Investigating the level of IP-10 gene expression in the peripheral blood of patients with severe type of corona virus (Covid-19) compared to the mild and recovered type of the disease

Subject Areas : Developmental biology of plants and animals , development and differentiation in microorganisms

Sanaz Paikar ¹ , naghmeh Bahrami ² , robab rafiee tabatabaii ³ , Abdolreza Mohamadnia ⁴

1 - depaetment
2 - Department of Tissue Engineering and Applied Cell Sciences, School of Advanced Technologies in Medicine, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran
3 - department
4 - Chronic Respiratory Diseases Research Center, NRITLD, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran

Received: 2023-11-01 Accepted : 2023-12-16 Published : 2024-02-20

Keywords: Covid-19, biomarker, IP-10, gene expression,

Abstract :

SARS-CoV-2 is an enveloped, symmetrical virus with ridges on its membrane that give it a crown shape. The virus has a positive single-stranded RNA genome. The World Health Organization declared the coronavirus disease 2019 (COVID-19) a pandemic on March 11, 2020, due to the widespread development of the disease. In this research, the expression of IP-10 gene in the peripheral blood of patients with severe type of corona was evaluated in comparison with the mild and improved type of the disease.Peripheral blood was collected from 30 patients with severe infection, 30 patients with mild infection, and 30 recovered from the disease in the age group of 30-70 years. Real-time PCR was performed to check the expression of IP-10 gene in the samples. In this study, it was shown that the expression of the IP-10 gene decreased as the severity of the corona disease decreased, and therefore, this test can be used in the diagnosis and even follow-up of the disease.The studied gene is suitable for predicting the severity and prognosis of the disease, but to obtain better results, more samples should be examined.

Full-Text:



بررسی میزان بیان ژن‌ IP-10  در خون محیطی در بیماران مبتلا به نوع شدید کرونا (Covid-19) در مقایسه با نوع ملایم و بهبود یافته از بیماری 

 

 

عنوان خلاصه : بیان ژن‌ IP-10  در بیماران Covid-19 مبتلا به  نوع شدید و ملایم و بهبود یافته

 

 

 

 

 

 

 

چکیده 

ویروس SARS-CoV-2 یک ویروس محصور شده و متقارن با برآمدگی‌هایی روی غشای آن است که به آن شکل تاج می‌دهد. این ویروس دارای ژنوم RNA تک‌رشته‌ای مثبت است  .سازمان بهداشت جهانی، بیماری کروناویروس 2019 (COVID-19) را در 11 مارس 2020، به دلیل توسعه فراگیر این بیماری، همه‌گیر اعلام کرد. در این تحقیق ، بیان ژن‌ IP-10    در خون محیطی بیماران نوع شدید کرونا در مقایسه با نوع ملایم و بهبود یافته از بیماری ارزیابی شده است .  خون محیطی از 30 بیمار مبتلا به کرونا بستری در بخش مراقبت‌های ویژه بیمارستان مسیح دانشوری با عفونت شدید، 30 بیمار بستری در بخش با عفونت خفیف و 30 فرد بهبود یافته از بیماری در رده سنی 70-30 سال جمع‌آوری گردید. Real-time PCR به منظور بررسی بیان ژن‌ IP-10 در نمونه‌ها، انجام شد. در این مطالعه نشان داده شد که با کاهش شدت بیماری کرونا، بیان ژن IP-10  کاهش یافت و بنابراین میتوان از این آزمایش در تشخیص و حتی پیگیری بیماری استفاده کرد . ژن مورد بررسی برای پیش‌بینی شدت و پیش‌آگهی بیماری مناسب می باشد اما برای دست یابی به نتایج بهتر باید تعداد نمونه های بیشتری را بررسی نمود .

 

کلمات کلیدی: کووید- 19، بیومارکر، IP-10  ، بیان ژن

 

 

 

 

 

Investigating the level of IP-10 gene expression in the peripheral blood of patients with severe type of corona virus (Covid-19) compared to the mild and recovered type of the disease

 

IP-10 gene expression in severe and mild and recovered Covid-19 patients

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                :Abstract

SARS-CoV-2 is an enveloped, symmetrical virus with ridges on its membrane that give it a crown shape. The virus has a positive single-stranded RNA genome. The World Health Organization declared the coronavirus disease 2019 (COVID-19) a pandemic on March 11, 2020, due to the widespread development of the disease. In this research, the expression of IP-10 gene in the peripheral blood of patients with severe type of corona was evaluated in comparison with the mild and improved type of the disease.Peripheral blood was collected from 30 patients with severe infection, 30 patients with mild infection, and 30 recovered from the disease in the age group of 30-70 years. Real-time PCR was performed to check the expression of IP-10 gene in the samples. In this study, it was shown that the expression of the IP-10 gene decreased as the severity of the corona disease decreased, and therefore, this test can be used in the diagnosis and even follow-up of the disease.The studied gene is suitable for predicting the severity and prognosis of the disease, but to obtain better results, more samples should be examined.

