Investigating the productivity of biomass, lipid content, and biodiesel fuel in the mixed culture of Scenedesmus sp. and Desmodesmus armatus microalgae.

Bagheri, Ammar; Gholami Parashkoohi, Mohammad; Mohammadi, Ahmad; Mohammadzamani, Davood

doi:https://doi.org/10.71890/IPER.2025.984426

Manuscript ID : IPER-2303-1854 (R1) Visit : 683 Page: 1 - 16

https://doi.org/10.71890/IPER.2025.984426

Article Type: Original Research

Investigating the productivity of biomass, lipid content, and biodiesel fuel in the mixed culture of Scenedesmus sp. and Desmodesmus armatus microalgae.

Subject Areas : microalgae

Ammar Bagheri ¹ , Mohammad Gholami Parashkoohi ^{2
*} , Ahmad Mohammadi ³ , Davood Mohammadzamani ⁴

1 - Department of Biosystem Mechanical Engineering. Takestan Branch. Islamic Azad university. Takestan, Iran
2 - Department of Biosystem Engineering, Takestan Branch, Islamic Azad University, Takestan, Iran
3 - Department of Bio-system mechanical, Arak branch, Islamic Azad University, Arak, Iran
4 - Department of Biosystem Mechanical Engineering. Takestan Branch. Islamic Azad university, Takestan, Iran

Received: 2023-03-17 Accepted : 2023-05-22 Published : 2025-06-22

Keywords: Microalgae, Secondary metabolite, mixed culture, primary metabolite, pure culture,

Abstract :

The role of biotechnology in the production of primary and secondary metabolites of algae is of great importance. Pure and single-cell algae cultivation has been widely carried out in the past years. Although mixed cultures of microalgae have advantages over pure cultures, there is still insufficient information on the performance of mixed cultures. In this research, all the effective factors in the growth of two types of freshwater microalgae in mixed culture and their biological effects on the growth rate, biomass, and lipid were investigated. The selected species included Scenedesmus sp and Desmodesmus armatus microalgae. After the initial culture and reaching the appropriate concentration, the sample was transferred to the vertical photobioreactor and environmental factors were applied to the microalgae in pure and mixed cultures. Then the effects of environmental parameters and type of cultivation on biomass productivity and lipid content were investigated. The results showed that the highest amount of cell density and biomass in the conditions of a temperature of 25 degrees Celsius, the light intensity of 3000 lux, 16 hours of exposure, and acidity of 8 is related to the pure culture of Scenedesmus sp and then the mixed culture of Scenedesmus sp and Desmodesmus armatus . The highest amount of lipid production in constant temperature conditions of 30^oC, 18 hours of exposure, the light intensity of 4000 lux, and acidity of 9 were related to Scenedesmus sp and then Desmodesmus armatus . Regarding the amount of biodiesel produced, the highest amount was related to Scenedesmus sp microalgae and then Desmodesmos in the conditions of 16 hours of exposure, 4000 lux radiation, a temperature of 25 degrees Celsius, and a ph of 8. The results showed that the mixed microalgae culture compared to the pure culture had a positive effect on the production of biomass and cell density and a negative effect on the production of secondary metabolites such as lipids. Of course, regarding the percentage of extracted biodiesel, it was observed that the biodiesel in the mixed culture was higher than in the pure culture of Desmodesmus armatus algae.

References:

_||_Andersen, R.A. (2005). Algal culturing techniques. Elsevier, Amsterdam, 578 pp.
Afsharbakhsh M., Mohammadi, A., Mashadi, H. and Mahmoudnia, F. (2020). Effect of culture medium temperature and pH on performance of micro algae of Spirolinaplatensis in vertical photobioreactor. System Researches and Agriculture Mechanisation, 21(76): 99-116. (in Persian)
Bharti, R.K.; Singh, A.; Dhar, D.W.; Kaushik, A. Biological Carbon Dioxide Sequestration by Microalgae for Biofuel and Biomaterials Production. In Biomass, Biofuels, Biochemicals; Elsevier: Amsterdam, The Netherlands, 2022; pp. 137–153
Chaudhary R., Khattar J. I. S.Singh D.P. (2017). Growth and lipid production by Desmodesmus armatus subspicatus and potential of lipids for biodiesel production. Journal of Energy and Environmental Sustainability,26(3): 58-63.
Dai C., Tao J., Xie F., Dai, Y.J. and Zhao M. (2007). Biodiesel generation oleaginous yeast Rhodotorula glutinis with xylose assimilating capacity. African Journal of Biotechnology, 6(18):2130-2134.
Deniz I. (2020). Determination of growth conditions for Chlorella vulgaris. Mar.sci. Tech. Bull. 9(2): 114-117.
El-Fadaly H., El-Ahmady N. Marvan E.M. (2009). Single cell oil production by an oleaginous yeast strain in a low cost cultivation medium. Research Journal of Microbiology, 4(8):301-313.
Fabregas J., Domingue A., Regueiro M., Maseda A., Otero A.(2000). Optimazation of culture medium for the continuous cultivation of the microalgae Haematococcus pluvialis. Journal of Microbiology and Biotechnology, 53 (5): 530- 5.
Fallahi A, Hajinajaf N, Tavakoli O, Sarrafzadeh MH. Cultivation of Mixed Microalgae Using Municipal Wastewater: Biomass Productivity, Nutrient Removal, and Biochemical Content. Iran J Biotechnol. 2020 Oct 1;18(4):e2586. doi: 10.30498/IJB.2020.2586. PMID: 34056025; PMCID: PMC8148641
Farsani M.N., Meshkiny S., Manaffar R., Asal Pishe Z. Response of growth, protein and fatty acid content of Desmodesmus armatus cuneatus to the repletion and depletion of nitrogen. Biological Journal of Microorganism 2015; 3 (12): 59- 68.
Georgianna DR, Mayfield SP. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels. Nature. 2012;488(7411):329–335. doi: 10.1038/nature11479. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Gupta PL, Choi HJ, Lee SM. Enhanced nutrient removal from municipal wastewater assisted by mixotrophic microalgal cultivation using glycerol. Environ Sci Pollut Res Int. 2016;23(10):114–123. doi: 10.1007/s11356-016-6224-1.
González-González, L.M.; Correa, D.F.; Ryan, S.; Jensen, P.D.; Pratt, S.; Schenk, P.M. Integrated Biodiesel and Biogas Production from Microalgae: Towards a Sustainable Closed Loop through Nutrient Recycling. Renew. Sustain. Energy Rev. 2018, 82, 1137–1148.
Hall CAS, Benemann JR. Oil from Algae? BioScience. 2011;61(10):741–742. [Google Scholar]
Hassanpour M, Abbasabadi M, Ebrahimi S, Hosseini M, Sheikhbaglou A. Gravimetric enrichment of high lipid and starch accumulating microalgae. Bioresour Technol. 2015;196:17–21. doi: 10.1016/j.biortech.2015.07.046
Hegewald E. (1997). Taxonomy and phylogeny of Scenedesmaceae Algae. 12:235-246.
Imamogul E., Sukan F.V. and Dalay M.C. (2007). Effect of different culture media and light intensities on growth of Haematococcus pluvialis. Natural Enginrring Science, 3 (1): 05- 09.

