Application of ERIC-PCR method for genetic classification of campylobacter strains isolated from raw milk

Subject Areas : Food-Borne Diseases

GholamReza Banisharif ¹ , Mohammad Hosein Marhamatizadeh ² , Hassan Momtaz ³

1 - Department of Food Safety and Quality Control, Kazerun Branch, Islamic Azad University, Kazerun, Iran
2 - Department of Food Safety and Quality Control, Kazerun Branch, Islamic Azad University, Kazerun, Iran
3 - Department of Microbiology, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran

Received: 2023-11-20 Accepted : 2024-05-12 Published : 2024-05-28

Keywords: Campylobacter, Raw milk, Genetic classification, ERIC-PCR,

Abstract :

Introduction and purpose: Campylobacter species are one of the most important pathogens causing bacterial gastroenteritis, which are generally transmitted through food of animal origin. The present study was conducted with the aim of genetic classification of Campylobacter isolated from raw milk of cows, sheep and goats in Chaharmahal and Bakhtiari province. Methods: 43 isolates of Campylobacter isolated from raw milk of cows, sheep and goats in Chaharmahal and Bakhtiari provinces were selected and confirmed by ERIC-PCR method. Results: The studied isolates revealed banding patterns ranging from 100 to 2000 open pairs, which were further classified into 5 main profiles with a similarity coefficient of simple matching at a similarity level above 80%. Except for 100% affinity which was observed in 1 case, other isolates had genetic affinity between 54% and 98%. Conclusion: The placement of the studied isolates in several subgroups showed the acceptable discrimination power of the ERIC-PCR technique in Campylobacter genotyping and the presence of different sources of contamination of dairy products with this pathogen. ERIC-PCR method is a simple, fast and low-cost method to describe the genetic diversity of different Campylobacter strains, including Campylobacter jejuni and coli strains.

Full-Text:



استفاده از روش ERIC-PCR جهت دسته بندی ژنتیکی ایزوله های کمپیلوباکتر جدا شده از شیر خام

 

چکیده

مقدمه و هدف: گونه هاي كمپيلوباكتر از مهم ترين پاتوژن هاي عامل گاستروآنتريت هاي باكتريايي هستند كه عمومـاً از طريـق مـواد غـذايي بـا منـشاء حيواني منتقل مي شوند. مطالعه حاضر با هدف دسته بندی ژنتیکی ایزوله های کمپيلوباكتر جدا شده از شیر خام گاو، گوسفند و بز در استان چهارمحال و بختیاری انجام شد.

روش کار: تعداد 43 ایزوله کمپیلوباکتر که از شیر خام گاو، گوسفند و بز درسطح استان چهارمحال وبختیاری جدا شده بودند، انتخاب و به روش ERIC-PCR آزمايش شدند.

نتایج: ايزوله های مورد مطالعه دارای الگوی باندی از محدوده 100تا 2000جفت باز بودند که در آناليز الگوی باندينگ حاصله با ضريب تشابه تطابق ساده در سطح تشابه بالای 80 درصد در قالب 5 پروفایل اصلی طبقه بندی شدند. بجز قرابت 100 درصدی که در 1 مورد ديده شد، ساير ايزوله ها دارای قرابت ژنتيكي بين 54% تا 98% بودند.

نتیجه گیری: قرار گرفتن ايزوله های مورد مطالعه در چند زير گروه نشان گر قدرت تمايزدهي قابل قبول تكنيک ERIC-PCR در ژنوتايپينگ کمپیلوباکتر و وجود منابع مختلف آلودگی فراورده های لبنی با این پاتوژن می باشد. روش ERIC-PCR روشي ساده، سريع و کم هزينه جهت توصيف تنوع ژنتيكي سويه های مختلف کمپیلوباکتر ازجمله سويه های کمپیلوباکترژژوني  و کمپیلوباکترکولی می باشد.

کلید واژه ها: کمپیلوباکتر، شیر خام، دسته بندی ژنتيكي،  ERIC-PCR 

 

Application of ERIC-PCR method for genetic classification of campylobacter strains isolated from raw milk

 

Abstract

Introduction and purpose: Campylobacter species are one of the most important pathogens causing bacterial gastroenteritis, which are generally transmitted through food of animal origin. The present study was conducted with the aim of genetic classification of Campylobacter isolated from raw milk of cows, sheep and goats in Chaharmahal and Bakhtiari province.

Methods: 43 isolates of Campylobacter isolated from raw milk of cows, sheep and goats in Chaharmahal and Bakhtiari provinces were selected and confirmed by ERIC-PCR method.

Results: The studied isolates revealed banding patterns ranging from 100 to 2000 open pairs, which were further classified into 5 main profiles with a similarity coefficient of simple matching at a similarity level above 80%. Except for 100% affinity which was observed in 1 case, other isolates had genetic affinity between 54% and 98%.

Conclusion: The placement of the studied isolates in several subgroups showed the acceptable discrimination power of the ERIC-PCR technique in Campylobacter genotyping and the presence of different sources of contamination of dairy products with this pathogen. ERIC-PCR method is a simple, fast and low-cost method to describe the genetic diversity of different Campylobacter strains, including Campylobacter jejuni and coli strains.

Keywords: Campylobacter, Raw milk, Genetic classification, ERIC-PCR

 