KEY WORDS: Covid-19, biomarker, IP-10, gene expression

 

 

 

 

 

 

 

 

مقدمه:

عفونت ویروسی معمولا با علائمی شبیه آنفولانزا شروع شده و می‌تواند بدون‌علامت باشد یا ممکن است پیشرفت جزئی تا شدید داشته باشد[1-3] . علائم بالینی غالب، که توسط افراد آلوده در طول همه‌گیری کووید- 19 ارائه می‌شود، علائم تنفسی است که شبیه به شیوع سارس و سندرم تنفسی خاورمیانه (M ERS) است. تقریبا 80% افراد مبتلا علائم خفیف تا متوسط دارند. بقیه بیماران بیماری شدیدی دارند که نیاز به مراقبت بستری دارد[4].

از این رو، نقش بیومارکرها به عنوان امیدوارکننده‌ترین بخش در میان تمام تحقیقات غیرتهاجمی، برای متوقف کردن این بیماری همه‌گیر مخوف در اینجا مطرح می‌شود[5].

در مطالعات متعدد نشان داده شده است که ویروس SARS-CoV-2 نه تنها بر دستگاه تنفسی، بلکه بر سایر سیستم‌ها و اندام‌ها، مانند قلب، کبد و دستگاه گوارش، تاثیر می‌گذارد. برخی از مطالعات نشان داده‌اند که چندین شاخص مهم بیوشیمیایی و هماتولوژیک در بیماران کووید- 19 تغییر می‌کند [6, 7].

 این بیومارکرها ممکن است برای پیش‌بینی پیش‌آگهی و همچنین برای مدیریت درمان مفید باشند، به‌ویژه در موارد همراه با بیماری‌های همراه و/ یا یک دوره بیماری شدید [8].

در نهایت مولکول‌های جدید، از جمله microRNAها (miRNA)، به عنوان بیومارکرهای کووید- 19 ارزیابی شده‌اند [9].

بر اساس شدت، کووید- 19 به سه نوع تقسیم می‌شود: خفیف ، متوسط و شدید [10] .

نقش سایتوکاین‌ها و کموکاین‌ها در بیماری‌زایی و شدت آن بررسی شده است. این عوامل در بیماری‌زایی کووید- 19 دخیل هستند.  اگرچه در بزرگسالان پاسخ سایتوکاین با شدت بیماری و پیش‌آگهی ضعیف مرتبط است، داده‌های مربوط به پاسخ التهابی به کووید- 19 در کودکان کم است [11].

IP10، یک مارکر جدید (پروتئین القا شده با اینترفرون گاما 10 کیلو دالتون، CXCL10) برای تشخیص فعال شدن سیستم ایمنی سلولی است. IP10پروتئینی است که توسط مونوسیت‌ها و ماکروفاژها و همچنین در مقادیر کم توسط سلول‌های اندوتلیال پس از تماس با IFN-γ تولید می شود. از آن‌جایی که IP10 منحصرا توسط اینترفرون‌ها القا می‌شود و در غلظت‌های بالاتر از خود اینترفرون‌ها در خون گردش می‌کند، این کموکاین یک مارکر ایده آل برای تعیین فعالیت بیولوژیکی IFN-γ و در نتیجه فعال‌سازی ایمنی سلولی T یا سلول‌های T است[12]. 

شواهد به طور خاص به IP-10 به عنوان مارکر پیشرفت بیماری کروناویروس در سال 2019

اشاره می‌کند که سطوح بالایی از مرگ و میر را حفظ می‌کند. در مدل‌های مختلف عفونت ویروسی، سطوح IP-10 در ابتدا افزایش می‌یابد، اما همچنین به‌عنوان یک عامل آسیب حاد ریه با واسطه ایمنی، نشان می‌دهد که نقش کلیدی در پاسخ‌های طبیعی و غیرقابل تنظیم به SARS را دارد. IP-10 ممکن 

است مارکری برای پیشرفت بیماری کووید- 19 و هدفی برای جلوگیری از آسیب ریه باشد [13, 14]

در تحقیق حاضر بررسی میزان بیان ژن‌ IP-10  در خون محیطی در بیماران مبتلا به نوع شدید کرونا (Covid-19) در مقایسه با نوع ملایم و بهبود یافته از بیماری انجام شده است .