Karlsson, H.; Ahlgren, S.; Sandgren, M.; Passoth, V.;Wallberg, O.; Hansson, P.-A. Greenhouse Gas Performance of Biochemical Biodiesel Production from Straw: Soil Organic Carbon Changes and Time-Dependent Climate Impact. Biotechnol. Biofuels 2017,10, 217. [CrossRef]
Kiaei, E., Soltani, N., Mazaheri Assadi, M., Khavarinegad, R., Dezfulian, M. (2013). Study of optimal conditions in order to the use of the cyanobacteria Synechococcus sp. ISC106 as a candidate for biodiesel production. Journal of Aquatic Ecology. 2(4): 40-51.

Kleerebezem R, van Loosdrecht MC. Mixed culture biotechnology for bioenergy production. Curr Opin Biotechnol. 2007;18(3):207–212. doi: 10.1016/j.copbio.2007.05.001.
Malek Ahmadi, F., and Khavari Nejad, R., and Soltani, N., and Najafi, F., and Nejad atari,T.(2019). Investigation of physiological properties of green algae in order to use them as biodiesel fuel. Plant Environmental Physiology, 14 (1): 30-46.
Matusiak-Mikulin K., Tukaj C. and Tukaj Z. (2007). Relatinships between growth, development and photosynthetic activity during the cell cycle of Desmodesmus armatus armatus (Chlorophyta) in synchronous cultures. European Journal of Phycology, 41(1):38-49
Moreno-Garrido I. (2008). Microalgae immobilization: Current techniques and uses. Bio resource Technology, 99: 3949-3964.
Mohan SV, Devi MP, Mohanakrishna G, Amarnath N, Babu ML, Sarma PN. Potential of mixed microalgae to harness biodiesel from ecological water-bodies with simultaneous treatment. Bioresour Technol. 2011;102(2):109–117. doi: 10.1016/j.biortech.2010.08.103.
Meireles L.C., Catarina A., Guedes A.C. and Malcata F.X.(2003). Lipid class composition of the microalgae Pavlova lutheri: Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic acids. Agriculture Food Chemistry,. 51: 2237-2241.
Naderi Farsani M., Meshkini S. and Manaffar R. (2013). Investigation of optimal growth and nutritional value of two micro algae Hematococcus and Desmodesmus armatus in different culture media. Journal of microorganism biology, 14: 49-60 (In Persian).
Naderi Farsani, M. Meshkini S., Manaffar R. and Banayi M. (2015). Effects of different level of nitrogen on growth and lipid contents of two species of freshwater micro algae (Desmodesmus armatus cunaetus and Haematococcus sp). Utilization and culture of water organism, 4(1): 15-27.
Najafi, B., Torkian, M., Hejazi M.A., Zamzamian, A.A.( 2012). Effect of Microalgae Biodiesel on Performance Parameters and Exhaust Emissions from IDI Diesel Engine. Fuel and Combustion. 4(2): 29-42.
Niazkhani, A, Mohammadi, A, Mashhadhi, H, and Mahmoudnia, F. (1401). The effect of different environmental factors on the optimal level of cell density, biomass production, lipid and biodiesel production in Desmodesmos microalgae. Plant environmental physiology. doi: 10.30495/iper.2022.1946872.1754
Novoveská L, Franks DT, Wulfers TA, Henley WJ. Stabilizing continuous mixed cultures of microalgae. Algal Research. 2016;13:126–133. doi: 10.1016/j.algal.2015.11.021. [CrossRef] [Google Scholar]
Nzayisenga J., Farge X., Groll S.L. and Sellstedt, A. (2020). Effects of light intensity on growth and lipid production in microalgae grown in wastewater. Biotechnology for Biofuels, 13(4):135-147
Ratledge C. and Cohen Z. (2008). Microbial and algal oils: Do they have a future for biodiesel or as commodity oils? Technology, 20(7): 155-160
Rostami, S., Ghobadian, B., Savadkouhi, L., Ebrahimi, R. (2010). Experimental Investigation of Effect of Injection Pressure on Performance of a Diesel Engine Using Blends of Biodiesel and Diesel. The Journal of Engine Research. 21: 73-83.
Salama el S, Kim HC, Abou-Shanab RA, Ji MK, Oh YK, Kim SH, et al. Biomass, lipid content, and fatty acid composition of freshwater Chlamydomonas mexicana and Scenedesmus obliquus grown under salt stress. Bioprocess Biosyst Eng.2013;36(6):827-833. doi.org/10.1007/s00449-013-0919-1 http://ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23411874

Sanchez S., Martinez E. and Espinola F.(2000). Biomass production and biochemicalvariability of the marine microalgae Isochrysis galbana in relation to culturemedium. Biochemistry Enginering, 6(1): 13- 18.