مقدمه

 گونه های کمپیلوباکتر (Campylobacter) باسیل هایی گرم منفی, خمیده, متحرک, گرمادوست و میکروآئروفیل از خانواده کمپیلوباکتریاسه (Campylobacteriacea) بوده و یکی از عاملین مهم انتریت به نام کمپیلوباکتریوزیس می باشند (1).  این جنس با دارا بودن گونه ها و ميزبان هاي مختلف يكي از مهم ترين باكتري هاي مشترك بين انسان و حيوان محسوب مي شود(2،3). مطالعات نشان مي دهد كه 95 درصد موارد كمپيلوباكتريوزيس در انسان توسط كمپيلوباكتر ژژوني و 4 درصد توسط كمپيلوباكتركولي و 1 درصد به وسيله ساير گونه ها ايجاد مي شود (4).  مهم ترين گونه كمپيلوباكتر كه بيش از 85 درصد از عفونت هاي روده اي را باعث مي شود،كمپيلوباكتر ژژوني است. معمول ترين بيماري كه در نتيجه مسموميت غذايي ناشي از اين باكتري در انسان ايجاد مي شودگاستروانتريت است (5). آمار جهاني 20 تا 35 درصد اسهال ها را ناشي از اين باكتري ها مي داند (6). آرتريت سپتيك و باكتريمي، عفونت هاي نادري هستند كه توسط گونه های كمپيلوباكتر ايجاد مي شوند (7). منبع اصلی این باکتری مجرای گوارش حیوانات, به ویژه مرغ و بوقلمون می باشد. مصرف گوشت و مرغ نیم پز, شیر خام و آب غیر کلرینه علل عمده انتقال این باکتری به انسان و بروز کمپیلوباکتریوزیس می باشند (8). همچنين اين بيماري در افراد با نقص ايمني يا افراد خيلي جوان يا پير به علت ضعف سيستم ايمني و توانايي بيشتر اين باكتري براي بيماري زايي، بيشتر ديده مي شود (9).

مطالعات نشان می دهد که کمپیلوباکتر به طور عمده همراه با مواد غذایی با منشا دامی انتقال می یابد. علاوه بر این که مصرف شیر خام در کشور ما بسیار پایین است و شیر به صورت سنتی و یا مدرن پاستوریزه می گردد، شیر خام آلوده به کمپیلوباکتر یکی از شایع ترین علت بیماری های روده ای در اثر مصرف مواد غذایی آلوده است (10). در صورتی که بار میکروبی در شیر خام بالا باشد به دلیل فعالیت آنزیم های مقاوم به گرما در باکتری ها حتی بعد از عمل پاستوریزاسیون شیر خام، مواد لبنی حاصل از آن کیفیت مورد انتظار را ندارند و حامل باکتری ها می باشند (11).

  2 تا 5 روز پس از مصرف غذای آلوده, علایم کمپیلوباکتریوزیس شامل تب, دل درد و اسهال ظاهر می شود که اسهال ممکن است به اسهال خونی ختم گردد. معمولا در این عفونت غذایی استفراغ وجود ندارد. برای کنترل این عفونت باید مواد غذایی گوشتی به طور کامل پخته شده و از مصرف شیر خام و آب غیر کلرینه نیز جلوگیری شود (12).

بنابر مطالب گفته شده آلودگی باکتریایی شیر خام دارای اهمیت بوده و وجود یا عدم وجود کمپیلوباکتر جهت تایید سلامت غذایی مواد لبنی از نقطه نظر وجود این باکتری ضروری است. به طور معمول روش های کشت، جداسازی و تست های تشخیص بر اساس خواص فنوتیپی جهت شناسایی گونه های کمپیلوباکتر به کار می رود (13) اما از آن جا که این باکتری جز باکتری های سخت رشد است، جداسازی آن به وسیله روش های کشت دشوار می باشد، لذا روش های مولکولی بر پایه واکنش زنجیره ای پلیمراز [Polymerase Chain Reaction (PCR)]  در شناسایی کمپیلوباکتر بیش تر مورد اطمینان بوده و به طور تجاری نیز مورد استفاده قرار می گیرند (14). 

از روش های مختلف فنوتيپي و ژنوتيپي نظير سروتاپينگ، بررسي الگوی پلاسميدی، تعيين الگوی حدت و مقاومت آنتي بيوتيكي، روش های متكي بربرش آنزيمي نظيرRFLP، روش های متكي بر PCR نظير ERIC-PCR، RAPD-PCR، REP-PCR و BOX-PCR به عنوان روش های سريع جهت دسته بندی اين باکتری استفاده شده است. روشRAPD- PCR يكي از سريع ترين روش های تايپينگ مولكولي پيشرفته مي باشد که به آساني قابل انجام است. در سال های اخير به دليل سادگي اين روش، سرعت باالی آن، دقت باال، قابليت تكرارپذيری، هزينه ی نسبتا ً پايين و قدرت بالا در افتراق بين سويه ای مورد استفاده ويژه ای قرار گرفته است (14).

علاوه بر تكنيکRAPD-PCR ، تكنيک ERIC-PCR جهت مطالعات اپيدميولوژيک مورد استفاده قرار مي گيرد. ارزيابي و سنجش های مبتني بر ERIC-PCR استفاده ازپرايمرهايي مي باشد که هدف آن ها توالي های تكراری محفوظ شده در ژنوم باکتری مي باشد. از جمله این عناصرتكراری، توالي های تكراری توافقي درون ژنی انتروباکتريال يا ERIC مي باشد که در باکتری های روده ای گرم منفي شايع است. به طور کلي اجزاء و عناصر  126جفت بازی، ERIC شامل يک نمونه تكراری معكوس مرکزی بسيار حفاظت شده در مناطق فراژني مي باشد که از اين توالي تكراری جهت طراحي پرايمر در تكنيک ERIC-PCR جهت انگشت نگاری DNA استفاده مي شود (15).

  با توجه به افزایش مصرف مواد لبنی در دهه گذشته و امکان بیش تر آلودگی باکتری ها، در مطالعه حاضر از روش ERIC-PCR جهت دسته بندی ایزوله های کمپیلوباکترژژونی و کمپیلوباکترکولی جدا شده از شیر خام گاو، گوسفند و بز استفاده شده است. 

 

 

روش کار

غنی سازی نمونه های شیر خام

10 میلی لیتر از هر کدام از نمونه های شیر خام در 14000دور به مدت 20 دقیقه سانتریفوژ شدند. توده به دست آمده بعد از سانتریفوژ به 90 میلی لیتر محیط پرستون براث (محیط پرستون براث ساخت شرکت Merck آلمان) جهت غنی سازی کمپیلوباکتر انتقال یافت و در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت گرمخانه گذاری شد. سپس نمونه ها به روش کشت خطی در محیط کشت اختصاصی (Campylobacter Selective Agar Base)  ساخت شرکت مرک آلمان و بر پایه آگار خون دار کشت داده شد. 