 

 

 

 

مواد و روش ها:

این پژوهش پس از اخذ مجوز از کمیته اخلاق، در بیمارستان مسیح دانشوری انجام شد. جامعه‌آماری پژوهش شامل 30 بیمار مبتلا به کرونا بستری در بخش مراقبت‌های ویژه با عفونت شدید، 30 بیمار بستری در بخش با عفونت خفیف و 30 فرد بهبود یافته از بیماری بود. لازم به­ذکر است که نمونه­های سه گروه، خون محیطی بود و بیماران در گروه‌هاي سنی يكسان با حداقل سن 35 سال و حداکثر سن 75 سال در نظر گرفته شدند. این مطالعه هیچ آسیب و ضرری به افراد مشارکت کننده وارد نکرد. استخراج  RNA   و سپس  Real time PCR به منظور بررسی بیان ژن‌ PD-1 در نمونه‌ها  انجام گردید . 

 

استخراج  RNA ، سنتز cDNA و انجام Real-Time PCR :

مرحله استخراج RNA  با استفاده از qiagen Cat no.75144) RNeasy Midi Kit) انجام شد. ارزیابی غلظت و کیفیت RNA استخراج شده با استفاده از دستگاه نانودراپ سنجش شد. 

به منظور سنتز cDNA از RTPL12) Viva 2-steps RT-PCR Kit (Cat no  استفاده شد .

پرایمر های اختصاصی مارکر به کمک نرم افزار AlleleID6 طراحی وجهت ساخت سفارش داده شد . لازم به ذکر است که پرایمرها باتوجه به مناسب­ترین غلظت یافته شده در آزمایشات set up اولیه به کار برده شدند. همچنین، در این مطالعه از ژن‌رفرنس 18S rRNA استفاده گردید. 

جدول 1- پرایمرهای مورد استفاده در پژوهش

	IP-10	18S rRNA
Forward primer	GGTGAGAAGAGATGTCTGAATCC	GTAACCCGTTGAACCCCATT
Length	23	20
Reverse primer	GTCCATCCTTGGAAGCACTGCA	CCATCCAATCGGTAGTAGCG
Length	22	20
product length	134	152
دمای مطلوب Annealing	59	56

 

 

 

انجام واکنش Real-time RT-PCRبااستفاده ازHotTaq EvaGreen qPCR Mix انجام گردید .

شرایط دمایی وزمانی به ترتیب : دناتوراسیون اولیه95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه ، دناتوراسیون95 درجه به مدت 15 ثانیه،اتصال پرایمرها 56درجه به مدت 60ثانیه و تکثیر 72 درجه به مدت 25 ثانیه ( برای 35 سیکل) و تکثیر نهایی 72 درجه به مدت5 دقیقه بود.

 

یافته ها :

در این مطالعه تعداد 30 فرد بستری در بخش مراقبت‌های ویژه با عفونت شدید، 30 فرد بستری در بخش با عفونت خفیف و 30 فرد بهبود یافته از بیماری بودند. گروه­ها با استفاده از آزمون t از نظر میانگین سنی مقایسه شدند و از نظر میانگین سنی تفاوت معنی­داری را نشان ندادند، لذا می­توان نتیجه گرفت که فاکتور سن در گروه­های مورد مطالعه اشکالی ایجاد نمی­کند.

 

 

 

بیومارکر IP-10 در گروه بیماران با عفونت شدید در 26 نفر از 30 نفر مثبت بود (86%). میزان
مثبت بودن این بیومارکر در گروه بیماران با عفونت خفیف 21 نفر از 30 نفر بود (70%). همچنین میزان مثبت بودن این بیومارکر در گروه افراد بهبود یافته از بیماری 9 نفر از 30 نفر بود (30%) (نمودار1). مقایسه آماری میزان مثبت شدن این بیومارکر در گروه بیماران با عفونت شدید و گروه بیماران با عفونت خفیف و گروه افراد بهبود یافته از بیماری توسط آزمون T-test صورت پذیرفت که نشان‌دهنده­ تفاوت آماری معنی­دار بین این سه گروه مورد مطالعه بود (P-value < 0.001).

 

نمودار 1- درصد مثبت بودن IP-10  در گروه بیماران مبتلا به کرونا با عفونت شدید و گروه بیماران با عفونت خفیف و گروه بهبود یافته از بیماری

جهت محاسبه تفاوت بیان بیومارکر مورد نظر ، ابتدا Ct هر نمونه ، تعیین گردید . میزان تفاوت بیان بیومارکر بین نمونه­ی آزمایش در مقابل کنترل اندازه­گیری شد، این­کار با روش Ct ΔΔ بین دو گروه ها صورت گرفت.

