Molecular identification and evaluation of probiotic and antifungal properties of Entrococcus faecium isolated from natural honey
Subject Areas : Aquatic Products
Sara Shahryari
1
(
Department of Food Science and Technology, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran
)
Delasa Rahimi
2
(
Department of Food Science and Technology, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran
)
Hosein Purabdolah
3
(
. Department of Food Science and Technology, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran
)
Maryam Ebrahimi
4
(
Food, Drug & Natural Products Health Research Center, Golestan University of Medical Science, Gorgan, Iran
)
Alireza Sadeghi
5
(
. Department of Food Science and Technology, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran
)
Keywords: antifungal effect, Natural honey, Probiotic properties, Predominant LAB isolate,
Abstract :
Natural honey is a proper substrate to isolate probiotic bacteria. Characterization of probiotic and antifungal properties of microorganisms isolated from food ecosystems such as natural honey that have been less studied is an interesting task. In the present study, after molecular identification of a predominant lactic acid bacterium (LAB) isolated from the natural honey, its probiotic properties and antifungal effect were investigated. Then, the antibacterial (spot method) and antifungal (overlay method) activities of the LAB isolate were evaluated against some foodborne microorganisms. Sequencing results of the PCR products led to the identification of Enterococcus faecium. Survival rate of the isolate in simulated gastrointestinal conditions was equal to 20.68%, and its antibacterial and antifungal effects on Salmonella enterica and Aspergillus niger were also 31.06 and 32.35% inhibition, which were significantly (P<0.05) higher than the other foodborne indicators studied. Furthermore, the isolate had a proper antibiotic resistance profile, and it had no hemolytic activity. Auto-aggregation ability of the isolate was also equal to 32.34%, and its co-aggregation with Escherichia coli, S. enterica, Listeria monocytogenes and Bacillus cereus was 34.29, 21.35, 15.58 and 14.98%, respectively. Based on the results, it can be concluded that the E. faecium isolated from honey can be used as probiotic and/or protective culture in food industry.
_||_
بررسی برخی از ویژگیهایEnterococcus faecium جدا شده از عسل طبیعی
چکیده
مطالعه خصوصیات میکروارگانیسمهای موجود در اکوسیستمهای غذایی که کمتر مورد مطالعه قرار گرفتهاند، همواره جالب توجه بوده است. در این پژوهش، پس از شناسایی مولکولی باکتری اسید لاکتیک غالب جدا شده از عسل طبیعی، ویژگیهای پروبیوتیکی آن مورد ارزیابی قرار گرفت. سپس اثرات ضد باکتریایی (به روش لکهگذاری) و ضد قارچی (به روش کشت دو لایه) جدایه لاکتیکی مذکور در برابر برخی از میکروارگانیسمهای غذازاد بررسی شد. توالییابی محصولات PCR منجر به شناساییEnterococcus faecium گردید. همچنین میزان زندهمانی جدایه مذکور در شرایط شبیهسازی شده دستگاه گوارش معادل 68/20 درصد و اثرات ضدباکتریایی و ضدقارچی آن بر روی Salmonella enterica و Aspergillus niger نیز بهترتیب با 06/31 و 35/32 درصد بازدارندگی به شکل معنیداری (05/0P<) نسبت به سایر عوامل باکتریایی و قارچی مورد مطالعه بیشتر بود. علاوه بر این، جدایه لاکتیکی از الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی مناسبی برخوردار بود و هیچگونه فعالیت همولیزی نداشت. همچنین قابلیت خود اتصالی آن نیز معادل 32/34 درصد و میزان دگراتصالی جدایه مذکور باEscherichia coli ، S. enterica، Listeria monocytogenes و Bacillus cereus بهترتیب معادل 29/34، 35/21، 58/15 و 98/14درصد بود. بر اساس نتایج پژوهش حاضر میتوان ازE. faecium جدا شده از عسل به عنوان کشت محافظت کننده در صنایع غذایی استفاده نمود.
واژههای کلیدی: جدایه لاکتیکی غالب، قابلیت دگر اتصالی، فعالیت ضد میکروبی، کشت محافظت کننده.
مقدمه
پروبیوتیکها میکروارگانیسمهای زنده‌ای هستند که در صورت مصرف به تعداد کافی، اثرات سلامتیبخش در میزبان به جای می‌گذارند. تحمل شرایط نامساعد دستگاه گوارش توسط این میکروارگانیسمها باعث حفظ فلور میکروبی روده در حالت طبیعی، محافظت در برابر میکروارگانیسمهای بیماریزای معدهای-روده‌ای و ارتقاء سیستم ایمنی میشود. این گروه از میکروارگانیسمها نقش مهمی در بازدارندگی از عفونت‌ها نیز دارند (Saarela et al., 2000; Saad et al., 2013).
زندهمانی باکتریهای پروبیوتیک در شرایط شبیهسازی شده دستگاه گوارش، شرط اصلی جهت ایفای نقش عملکردی آنها و یکی از چالشهای مهم صنعت فرآوردههای پروبیوتیک بهشمار میرود. کاربرد صنعتی و نقش سلامتیبخش این باکتریها منوط به حفظ زندهمانی آنها طی فرآیند و تحت شرایط تنشزای محیطی دستگاه گوارش است. این میکروارگانیسمها برای اینکه بتوانند نقش فراویژه خود را ایفا نمایند باید بهصورت زنده، فعال و به تعداد کافی به روده برسند. علاوه بر این، نسبت به اسید معده و نمکهای صفراوی روده کوچک مقاوم باشند. این باکتریها در مواجهه با هرگونه تغییر ناگهانی در یک یا چند عامل محیطی که بر رشد یا بقای آنها موثر باشد با بیان ژنهای ویژه و سنتز پروتئینهای مرتبط، امکان رویارویی با تغییرات ناخواسته و محافظت از سلول را فراهم میسازند (Fernández et al., 2003).
عسل، منبع مناسبی از باکتریهای اسیدلاکتیک با خاصیت پروبیوتیکی است زیرا اولیگوساکاریدها و فروکتوالیگوساکاریدهای پریبیوتیک مختلفی دارد که زندهمانی این باکتریها را افزایش می‌دهند. همچنین pH پایین این محصول به دلیل وجود اسیدهای آلی مختلف نظیر استیک، بوتیریک و سیتریک، شرایط را برای زندهمانی باکتریهای اسید لاکتیک مساعد می‌سازد. در کنار اثر محافظت کنندگی عسل به دلیل وجود کربوهیدرات‌های پیچیده، قندهای احیا کننده، ترکیبات فنلی و آنتیاکسیدانی آن نیز موجب کاهش پتانسیل احیا شده که این امر برای رشد باکتریهای بی‌هوازی مانند Bifidobacterium ها مهم است (Hamdy et al., 2017).
