A. and Sekhon, L.H. (2010). The role of antioxidant therapy in the treatment of male infertility. Human Fertility, 13(4): 217-225.

·       Agarwal, A., Aponte-Mellado, A., Premkumar, B.J., Shaman, A. and Gupta, S. (2012). The effects of oxidative stress on female reproduction: A review. Reproductive Biology and Endocrinology, 10: 1-31.

·       Alcay, S., Toker, M.B., Gokce, E., Ustuner, B., Onder, N.T., Sagirkaya, H., et al. (2015). Successful ram semen cryopreservation with lyophilized egg yolk-based extender. Cryobiology, 71(2): 329-333.

·       Alipour, P., Daghigh Kia, H. Moghaddam, Gh. and Ebrahimi, M. (2018). Evaluation caffeine antioxidant properties on Ghezel ram sperm quality after freeze- thawing. Revue de Medecine Veterinaire, 169(10-12): 233-240.

·       Allai, L., Benmoula, A., Marciane da Silva, M., Nasser, B. and El Amiri, B. (2018). Supplementation of ram semen extender to improve seminal quality and fertility rate. Animal Reproduction Science, 192(2018): 6-17.

·       Alvarez, J.G., Touchstone, J.C., Blasco, L. and Storey, B.T. (1987). Spontaneous lipid peroxidation and production of hydrogen peroxide and superoxide in human spermatozoa superoxide dismutase as major enzyme protectant against oxygen toxicity. Journal of Andrology, 8(5): 338-348.

·       Amidi, F., Pazhohan, A., Shabani Nashtaei, M., Khodarahmian, M. and Nekoonam, S. (2016). The role of antioxidants in sperm freezing: A review. Cell Tissue Bank, 17(4): 745-756.

·       Amorini, A.M., Listorti, I., Bilotta, G., Pallisco, R., Saab, M.W., Mangione, R., et al. (2021). Antioxidant-Based Therapies in Male Infertility: Do We Have Sufficient Evidence Supporting Their Effectiveness? Antioxidants, 10(2): 1-31.

·       Anand, M., Baghel, G. and Yadav, S. (2017). Effect of egg yolk concentration and washing on sperm quality following cryopreservation in Barbari buck semen. Journal of Applied Animal Research, 45(1): 560-565.

·       Asadpour, R., Pourseif, M.M., Moghaddam, Gh., Jafari, R., Tayefi, H. and Mahmodi, H. (2012). Effect of vitamin B12 addityion to extenders on some physiochemical paraameters of semen in crossbred rams. African Journal of Biotechnology, 11(54): 11741-11745.

·       Aurich, J.E., Schönherr, U., Hoppe, H. and Aurich, C. (1997). Effects of antioxidants on motility and membrane integrity of chilled-stored stallion semen. Theriogenology, 48(2): 185-192.

·       Balao Da Silva, C.M., MacÍas-García, B., Miró-Morán, A. González-Fernández, L., Morillo-Rodriguez, A., Ortega-Ferrusola, C., et al. (2011). Melatonin reduces lipid peroxidation and apoptotic-like changes in stallion spermatozoa. Journal of Pineal Research, 51(2): 172-179.

·       Ball, B.A., Medina, V., Gravance, C.G. and Baumber, J. (2001). Effect of antioxidants on preservation of motility, viability and acrosomal integrity of equine spermatozoa during storage at 50C. Theriogenology, 56(4): 577-589.

·       Barrios, B., Pe´rez-Pe´, R., Gallego, M., Tato, A., Osada, J. and Muin˜o-Blanco, T. (2000). Seminal plasma proteins revert the cold-shock damage on ram sperm membrane. Biology Reproduction, 63(5): 1531-1537.

·       Behnam, M., Moghaddam, Gh., Daghigh kia, H., qasqmi panahi, B. and Nateq, S. (2022). Effect of of silymarin on the membrane integrity, viability and motlility of ram frozen sperm. Journal of Animal Science Researches, 32(2): 95-105. [In Persian]

·       Boron, W.F. (2004). Regulation of intracellular pH. Advances in physiology education, 28: 160–179.

·       Bucak, M.N., Keskin, N., Taşpınar, M., Çoyan, K., Başpına, N., Cenariu, M.C., et al. (2013). Raffinose and hypotaurine improve the post-thawed Merino ram sperm parameters. Cryobiology, 67(1): 34-39.