Soeder, C. J. (1986). A historical outline of applied algology. In Handbook of Microalgal Mass Culture; Richmond, A., Ed.; CRC Press: Boca Raton, FL. pp. 25-41
Taskan E. Performance of mixed algae for treatment of slaughterhouse wastewater and microbial community analysis. Environ Sci Pollut Res Int. 2016;23(20):474–482. doi: 10.1007/s11356-016-7241-9
Unpaprom, Y., Tipnee, S. & Ramaraj, R. (2015). Biodiesel from green alga Scenedesmus acuminatus. International Journal of Sustainable and Green Energy. Special Issue: Renewable Energy Applications in the Agricultural Field and Natural Resource Technology, 4(1), 1-6
Wang S., Cao M., Wand B., Deng R., Gao Y. and Liu P. (2019). Optimization of growth requirement and scale-up cultivation of freshwater algae Desmodesmus armatus armatus using response surface methodology. Aquaculture Research, 50(11): 3313-3325.

Xin L., Hong-Ying H., Jia Y. and Yin-Hu W. (2010). Enhancement effect of ethyl-2-methyl acetoacetate on triacylglycerols production by a freshwater microalga, Scenedesmus sp. LX1. Bioresource Technology, 101(24):9819-21.

Full-Text:

بررسی بهره وری زیست توده ، محتوی لیپید و سوخت بیودیزل در کشت مخلوط ریز جلبکهای Scenedesmus sp و armatus Desmodesmus .

چکیده:

نقش بیوتکنولوژی در تولید متابولیت های اولیه و ثانویه جلبک از اهمیت بالایی برخوردار است. کشت جلبک بصورت خالص و تک سلولی به طور گسترده در سالهای گذشته انجام شده است. با این حال، اگرچه کشت مخلوط ریزجلبک مزایایی نسبت به کشت های خالص دارد، اما هنوز در مورد عملکرد کشت های مخلوط اطلاعات کافی وجود ندارد.

در این تحقیق سعی شده است تمامی فاکتورهای موثر در رشد دو گونه ریز جلبک آب شیرین در کشت مخلوط و اثرات بیولوژیکی آنها بر میزان تراکم سلولی، میزان زیست توده و درصد لیپید نسبت به وزن خشک مورد بررسی قرار گیرد. گونههای انتخابی شامل ریز جلبک سندموس و دسمودسموس بود. پس از کشت اولیه و رسیدن به تراکم مناسب نمونه به فتوبیوراکتور عمودی منتقل و فاکتورهای محیطی در دو سطح کشت خالص و مخلوط برای ریز جلبکها اعمال گردید. سپس اثرات پارامترهای محیطی و نوع کشت بر بهره وری زیست توده، و محتوای لیپید مورد بررسی قرار گرفت.

نتایج به‌دست‌آمده نشان داد که بیشترین میزان تراکم سلولی و زیست توده در شرایط ثابت دمای 25 درجه سلسیوس، تابش نور 3000 لوکس، مدت زمان 16 ساعت نوردهی اسیدیته 8 مربوط به کشت خالص سندسموس بوده و سپس کشت مخلوط سندسموس و دسمودسموس می باشد. همچنین بیشترین میزان تولید لیپید در شرایط ثابت دمای 30درجه سلسیوس،مدت زمان نوردهی 18 ساعت، شدت تابش 4000 لوکس و اسیدیته 9 مربوط به جلبک سندسموس و سپس دسمودسموس بود. درخصوص میزان بیودیزل تولیدی نیز بیشترین میزان مربوط به ریز جلبک سندسموس و سپس دسمودسموس در شرایط 16ساعت نوردهی ، تابش 4000 لوکس ، دمای 25 درجه سلسیوس و اسیدیته 8 بود.

نتایج مقایسه کشت ترکیبی با کشت خالص بیانگر تاثیر مثبت کشت ترکیبی بر میزان تولید و تراکم سلولی و در مقابل کاهش لیپید بوده اما در مجموع درصد بیودیزل استخراجی از لیپید در کشت مخلوط نسبت به کشت خالص ریز جلبک دسمودسموس بالاتر است البته در مورد درصد بیودیزل استخراجی از لیپید ملاحظه میگردد که میزان بیودیزل در کشت مخلوط نسبت به کشت خالص ریز جلبک دسمودسموس بالاتر است.