تاکنون در مطالعاتی ویژگیهای پروبیوتیکی میکروارگانیسمهای جدا شده از عسل و زنبور عسل، مورد ارزیابی قرار گرفته است. به عنوان مثال، Landry و همکاران (2018) زندهمانی Lactobacillus plantarum های جدا شده از عسل را در طی نگهداری عسل تلقیح شده با آنها مورد بررسی قرار دادند. این محققین، دلیل حضور باکتریهای مذکور را در عسل به وجود ترکیبات اولیگوساکاریدی (فروکتو اولیگوساکارید و گلوکو اولیگوساکارید) نسبت دادند. Aween و همکاران (2012) پس از جداسازی شش سویهLactobacillus acidophilus از 13 نمونه عسل، گزارش نمودند که هر شش سویه مورد آزمایش، دارای فعالیت ضد باکتریایی در برابر Staphylococcus aureus، Staphylococcus epidermis و Bacillus subtilis بودند. بر اساس مطالعات Asama و همکاران (2015) مشخص گردید که Lactobacillus kunkeei جدا شده از عسل سبب افزایش تولید ایمونوگلوبین A در موشهای تحت تیمار شد. همچنین Esawy و Danial(2012) ضمن بررسی ویژگیهای باکتریهای جدا شده از عسل شامل خاصیت ضد میکروبی، مقاومت به شرایط شبیهسازی شده دستگاه گوارش و مقاومت آنتیبیوتیکی آنها دریافتند که جدایههای مختلف، توانایی تحمل شرایط اسیدی را به مدت 3 ساعت داشتند اما مقدار کاهش جمعیت آنها متفاوت بود. همچنین تمامی جدایهها خاصیت ضد باکتریایی علیه Pseudomonas aeruginosa و S. aureus نشان دادند. Olofsson و Vásquez (2008) پس از بررسی و شناسایی جمعیت میکروبی باکتریهای اسید لاکتیک معده زنبور عسل دریافتند که این باکتریها از انواع مختلف گیاهان، منشاء گرفته و در بخشهای مختلف آناتومی زنبورها و لارو آنها یافت میشوند.
اکوسیستمهای غذایی تحت تنش نظیر عسل طبیعی که فلور میکروبی آن کمتر مورد مطالعه قرار گرفته ممکن است حاوی باکتریهای اسید لاکتیک با قابلیت‌های ضد میکروبی و پروبیوتیکی جالب توجه باشند. ضمن اینکه بر اساس بررسی منابع صورت گرفته تا کنون گزارشی در خصوص ویژگیهای ضد میکروبی و پروبیوتیکی فلور لاکتیکی عسل طبیعی در کشور گزارش نشده است. لذا هدف از پژوهش حاضر، ارزیابی ویژگیهای پروبیوتیکی باکتری اسیدلاکتیک غالب جداشده از عسل بود.
مواد و روشها
مواد خام، محیطهای کشت میکروبی و مواد شیمیایی
عسل طبیعی (وحشی) مورد استفاده در این پژوهش از جنگلهای هیرکانی تهیه شده و خصوصیات آن، مطابق با آزمونهای استاندارد ملی ایران (2014) ارزیابی گردید. مواد شیمیایی و محیطهای کشت مصرفی نیز از شرکت مرک آلمان و کشتهای لیوفیلیزه باکتریها و قارچهای شاخص شامل E. coli PTCC 1399، B. cereus PTCC 1015، S. enterica PTCC 1709، S. aureus PTCC 1112، L. Monocytogenes PTCC 1298 و PTCC 5012 A. niger از کلکسیون میکروبی سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، تهیه و سپس در محیط کشت مناسب، فعالسازی شدند.
جداسازی باکتریهای اسید لاکتیک غالب از عسل
10 گرم عسل پس از یک مرحله غنیسازی در محیط کشت De Man, Rogosa and sharpe agar (MRS) براث (گرمخانهگذاری در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت) به صورت متوالی، رقیق شده و سپس کشت داده شد. در ادامه، آزمونهای رنگآمیزی گرم و کاتالاز برای تایید اولیه جدایه مورد استفاده قرار گرفت.
ارزیابی زندهمانی جدایه لاکتیکی در تیمار متوالی اسید و صفرا
باکتری جدا شده ابتدا تحت شرایط اسیدی با 2 pH =به مدت 90 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار گرفته و بلافاصله به آن نمک صفراوی با غلظت 3/0 درصد در 6 pH = اضافه گردیده و مجددا به مدت 90 دقیقه در دمای مشابه گرمخانهگذاری شد. پس از تهیه رقت‌های متوالی، سوسپانسیون مذکور به صورت سطحی کشت داده شد. پس از 24 ساعت گرمخانهگذاری در 37 درجه سانتیگراد، کلنی‌ها شمارش شده و درصد زندهمانی نسبت به نمونه شاهد (تیمار نشده) محاسبه گردید (Rolim et al., 2015).
شناسایی مولکولی جدایه لاکتیکی
ابتدا از تک پرگنه خالص جدايه لاکتيکي، DNA استخراج شده (کیت استخراج بیونیر، کره جنوبی) و سپس توسط PCR با پرايمرهای اختصاصي F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG و R: GGTTACCTTGTTACGACTT تکثير (ترموسایکلر کوربت، استرالیا) و متعاقبا محصولات PCR با طول 1500 جفت باز، پس از الکتروفورز (ژل آگارز 5/1 درصد، ولتاژ 90 به مدت 25 دقیقه)، توالي‌يابي (بیونیر، کره جنوبی) شد. مقادیر واکنشگرهای PCR و شرایط دمایی تکثیر مطابق روش Abnous و همکاران (2009) اعمال شد (Abnous et al., 2009).
بررسی قابلیت همولیز خون توسط جدایه لاکتیکی
برای این منظور، جدایه لاکتیکی بر روی سطح محیط کشت Blood آگار حاوی 5 درصد خون تازه گوسفندی، کشت داده شده و پس از 48 ساعت گرمخانهگذاری در 37 درجه سانتیگراد، ایجاد هاله و تغییر رنگ در محیط کشت بررسی شد (Angmo et al., 2016).