پس از انجام محاسبات نشان داده شد که میزان بیان این مارکر در افراد بیمار با عفونت شدید 94/2 برابر افراد سالم و در افراد بیمار با عفونت ملایم  68/1 برابر افراد سالم محاسبه گردید(نمودار2) .

 

نمودار 2- تفاوت بیان ژن  IP-10 در بیماران با عفونت شدید و بیماران با عفونت خفیف و بهبود یافته  

 

بحث :

سازمان بهداشت جهانی، بیماری کروناویروس 2019 (COVID-19) را در 11 مارس 2020،

به دلیل توسعه فراگیر این بیماری، همه‌گیر اعلام کرد[15]. پس از 

توالی‌یابی ژنوم ویروس، توسط کمیته بین‌المللی طبقه‌بندی ویروس‌ها، ویروس به عنوان سندرم 

حاد تنفسی کرونا- 2 (SARS-CoV-2) نام‌گذاری شد [16].

عفونت ویروسی معمولا با علائمی شبیه آنفولانزا شروع شده و می‌تواند بدون‌علامت باشد یا ممکن است پیشرفت جزئی تا شدید داشته باشد[1, 3].

علائم بالینی غالب، که توسط افراد آلوده در طول همه‌گیری کووید- 19 ارائه می‌شود، علائم تنفسی است که شبیه به شیوع سارس و سندرم تنفسی خاورمیانه (M ERS) است. تقریبا 80% افراد مبتلا علائم خفیف تا متوسط دارند. بقیه بیماران بیماری شدیدی دارند که نیاز به مراقبت بستری دارد[4].

با ارزیابی سطح این بیومارکرها می‌توان زمان عفونت را مشخص، وضعیت بیمار را ارزیابی و اندام آسیب‌دیده را تعیین کرد[17]. 

Jøntvedt Jørgensen و همکاران در سال 2020 در نروژ نشان دادند که سطوح IP-10 پلاسما با نارسایی تنفسی (R F) در بیماران مبتلا به کووید- 19 شدید ارتباط دارد و می‌تواند به عنوان بیومارکر برای شناسایی بیماران در معرض خطر R F شدید و به عنوان هدفی برای بهبود استراتژی‌های درمانی مورد بررسی قرار گیرد[18].      Yang و همکاران در سال 2020 در چین بررسی و نتیجه‌گیری کردند که سطوح IP-10 پلاسما با شدت کووید- 19 مرتبط است و پیشرفت بیماری را پیش‌بینی می‌کند[19]. 

 Chen و همکاران در سال 2020 در چین، IP-10 را به عنوان بیومارکر مرتبط با شدت بیماری کووید- 19 بررسی کردند. سطح سرمی IP-10 در بیماران بدحال، بالاتر از بیماران شدید بود[20]. Haroun و همکاران در سال 2021 در مصر نشان دادند که IP-10 بیومارکر عالی برای پیش‌بینی پیشرفت و شدت کووید- 19 است.

 Önal و همکاران در سال 2022 در ترکیه، بیومارکرهای تشخیصی و پیش‌آگهی بیماری کرونا در کودکان را بررسی کردند. سطوح IP-10 به طور قابل توجهی در بیماران کووید- 19 بالاتر بود. افزایش سطح IP-10 در کودکان مبتلا به کووید- 19 شاخصی برای تشخیص زودهنگام و پیش‌بینی کننده شدت بیماری است [21] . Tufa در سال 2022 در آفریقا بیان کرد که در مقایسه با افراد سالم، بیماران مبتلا به کووید- 19 سطوح بالاتری از IP-10 را نشان دادند[22]. بنابراین، نتایج پژوهش‌های ذکر شده با نتایج پژوهش حاضر همسو بود.

به طور کلی در پژوهش حاضر نتیجه گرفته شد که در بیماری کرونا با کاهش حدت بیماری، بیان بیومارکر IP-10 کاهش می‌یابد. بنابراین به عنوان بیومارکر مناسب جهت تشخیص و درمان بیماری مطرح و می‌توان از آن‌ در تشخیص بیماری و درمان بهره برد البته مطالعات تکمیلی توصیه می گردد .

 

 

رفرنس :

 

 

1.        Aktas G. A comprehensive review on rational and effective treatment strategies against an invisible enemy; SARS Cov-2 infection. Experimental Biomedical Research. 2020;3(4):293-311.