·       Celeghini, E.C.C., De Arruda, R.P., De Andrade, A.F.C., Nascimento, J., Raphael, C.F. and Rodrigues, P.H.M. (2008). Effects that Bovine Sperm Cryopreservation Using Two Different Extenders have on Sperm Membranes and Chromatin. Animal Reproduction Science 104(2-4): 119-131.

·       Cevik, M., Tuncer, P.B., Tas demer, U. and Ozgurtas, T. (2007). Comparison of spermatological characteristics and biochemical seminal plasma parameters of normozoospermic and oligoasthenozoospermic bulls of two breeds. Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences, 31(6): 381-387.

·       Chainy, G.B.N. and Sahoo, D.K. (2020). Hormones and oxidative stress: An overview. Free Radical Research, 54(1): 1-26.

·       Chandonnet, I., Roberts, K.D., Chapdelaine, A. and Manjunath, P. (1990). Identification of heparin-binding proteins in bovine seminal plasma. Molecular Reproduction and Development, 26(4): 313-318

·       Chatdarong, K., Chaivechakarn, A., Thuwanut, P. and Ponglowhapan, S. (2012). Effects of Cold Storage Prior to Freezing on Superoxide Dismutase, Glutathione Peroxidase Activities, Level of Total Reactive Oxygen Species and Sperm Quality in Dogs. Reproduction in Domestic Animals, 47(6): 274-277.

·       Cross, N.L. (1998). Role of cholesterol in sperm capacitation. Biology of reproduction, 59(1): 7-11.

·       De Lamirande, E. and Gagnon C. (1992). Reactive oxygen species and human spermatozoa II depletion of adenosine triphosphate plays an important role in the inhibition of sperm motility. Journal of Andrology, 13(5): 379-386.

·       Del Prete, C.; Stout, T., Montagnaro, S., Pagnini, U., Uccello, M., Florio, P., et al. (2019). Combined addition of superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase improves quality of cooled stored stallion semen. Animal Reproduction Science, 210: 1-10.

·       Domı´nguez, M.P., Falcinelli, A., Hozbor, F., Sa´nchez, E., Cesari, A. and Alberio, R.H. (1992). Seasonal variations in the composition of ram seminal plasma and its effect on frozen-thawed ram sperm. Theriogenology, 69(5): 564-573.

·       Dovlati, P., Moghaddam, Gh, Daghigh kia, H., Taghizadeh, A. and Rafat, A. (2015). The effect of adding different raffinose concentrations in the diluents in semen cryopreservation of different breeds of ram at reproductive season. Journal of Animal Science Researches, 25(2): 121-132. [In Persian]

·       Dovlati, P., Moghaddam, Gh. and Ahmadian, H. (2016). Evaluation of the effects of cysteine and trehalose on long- term cryopreservation of ram semen. Journal of Agri-Food and Applied Sciences, 4(1): 1-6.

·       Eghbali, M., Alvi-Shoushtari, S.M. and Rezaii, S.A. (2008). Effects of copper and superoxide dismutase content of seminal plasma on buffalo semen characteristics. Pakistan Journal of Biological Sciences, 11(15): 1964-1968.

·       Elbein, A.D., Pan, Y.T., Pastuszak, I. and Carroll, D. (2003). New insights on trehalose: a multifunctional molecule, Glycobiology. 13(4): 17-27.

·       El-Hajj Ghaoui, R., Gillan, L., Thomson, P.C., Evans, G. and Maxwell, W.M.C. (2007). Effect of seminal plasma fractions from entire and vasectomized rams on the motility characteristics, membrane status, and in vitro fertility of ram spermatozoa. Journal of Andrology, 28(1): 109–122.

·       Ferdinand, N., Thomas, T.T., Augustave, K., Herny, D.F., Ferdinand, T. and Etienne, P.T. (2012). Effects of Buck Age, Storage Duration, Storage Temperature and Diluent on Fresh West African Dwarf Buck Semen. Journal of Reproduction and Fertility, 3(3): 58-66.

·       Ferreira, V.D.S., Mello, M.R.B.D., Fonseca, C.E.M.D., Dias, A.C.F., Cardoso, J.M., Silva, R.B. et al. (2014). Effect of seminal plasma and egg yolk concentration on freezability of goat semen. Revista Brasileira de Zootecnia, 43(10): 513-518.

·       Flipse, R.J. (1960). Metabolism of bovine semen IX glutamic oxaloacetic and glutamic pyruvic transaminase activities. Journal of Dairy Science, 43(6): 773-776.