الگوی مقاومت جدایه لاکتیکی نسبت به آنتیبیوتیکهای رایج
بدین منظور ابتدا 200 میکرولیتر از کشت 24 ساعته باکتری اسید لاکتیک به محیط کشت MRS آگار یک درصد (نیمه جامد) اضافه گردید. سپس مخلوط مذکور بر روی سطح پلیت‌های از پیش آماده شده حاوی 15 میلیلیتر MRS آگار 5/1 درصد ریخته شد. در ادامه، دیسک‌های آنتیبیوتیک (مطابق جدول1) بر روی سطح هر پلیت قرار گرفت. پس از 24 ساعت گرمخانهگذاری در 37 درجه سانتیگراد، قطر هاله عدم رشد در اطراف دیسک‌ها اندازه‌گیری شده و با توجه به قطر هاله عدم رشد کمتر یا مساوی 14 میلیمتر (مقاوم)، 15 تا 19 میلیمتر(حساسیت نسبی) و بیشتر از 20 میلیمتر (حساس)، مقاومت جدایههای مخمری در برابر آنتیبیوتیکهای مورد استفاده تعیین گردید (Rojo-Bezares et al., 2006).
بررسی قابلیت خود اتصالی جدایه لاکتیکی
برای ارزیابی قابلیت خود اتصالی جدایه لاکتیکی، چهار میلیلیتر از سوسپانسیون کشت فعال آن در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت، گرمخانهگذاری و جذب نوری این سوسپانسیون در زمانهای صفر و 24 ساعت در طول موج 600 نانومتر (اسپکتروفتومتر اینسترومنتز، انگلیس) خوانش و سپس میزان قابلیت خوداتصالی بر اساس رابطه ذیل محاسبه گردید. در این رابطه At مقدار جذب 24 ساعته و A0 مقدار جذب در ساعت صفر است (Zhang et al., 2011).
[1-(At/A0)]*100
بررسی قابلیت دگر اتصالی جدایههای لاکتیکی
برای ارزیابی خاصیت دگراتصالی جدایه لاکتیکی با E. coli ، S. enterica، L. monocytogenes و B. cereus به عنوان عوامل بیماریزای غذازاد، مخلوطی از حجم‌های مساوی سوسپانسیون جدایه لاکتیکی و سوسپانسیون هر باکتری بیماریزا تهیه و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 4 ساعت گرمخانهگذاری شد. سپس جذب هر یک از باکتریهای مذکور و مخلوط آنها در 600 نانومتر خوانده شده و از طریق معادله ذیل، میزان خاصیت دگراتصالی محاسبه گردید. در این رابطه AP: جذب سوسپانسیون باکتری بیماریزا، Alac: جذب سوسپانسیون جدایه لاکتیکی و Amix: جذب مخلوط سوسپانسیون جدایه لاکتیکی و باکتری بیماریزا پس از 4 ساعت گرمخانهگذاری میباشد (Zhang et al., 2011).
100*[2/( [(AP+Alac)/2-(Amix)/AP+Alac
ارزیابی خاصیت ضد باکتریایی جدایه لاکتیکی
بدین منظور ابتدا کشت فعال 24 ساعته جدایه انتخابی در مرکز پلیت حاویMRS آگار، لکهگذاری شده و پس از 72 ساعت گرمخانهگذاری در 37 درجه سانتیگراد، لایه دوم حاوی محیط کشت BHI آگار (Brain heart infusion) و هر باکتری بیماریزا (L. monocytogenes، E. coli ، B. cereus و S. enterica) با جمعیت colony forming units (CFU)/mL 105 بر روی لایه اول ریخته شده و پس از 24 ساعت گرمخانهگذاری در 37 درجه سانتیگراد، قطر هاله عدم رشد تعیین گردید (Aween et al., 2012).
ارزیابی اثر ضد قارچی جدایه لاکتیکی
به منظور ارزیابی خاصیت ضد قارچی جدایه لاکتیکی علیه A. niger از روش کشت دو لایه استفاده شد. از باکتری فعال شده با استفاده از سواب استریل دو خط موازی به طول 3 سانتی‌متر و فاصله 3 سانتی‌متر از یکدیگر کشیده شد و به مدت 72 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری گردید. سپس لایه دوم، حاوی محیط کشت PDA (Potato dextrose agar) و اسپور قارچ با تعداد 104 در میلیلیتر به آرامی بر روی پلیت‌های حاوی باکتری ریخته شد و به مدت 5 روز گرمخانهگذاری در دمای 25 درجه سانتیگراد صورت گرفت. قطر هاله عدم رشد در روز پنجم با عکسبرداری به کمک نرمافزارImage J (نسخه 1.42e) تعیین شد (Magnusson et al., 2003).
آنالیز آماری نتایج
تمامی آزمون‌ها در سه تکرار، اجرا شده و نتایج حاصل از این پژوهش با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه (One Way ANOVA) با مقایسات زوجی حداقل اختلاف معنیداری (LSD) در سطح معنیداری 05/0P< تجزیه و تحلیل گردید. برای آنالیز آماری و ترسیم نمودارها نیز به ترتیب نرم‌افزارهای SPSS نسخه 19 و Excel نسخه 2010 مورد استفاده قرار گرفتند.
نتایج
جداسازی و غربالگری باکتریهای اسید لاکتیک عمده موجود در عسل
عسل مورد استفاده در این پژوهش، حاوی 7/12 درصد رطوبت، 6/2 درصد ساکارز، 25/0 درصد خاکستر، pH معادل 6/3، فعالیت دیاستازی 3/15 واحد، نسبت فروکتوز به گلوکز 9/0 و دارای 2/78 درصد قند احیاء کننده قبل از هیدرولیز بود. درصد زندهمانی باکتری اسید لاکتیک جدا شده از عسل طبیعی 09/3 ± 68/20 بود. بر اساس نتایج آزمونهای بیوشیمیایی و مورفولوژی، جدایه لاکتیکی نیز یک باکتری گرم مثبت، کاتالاز منفی و کروی شکل بود.
شناسایی مولکولی جدایه لاکتیکی منتخب
ژل الکتروفورز محصولات PCR منجر به تایید تکثیر اختصاصی توالی هدف 1500 جفتبازی در DNA ژنومی جدایه لاکتیکی در مقایسه با نمونه کنترل منفی و کنترل مثبت شد (شکل1). سرانجام بر اساس نتایج توالییابی محصولات PCR و همردیفی آنها با دادههای موجود در پایگاه اطلاعاتی NCBI جدایه لاکتیکی،E. faecium (96 درصد تشابه) شناسایی گردید.