2.        Gupta A, Madhavan MV, Sehgal K, et al. Extrapulmonary manifestations of COVID-19. Nature medicine. 2020;26(7):1017-1032.

3.        Laing AG, Lorenc A, Del Molino Del Barrio I, et al. A dynamic COVID-19 immune signature includes associations with poor prognosis. Nature medicine. 2020;26(10):1623-1635.

4.        Frater JL, Zini G, d’Onofrio G, Rogers HJ. COVID‐19 and the clinical hematology laboratory. International journal of laboratory hematology. 2020;42:11-18.

5.        Kelly MS, Valle CW, Fernandes ND, et al. Multisystem inflammatory syndrome in children: cardiac biomarker profiles and echocardiographic findings in the acute and recovery phases. Journal of the American Society of Echocardiography. 2020;33(10):1288-1290.

6.        Lippi G, Plebani M. Laboratory abnormalities in patients with COVID-2019 infection. Clinical chemistry and laboratory medicine (CCLM). 2020;58(7):1131-1134.

7.        Deng X, Liu B, Li J, et al. Blood biochemical characteristics of patients with coronavirus disease 2019 (COVID-19): a systemic review and meta-analysis. Clinical chemistry and laboratory medicine (CCLM). 2020;58(8):1172-1181.

8.        Thompson S, Bohn MK, Mancini N, et al. IFCC interim guidelines on biochemical/hematological monitoring of COVID-19 patients. Clinical chemistry and laboratory medicine (CCLM). 2020;58(12):2009-2016.

9.        Fani M, Zandi M, Ebrahimi S, Soltani S, Abbasi S. The role of miRNAs in COVID-19 disease. Future Virology. 2021;16(4):301-306.

10.        Azoulay E, De Waele J, Ferrer R, et al. International variation in the management of severe COVID-19 patients. Critical care. 2020;24(1):1-7.

11.        Doulati MA, Doulati M. The value of D-Dimer as a biomarker in assessing disease severity and mortality in patients with Covid-19, a review study. Laboratory & Diagnosis. 2020;12(49):41-45.

12.        Colaneri M, Bogliolo L, Valsecchi P, et al. Tocilizumab for treatment of severe COVID-19 patients: preliminary results from SMAtteo COvid19 REgistry (SMACORE). Microorganisms. 2020;8(5):695.

13.        Ichikawa A, Kuba K, Morita M, et al. CXCL10-CXCR3 enhances the development of neutrophil-mediated fulminant lung injury of viral and nonviral origin. American journal of respiratory and critical care medicine. 2013;187(1):65-77.

14.        Tsai A, Diawara O, Nahass RG, Brunetti L. Impact of tocilizumab administration on mortality in severe COVID-19. Scientific reports. 2020;10(1):19131.

15.        Filipović N, editor Artificial intelligence and finite element methods in modeling of COVID-19. Mathematics for Human Flourishing in the Time of COVID-19 and Post COVID-19: Proceedings of the Workshop held at the Faculty of Mechanical Engineering, University of Niš, Niš, 21 of October 2020; 2023: Walter de Gruyter GmbH & Co KG.

16.        Dos Santos WG. Natural history of COVID-19 and current knowledge on treatment therapeutic options. Biomedicine & Pharmacotherapy. 2020;129:110493.

17.        Codina H, Vieitez I, Gutierrez-Valencia A, et al. Elevated anti-SARS-CoV-2 antibodies and IL-6, IL-8, MIP-1β, early predictors of severe COVID-19. Microorganisms. 2021;9(11):2259.

18.        Jøntvedt Jørgensen M, Holter JC, Christensen EE, et al. Increased interleukin-6 and macrophage chemoattractant protein-1 are associated with respiratory failure in COVID-19. Scientific reports. 2020;10(1):21697.

19.        Yang Y, Shen C, Li J, et al. Plasma IP-10 and MCP-3 levels are highly associated with disease severity and predict the progression of COVID-19. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2020;146(1):119-127. e114.

20.        Chen Y, Wang J, Liu C, et al. IP-10 and MCP-1 as biomarkers associated with disease severity of COVID-19. Molecular Medicine. 2020;26:1-12.

21.        Önal P, Kılınç AA, Aygün FD, et al. Diagnostic and prognostic biomarkers of coronavirus disease 2019 in children. Journal of Tropical Pediatrics. 2022;68(2):fmac003.

22.        Tufa A, Gebremariam TH, Manyazewal T, et al. Inflammatory mediators profile in patients hospitalized with COVID-19: A comparative study. Frontiers in Immunology. 2022;13:964179.

 

4

 

---