·       Garner, D.L., Thomas, C.A., Gravance, C.G., Marshall, C.E., DeJarnette, J.M. and Allen, C.H. (2001). Seminal plasma addition attenuates the dilution effect in bovine sperm. Theriogenology, 56: 31-40.

·       Gülçin, I. (2006). Antioxidant and antiradical activities of L-carnitine. Life Science, 78: 803-811.

·       Hammerstedt, R.H. and Graham, J.K. (1992). Cryopreservation of poultry sperm: the enigma of glycerol. Cryobiology, 29(1): 26-38.

·       Hammerstedt, R.H., Graham, J.K. and Nolan, J.P. (1990). Cryopreservation of mammalian sperm: what we ask them to survive. Journal of Andrology, 11(1): 73-88.

·       Heidari, M., qasqmi panahi, B., Moghaddan, Gh., Daghigh kia, H. and Masoudi, R. (2022). L-carintine improves quality parameters and epigenetic patterns of Bucks froen- thawed semen. Animal Reproduction Science, 247: 1-7.

·       Hess, R.A., Zhou, Q., Nie, R., Oliveira, C., Cho, H., Nakaia, M., et al. (2001). Estrogens and epididymal function. Reproduction, Fertility and Development, 13(4): 273-283.

·       Hidiroglou, M. and Knipfel, J.E. ­)­1984(. Zink in mammalian sperm: a review. Journal of Dairy Science, 67(6): 1147-1156.

·       Holt, W.V. (2000). Basic aspects of frozen storage of semen. Animal Reproduction Science, 62(1-3): 3-22.

·       Jang, H.Y., Kim, Y.H., Kim, B.W., Park, I.C., Cheong, H.T., Kim, J.T., et al. (2010). Ameliorative effects of melatonin against hydrogen peroxide-induced oxidative stress on boar sperm characteristics and subsequent in vitro embryo development. Reproduction in Domestic Animals, 45(6): 943-950.

·       Jobim, M.I.M., Oberst, E.R., Salbego, C.G., Souza, D.O., Wald, V.B., Tramontina, F., et al. (2004). Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis of bovine seminal plasma proteins and their relation with semen freezability. Theriogenology, 61(2-3): 255–266.

·       Jones, R.C. (1973). Collection, motility and storage of spermatozoa from the African elephant Loxodonta Africana. Nature, 243(5401): 38-39.

·       Juyena, N.S. and Stella. (2012). Seminal Plasma: An Essential Attribute to Spermatozoa. Journal of Andrology, 33(4): 536-551.

·       Kaya, A., Aksoy, M. and Tekeli, T. (2002). Influence of ejaculation frequency on sperm characteristics, ionic composition and enzymatic activity of seminal plasma in rams. Small Ruminant Research, 44(2): 153-158.

·       Khanzadeh, P., Moghaddam, G., Daghigh kia, H., Rafat, S.A. and Moradi, R. (2021). The effect of apricot Tree gum on the quality of frozen and melted ram sperm in the breeding season. Iranian Journal of ASpplied Animal Science, 11(4): 749-760.

·       Khumran, A., Yimer, N., Rosnina, Y., Ariff, M., Wahid, H., Kaka, A., et al. (2017). Supplementation of Antioxidant BHT to Different Bull Semen Extenders Enhances Semen Quality after Chilling. Pertanika Journal of Tropical Agricultural Science, 40 (1): 131-142.

·       Lapwood, K.R. and Martin, I.C.A. (1966). The Use of Monosaccharides, Disaccharides, and Trisaccharides in Synthetic Diluents for the Storage of Ram Spermatozoa at 37°C and 5°C. Australian Journal of Biological Sciences, 19(4): 655-672.

·       Lenzi, A., Picardo, M., Gandini, L. and Dondero, F. (1996). Lipids of the sperm plasma membrane: from polyunsaturated fatty acids considered as markers of sperm function to possible scavenger therapy. Human Reproduction Update, 2(3): 246-256.

·       Levine, R.L., Berlett, B.S., Moskovitz, J., Mosoni, L. and Stadtman, E.R. (1999). Methionine residues may protect proteins from critical oxidative damage. Mechanisms of Ageing and Development, 107(3): 323-332.

·       Li, H., Zhang, X.G., Fang, Q., Liu, Q., Du, R.R., Yang, G.S., et al. (2017). Supplemental effect of different levels of taurine in Modena on boar semen quality during liquid preservation at 170C. Animal Science Journal, 88(11): 1692-1699.