شکل 1- ژل الکتروفورز محصولات PCR. لاین1: لدر 100 جفت بازی، لاین2: کنترل منفی، لاین3: کنترل مثبت و لاین4: DNA تکثیر یافته از جدایه لاکتیکی.
قابلیت همولیز خون توسط جدایه لاکتیکی
فعالیت همولیزی جدایهE. faecium در پژوهش حاضر از نوع گاما (فاقد فعالیت همولیزی) بود.
مقاومت جدایه لاکتیکی به آنتیبیوتیکهای رایج
بر اساس نتایج مقاومت آنتیبیوتیکی که در جدول 1 نشان داده شده است، جدایه لاکتیکی نسبت به آنتیبیوتیکهای استرپتومایسین، کانامایسین، اسید نالیدیکسیک، ونکومایسین و جنتامایسین، مقاوم بود اما نسبت به سفازولین، سفالوتین، سفتریاکسون و ایمیپنم حساسیت نسبی و در برابر پنیسیلین حساسیت نشان داد.
جدول 1- مقاومت باکتری اسید لاکتیک در برابر برخی از آنتیبیوتیکهای رایج بر اساس آزمون انتشار در دیسک
آنتی بیوتیک (میکروگرم) | قطر هاله عدم رشد (میلیمتر) | مقاومت نسبی |
پنیسیلین (10) | 38/18±11/2 a | حساس |
سفازولین (30) | 66/15±38/0 b | حساسیت نسبی |
سفالوتین (30) | 99/10±26/0 c | حساسیت نسبی |
سفتریاکسون (30) | 29/10±01/0 c | حساسیت نسبی |
ایمیپنم (10) | 73/6±12/0 d | حساسیت نسبی |
استرپتومایسین (10) | 00/0±00/0 e | مقاوم |
اسید نالیدیکسیک (30) | 00/0±00/0 e | مقاوم |
جنتامایسین (10) | 00/0±00/0 e | مقاوم |
ونکومایسین (30) | 00/0±00/0 e | مقاوم |
کانامایسین (30) | 00/0±00/0 e | مقاوم |
حروف متفاوت، نشاندهنده تفاوت معنیدار در سطح 05/0P< هستند.
قابلیت خود اتصالی و دگراتصالی جدایه لاکتیکی
میزان قابلیت خود اتصالیE. faecium معادل 37/1±32/34 درصد بود. همچنین میزان قابلیت دگر اتصالی جدایه لاکتیکی باE. coli ، S. enterica، L. monocytogenes و B. cereus بهترتیب معادل 13/1± 29/34، 16/1± 35/21، 04/1± 58/15 و 91/0± 98/14 درصد بود. براساس این یافتهها، قابلیت دگراتصالی جدایه لاکتیکی در برابر E. coli به شکل معنیداری (05/0P<) از سایر باکتریهای موردمطالعه بیشتر بود. درحالیکه بین سویههای L. monocytogenes و B. cereus تفاوت معنیداری مشاهده نگردید.
شکل 2-میزان دگراتصالی جدایه لاکتیکی در برابر شاخصهای باکتریایی غذازاد. حروف ناهمسان، نشان دهنده تفاوت معنیدار در سطح 05/0p< میباشد.
خاصیت ضد باکتریایی جدایه لاکتیکی
اثر ضدباکتریایی جدایه لاکتیکی در برابر E. coli ، S. enterica، L. monocytogenes و B. cereus بهترتیب معادل 85/4 ± 97/29، 64/4 ± 01/31، 85/2 ± 64/25 و 64/0 ± 45/25 ثبت شد اما اختلاف معنیداری (05/0<P) بین آنها مشاهده نشد. همانطور که در شکل3 مشاهده میشود، بیشترین میزان بازدارندگی جدایه لاکتیکی بر روی S. entericaمشاهده گردید.
شکل 3- مقایسه درصد بازدارندگی جدایه لاکتیکی بر روی باکتریهای غذازاد مورد مطالعه. حروف متفاوت، نشان دهنده تفاوت معنیدار در سطح 05/0P< هستند.
اثر ضد قارچی جدایه لاکتیکی
اثر ضد قارچی جدایه لاکتیکی در برابر A. nigerبراساس نتایج آزمون کشت دو لایه (شکل3) نشان داد که میزان بازدارندگی از رشد این قارچ 27/1 ± 35/32 درصد بود.
شکل 4- اثر ضد قارچی جدایه لاکتیکی (ب) پس از پنج روز گرمخانهگذاری در مقایسه با نمونه شاهد (الف) در آزمون کشت دو لایه در برابرAspergillus niger.
بحث
تاکنون، مطالعاتی در رابطه با ارزیابی میزان زندهمانی باکتریهای اسید لاکتیک جدا شده از عسل در شرایط شبیهسازی شده دستگاه گوارش صورت گرفته است. بهعنوان مثال، Wahab و همکاران (2018) ضمن بررسی میزان زندهمانی باکتریهای اسید لاکتیک موجود در عسل دریافتند که این باکتریها تا کاهش pH به حدود 2-5/1، توانستند تا بیش از 75 درصد زندهمانی خود را حفظ نموده و در شرایط قلیایی روده نیز حدود 77 درصد زندهمانی داشتند. Ruiz-Moyano و همکاران (2019) به منظور ارزیابی قابلیت زندهمانی جدایه لاکتیکی در شرایط شبیهسازی شده دستگاه گوارش از pHهای بین 3-5/2 به مدت 2 ساعت استفاده کرده و سپس pH را به 8 افزایش دادند. محققین مذکور دریافتند که تمام باکتریهای اسید لاکتیک، pH معادل3 را تحمل نموده ولی قادر به رشد در pH معادل 5/2 نبودند. علاوه بر این، 20 جدایه از 116 جدایه مذکور توانستند در pH معادل 75/2 تا سطح قابل قبولی زنده بمانند. مقاومت بالای برخی از باکتریهای اسید لاکتیک به pH پایین را میتوان به تولید ترکیباتی مانند اگزوپلیساکاریدها نسبت داد که از اثر اسید بر روی غشای سلولی آنها ممانعت میکند. همچنین باکتریهای اسید دوست در pH های پایینتر از محدوده رشدشان، ترکیبات اسیدی محیط را به وسیله آنزیمهای دکربوکسیلاز، هیدرولیز و pH محیط را تعدیل میکنند. علاوه بر این، تأثیر هیدرولیز نمکهای صفراوی (آنزیمهای تجزیه کننده صفرا و آمینو اسید دکربوکسیلاز) در مقاومت باکتریها نسبت به نمکهای صفراوی و شرایط قلیایی موثر است (Vinderola and Reinheimer. 2003).