محیط Campylobacter Selective Agar Base  حاوی 7 درصد خون تجزیه شده اسب بود. همچنین هر 500 میلی لیتر از آن شامل 2 میلی گرم آنتی بیوتیک وانکومایسین جهت جلوگیری از رشد باکتری های گرم مثبت مقاوم به متی سیلین، 50 میلی گرم پلی میکسین B جهت جلوگیری از رشد باکتری های پسودوموناس، پاستورلا، سالمونلا، شیگلا و کلبسیلا و 1 میلی گرم تری متوپریم به منظور جلوگیری از رشد اشریشیاکلی، انتروباکتر، کلبسیلا، استرپتوکوکوس، پاستورلا، کلستریدیوم، سامونلا، شیگلا، کورینه باکتریوم و پرتئوس بود (16).  سپس پلیت های فوق در شرایط میکروآئروفیلیک به همراه گازپک شامل 5 درصد اکسیژن، 10 درصد دی اکسیدکربن و 85 درصد نیتروژن (گازپک ساخت شرکت Oxoid کانادا) در دمای 42 درجه سانتی گراد و مدت زمان 48 ساعت گرم خانه گذاری شدند (17).
شناسایی و جداسازی کمپیلوباکتر

پلیت ها یی که حاوی پرگنه های مسطح، غیر همولیتیک، کروی، آبکی و خاکستری به قطر 1 میلی متر بودند مورد بررسی های بعدی قرار گرفتند. پس از شناسایی پرگنه های
مشکوک با مشخصات ذکر شده در بالا در پلیت ها، پرگنه ها به روش گرم، رنگ آمیزی شدند. پرگنه هایی که واجد مشخصات کمپیلوباکتر بودند برای انجام آزمایشات تکمیلی و تایید کمپیلوباکتر ژژونی و کولی، خالص سازی و نگهداری شدند. آزمایشات تکمیلی شامل آزمایش اکسیداز و کاتالاز می باشند. از آزمایش اکسیداز با استفاده از دیسک اکسیداز برای تایید کمپیلوباکتر بودن پرگنه مشکوک استفاده گردید. در ادامه نیز از آزمایش هیدرولیز هیپورات جهت تشخیص کمپیلوباکتر ژژونی و کولی استفاده شد(17).

ایزوله های جدا شده جهت مطالعات بعدی در محیط مایع TSB کشت داده شدند. جهت استخراج DNA از ایزوله های جدا شده از روش جوشاندن (Boiling) استفاده شد برای این منظور 50 میکرولیتر از کشت مایع یک شبه باکتری در محیط TSB در500 میکرولیتر آب مقطر استریل به مدت 10 دقیقه در آب جوش حرارت داده شد. پس از سانتریفیوژ نمونه ها در 10000دور به مدت 10 دقیقه، مایع رویی به عنوان منبع DNA جدا گردید.

آزمایشات مولکولی

برای تایید قطعی کمپیلوباکتر در ایزوله های جدا شده از ردیابی ژن 16SrRNA به روش PCR استفاده شد که این ناحیه ژنی در تمام گونه های کمپیلوباکتر وجود دارد(18). جهت افتراق گونه های کمپیلوباکترژژونی وکمپیلوباکترکولی از PCR ژن های mapA و ceuE با زوج پرایمرهای نشان داده شده در جدول 1 استفاده شد.

 

جدول1- توالی پرایمرهای مورداستفاده جهت تشخیص گونه‌های کمپیلوباکتر

هدف	نام ژن	توالی پرایمر(3ـ 5)	اندازه محصول (جفت باز)
جنس کمپیلوباکتر	16SrRNA	ATC TAA TGG CTT AAC CAT TAA AC GGA CGG TAA CTA GTT TAG TAT T	857
کمپیلوباکترژژونی	mapA	CTA TTT TAT TTT TGA GTG CTT GTG GCT TTA TTT GCC ATT TGT TTT ATT A	589
کمپیلوباکترکولی	ceuE	AAT TGA AAA TTG CTC CAA CTA TG TGA TTT TAT TAT TTG TAG CAG CG	462

 

واکنش PCR در دستگاه ترموسایکلر مدل (Germany) FlexCycler2 در حجم 50 میکرولیتر واجد 5 میکرولیتر PCR buffer 10x، 5/1 میلی مول Mgcl2، 200 میکرومول NTP Mix، 5/. میکرومول از زوج پرایمرهای FوR (مربوط به سه ژن)، 6/0 واحد آنزیم Taq DNA Polymerase و 4 میکرولیتر از DNA مربوط هر ایزوله تنظیم شد. برنامه حرارتی مورداستفاده عبارت بود از: یک سیکل 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه، 35 سیکل تکراری 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه، 59 درجه سانتی‌گراد به مدت 90 ثانیه، 72 درجه سانتی‌گراد به مدت60 ثانیه و یک سیکل انتهایی 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه.

در آزمایش PCR از سویه‌های استاندارد Campylobacter jejuni ATCC29428 و Campylobacter coli ATCC43478 و ایزوله‌های جدا شده در مطالعات قبلی به‌ عنوان کنترل مثبت و از آب مقطر به ‌عنوان نمونه کنترل منفی استفاده شد.

جهت دسته‌بندی ژنتیکی و تیپ بندی ایزوله‌های کمپیلوباکترژژونی و کولی جداشده از فراورده های لبنی از روش ERIC-PCR استفاده شد.

آزمایش ERIC-PCR به کمک زوج پرایمرهای R1: ATGAAGCTCCTGGGGATTCAC و R2: AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG معرفی‌شده توسط Zorman و همکاران (2006) انجام شد(19). آزمایش PCR در این مرحله سه نوبت روی 43 ایزوله انتخابی از ایزوله‌های کمپیلوباکترژژونی و کولی جداشده، در حجم 25 میکرولیتر واجد 5/2 میکرولیتر PCR buffer 10X ، 3 میلی مول Mgcl2، 250 میکرومول dNTP Mix، 2 میکرومول از زوج پرایمرهای فوق، 2 واحد آنزیم Taq DNA Polymerase و 3 میکرولیتر از DNA مربوط به هر ایزوله با برنامه حرارتی شامل:

یک سیکل 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 2 دقیقه، 45 سیکل تکراری 94 سانتی‌گراد 45 ثانیه، 38 درجه سانتی‌گراد 40 ثانیه، 72 درجه سانتی‌گراد 60 ثانیه و یک سیکل انتهایی 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه انجام شد.