·       Mahmoudi, M., Ebrahimzadeh, M.A., Nabavi, S.F., Hafezi, S., Nabavi, S.M. and Eslami, S.H. (2010). Antiinflammatory and antioxidant activities of gum mastic. European Review for Medical and Pharmacological Sciences, 14(9): 765-769.

·       Mann, T. and Lutwak-Mann, C. (1981). Male reproductive function and semen: themes and trends in physiology, biochemistry and investigative andrology. Berlin, Germany: Springer-Verlag; pp: 495.

·       Massa´nyi, P., Trandzik, J., Nad, P., Toman, R., Skalicka´, M. and Kore´nekova´, B. (2003). Seminal concentrations of trace elements in various animals and their correlations. Asian Journal of Andrology, 5(2): 101-104.

·       Matsuoka, T., Imai, H., Asakuma, S., Kohno, H. and Fukui, Y. (2006). Changes of fructose concentrations in seminal plasma and glucose and testosterone concentrations in blood plasma in rams over the course of a year. Journal of Reproduction and Development, 52(6): 805-810.

·       Maxwell, W. and Stojanov, T. (1996). Liquid storage of ram semen in the absence or presence of some antioxidants. Reproduction, Fertility and Development, 8(6): 1013-1020

·       Maxwell, W.M.C., Graaf, S.P., Ghaoui, R.E.H. and Evans, G. (2007). Seminal plasma effects on sperm handling and female fertility. Society of Reproduction and Fertility Supplement, 64(1): 13-38.

·       Michael, A.J., Alexopoulos, C., Pontiki, E.A., Hadjipavlou-Litina, D.J., Saratsis, P., Ververidis, H.N. and Boscos, C.M. (2009). Effect of antioxidant supplementation in semen extenders on semen quality and reactive oxygen species of chilled canine spermatozoa. Animal Reproduction Science, 112(1-2): 119-135.

·       Miguel, A., Jesús L. Fernando, J., Santolaria, P. and Castelló-Ruiz, M. (2021). Role of Antioxidants in Cooled Liquid Storage of Mammal Spermatozoa. Antioxidants, 10(7): 1-19.

·       Miro´nczuk-Chodakowska, I., Witkowska, A.M. and Zujko, M.E. (2018). Endogenous non-enzymatic antioxidants in the human body. Advances in Medical Sciences, 63(1): 68-78.

·       Moghaddam, Gh., Pourseif, M.M. and Rafat, S.A. (2012). Seasonal variation n semen quality and quality traits of Iranian crossbred rams. Slovak journal of Animal Science, 45(3): 67-75.

·       Mohammadi, S.H., Movahedin, M. and Mowla, S.J. (2008). Antioxidant effects of selenium on sperm parameters and testicular structure in young and aged mice. Journal of Reproduction and Infertility, 9(3): 229-237.

·       Momeni, H.N., Sepehri, H. and Yosefi, M. (2015). Effect of Silymarin on Plasma Membrane and Acrosome of Sperm Treated with Aluminum Chloride. Journal of Arak University of Medical Sciences, 18(4): 71-80. [In Persian]

·       Motta, J.P.R., Paraguassú-Braga, F.H., Bouzas, L.F. and Porto, L.C. (2014). Evaluation of intracellular and extracellular trehalose as a cryoprotectant of stem cells obtained from umbilical cord blood. Cryobiology, 68(3): 343-348.

·       Mousavi, S.M., Towhidi, A., Zhandi, M., Amoabediny, G., Mohammadi-Sangcheshmeh, A., Sharafi, M., et al. (2019). Comparison of two different antioxidants in a nano lecithin-based extender for bull sperm cryopreservation. Animal Reproduction Science, 209(1): 1-9.

·       Muzandu, K., Ishizuka, M., Sakamoto, K.Q., Shaban, Z., El Bohi, K., Kazusaka, A. and Fujita, S. (2006). Effect of lycopene and carotene on peroxynitrite-mediated cellular modifications. Toxicology and Applied Pharmacology, 215(3): 330-340.

·       Nateq, S., Moghaddam, Gh. Alijani, S. and Behnam, M. (2020). The effects of differen levels of Nano selenium on the quality of frozen- thawed sperm in ram. Journal of Applied Animal Science, 48(1): 434-439.