ترکیبات ضد میکروبی طبیعی موجود در عسل (آب اکسیژنه، ترکیبات آنتیاکسیدان) و فشار اسمزی بالا به واسطه محتوای بالای ترکیبات قندی از یک سو و همچنین ویژگیهای پریبیوتیکی عسل از سوی دیگر بر تنوع میکروبی آن موثر است. ترکیبات فنلی موجود در عسل، اثرات مفیدی بر رشد باکتریهای اسید لاکتیک دارند. این باکتریها بخش کوچکی از میکروبیوتای محصولات دارای منشا گیاهی هستند و لذا به واسطه فعالیت‌های متابولیکی مناسب عموما نسبت به شرایط درونی مواد غذایی وفق پیدا میکنند. آنها همچنین توانایی زندهمانی در شرایط میکروآیروفیل و غنی از ریز مغذی‌ها شامل قندها و آمینو اسیدها را داشته و به همین سبب، عسل منبع مهمی از انرژی برای رشد مناسب این باکتریها محسوب میشود (Nutter et al., 2016). Janashia و همکاران (2018) باکتریهای متفاوتی مانند Fructobacillus fructosus، L. kunkeei، Lactobacillus casei را از دستگاه گوارش زنبور عسل جداسازی کردند. Vásquez و همکاران (2012) نیز به مطالعه تنوع میکروبی در زنبور عسل اشاره نموده و آن را عامل اصلی محافظت زنبور در برابر میکروارگانیسمهای بیماریزا و حافظ سلامتی زنبورها معرفی کردند. بر این اساس، Lactobacillus ها و Bifidobacterium ها از جنس‌های اصلی موجود در دستگاه گوارش زنبور عسل بودند. Ibarguren و همکاران در سال 2010 موفق به جداسازی چندین گونهE. faecium از عسل طبیعی شده و بیان داشتند که این گونه به دلیل حضور در حشرات، گیاهان و گل‌ها در عسل‌های طبیعی رایج است. بر اساس یافتههایBarbosa و همکاران (2014)، E. faecium پروبیوتیک جدا شده از موادغذایی تخمیری کشور پرتغال از قابلیت زندهمانی مناسبی برخوردار بوده و سایر ویژگیهای پروبیوتیکی مطلوبی نیز داشت.
مطالعات صورتگرفته در خصوص میزان مقاومت آنتیبیوتیکی جدایههای لاکتیکی پروبیوتیک حاکی از مقاومت متفاوت آنها در مقابل هر کدام از آنتیبیوتیکها است. براساس یافتههای Sakandar و همکاران (2019) هیچ کدام از جدایههای لاکتیکی نسبت به آنتیبیوتیکهای مورد آزمون، شامل سیپروفلوکسازین، جنتامایسین، نووبیوسین، ونکومایسین و سفتریاکسون مقاومتی نداشته و همه جدایهها در مقابل نووبیوسین دارای مقاومت نسبی بودند. Aween و همکاران (2012) پس از بررسی فعالیت ضد باکتریایی سویههای L. acidophilus جدا شده از عسل در مالزی در مقابل چند آنتیبیوتیک رایج دریافتند که باکتریهای مذکور، مقاومت زیادی نسبت به چند آنتیبیوتیک مورد آزمون داشتند و قطر هاله عدم رشد آنها بین 25-2 میلیمتر، متغیر بود. تعیین مقاومت آنتیبیوتیکی جدایههای پروبیوتیک، یک نگرانی جهانی است چراکه نحوه مقاومت آنها میتواند اثر بخشی درمان آنتیبیوتیکی را کاهش دهد. انتقال ژنهای مقاومت آنتیبیوتیکی از باکتریهای پروبیوتیک به باکتریهای همزیست یا بیماریزای دستگاه گوارش، مهمترین نگرانی مرتبط با کاربرد این باکتریهای مفید در صنایع غذایی است. بنابراین، الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی میکروارگانیسمها باید به دقت بررسی شود. (EFSA. 2012).
قابلیت اتصال در باکتریهای اسیدلاکتیک نیز توسط محققین مختلفی مورد بررسی قرار گرفتهاست. بهعنوان مثال، در مطالعه Angmo و همکاران (2016) L. plantarum با قابلیت خود اتصالی 73 درصد بیشترین میزان خود اتصالی را نسبت به سایر جدایههای لاکتیکی مورد مطالعه داشت. همچنین قابلیت خود اتصالیL. plantarum در پژوهش Collado و همکاران در سال 2008 نیز پس از دو ساعت گرمخانهگذاری در 37 درجه سانتیگراد، 7/21 درصد گزارش شد. در رابطه با قابلیت دگر اتصالی جدایههای لاکتیکی، Abushelaibi و همکاران (2017) گزارش نمودند که میزان دگراتصالی جدایه لاکتیکی موردآزمون آنها در برابر E. coli، پس از 2 و 4 ساعت در دمای گرمخانهگذاری 37 درجه سانتیگراد نسبت به 20 درجه سانتیگراد افزایش یافت. اتصال باکتریهای هم نوع به یکدیگر سبب ایجاد ساختار یکپارچهای میشود که در اتصال پروبیوتیکها به سلولهای اپیتلیال روده و تجمع و محافظت از دستگاه گوارش نقش دارد. عامل اصلی دراین اتصال، پروتئینهای سطح باکتریهای اسید لاکتیک و اسیدهای تئیکوئیک بوده و شروع این واکنش به ویژگی آبگریزی دیواره سلولی باکتریهای اسید لاکتیک بستگی دارد. آبگریزی سطحی سلول به عنوان یک عامل فیزیکوشیمیایی، سبب ایجاد اتصال این باکتریها به پوشش دستگاه گوارش از یک سو و اتصال به باکتریهای بیماریزا از سوی دیگر میگردد. خاصیت آبگریزی دیواره سلولی در باکتریهای اسید لاکتیک، یکسان نبوده و بسته به جنس و نژاد آنها متفاوت میباشد (Grześkowiak و همکاران، 2011). قابلیت اتصال در باکتریها به دو صورت خود اتصالی (اتصال سویههای باکتریایی هم نوع) و دگر اتصالی (اتصال سویههای باکتریایی متفاوت) موردمطالعه قرار میگیرد. علاوه براین، اتصال سویههای باکتریایی متفاوت، سبب واکنش پروبیوتیکها با عوامل بیماریزا و همچنین ممانعت از لانه‌گزینی آنها در دستگاه گوارش میگردد (Janković et al., 2012).