در تمام مراحل فوق جهت ارزیابی محصول PCR، از الکتروفورز محصول روی ژل آگاروز 2 درصد استفاده شد. الکتروفورز نمونه‌ها در ولتاژ ثابت 90 ولت به مدت حدوداً یک ساعت انجام و بعد از مشاهده ژل در زیر نور UV از ژل حاصله تصویربرداری و ثبت گردید.

در تکنیک ERIC-PCR آزمایش PCR روی ایزوله‌های موردمطالعه سه نوبت انجام و پس از اطمینان از تعداد و اندازه باندهای ایجادشده در هر ایزوله، الگوی باندی حاصله به کمک نرم‌افزار NTSIS آنالیز و با در نظر گرفتن قرابت بالای 80 درصد، ژنوتیپ‌های (پروفایل‌های) مربوط با روش UPGMA شناسایی و دندروگرام مربوط به این نشان‌گر ترسیم گردید(20).

نتایج:

علاوه بز آزمون های میکروبی متداول به منظور تشخیص ایزوله های کمپیلوباکتر از روش PCR جهت ردیابی ژن 16SrRNA استفاده گردید نتیجه حاصل از ردیابی ژن 16SrRNA در شکل 1 نشان داده شده است.

 

 

 

 

شکل 1- ژل حاصل از الکتروفورز محصول PCR مربوط به ردیابی ژن 16srRNA مربوط به گونه‌های کمپیلوباکتر در ایزوله‌های جداشده (ستون M= مارکر 100 جفت بازی DNA، ستون NC= نمونه کنترل منفی، ستون 1= نمونه کنترل مثبت، ستون های 16-8= نمونه های مورد مطالعه)

در کلنی‌های مشکوک به گونه‌های کمپیلوباکتر وجود ژن mapA نشانگر وجود گونه کمپیلو باکتر ژژونی و ژن ceuE نشان‌گر وجود گونه کمپیلوباکتر کولی بود. ایزوله‌های فاقد دو ژن به‌عنوان سایر گونه‌های کمپیلو باکتر قلمداد شدند

 

عکس 2- ژل حاصل از الکتروفورز محصول PCR مربوط به ردیابی ژن mapA مربوط به گونه کمپیلوباکترژژونی (قطعه 589 جفت بازی) و ژن ceuB مربوط به گونه کمپیلوباکترکولی (قطعه 462 جفت بازی) در ایزوله‌های جداشده از شیر خام گاو، گوسفند و بز (ستون M= مارکر 100 جفت بازی DNA، ستون های 8-1= نمونه های مورد مطالعه)

 

از مجموع 432 نمونه اخذ شده از شیر خام گاو، گوسفند و بز، 76 ایزوله کمپیلوباکتر جدا شد که جهت دسته بندی ژنتيكي 43 ايزوله انتخاب شده از بین آن ها، از روش ERIC-PCR استفاده شد که در اين راستا 43 ايزوله مورد مطالعه سه نوبت با روش ERIC-PCR آزمايش و پس از اطمينان از حضور قطعات تكثير يافته در ( PCRتصاوير حاصل از الکتروفورز (عکس های 3 و 4) آناليز شدند .

ایزو له های انتخابی شامل، نمونه های شماره 18-1 گونه کمپیلوباکتر ژژونی (ایزوله های 3-1 جدا شده از شیر بز، ایزوله های 12-4 جدا شده از شیر گاو، ایزوله های 18-13 جدا شده از شیر گوسفند) و نمونه های شماره 43-19 گونه کمپیلوباکتر کولی (ایزوله های 26-19 جدا شده از شیر بز، ایزوله های 38-27 جدا شده از شیر گاو، ایزوله های 43-39 جدا شده از شیر گوسفند) بودند.

 

شکل 3- ژل حاصل از الکتروفورز محصول PCR مربوط به نشان‌گر ERIC-PCR روی ایزوله‌های کمپیلوباکترژژونی(ستون M1= مارکر 100 جفت بازی DNA، ستون M2= مارکر 1 کیلو بازی DNA)

 

عکس 4- ژل حاصل از الکتروفورز محصول ERIC-PCR روی ایزوله‌های کمپیلوباکترکولی(ستون M1= مارکر 100 جفت بازی DNA، ستون M2= مارکر 1 کیلو بازی DNA)

طبق تصاوير ايزوله های مورد مطالعه دارای الگوی باندی از محدود 120تا 3000 جفت بازی DNAبودند که قطعات تكثير يافته در ايزوله ها در قالب اعداد (1وجود باند) و ( 0عدم وجود باند)امتيازدهي و به وسيله بازخواني مقادير کامپيوتری ژل هادر برنامه NTSYSآناليز شدند. پس از امتيازدهي ژل ها،شباهت ژنتيكي بر اساس داده های 0و1با استفاده از ضرايب جاکارد،دايس و تطابق ساده محاسبه شدکه ضريب کوفنتيک محاسبه شده برای الگوريتمAو هر کدام از سه ضريب فوق در جدول 1آورده شده است.

جدول 1-ضريب کوفنتيک محاسبه شده برای الگوريتم و ضرايب تشابه جاکارد، دايس و تطابق ساده روی ايزوله های کمپیلوباکترژژونی و کولی با نشانگر
ERIC-PCR

ضریب تشابه الگوریتم	ضریب تشابه جاکارد(J)	ضریب تشابه دایس (DICE )	ضریب تطابق ساده (SM)
UPGMA	0.77145	0.68810	0.77743

 

طبق اطلاعات جدول فوق ضريب تطابق ساده(777./)  بزرگتر از دو ضريب جاکارد و دايس بوده لذا جهت محاسبه درصد تشابه ژنتيكي ايزوله ها و ترسيم درخت فيلوژني از اين ضريب استفاده شد.

در نشانگر ERIC-PCR یک مورد ایزوله ها داری قرابت 100 % (ضریب شباهت 1) بودند. قرابت ژنتیکی 100 % بین ایزوله های 35 با 39 مشاهده شد. و کمترین قرابت ژنتیکی بین ایزوله 22با1(ضزیب شباهت54 %) وجود داشت (جدول 2)

با در نظر گرفتن قرابت بالای 80 درصد 43 ایزوله انتخابی در قالب 5 پروفایل قرار گرفتند (شکل 5).