·       Neumark, H. and Schindler, H. (1967). Amino acids, amines and peptides of ram epidiymal semen. Journal of Reproduction and Fertility, 14(3): 469-471.

·       Ollero, M., Garcı ´a-Lo´pez, M., Cebria´n-Pe´rez, J.A. and Muin˜o-Blanco, T. (1996). Viability of ram spermatozoa in relation to the abstinence period and successive ejaculations. International Journal of Andrology, 19(5): 287-292.

·       Ozbal, S., Erbil, G., Kocdor, H., Tugyan, K. and Pekcetin, C. (2008). The effects of selenium against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Neurosci Letters, 438(3): 265-269.

·       Parks, J.E. and Graham, J.K. (1992). Effects of cryopreservation procedures on sperm membranes. Theriogenology, 38(2): 209-222.

·       Patel, A.B., Srivastava, S., Phadke, R.S. and Govil, G. (1998). Arginine activates glycolysis of goat epididymal spermatozoa: an NMR study. Biophysical Journal, 75(3): 1522-1528

·       Pérez, G.O., Juárez-Mosqueda, M.D.L., Carvajal, S.U. and Ortega, M.E.T. (2009). Boar spermatozoa cryopreservation in low glycerol/trehalose enriched freezing media improves cellular integrity. Cryobiology, 58(3): 287-292.

·       Peruma, P., Chamuah, J.K. and Rajkhowa, C. (2013). Effect of catalase on the liquid storage of mithun (Bos frontalis) semen. Asian Pacific Journal of Reproduction, 2(3): 209-214.

·       Pezo, F., Yeste, M., Zambrano, F., Uribe, P., Risopatrón, J. and Sánchez, R. (2021). Antioxidants and their effect on the oxidative/nitrosative stress of frozen-thawed boar sperm. Cryobiology, 98: 5-11.

·       Rao, A.V., Ray, M.R. and Rao, L.G. (2006). Lycopene. Advances in Food and Nutrition Research, 51: 99-164.

·       Rasad, S.D. and Simanjuntak, L.C. (2011). The Effect of Fructose Addition in Semen Extender on Quality of Separation of Garut Ram Sperm in Several Storage Length. Animal Production, 11(3): 196-201.

·       Rigby, S.L., Brinshko, S.P. and Cochran, M. (2001). Advances in cooled semen technology: seminal plasma and semen extender. Animal Reproduction Science, 68(3-4): 171-180.

·       Rudolph, A.S., Crowe, J.H. and Crowe, L.M. (1986). Effects of three stabilizing agents’ proline, betaine, and trehalose on membrane phospholipids. Archives of Biochemistry and Biophysics, 245(1): 134-143.

·       Ruffin, V.A., Salameh, A.I., Boron, W.F. and Parker, M.D. (2014). Intracellular pH regulation by acid-base transporters in mammalian neurons. Frontiers in Physiology, 43(5): 1-11.

·       Safa, S., Moghaddam, Gh. Jafari, R., Daghigh kia, H. and Janmohammadi, H. (2016). Effect of vitamin E and selenium nanoparticles on post- thawn variables and oxidative statys of rooster semen. Animal Reproduction Science, 174: 100-106.

·       Salamon, S. and Maxwell, W.M.C. (1995). Frozen storage of ram semen I. Processing, freezing, thawing and fertility after cervical insemination. Animal Reproduction Science, 37(3): 185-249.

·       Salamon, S. and Maxwell, W.M.C. (2000). Storage of ram semen. Animal Reproduction Science, 62(1): 7-111.

·       Samaei, S.P., Ghorbani, M., Sadeghi Mahoonak, A.R. and Jafari, S. M. (2017). Physicochemical and functional properties of apricot tree gum. Journal of Food Science and Technology (Iran), 65(14): 335-342. [In Persian]

·       Scott, T.W. and Dawson, R.M.C. (1968). Metabolism of phospholipids by spermatozoa and seminal plasma. Biochemical Journal, 108(3): 457-463.

·       Setchell, B.P. and Brooks, D.E. (1988). Anatomy, vasculature, innervation and fluids of the male reproductive tract. The Physiology of Reproduction. New York, NY: Raven Press; pp: 753-836.