اثرات ضدباکتریایی جدایههای لاکتیکی پروبیوتیک نیز در مطالعات متعددی مورد بررسی قرار گرفته است. بهعنوان مثال، Hladíková و همکاران (2012) نشان دادند که Pediococcus pentosaceus در برابر B. subtilis، E. coli، L. monocytogenes و S. aureus اثر مهار کنندگی داشت. ویژگی بازدارندگی Pediococcus در برابر میکروارگانیسمهای مذکور به تولید اسیدهای آلی و برخی از پپتیدهای ضد میکروبی شناخته شده نظیر باکتریوسینها نسبت داده شد. طی تحقیقات Divya و همکاران در سال 2012 مشخص شد که Weissella cibaria بر روی S. aureus و E. coli تاثیر بازدارندگی داشت. بر اساس مطالعات Angmo و همکاران (2016) نیز یکی از زیرگونههایL. plantarum دارای اثر ممانعت کنندگی در برابر B. cereus، S. aureus و Shigella dysenteriaeبود و زیرگونه دیگری ازL. plantarum اثر ممانعتکنندگی ضعیفی در برابر E. coli از خود نشان داد. طی مطالعه Cizeikiene و همکاران در سال 2013 مشخص شد که متابولیتهای تولید شده به وسیله P. pentosaceus و Pediococcus acidilictici دارای خاصیت بازدارندگی بر روی B. subtilis ، L. monocytogenes و E. coli بودند. مهمترین عوامل موثر در خاصیت ضد میکروبی باکتریهای اسید لاکتیک شامل رقابت در جذب مواد مغذی، تولید اسیدهای آلی و کاهش pH، تولید سایر ترکیبات ضد میکروبی و اثر متقابل بین اسیدهای آلی و متابولیتهای ضد میکروبی دیگر است (Angmo et al., 2016). علاوه بر این، معمولا این متابولیتها در شرایط اسیدی از نفوذپذیری بیشتری برخوردار میباشند (Şimşek et al., 2006).
Bulgasem و همکاران (2016) اثرات ضد قارچی چهار باکتری اسید لاکتیک جدا شده از عسل را مورد بررسی قرار دادند. در پژوهش مذکور، تاثیر تیمارهای حرارتی و آنزیمی روماند فاقد سلول این باکتریها بر خاصیت ضد قارچی آنها علیه کاندیدا مطالعه شد. این محققین دریافتند که تیمار حرارتی، اثر ضد قارچی روماند فاقد سلول برخی از باکتریها را به طور کامل از بین برد. علاوه بر این، تاثیر آنزیمهای پروتئیناز و RNAآز در برخی از باکتریها موجب افزایش اثر ضدقارچی و در برخی موجب کاهش این اثر شد. همچنین Poornachandra و همکاران (2019) گزارش کردند که چندین ترکیب ضد قارچی موجود در روماند فاقد سلول L. plantarum بر علیه قارچ آفلاتوکسینزای Aspergillus parasiticus تأثیرگذار هستند. از جمله مکانیسم‌های اثر ترکیبات ضد قارچی تولید شده به وسیله باکتریهای اسید لاکتیک میتوان به مواردی نظیر ممانعت از توسعه، تخریب دیواره هیف و جلوگیری از جوانه‌زنی قارچ اشاره کرد. Shehata و همکاران (2019) با بررسی اثر ضد قارچی باکتریهای اسید لاکتیک دریافتند که با افزایش غلظت روماند فاقد سلول، توده زیستی قارچ و مقدار مایکوتوکسین‌ها کاهش یافته که این امر به ترشح متابولیت‌هایی نظیر اسیدهای چرب اشباع و غیراشباع بلند زنجیر در محیط کشت نسبت داده شد.
همچنین، Wahab و همکاران (2018) پس از مطالعه فعالیت پروبیوتیکی سه باکتری جدا شده از عسل دریافتند که هیچکدام از جدایهها اثر همولیزی نداشتند و فاقد ژنهای اینتروتوکسینزای همولیتیک بودند. Angmo و همکاران (2016) نیز هیچ فعالیت همولیتیکی مرتبط با جدایههای لاکتیکی مورد مطالعه مشاهده نکردند. همولیز سلولهای قرمز خون، نشاندهنده قابلیت بیماریزایی گونههای باکتریایی است. در واقع، تعیین قابلیت همولیز خون، یکی از مهمترین معیارهای انتخاب باکتریهای پروبیوتیک است. یکی از علل همولیز، فعالیت همولیزین و توکسینهایی است که توسط برخی از باکتریهای بیماریزا تولید میگردد. علت دیگر آن، آسیب به غشای سیتوپلاسمی سلولهای قرمز خون بوده که سبب تجزیه و گاها مرگ سلول میشود.
جمعبندی
عسل به واسطه ترکیبات منحصر به فرد خود میتواند حاوی میکروارگانیسمهای متفاوتی باشد که در این اکوسیستم غذایی ویژه تطابق مییابند. لذا جداسازی فلور میکروبی از چنین زیستبومهایی همواره جالبتوجه است. در پژوهش حاضر، E. faecium با قابلیت زندهمانی مناسب در تیمار متوالی اسید و صفرا، عدم همولیز خون، قابلیت خوداتصالی و دگراتصالی مناسب از عسل انتخاب گردید. باکتری مذکور ضمن داشتن اثر ضد باکتریایی مطلوب از قابلیت ضدقارچی مناسبی نیز برخوردار بود. علاوه بر این، فاقد فعالیت همولیزی و دارای الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی مناسب و همچنین قابلیت خود اتصالی بالایی بود. بر اساس نتایج این پژوهش، میتوان ازE. faecium جدا شده از عسل به عنوان کشت پروبیوتیک و یا محافظت کننده در صنایع غذایی استفاده نمود.
Evaluation of probiotic properties of Entrococcus faecium isolated from Natural honey
Investigating some characteristics of Enterococcus faecium isolated from natural honey
Abstract
Characterization of microorganisms isolated from food ecosystems that have been less studied is an interesting task. In the present study, after molecular identification of a predominant lactic acid bacterium (LAB) isolated from the natural honey, its probiotic properties were investigated. Then, the antibacterial (spot method) and antifungal (overlay method) activities of the LAB isolate were evaluated against some foodborne microorganisms. Sequencing results of the PCR products led to the identification of Enterococcus faecium. Survival rate of the isolate in simulated gastrointestinal conditions was equal to 20.68%, and its antibacterial and antifungal effects on Salmonella enterica and Aspergillus niger were also 31.06 and 32.35% inhibition, which were significantly (P<0.05) higher than the other foodborne bacteria and fungi studied. Furthermore, the isolate had a proper antibiotic resistance profile, and it had no any hemolytic activity. Auto-aggregation ability of the isolate was also equal to 32.34%, and its co-aggregation with Escherichia coli, S. enterica, Listeria monocytogenes and Bacillus cereus was 34.29, 21.35, 15.58 and 14.98%, respectively. Based on the results, it can be concluded that the E. faecium isolated from honey can be used as protective culture in food industry.