	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S7	S8	S9	S10	S11	S12	S13	S14	S15	S16	S17	S18	S19	S20	S21	S22	S23	S24	S25	S26	S27	S28	S29	S30	S31	S32	S33	S34	S35	S36	S37	S38	S39	S40	S41	S42	S43
S1	1.00
S2	0.76	1.00
S3	0.61	0.76	1.00
S4	0.71	0.80	0.80	1.00
S5	0.66	0.71	0.80	0.85	1.00
S6	0.68	0.73	0.68	0.83	0.78	1.00
S7	0.71	0.80	0.80	0.95	0.85	0.83	1.00
S8	0.71	0.76	0.71	0.80	0.80	0.83	0.80	1.00
S9	0.59	0.63	0.73	0.73	0.78	0.71	0.73	0.68	1.00
S10	0.66	0.71	0.71	0.85	0.80	0.73	0.90	0.71	0.83	1.00
S11	0.68	0.73	0.78	0.88	0.83	0.80	0.88	0.73	0.66	0.78	1.00
S12	0.63	0.68	0.78	0.83	0.93	0.80	0.83	0.78	0.76	0.78	0.80	1.00
S13	0.59	0.63	0.73	0.78	0.78	0.71	0.78	0.73	0.80	0.83	0.76	0.80	1.00
S14	0.66	0.76	0.76	0.90	0.85	0.78	0.90	0.80	0.68	0.80	0.88	0.83	0.78	1.00
S15	0.63	0.73	0.78	0.83	0.83	0.71	0.83	0.78	0.76	0.83	0.80	0.76	0.71	0.83	1.00
S16	0.73	0.73	0.73	0.83	0.83	0.76	0.83	0.88	0.66	0.73	0.80	0.80	0.71	0.83	0.80	1.00
S17	0.68	0.68	0.78	0.83	0.78	0.71	0.83	0.73	0.71	0.78	0.85	0.76	0.76	0.83	0.76	0.80	1.00
S18	0.76	0.71	0.66	0.80	0.80	0.73	0.80	0.80	0.73	0.80	0.78	0.78	0.83	0.80	0.78	0.88	0.78	1.00
S19	0.63	0.73	0.68	0.78	0.73	0.71	0.78	0.68	0.66	0.73	0.71	0.80	0.66	0.73	0.76	0.71	0.66	0.68	1.00
S20	0.76	0.80	0.76	0.85	0.76	0.78	0.85	0.76	0.68	0.80	0.78	0.78	0.73	0.80	0.78	0.78	0.78	0.80	0.83	1.00
S21	0.59	0.68	0.73	0.83	0.78	0.76	0.83	0.68	0.71	0.78	0.80	0.76	0.76	0.83	0.80	0.71	0.71	0.73	0.76	0.78	1.00
S22	0.54	0.63	0.68	0.78	0.73	0.76	0.78	0.68	0.71	0.73	0.71	0.80	0.76	0.78	0.66	0.71	0.71	0.68	0.76	0.73	0.80	1.00
S23	0.66	0.66	0.66	0.80	0.76	0.68	0.80	0.66	0.78	0.90	0.78	0.73	0.78	0.80	0.78	0.73	0.83	0.80	0.68	0.76	0.73	0.68	1.00
S24	0.63	0.78	0.88	0.88	0.88	0.76	0.88	0.73	0.76	0.78	0.85	0.85	0.76	0.83	0.80	0.76	0.80	0.73	0.76	0.78	0.76	0.71	0.73	1.00
S25	0.59	0.73	0.78	0.83	0.78	0.76	0.83	0.68	0.80	0.83	0.76	0.85	0.76	0.83	0.80	0.71	0.76	0.73	0.80	0.78	0.76	0.76	0.83	0.85	1.00
S26	0.71	0.80	0.80	0.95	0.85	0.88	0.95	0.80	0.73	0.85	0.88	0.88	0.78	0.90	0.83	0.83	0.83	0.80	0.83	0.90	0.88	0.83	0.80	0.88	0.88	1.00
S27	0.73	0.78	0.78	0.93	0.83	0.85	0.93	0.78	0.71	0.83	0.90	0.85	0.76	0.88	0.80	0.85	0.85	0.83	0.80	0.88	0.85	0.80	0.83	0.85	0.85	0.98	1.00
S28	0.61	0.71	0.66	0.80	0.71	0.73	0.80	0.71	0.63	0.76	0.78	0.78	0.68	0.85	0.73	0.68	0.73	0.66	0.73	0.76	0.78	0.73	0.80	0.73	0.83	0.85	0.83	1.00
S29	0.68	0.78	0.78	0.93	0.88	0.85	0.93	0.83	0.71	0.83	0.85	0.90	0.80	0.93	0.80	0.85	0.80	0.83	0.80	0.88	0.85	0.85	0.78	0.85	0.85	0.98	0.95	0.83	1.00
S30	0.73	0.78	0.68	0.83	0.73	0.71	0.83	0.68	0.66	0.78	0.76	0.71	0.76	0.78	0.71	0.71	0.76	0.78	0.80	0.83	0.76	0.66	0.73	0.76	0.71	0.83	0.80	0.73	0.80	1.00
S31	0.63	0.73	0.73	0.83	0.78	0.71	0.83	0.68	0.71	0.78	0.80	0.76	0.71	0.88	0.85	0.71	0.76	0.73	0.71	0.73	0.76	0.66	0.78	0.80	0.85	0.83	0.80	0.83	0.80	0.76	1.00
S32	0.68	0.73	0.78	0.88	0.88	0.76	0.88	0.78	0.76	0.88	0.85	0.85	0.90	0.88	0.80	0.80	0.85	0.88	0.71	0.83	0.76	0.76	0.83	0.85	0.80	0.88	0.85	0.73	0.90	0.80	0.80	1.00
S33	0.68	0.78	0.78	0.88	0.83	0.76	0.88	0.73	0.71	0.78	0.85	0.80	0.71	0.88	0.80	0.80	0.85	0.78	0.80	0.83	0.76	0.71	0.83	0.85	0.85	0.88	0.90	0.78	0.85	0.80	0.85	0.80	1.00
S34	0.78	0.78	0.78	0.93	0.88	0.85	0.93	0.83	0.80	0.88	0.85	0.85	0.80	0.88	0.80	0.85	0.85	0.88	0.76	0.88	0.80	0.76	0.83	0.85	0.80	0.93	0.90	0.78	0.90	0.85	0.80	0.90	0.85	1.00
S35	0.66	0.80	0.80	0.90	0.80	0.83	0.90	0.76	0.73	0.80	0.83	0.83	0.73	0.85	0.78	0.78	0.78	0.76	0.78	0.85	0.83	0.78	0.76	0.93	0.88	0.95	0.93	0.80	0.93	0.78	0.78	0.83	0.83	0.88	1.00
S36	0.78	0.78	0.78	0.93	0.83	0.80	0.93	0.78	0.76	0.88	0.85	0.80	0.80	0.88	0.80	0.80	0.85	0.83	0.76	0.88	0.80	0.76	0.83	0.85	0.80	0.93	0.90	0.78	0.90	0.85	0.80	0.90	0.85	0.95	0.88	1.00
S37	0.73	0.78	0.83	0.93	0.88	0.80	0.93	0.78	0.80	0.88	0.85	0.85	0.80	0.88	0.85	0.80	0.85	0.83	0.80	0.88	0.80	0.76	0.83	0.90	0.85	0.93	0.90	0.78	0.90	0.85	0.85	0.90	0.90	0.95	0.88	0.95	1.00
S38	0.71	0.85	0.85	0.95	0.85	0.83	0.95	0.80	0.78	0.85	0.88	0.83	0.78	0.90	0.83	0.83	0.83	0.80	0.78	0.85	0.83	0.78	0.80	0.93	0.88	0.95	0.93	0.80	0.93	0.83	0.83	0.88	0.88	0.93	0.95	0.93	0.93	1.00
S39	0.66	0.80	0.80	0.90	0.80	0.83	0.90	0.76	0.73	0.80	0.83	0.83	0.73	0.85	0.78	0.78	0.78	0.76	0.78	0.85	0.83	0.78	0.76	0.93	0.88	0.95	0.93	0.80	0.93	0.78	0.78	0.83	0.83	0.88	1.00	0.88	0.88	0.95	1.00
S40	0.71	0.80	0.80	0.95	0.85	0.83	0.95	0.80	0.73	0.85	0.88	0.83	0.78	0.90	0.83	0.83	0.83	0.80	0.78	0.85	0.83	0.78	0.80	0.93	0.83	0.95	0.93	0.80	0.93	0.83	0.83	0.88	0.88	0.93	0.95	0.93	0.93	0.95	0.95	1.00
S41	0.63	0.73	0.83	0.88	0.83	0.76	0.88	0.83	0.71	0.78	0.80	0.80	0.80	0.88	0.80	0.85	0.80	0.78	0.71	0.78	0.80	0.80	0.73	0.85	0.76	0.88	0.85	0.73	0.90	0.76	0.76	0.85	0.80	0.85	0.88	0.85	0.85	0.88	0.88	0.93	1.00
S42	0.63	0.78	0.78	0.83	0.78	0.71	0.83	0.83	0.66	0.73	0.76	0.76	0.71	0.83	0.80	0.85	0.76	0.78	0.71	0.78	0.71	0.71	0.68	0.85	0.76	0.83	0.80	0.68	0.85	0.71	0.71	0.80	0.76	0.80	0.88	0.80	0.80	0.88	0.88	0.88	0.90	1.00
S43	0.66	0.76	0.80	0.85	0.80	0.73	0.85	0.85	0.68	0.76	0.78	0.78	0.78	0.85	0.83	0.88	0.78	0.80	0.73	0.80	0.78	0.78	0.71	0.83	0.73	0.85	0.83	0.71	0.88	0.73	0.73	0.83	0.78	0.83	0.85	0.83	0.83	0.85	0.85	0.90	0.98	0.93	1.00