کلمات کلیدی: کشت مخلوط ، ریز جلبک ، متابولیت اولیه ، متابولیت ثانویه، کشت خالص

مقدمه:

ذخایر سوخت فسیلی زمین به سرعت در حال اتمام است و نیاز به منابع انرژی تجدید پذیر افزایش یافته است. بیودیزل اخیراً توجه خاصی را به خود به عنوان سوختی با آلودگی کم و تجدید پذیر جلب کرده است. یکی از نگرانی‌های اصلی مربوط به منابع نسل اول و دوم تولید بیودیزل، استفاده از زمین‌های زراعی است که منجر به رقابت با بخش‌های دیگر مانند اتانول زیستی و کشاورزی،خوراک دام،تولید غذا می‌شود (بهارتی و همکاران 2022). علاوه بر این، زمان تولید، وابستگی آب و هوایی و کیفیت خاک، از جمله عوامل موثر در تولید منابع نسل اول و دوم می باشند. از سوی دیگر تولید این محصولات بخاطر استفاده از کود، اکسید نیتروژن را آزاد می کند که یک گاز گلخانه قوی است(کارلسون و همکاران،2017)

میکروجلبک‌ها،‌ به گیاهان شناور یا فیتوپلانکتوهایی اطلاق می شود که غذای آغازین جانوران را در اکوسیستم های آبی تشیکل می دهند و تمام حلقه های بالاتر شبکه غذایی انرژی خود را از مواد آلی ساخته شده از میکروجلبک ها دریافت می کنند. اکثر این موجودات تک سلولی بوده و از تولید کنندگان اولیه در زیستگاه های آبی محسوب می شوند. میکروجلبک ها منبع غنی از پروتئین، کربوهیدرات ها و به ویژه اسیدهای چرب ضروری می باشند (صیدانلو و همکاران، 1391).

در بین منابع تولید بیودیزل، میکروجلبک ها به علت محتوای بالای چربی و رشد سریع جایگاه ویژه ای را کسب کرده است (Unpaprom et al., 2015). ایده استفاده از ریزجلبک‌ها در مقیاس زیاد اولین بار توسط دانشمندان آلمانی به منظور دستیابی به منابع پروتئین ارزان قیمت و جایگزینی آن با منابع پروتئین حیوانی مطرح شد (Soeder, 1986). علاوه بر این، ریزجلبک‌ها منبع اصلی اکسیژن در این سیاره هستند، و تثبت دی اکسیدکربن در فرایند فتوسنتز و تولید بیودیزل در جلبکها می تواند نوید تولید سوخت بدون کربن را در آینده بدهد. در این زمینه،استفاده از زیست توده ریز جلبک ها به عنوان منبع بیودیزل در حال رشد است [کارلسون و همکاران،2017]. این میکروارگانیسم ها در مقایسه با محصولات معمولی نرخ رشد و بهره وری بالاتری از خود نشان می دهند. علاوه بر این، آنها را می توان با استفاده از فاضلاب کشت کرد، بنابراین از رقابت برای آب شیرین و افزایش بحران آب جلوگیری کرد [گنزالس و همکاران 2018].

در بین گونه های مختلف ریز جلبک ها دسمودسموس¹ و سندسموس² از نظرقابلیت محتوی چربی تولیدی دارای قابلیت برتر می باشند(محمدی و همکاران، 1400)

ريزجلبك دسمودسموس از شاخه كلروفيتا و معمولا به شكل يك كلوني مسطح، بيشتر درآب هاي شيرين ديده مي شود . اين ريزجلبك در زنجيره غذايي و در تغذيه زئوپلانكتون ها و ماهي ها اهميت دارد همچنين از اين ريز جلبك به عنوان شاخص زيستي در خود پالايي سيستم هاي آبي استفاده مي شود(فارسانی و همکاران، 2015)

جبلک سندسموس در مطالعات آزمایشگاهی زمینه های مختلف علم لیمنولوژی بسیار پراستفاده بوده و کاربرد فراوانی در بخش تحقیقات دارد. سندسموس از خانواده Scenedesmaceae بوده و تا کنون ۱۷۱ گونه از این جنس شناسایی شده است. این جلبک ها به عنوان میکروارگانیزمهای استاندارد در بسیاری از پژوهش های علوم دریایی و آبی،‌ تکنولوژی و مدیریت آب ها مطرح هستند (هدایتی فرد و همکاران،‌1395). در آب‌های شیرین، خاک و سنگ های مرطوب پیدا می شود (هراتی و همکاران،‌1388). به عنوان منبعی بالقوه برای تولید مواد اولیه بیودیزل پیشنهاد شده اند. میکروجلبک سندسموس و دسمودسموس دارای توانایی لازم برای تولید میزان زیادی لیپید بوده که می تواند برای تولید بیودیزل و یا بیواتانول مورد استفاده قرار گیرد (ملک احمدی و همکاران،‌1397).

بهینه سازی شرایط رشد جلبک های سبز پیچیده بوده و به عوامل مختلفی مرتبط است که هر کدام می توانند بازدارنده یا تحریک کننده باشند که از آن جمله می توان به مواد غذایی، دما،‌هوادهی، تغییرات گازی، میزان تابش نور، شوری و تراکم سلولی اشاره کرد. علاوه بر عوامل ذکر شده فوق نحوه کشت (کشت خالص یا کشت مختلط) می تواند در میزان تولید زیست توده و متابولیت های ثانویه تاثیر بسزایی داشته باشد(Salama et al,2013)