Keywords: predominant LAB isolate, co-aggregation capability, antimicrobial activity,
Conflict of interest: None declared
Keywords: Lactic isolate of honney, probiotic properties, Antimicrobial effect, Protective culture.
منابع
Abnous K., Brooks S. P., Kwan J., Matias F., Green-Johnson J., Selinger L. B., Kalmokoff M. 2009. Diets enriched in oat bran or wheat bran temporally and differentially alter the composition of the fecal community of rats. J Nutr. 139(11): 2024-2031.
Abushelaibi A., Al-Mahadin S., El-Tarabily K., Shah N. P and Ayyash M. 2017. Characterization of potential probiotic lactic acid bacteria isolated from camel milk. LWT- Food Sci Technol. 79, 316-325.
Angmo K., Kumari A., Savitri D., Bhalla T. C. 2016. Probiotic characterization of lactic acid bacteria isolated from fermented foods and beverage of Ladakh. LWT- Food Sci Technol. 66: 428-435.
Asama T., Arima T. H., Gomi T., Keishi T., Tani H., Kimura Y., Tatefuji T., Hashimoto K. 2015. Lactobacillus kunkeei YB38 from honeybee products enhances IgA production in healthy adults. J Appl Microbiol. 119(3): 818–826.
Aween M. M., Hassan Z., Muhialdin B. J., Eljamel Y. A., Al-Mabrok A. S. W., Lani M. N. 2012. Antibacterial activity of Lactobacillus acidophilus strains isolated from honey marketed in Malaysia against selected multiple antibiotic resistant (MAR) Gram-positive bacteria. J Food Sci. 77(7): M364–M371.
Bakr I., Mohamed T., Tammam A., El-Gazzar F. 2015. Characteristics of bioyoghurt fortified with fennel honey. Int J Curr Microbiol Appl Sci. 4(3): 959-970.
Barbosa J., Borges S., & Teixeira P. 2014. Selection of potential probiotic Enterococcus faecium isolated from Portuguese fermented food. Int j Food Microbiol. 191, 144-148.
Begum S. B., Roobia R. R., Karthikeyan M., Murugappan R. M. 2015. Validation of nutraceutical properties of honey and probiotic potential of its innate microflora. LWT- Food Sci Technol. 60(2): 743–750.
Bulgasem Y. B., Lani M. N., Hassan Z., Yusoff W., Fnaish S. 2016. Antifungal activity of lactic acid bacteria strains isolated from natural honey against pathogenic Candida species. Mycobiology. 44(4): 302-309.
Poornachandra R. K., Deepthi B. V., Rakesh S., Ganesh T., Achar P., Sreenivasa M. Y. 2019. Antiaflatoxigenic potential of cell-free supernatant from Lactobacillus plantarum MYS44 against Aspergillus parasiticus. Probiotics Antimicro. 11(1): 55–64.
Chlebicz A., Śliżewska K. 2019. In vitro detoxification of aflatoxin B1, deoxynivalenol, fumonisins, T-2 toxin and zearalenone by probiotic bacteria from genus Lactobacillus and Saccharomyces cerevisiae yeast. Probiotics Antimicro. 12, 289-301.
Cizeikiene D., Juodeikiene G., Paskevicius A., Bartkiene E. 2013. Antimicrobial activity of lactic acid bacteria against pathogenic and spoilage microorganism isolated from food and their control in wheat bread. Food Control. 31(2): 539-545.
Collado M. C., Meriluoto J., Salminen S. 2008. Adhesion and aggregation properties of probiotic and pathogen strains. Eur Food Res Technol. 226, 1065-1073.
Divya J. B., Varsha K. K., Nampoothiri K. M. 2012. Newly isolated lactic acid bacteria with probiotic features for potential application in food industry. Appl Biochem Biotech. 167, 1314-1324.
El-Nezami H., Kankaanpaa P., Salminen S., Ahokas J. 1998. Physicochemical alterations enhance the ability of dairy strains of lactic acid bacteria to remove aflatoxin from contaminated media. J Food Protect. 61(4): 466–468.
Esawy M. A and Danial E. N. 2012. Evaluation of honey as a new reservior for brobiotic bacteria. Adv Food Sci. 34, 72-81.
European food safety authority. 2012. EFSA panel on additives and products or substances used in animal feed (FEEDAP). Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance. EFSA J.10, 2740.
Fernández M. F., Boris S., Barbes C. 2003. Probiotic properties of human lactobacilli strains to be used in the gastrointestinal tract. J Appl Microbiol. 94(3): 449-455.
Gerbaldo G. A., Barberis C., Pascual L., Dalcero A., Barberis L. 2012. Antifungal activity of two Lactobacillus strains with potential probiotic properties. Fems Microbiol Lett. 332(1): 27–33.
Gharehyakheh S., Hosein A., Rad E., Nateghi L. 2019. Production of GABA ‐ enriched honey syrup using Lactobacillus bacteria isolated from honey bee stomach. J Food Process Pres. 43(8), e14054.
Grześkowiak Ł., Collado M. C., Vesterlund S., Mazurkiewicz J., Salminen S. 2011. Adhesion abilities of commensal fish bacteria by use of mucus model system: quantitative analysis. Aquaculture. 318(1-2): 33-36.
Guimarães A., Santiago A., Teixeira J. A., Venâncio A., Abrunhosa L. 2018. Anti-aflatoxigenic effect of organic acids produced by Lactobacillus plantarum. Int J Food Microbiol. 264: 31–38.
Hamdy A. A., Elattal N. A., Amin M. A., Ali A. E., Mansour N. M., Awad G. E. A., Awad H., Esawy M. A. 2017. Possible correlation between levansucrase production and probiotic activity of Bacillus sp. isolated from honey and honey bee. World J Microb Biot. 33, 1-10.
Hladíková Z., Smetanková J., Greif G., Greifová M. 2012. Antimicrobial activity of selected lactic acid cocci and production of organic acids. Acta Chem Slov. 5(1): 80-85.