·       Shafaati Alishah, P. and Moghaddam, Gh. (2021). The effect of morphometry, viscosity and liquefaction of semen on the quality of frozen ram sperm, Veterinary Clinical Pathology, 15(2): 155-167. [In Persian]

·       Shafaati Alishah, P., Moghaddam, Gh., Daghighkia, H. and Alijani, S. (2020). Investigating the effect of diluents containing EDTA and Propylene glycol on survival of frozen semen of Ghezel ram. Veterinary Clinical Pathology, 13(4): 353-369. [In Persian]

·       Sheikholeslami, S.A., Soleimanzadeh, A., Rakhshanpour, A. and Shirani, D. (2020). The evaluation of lycopene and cysteamine supplementation effects on sperm and oxidative stress parameters during chilled storage of canine semen. Reproduction in Domestic Animals, 55(9): 1229-1239.

·       Shi, L., Jin, T., Hu, Y., Ma, Z., Niu, H. and Ren, Y. (2020). Effects of reduced glutathione on ram sperm parameters, antioxidant status, mitochondrial activity and the abundance of hexose transporters during liquid storage at 50C. Small Ruminant Research, 189: 106-139.

·       Shore, L., Yehuda, R., Marcus, S., Bartoov, B. and Shemesh, M. (2003). Effect of HCG injection on prostaglandin E concentrations in ram seminal plasma. Prostaglandins & Other Lipid Mediators, 70(3-4): 291-301.

·       Sinha, M.P., Sinha, A.K., Singh, B.K. and Prasad, R.L. (1996). The effect of glutathione on the motility, enzyme leakage and fertility of frozen goat semen. Animal Reproduction Science, 41(3-4): 237-243.

·       Sirat, M.P., Sinha, A.K., Singh, B.K. and Prasad, R.L. (1996). Effects of cryoprotectants on release of various enzymes from buck spermatozoa during freezing. Theriogenology, 45(2): 405-416.

·       Soultanpour, F., Moghaddam, Gh., Daghigh kia, H. and Rafat, A. (2014). Evaluation of Ghezel- Merino, Merino- Moghani ram semen characteristics in breeding Season. Journal of Animal Science Researches, 24(3): 31-41. [In Persian]

·       Taha, T.A., Abdel-Gawad, E.I. and Ayoub, M.A. (2000). Monthly variations in some reproductive parameters of Barki and Awassi rams throughout 1 year under subtropical conditions biochemical and enzymatic properties of seminal plasma. Journal of Animal Science, 71(2): 325-332.

·       The´rie´n, I., Moreau, R. and Manjunath, P. (1998). Major proteins of bovine seminal plasma and high-density lipoprotein induce cholesterol efflux from epididymal sperm. Biology of Reproduction. 59(4): 768-776.

·       Tummaruk, P., Lundeheim, N., Einarsson, S. and Dalin, A.M. (2000). Reproductive performance of purebred Swedish Landrace and Swedish Yorkshire sows: II, Effect of mating type, weaning-to-first service interval and lactation length. Acta Agriculturae Scandinavica, 50(3): 217-224.

·       Tuncer, P.B., Bucak, M.N., Sarıözkan, S., Sakin, F., Yeni, D., Çiğerci, İ.H., et al. (2010). The effect of raffinose and methionine on frozen/thawed Angora buck (Capra hircus ancryrensis) semen quality, lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities. Cryobiology, 61(1): 89-93.

·       Verstegen, J.P., Onclin, K. and Iguer-Ouada, M. (2005). Long-term motility and fertility conservation of chilled canine semen using egg yolk added Tris–glucose extender: In vitro and in vivo studies. Theriogenology, 64(3): 720-733.

·       Watanabe, M., Kikawada, T. and Okuda, T. (2003). Increase of internal ion concentration triggers trehalose synthesis associated with cryptobiosis in larvae of Polypedilum vanderplanki. Journal of Experimental Biology, 206(13): 2281-2286.

·       Watson, P.F. (2000). The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Animal Reproduction Science, 60-61: 481-492.

·       Wellington, K. and Jarvis, B. (2001). Silymarin: A review of its clinical properties in the management of hepatic disorders. BioDrugs, 15(7): 465-489.

·       Zhang, X.G., Liu, Q., Wang, L.Q., Yang, G.S. and Hu, J.H. (2016). Effects of glutathione on sperm quality during liquid storage in boars. Animal Science Journal, 87(10): 1195-1201.

·       Zubkova, E.V. and Robaire, B. (2004). Effect of glutathione depletion on antioxidant enzymes in the epididymes, seminal vesicles, and liver and on spermatozoa motility in the aging brown Norway rat. Biology of Reproduction, 71(3): 1002-1008.

 

 

61