کشت خالص جلبک به طور گسترده در دهه های گذشته انجام شده است. با این حال، کشت خالص ممکن است خطر آلودگی توسط جلبک‌های غیر هدف غیرعمدی موجود (رقبا) یا چرندگان (شکارچیان) را افزایش دهد که ممکن است منجر به کاهش بهره‌وری زیست توده و همچنین کاهش پایداری اقتصادی سوخت‌های زیستی جلبکی شود. Georgianna et al,2012). در این راستا، خطر آلودگی حتی در محیط‌های شور بالاست که در آن گونه‌های جلبکی آب شیرین که در برابر شوری مقاوم هستند ، می‌توانند در بخشی از دوره کشت رشد کنند و کارایی کلی سیستم را کاهش دهند. از سوی دیگر، بیوتکنولوژی کشت مخلوط دارای مزایایی نسبت به فرهنگ خالص است. به عنوان مثال، تنوع میکروبی در بیشتر موارد باعث ایجاد شرایط سازگاری می شود که در آن نگرانی شدیدی در مورد آلودگی وجود نخواهد داشت و همچنین امکان یک فرآیند مداوم بیشتر است (Hall CAS,2011) (Novoveská et al,2016). با این حال، اختلاف نظر در مورد امکان پذیری ادغام کشت گونه های جلبک آب شیرین و دریایی در یک کشت مخلوط با تصفیه فاضلاب شور وجود دارد ( Mohan,.Devi, 2011) لذا در این تحقیق سعی گردید گونه های مورد استفاده محیط یکسانی داشته باشند.

مواد و روشها:

کشت جلبکها:

مواد شیمیایی مورد استفاده در این مطالعه متعلق به شرکت مرک ³(دارمشتات، آلمان) بود. تمام محلول‌ها که با آب دوبار تقطیر تهیه شده بودند، قبل از استفاده در دمای 4 درجه سلسیوس نگهداری شدند. ریزجلبک های سندسموس و دسمودسموس از آزمایشگاه زیست فناوری جلبک مرکز تحقیقات علوم گیاهی کاربردی اراک تهیه شد و برای آزمایشات مورد نظر استفاده گردید. شکل (1) نمایی از ساختار تک سلولی سندسموس و دسمودسموس است که توسط میکروسکوپ گرفته شده است.

شکل 1 میکروجلبک دسمودسموس(سمت راست) و سندموس (سمت چپ)

محیط کشت مورد استفاده برای هر دو ریزجلبک بی بی ام⁴ بود. کشت اولیه جلبکهای مذکور در محیط کشت BBM در مقادیر 100 و سپس 1000 میلی لیتري و تحت شـرایط کنتـرل شـده در انکوبـاتور ژرمینـاتور بـا دمـاي 24 درجه سلسیوس با لامپهـاي فلورسـنت بـا شـدت نـوري 2500 لوکس و7pH= کشـت داده شـد. هوادهی از طریق پمپ اکواریوم مدل AQUA 9805 ساخت کشور چین انجام گرفت. پس از 5 روز مقدار 100 میلی لیتر از آن با تراکم 104×17500 در میلی لیتر به هرکدام از محیط کشت های آماده در فتوبیوراکتور لوله ای عمودی جهت کنترل عوامل محیطی منتقل گردید(شکل 2).

شکل 2 فتوبیوراکتور عمودی نیمه اتوماتیک

از فتوبیوراکتوری استفاده شد که دارای 4 محیط جداگانه بوده و تمام پارامترها از جمله میزان دما، شدت نور، مدت نوردهی و میزان هوادهی در هرکدام از محیط ها قابل کنترل بود. در هر کدام از محیط ها از سه استوانه شیشه ای استفاده شد که به عنوان تکرارِ هر کدام از نمونه ها مورد استفاده قرار گرفت. ((Afsharbakhsh et al.. 2020. فاکتورها و سطوح بررسي شده در جدول 1 به صورت کامل آورده شده است.

جدول 1- مشخصات عوامل محيطي و متغير هاي تحقيق

میزان دی اکسید کربن(%)	شدت نور (لوکس)	مدت روشنايي(ساعت)	pH	دما(سلسیوس)	طول دوره(روز)	محیط کشت	نوع جلبک
1	2	3	2	3	1	1	3	سطوح تیمار
15	4000-3000	18-16-14	9-8	30-25-20	15	BBM	دسمودسموس	شرح تیمار
							سندسموس
							مخلوط دسمودسموس و سندسموس

برداشت و بررسي نمونه ها:

برای برداشت جلبک‌ها زیست توده از سانتریفوژ Arsan separator, Cream Turkey که در واقع نوعی دستگاه خامه‌گیر با حجم بالا و سرعت12000 دور در دقیقه بود استفاده شد. پس از رسوب و جمع شدن جلبک‌ها در قسمت داخلی روتور ،‌ جلبک‌های تغلیظ شده جمع آوری و به ظروف استریل جداگانه منتقل شدند.پس از برداشت نمونه ها پارامترهای وابسته مورد بررسی قرار گرفت.

تراکم سلولي:

تراکم سلولي توسط لام نئوبار، با استفاده از روش Lavens & Sorgeloos (1996) در پایان روز پانزدهم انجام گرديد.

میزان زیست توده (وزن خشك):

برای اندازه گیری زیست توده، در پایان روز پانزدهم از نمونه مورد نظر 400 میلی لیتر محلول جلبکی برداشته شد و با کاغذهای صافی غشایی از قبل توزین شده، فیلتر گردید. کاغذ صافی حاوی محلول جلبکی در آون الکتریکی در دمای 80 درجه سانتی گراد به مدت 4 ساعت خشک گردید و پس از خشک شدن، کاغذ صافی در دسیکاتور نگهداری شد و پس از هم دما شدن با محیط آزمایشگاه بوسیله یک ترازوی دیجیتالی مورد توزین قرار گرفت تا اختلاف وزن حاصل نشان دهنده وزن خشک جلبک باشد. با توجه به اینکه اختلاف وزن مربوط به 400 میلی لیتر جلبک فیلتر شده می باشد، لذا برای محاسبه وزن خشک یک میلی لیتر جلبک، عدد 400 به‌عنوان V در فرمول زیر لحاظ گردید تا وزن خشک بر حسب میلی‌گرم بر میلی لیتر محاسبه گردد (Ikedo& Omori. 1984)