Ibarguren C., Raya R. R., Apella M. C., & Audisio M. C. 2010. Enterococcus faecium isolated from honey synthesized bacteriocin-like substances active against different Listeria monocytogenes strains. J Microbiol. 48, 44-52.
ISIRI. 2014. Honey quality standards. ICS: 67.180.10.
Janashia I., Choiset Y., Jozefiak D., Déniel F., Coton E., Moosavi-movahedi A. A., Chanishvili N., Haertlé T. 2018. Beneficial protective role of endogenous lactic acid bacteria against mycotic contamination of honeybee beebread. Probiotics Antimicro. 10, 638-646.
Janković T., Frece J., Abram M., and Gobin I. 2012. Aggregation ability of potential probiotic Lactobacillus plantarum strains. Int J Sanitary Eng Res. 6(1), 19-24.
Kaznowski A., Szymas B., Jazdzinska E., Kazimierczak M., Paetz H., Mokracka J. 2005. The effects of probiotic supplementation on the content of intestinal microflora and chemical composition of worker honey bees (Apis mellifera). J Apicult Res. 44(1): 10–14.
Landry B. K. U., François Z. N., Wang R., Taicheng Z., Li Y. 2018. Viability and stress response of putative probiotic Lactobacillus plantarum strains in honey environment. Probiotics Antimicro. 10, 629-637.
Magnusson J., Strom K., Roos S, Sjogren J., Schnurer J. 2003. Broad and complex antifungal activity among environmental isolates of lactic acid bacteria. Fems Microbiol Lett. 219(1), 129-135.
Mathara J. M., Schillinger U., Kutima P. M., Mbugua S. K., Guigas C., Franz C., Holzapfel W. H. 2008. Functional properties of Lactobacillus plantarum strains isolated from Maasai traditional fermented milk products in Kenya. Curr Microbiol. 56, 315-321.
Nutter J., Fritz R., Amelia I. S., Miriam O. I. 2016. Effect of honey supplementation on sourdough: Lactic acid bacterial performance and gluten microstructure. LWT- Food Sci Technol. 77: 119-125.
Ogunbanwo S. T., Sanni A. I., Onilude A. A. 2003. Characterization of bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum F1 and Lactobacillus brevis OG1. Afr J Biotechnol. 2(8): 219-227.
Olofsson T. C., Vásquez A. 2008. Detection and identification of a novel lactic acid bacterial flora within the honey stomach of the honeybee Apis mellifera. Curr Microbiol. 57, 356-363.
Picard C., Fioramonti J., Francois A., Robinson T., Neant F., Matuchansky C. 2005. Bifidobacteria as probiotic agents–physiological effects and clinical benefits. Aliment Pharm Ther. 22(6), 495-512.
Rojo-Bezares B., Saenz Y., Poeta P., Zarazaga M., Ruiz-Larrea F., Torres C. 2006. Assessment of antibiotic susceptibility within lactic acid bacteria strains isolated from wine. Int J Food Microbiol. 111(3), 234-240.
Rolim F. R. L., dos Santos K. M. O., de Barcelos S. C., do Egito A. S., Ribeiro T. S., da Conceição M. L., Magnani M., Oliveira M., Queiroga R de C. R. E. 2015. Survival of Lactobacillus rhamnosus EM1107 in simulated gastrointestinal conditions and its inhibitory effect against pathogenic bacteria in semi-hard goat cheese. LWT- Food Sci Technol. 63(2): 807–813.
Ruiz-Moyano S., dos Santos M. T. P. G., Galván A. I., Merchán A. V., González E., de Guía Córdoba M., & Benito M. J. 2019. Screening of autochthonous lactic acid bacteria strains from artisanal soft cheese: Probiotic characteristics and prebiotic metabolism. LWT- Food Sci Technol. 114, 108388.
Sakandar H. A., Kubow S., Azadi B., Faryal R., Ali B., Ghazanfar S., Quraishi U. M., Imran M. 2019. Wheat fermentation with Enterococcus mundtii QAUSD01 and Wickerhamomyces anomalus QAUWA03 consortia induces concurrent gliadin and phytic acid degradation and inhibits gliadin toxicity in Caco-2 monolayers. Front Microbiol. 9, 3312.
Saad N., Delattre C., Urdaci M., Schmitter J. M., and Bressollier P. 2013. An overview of the last advances in probiotic and prebiotic field. LWT- Food Sci Technol. 50(1), 1-16.
Saarela M., Mogensen G., Fonden R., Mättö J., and Mattila-Sandholm T. 2000. Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties. J Biotechnol. 84(3), 197-215.
Shehata M. G., Badr A. N., El Sohaimy S. A., Asker D., Awad T. S. 2019. Characterization of antifungal metabolites produced by novel lactic acid bacterium and their potential application as food biopreservatives. Ann Agric Sci. 64(1): 71–78.
Şimşek Ö., Çon A. H., Tulumogˇlu Ş. 2006. Isolating lactic starter cultures with antimicrobial activity for sourdough processes. Food Control. 17(4): 263-270.
Sornplang P., Piyadeatsoontorn S. 2016. Probiotic isolates from unconventional sources: a review. J Anim Sci Techno. 58(1), 1-11.
Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. 2013. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 30(12): 2725-2729.
Vásquez A., Forsgren E., Fries I., Paxton R. J., Flaberg E., Szekely L., Olofsson T. C. 2012. Symbionts as major modulators of insect health: lactic acid bacteria and honeybees. Plos One. 7(3): e33188.
Vinderola C. G., Reinheimer A. 2003. Lactic acid starter and probiotic bacteria: a comparative “in vitro” study of probiotic characteristics and biological barrier resistance. Food Res Int. 36(9-10): 895-904.
Wahab W. A. A., Saleh S. A., Karam E. A., Mansour N. M., Esawy M. A. 2018. Possible correlation among osmophilic bacteria, levan yield, and the probiotic activity of three bacterial honey isolates. Biocatal Agric Biotechnol. 14: 386-394.
Zhang Y., Zhang L., Du M., Yi H., Guo C., Tuo Y., Han X., Li J., Zhang L., Yang L. 2011. Antimicrobial activity against Shigella sonnei and probiotic properties of wild lactobacilli from fermented food. Microbiol Res. 167(3), 27-31.
Zinedine A., Faid M., Benlemlih M. 2005. In vitro reduction of aflatoxin B1 by strains of lactic acid bacteria isolated from Moroccan sourdough bread. Int J Agric Biol. 7(1), 67-70.