جدول 2- ماتریکس شباهت ژنتیکی بین ایزوله های کمپیلوباکتر جدا شده از شیر خام بر پایه الگوریتم تطابق ساده

 

 

شکل 5- دندروگرام حاصل از آنالیز ایزوله های کمپیلوباکتر برمبنای الگوریتم تطابق ساده (Simple Match)

 

بحث

کمپیلوباکتریوز یک بیماری گوارشی ناشی از غذای مشترک انسان و دام است که بیشتر از طریق شیر و فرآورده های حیوانی غیر پاستوریزه یا آلوده به انسان منتقل می شود (22). با توجه به سهم بالای محصولات طیور در انتقال گونه‌های کمپیلوباکتر، نقش شیر خام گونه‌های حیوانی در چندین پژوهش ایرانی شناسایی شده است (23). کمپیلوباکترها با داشتن گونه‌ها و میزبان‌های مختلف، یکی از مهم‌ترین و شایع‌ترین باکتری‌های بیماری‌زای مشترک بین انسان و دام محسوب می‌شوند. در جنس کمپیلوباکتر دو گونه مهم به نام کمپیلوباکترژژونی و کمپیلوباکترکولی مسئول اصلی عفونت‌های ناشی از کمپیلوباکترها در انسان محسوب می‌شوند. همچنین کمپیلوباکتر امروزه به‌عنوان یکی از عوامل مهم در عفونت‌های باکتریایی با منشأ غذایی موردتوجه قرارگرفته است. این باکتری سالیانه 400 تا 500 میلیون نفر را در دنیا مبتلا می‌کند. مطالعات جدید نشان می‌دهد که در کشورهای توسعه‌یافته و درحال‌توسعه عفونت‌های ناشی کمپیلوباکترها در انسان رو به افزایش است (24).