استخراج و اندازه گیری لیپید:

برای استخراج لیپید از دستگاه سوکسله مدل Soxtec 2050 ساخت کشور سوییس استفاده گردید. ۱۰ گرم از هر نمونه زیست توده خشک شده، توسط هاون یکنواخت گردیده و از دستگاه سوکسله جهت استخراج استفاده شد. هر سیکل شامل جوشیدن به مدت ۲۵ دقیقه،‌ استخراج لیپید به مدت ۴۰ دقیقه و بازیابی حلال به مدت ۱۵ دقیقه بود. استخراج تمامی نمونه‌ها بطور یکسان در سه مرحله انجام گردید. جهت استخراج از سه حلال متداول دی اتیل اتر، ‌ان هگزان و ان پنتان با دمای نقطه جوش متفاوت و خلوص بالا استفاده گردید. برای حذف بقایای ریزجلبک،‌ لیپید استخراج شده به وسیله فیلتر 45/0 میکرومتر صاف شد. پس از تعیین مقدار لیپید،‌ لیپید خشک شده را در 4/0 میلی لیتر الکل ایزوپروپیل حل نموده و مقدار تری گلیسرید در لیپید اندازه گیری گردید (Xin et al., 2010). جهت محاسبه درصد لیپید زیست توده فاز آلی جدا شده در یک ویال که از قبل وزن شده بود (W1) ریخته شد و در دماي 50 درجه سلسیوس در آون مدل HD ساخت کشور آلمان قرار داده شد تا حلال تبخیر شود. پس از آن ویال ها دوباره وزن شدند (W2) و میزان لیپید کل با اختلاف بین وزن اولیه و ثانویه (W2-W1) برحسب درصد محاسبه شد (Nigam et al., 2011).

استخراج بیودیزل:

ترنس استریفیکاسیون اسیدهای چرب در فلاسک های حاوی سولفوریک اسید به عنوان کاتالیزور با نسبت مولی 1: 40 متانول به روغن استخراج شده در rpm 180 به مدت 5 ساعت صورت گرفت. پس از آن دو لایه تشکیل شد که لایه بالایی حاوی سوخت زیستی بوده و به واسطه پترولیوم اتر جداسازی شد (Dai et al., 2007).

آناليز آماری:

در اين پژوهش، پس از مشخص شدن سطوح تیمارها (جدول1) جهت طراحی و اجرای تحقیق از نرم افزار Design Expert V18 استفاده گردید. با توجه به تعداد سطوح تیمارها و محدودیت اجرای طرح از بخش سطوح بهینه فاکتوریل استفاده گردید. تعداد نمونه های اندازه گیری شده 70 نمونه بود. پس از انجام آزمایشها میزان تراکم سلولی، وزن خشک زیست توده، درصد لیپید و درصد بیودیزل تولیدی محاسبه و با بکارگیری شاخص آنالیز واریانس برای مقایسه داده ها در سطح معناداری 1 و 5 درصد استفاده گردید.

نتایج:

تراکم سلولی:

بررسی تاثیر نوع جلبک بر میزان تراکم سلولی در روش تولید سوسپانسیون در شرایط اسیدیته برابر با 8، شدت تابش نور 3000 لوکس، زمان تابش نور برابر با 16 ساعت در تمامی دماهای مورد بررسی نشان میدهد بیشترین و کمترین تراکم سلولی به ترتیب متعلق به جلبک سندسموس و دسمودسموس است (شکل 3). با توجه به معنادار بودن تاثیر پارامترهای محیطی بر میزان تراکم سلولی در هر سه جلبک، بیشترین میزان تکثیر سلول در دمای 25 درجه سلسیوس می باشد و کمترین میزان آن مربوط به دمای 20 دجه سلسیوس می باشد . با توجه به شکل 3 می توان گفت که میزان تراکم سلولی در محدوده 25 تا 30 درجه سلسیوس بیشتر از دمای 20درجه سلسیوس می باشد . این مقادیر در مدت زمان نوردهی 16 ساعت با اسیدیته 8 و شدت نوردهی 4000 بدست آمده است. در تمامی مراحل تحقیق محیط کشت BBM و میزان درصد دی اکسیدکربن 15% درنظر گرفته شد.

شکل 3- تاثير دما بر تراکم سلولي جلبکهای سندسموس، دسمودسموس و مخلوط دسمودسموس و سندسموس در شرایط ثابت pH8 و زمان نوردهی 16ساعت و شدت نوردهی 4000لوکس

درخصوص تاثیر مدت زمان نوردهی می توان گفت که با توجه به تاثیر مستقیم نور در میزان فتوسنتز با افزایش مدت نوردهی در هر سه نوع جلبک میزان تراکم سلولی افزایش یافته است اما با توجه به بررسی انجام گرفته تفاوت معناداری بین مدت زمان 16 و 18 وجود ندارد لذا با توجه به هزینه انرژی بهینه ترین مدت زمان نوردهی 16 ساعت انتخاب گردید. این نتایج در شدت نوردهی 4000لوکس بدست آمده است و ممکن است در شدت نور بالاتر بعنوان عامل بازدارنده باعث کاهش میزان فتوستنز گردد.

شکل 4- تاثير مدت زمان نوردهی بر تراکم سلولي جلبکهای سندسموس و دسمودسموس و مخلوط دسمودسموس و سندسموس در شرایط ثابت دمای25درجه ، شدت نوردهی 4000لوکس در pH8

با توجه به تاثیر شدت نوردهی بر میزان رشد و فعالیت متابولیت های اولیه و ثانویه مشاهده میگردد که بیشترین میزان تراکم سلولی در هر دو شدت 3000 و 4000 لوکس مربوط به جلبک سندسموس و کمترین میزان مربوط به جلبک دسمودسموس می باشد. در مقایسه بین دو میزان شدت نور در جلبک سندسموس بیشترین میزان مربوط به 3000 لوکس می باشد.

شکل 5 تاثير شدت نور بر تراکم سلولي جلبکهای سندسموس و دسمودسموس و مخلوط دسمودسموس و سندسموس در شرایط دمای 25درجه و مدت زمان نوردهی 16ساعت با pH8

در خصوص تاثیر پارامتر pH بر میزان تراکم سلولی با توجه به اینکه پارامترهای دیگرمانند شدت نوردهی 4000لوکس،.مدت نوردهی 16 ساعت و دما ۲۵ درجه سانتی گراد به صورت ثابت درنظر گرفته شده است نتایج بدست آمده نشان می دهد که مقدار تراکم سلولی در اسیدیته 8 نسبت به اسیدیته 9 بیشتر می باشد. البته با توجه به مقایسه میانگین انجام شده تفاوت معناداری بین این دو pH مشاهده نشد. در مقایسه بین میکروجلبکها ملاحظه میشود که بیشترین میزان مربوطه به سندسموس در pH 8 و کمترین میزان مربوط به دسمودسموس در pH 9 می باشد(شکل 6)

شکل 6 تاثير اسیدیته محیط کشت بر تراکم سلولي جلبکهای دسمودسموس،سندسموس و کشت مخلوط در دمای 25درجه سلسیوس ، مدت زمان نوردهی 16ساعت و شدت نوردهی 4000 لوکس

میزان زیست توده (وزن خشک):

در مقایسه بین جلبکها در شرایطی که مدت زمان نوردهی 16ساعت با شدت لوکس 3000 ،در هر سه دما و pH 8 مطابق شکل7بیشترین میزان مربوط به جلبک سندسموس و کمترین میزان مربوط به دسمودسموس می باشد. در مقایسه بین کشت مخلوط با دسمودسموس تفاوت معناداری از نظر میزان زیست توده ملاحظه نگردید.(شکل 7)

در خصوص تاثیر دما بر میزان زیست توده ملاحظه میگردد که در هر سه میکروجلبک بیشترین میزان مربوط به دمای 25درجه سلسیوس و کمترین میزان مربوطه به دمای 20درجه سلسیوس می باشد. نتایج ذکر شده در شرایط ثابت مدت زمان نوردهی 16 ساعت، شدت نوردهی 3000 لوکس و اسیدیته 8 بدست آمد.(شکل 7)

شکل7 تاثير دما بر میزان زیست توده جلبکهای دسمودسموس،سندسموس و کشت مخلوط در شرایط ثابت مدت زمان نوردهی 16 ساعت، شدت نور 3000 لوکس و pH8

با توجه به نقش مهم نور در انجام فرايند فتوسنتز و تولید زیست توده علاوه بر شدت نور ميزان نوردهي نيز مورد بررسي قرار گرفت که با توجه به شکل 10 ملاحظه می گردد که با افزايش ميزان نوردهي ميزان تراکم سلولي افزايش يافته و بيشترين ميزان آن مربوط به محدوده 16 ساعت نوردهي در میکروجلبک سندسموس بوده کمترین میزان مربوط به میکروجلبک دسمودسموس در 14 ساعت نوردهی می باشد(شکل 8).

شکل8تاثير مدت زمان نوردهی بر میزان زیست توده جلبکهای دسمودسموس،سندسموس و کشت مخلوط

در شرایط ثابت pH8، شدت نوردهی 3000 و دمای 25درجه سلسیوس

در بررسی بعمل آمده درخصوص تاثیر شدت نوردهی نتایج بدست آمده نشان داد که بیشترین میزان زیست توده تولیدی در میکروجلبک سندسموس در دمای ثابت 25 درجه سلسیوس،مدت زمان نوردهی 16 ساعت و اسیدیته 8 مربوط به شدت نوردهی 3000 لوکس بوده و کمترین میزان مربوط به میکروجلبک دسمودسموس در شدت نوردهی 4000 لوکس می باشد (شکل 9).

شکل9 تاثیر شدت نور دهی بر میزان زیست توده جلبک های دسمودسموس، سندسموس و کشت مخلوط در شرایط ثابت دمای 25درجه سلسیوس، مدت نوردهی 16 ساعت و pH8

در خصوص تاثير پارامتر pHبر ميزان تراکم سلولي نتايج بدست آمده نشان مي دهد که بیشترین مقدار تراکم سلولي مربوط به pH8 در میکروجلبک سندسموس با در نظر گرفتن شرایط ثابت دمای 25درجه سلسیوس، مدت نوردهی 16 ساعت و شدت نورد هی 3000 لوکس می باشد. کمترین میزان تراکم سلولي در pH برابر با 9 برای میکروجلبک دسمودسموس مشاهده مي‌شود (شکل10).