درگذشته از روش های فنوتيپي ازجمله سروتايپينگ جهت دسته بندی سويه های اين باکتری استفاده مي شد. امروزه روش های مولكولي جايگزين روشهای مرسوم فنوتيپي شده است. چند روش برای دسته بندی سويه های مختلف کمپیلوباکتر طراحي و ارائه شده است. ارزيابي سيستم های مختلف طبقه بندی باکتری ها در بررسي های اپيدميولوژيكي بر پايه معيارهای مهمي نظير توان تمايزدهي تكنيک، قابليت تعيين تيپ و تكرارپذيری روش مربوطه مي باشد. روش های مختلف فنوتيپي و ژنوتيپي برای تيپ بندی سويه های کمپیلوباکتر شناخته شده است روش های فنوتيپي نظير سروتايپينگ و فاژتايپينگ قدرت تمايزدهي پاييني دارند از اين رو روش های ژنوتيپي با قدرت تمايز بالا، هزينه پايين، کاربرد آسان و سريع در شناسايي و دسته بندی سويه های کمپیلوباکتر کاربرد پيدا کرده اند(25).

اخيراًروش های مختلفي برای تعيين منشأ و منبع ميكروب ها به کاررفته اند. روش هايي مثل ريبوتايپينگ، ERIC-PCR، RAPD-PCR و RFLPبه طرز موفقيت آميزی برای متمايز کردن سويه های باکتری های مختلف استفاده شده اند. ازکاربردی ترين روش ها در تيپ بندی سويه های کمپیلوباکتر روش های مبتني بر PCRبه ويژه سه روش –RAPD ERIC-PCR،PCRو RFLP-PCR مي باشد، در اين مطالعه نيز از روش ERIC-PCR جهت دسته بندی ايزوله های کمپیلوباکتر جداشده از فراورده های لبنی دراستان چهارمحال و بختياری استفاده شد

43 ايزوله کمپیلوباکتر با نشانگر،ERIC-PCR آزمايش و ميزان شباهت ژنتيكي آن ها با ضريب تطابق ساده تعيين گرديد. به جزشباهت 100درصدی که در یک مورد بين ایزوله های 35 با39 مشاهده شد بیش ترین و کمترین درصد قرابت 54% تا98% بین ایزوله های مورد مطالعه دیده شد و همان گونه در درخت فیلوژنی ترسیم شده بر اساس ضریب تطابق ساده مشهود است،

 

Ahmed و همکاران (2015) در مصر، از روشERIC-PCR جهت ژنوتایپینگ ایزوله‌های کمپیلوباکترژژونی جداشده از منابع انسانی و مرغ استفاده کردند. ایزوله‌های جداشده از 287 نمونه مرغ (131 سواپ رکتوم،39 نمونه پوست مرغ، 87 نمونه گوشت خام مرغ و39 نمونه بافت سکوم روده ) و246 نمونه مدفوع از بیماران مشکوک به گاستروآنتریت بعد از تائید مولکولی به روش Real-Time PCR و روش ERIC-PCR آنالیز شدند. در این مطالعه 31 ایزوله کمپیلوباکترژژونی جداشده در 18 پروفایل قرار گرفتند که 2 پروفایل مربوط به ایزوله‌های انسانی و دامی مشترک بود (26).

در مطالعه Lgwaran، Okoh (2020) از مجموع 402 ایزوله کمپیلوباکتر جداشده از منابع مختلف (گوشت، شیر گاو و آب) در مناطق مختلف، 85 ایزوله کمپیلوباکترژژونی و 67 ایزوله کمیلوباکترکولی شناسایی شد که از این تعداد 71 ایزوله (35 ایزوله کمپیلوباکترکولی و36 ایزوله کمپیلوباکترژژونی) جهت مطالعه ژنوتایپینگ انتخاب شدند.آنالیز الگوی باندی حاصل از آزمایش ایزوله‌ها با روش ERIC-PCR با نرم‌افزار GelJ نشان دادند که 36 ایزوله کمپیلوباکترژژونی موردمطالعه در 29 پروفایل و4 کلاستر و 35 ایزوله کمپیلوباکترکولی در 29 پروفایل و 6 کلاستر قرار گرفتند. نتایج این مطالعه نشان‌گر تنوع ژنتیکی بالا در ایزوله‌های کمپیلوباکترژژونی و کمپیلوباکترکولی جداشده از منابع مختلف بود(27).

Ammar و همکاران (2021) در مطالعه‌ای مشابه با مطالعه حاضر خصوصیات مولکولی (الگوی مقاومت آنتی‌بیوتیکی و توزیع عوامل حدت) و دسته‌بندی ژنتیکی ایزوله‌های کمپیلوباکترژژونی جداشده از منابع انسانی و دامی را ارزیابی کردند. در این مطالعه 8/32 درصد از ایزوله‌های جداشده از مدفوع انسان و گوشت خام مرغ مقاومت چندگانه آنتی‌بیوتیکی داشته و در روش ERIC-PCR در 5 کلاستر قرار گرفتند (28).

نتیجه گیری

انتخاب يک تكنيک ژنوتايپينگ به سطح مهارت کاربران و امكانات آزمايشگاه و نيز به هدف بررسي وابسته است. در بررسي حاضر از تكنيک ERIC-PCRجهت دسته بندی ژنتیکی سویه های کمپیلوباکتر به عنوان یکی از مهم ترین و شایع ترین میکروارگانیسم های پاتوژن دار استفاده شد. .استفاده از روش ERIC-PCR در ژنوتایپینگ ایزوله‌های جداشده نشان‌گر وجود تنوع ژنتیکی بالا در بین ایزوله‌ها بود و نشان داد که ایزوله‌های قرارگرفته در یک پروفایل احتمالاً می‌توانند نحوه انتقال مشابهی داشته باشند.

 

منابع

 

 

1.       Izat AL, Gardner FA, Denton JH, Golan FA. Incidence and level of Campylobacter jejuni in broiler processing. Poultry Science. 1988 Nov 1;67(11):1568-72.

2.       Karenlampi R, Kalso S, Ponka A, Schildt M, Hakkinen M, Hanninen ML. Isolation and PFGE typing of Finnish Campylobacter jejuni strains from cattle, poultry and organic hens Abstracts of 5th World Congress Foodborne Infections and Intoxications. Berlin, Germany. 2004; 7-11:165

3.       Allos BM, Blaser MJ. Campylobacter jejuni and the expanding spectrum of related infections. Clinical Infectious Diseases. 1995 May 1:1092-9.

4.       Alterkruse SF, Boor KJ, Cook M, Cole E, Freier T, Jaykus L, King R, Mazzotta A, Kowalcyk B, Perencevich E, Ruple A. Analytical utility of campylobacter methodologies. Journal of Food Protection. 2007 Jan 20; 70(1):241-50.

5.       Blaser MJ. Epidemiologic and clinical features of Campylobacter jejuni infections. Journal of Infectious Diseases. 1997 Dec 1;176 (Supplement_2):S103-5.

6.       Mead PS, Slutsker L, Dietz V, McCaig LF, Bresee JS, Shapiro C, Griffin PM, Tauxe RV. Food-related illness and death in the United States. Emerging Infectious Diseases. 1999 Sep;5(5):607.

7.       Christopher FM, Smith GC, Vanderzant C. Examination of poultry giblets, raw milk and meat for Campylobacter fetus subsp. jejuni. Journal of Food Protection. 1982 Feb 1;45(3):260-2.

8.       Jay JM, Loessner MJ, Golden DA. Modern food microbiology. Springer Science & Business Media; 2008 Feb 5.

9.       Hesari J, Ehsani MR, Khosrowshahi A, Ghaemi N. Effect of psychrotrophic bacteria and somatic cell count on proteolysis and sensory properties of UF white cheese. Iranian Food Science and Technology Research Journal. 2005 Sep 23;1(2).

10.       Rosyidi A, Budhiharta S, Asmara W, Yudhabuntara D. Phenotypic and genotypic detection of Campylobacter jejuni at local chicken and chicken meat. Animal Production. 2010;12(2):128-34.

11.       Klena JD, Parker CT, Knibb K, Ibbitt JC, Devane PM, Horn ST, Miller WG, Konkel ME. Differentiation of Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter lari, and Campylobacter upsaliensis by a multiplex PCR developed from the nucleotide sequence of the lipid A gene lpxA. Journal of Clinical Microbiology. 2004 Dec;42(12):5549-57.

12.       Saif YM, Fadly AM, Glisson JR, McDougald LR, Nolan LK, Swayne DE. Disease of poultry 12th Edition, Blackwell Publishing Professional, 2008; 657-90.

13.       Lastovica AJ, Le Roux E. Efficient isolation of Campylobacter upsaliensis from stools. Journal of Clinical Microbiology. 2001 Nov;39(11):4222.

14.       Linton D, Lawson AJ, Owen RJ, Stanley JP. PCR detection, identification to species level, and fingerprinting of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli direct from diarrheic samples. Journal of Clinical Microbiology. 1997 Oct;35(10):2568-72.

15.       Soleimanjahi H, Bamdad T, Kermanian M. Diagnosis of Enterovirus and mumps virus in CSF samples of patients with aseptic meningitis by RT-PCR assay. Daneshvar Medicine. 2008 Aug 22;15(3):75-80.

16.       Shahrokhabad R, Rahimi E, Mommtaz H. Investigation of morbidity and antibacterial resistance of Campylobacter spp. sample isolation from broilers slaughter in Rafsanjan city using basic culture method. Veterinary Researches & Biological Products. 2011 Jun 22;24(2):53-8.

17.       Khanzadi S, Jamshidi A, Soltaninejad V, Khajenasiri S. Isolation and identification of Campylobacter jejuni from bulk tank milk in Mashhad-Iran. World Applied Sciences Journal. 2010;9(6):638-43.

18.       Rahimi E, Momtaz H, Ameri M, Ghasemian-Safaei H, Ali-Kasemi M. Prevalence and antimicrobial resistance of Campylobacter species isolated from chicken carcasses during processing in Iran. Poultry Science. 2010 May 1;89(5):1015-20.

19.       Zorman T, Heyndrickx M, Uzunović-Kamberović S, Možina SS. Genotyping of Campylobacter coli and C. jejuni from retail chicken meat and humans with campylobacteriosis in Slovenia and Bosnia and Herzegovina. International Journal of Food Microbiology. 2006 Jul 1;110(1):24-33.

20.       Heras J, Domínguez C, Mata E, Pascual V, Lozano C, Torres C, Zarazaga M. GelJ–a tool for analyzing DNA fingerprint gel images. BMC Bioinformatics. 2015 Dec;16(1):1-8.

21.       Versalovic J, Koeuth T, Lupski R. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to finger printing of bacterial genomes. Nucleic Acids Research. 1991 Dec 25;19(24):6823-31.

22.       TCR from Poultry. Antimicrobial resistance and antibiogram of thermotolerant Campylobacter recovered from poultry meat in Baghdad markets, Iraq. Archives of Razi Institute. 2022;77(1):249-55.

23.       Taghizadeh M, Nematollahi A, Bashiry M, Javanmardi F, Mousavi M, Hosseini H. The global prevalence of Campylobacter spp. in milk: A systematic review and meta-analysis. International Dairy Journal. 2022 Oct 1;133:105423.

24.       Fani MJ, Mokhtarian D H, Mohsenzadeh M, Ghahramani M, Moshki M. Detection and identification of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from poultry carcasses slaughtered in Gonabad poultry slaughterhouse. Internal Medicine Today. 2009 Jul 10;15(2):30-5.

25.       Kamerbeek J, Schouls LE, Kolk A, Van Agterveld M, Van Soolingen D, Kuijper S, Bunschoten A, Molhuizen H, Shaw R, Goyal M, van Embden J. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. Journal of Clinical Microbiology. 1997 Apr;35(4):907-14.

26.       Ahmed HA, El Hofy FI, Ammar AM, Abd El Tawab AA, Hefny AA. ERIC-PCR genotyping of some Campylobacter jejuni isolates of chicken and human origin in Egypt. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 2015 Dec 1;15(12):713-7.

27.       Igwaran A, Okoh AI. Molecular determination of genetic diversity among Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolated from milk, water, and meat samples using enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR (ERIC-PCR). Infection Ecology & Epidemiology. 2020 Jan 1;10(1):1830701.

28.       Ammar AM, El-Naenaeey ES, El-Malt RM, El-Gedawy AA, Khalifa E, Elnahriry SS, Abd El-Hamid MI. Prevalence, antimicrobial susceptibility, virulence and genotyping of Campylobacter jejuni with a special reference to the anti-virulence potential of Eugenol and beta-resorcylic acid on some multi-drug resistant isolates in Egypt. Animals. 2020 Dec 22;11(1):3.

 

 

 

 

---