شکل10تاثير اسیدیته محیط کشت بر میزان زیست توده جلبک های دسمودسموس، سندسموس و کشت مخلوط در شرایط ثابت دمای 25درجه سلسیوس،مدت زمان نوردهی 16ساعت و شدت تابش 3000لوکس

میزان لیپید:

در بررسي تاثير پارامترهاي مختلف بر ميزان ليپيد توليدي بر حسب درصدی از وزن خشک زیست توده در ميکروجلبک های سندسموس، دسمودسموس و کشت مخلوط نتایج بدست آمده نشان می دهد که نوع جلبک و عوامل محیطی همانگونه که بر میزان تراکم سلولی تاثیر معنادار داشتند بر میزان لیپید تولیدی نیز تاثیر گذار هستند هرچند در برخی موارد این تاثیرات مشابه تغییرات تراکم سلولی نمی باشد. با توجه به شکل 11 بیشترین میزان لیپید تولیدی مر بوطه به میکروجلبک سندسموس و کمترین میزان مربوط به دسمودسموس می باشد. این نتایج در شرایط ثابت دمای 30 درجه سلسیوس، مدت زمان نوردهی 18 ساعت، شدت نوردهی 4000 لوکس و اسیدیته 9 بدست آمد . همانگونه که ملاحظه می گردد میزان تولید لیپید در کشت مخلوط کمتر از میکروجلبک دسمودسموس می باشد در حالی که میزان زیست توده تولیدی در کشت مخلوط بالاتر بود . نتیجه بدست آمده می تواند موید این امر باشد که همزیستی این دو میکروجلبک در افزایش متابولیتهای ثانویه البته در شرایط محیطی ذکر شده تاثیر مثبتی نداشته است و همچنان بیشترین میزان مربوط به کشت تک میکروجلبک سندموس می باشد(شکل11)

در مورد تاثير دما بر توليد ليپيد در ميکروجلبک های سندسموس، دسمودسموس و کشت مخلوط مشاهد می شود که با ثابت نگاه داشتن شدت تابش نور برابر با ۴۰۰۰ لوکس، مدت تابش نور برابر با ۱8 ساعت و اسيديته برابر با 9 بیشترین تولید لیپید مربوط به سندسموس و کمترین مربوط به کشت مخلوط می باشد در هر سه جلبک بالاترین میزان لیپید تولیدی در دمای 30 درجه سلسیوس و کمترین مربوط به دمای 20 درجه می باشد(شکل 11).

شکل11 تاثير دما بر میزان لیپید جلبک های دسمودسموس، سندسموس و کشت مخلوط در شرایط نوردهی 18ساعت، شدت نوردهی 4000لوکس و pH9

با توجه به نقش مهم نور در تولید متابولیتهای اولیه و ثانویه، نتایج بدست آمده نشان می دهد که بیشترین میزان لیپید تولید شده مربوط به 18 ساعت نوردهی در میکروجلبک سندسموس می باشد . این نتیجه در شرایط ثابت دمای 30درجه سلسیوس با شدت نور 4000 لوکس در اسیدیته 8 بدست آمده است. کمترین میزان تولید لیپید نیز مربوط به کشت مخلوط بوده و در تمامی مدت زمان نوردهی میزان لیپید جلبک تک کشت دسمودسموس بیشتر از کشت مخلوط می باشد(شکل12).

شکل 12 تاثیر مدت زمان نوردهی(الف)، شدت نوردهی(ب) و اسیدیته محیط(ج) بر میزان بیودیزل تولید شده در شرایط ثابت دمای 30درجه سلسیوس،شدت نوردهی 4000لوکس و مدت نوردهی 18 ساعت

میزان بیودیزل:

محتوای لیپید تحت تاثیر عواملی مختلفی می باشد. عواملی مانند مدت زمان نوردهی، شدت نوردهی و مقدار نیتروژن بر محتوای لیپید بسیار موثر است. در این بررسی تاثیر نوع جلبک بر درصد بیودیزل تولیدی نسبت به ماده خشک در روش تولید سوسپانسیون در شرایط اسیدیته برابر با 8، شدت تابش نور 4000 لوکس، زمان تابش نور برابر با 16 ساعت و دمای 25 درجه سلسیوس نشان میدهد بیشترین و کمترین درصد بیودیزل تولیدی به ترتیب متعلق به جلبک سندسموس و دسمودسموس است. در مقایسه بین کشت مخلوط و جلبک دسمودسموس ملاحظه میگردد که کشت مخلوط با ایجاد رقابت در جذب مواد غذایی توانسته باعث افزایش میزان متابولیت ثانویه (بیودیزل) گردد.(شکل 13)

شکل 13 تاثیر دما بر میزان بیودیزل تولیدی در شرایط ثابت شدت نوردهی 4000لوکس ، مدت نوردهی 18 ساعت و pH8

در مورد تاثير دما بر میزان بيوديزل تولیدی در ميکروجلبک های سندسموس، دسمودسموس وکشت مخلوط مشاهده مي شود که بيشترين درصد توليد در هر سه تیمار مربوط به دماي ۲5 درجه سلسیوس بوده و بالاترین آن مربوط به میکروجلبک سندسموس می باشد. در مقایسه میانگین بین دو دمای 25 و 30 درجه سلسیوس اختلاف معناداری مشاهده نشده است. لذا بهترین دما در شرایط ثابت مدت نوردهی 18 ساعت با شدت 4000 لوکس و اسیدیته 8، دمای 25درجه سلسیوس می باشد. همچنین کمترین میزان بیودیزل نیز مربوط به میکروجلبک دسمودسموس در دمای 20 درجه سلسیوس می باشد(شکل16). درخصوص مدت زمان نوردهی ملاحظه می گردد که بیشترین میزان بیودیزل تولیدی مربوط به 16 و 18 ساعت نوردهی می باشد که با توجه به معنادار نبودن اختلاف بین آنها نوردهی 16 ساعت انتخاب گردید. درخصوص مقایسه بین تک کشت دسمودسموس و کشت مخلوط اختلاف معناداری مشاهده گردید که نشان دهنده تاثیر رقابت دو سویه در جذب مواد غذایی و میزان فتوسنتز در متابولیت های ثانویه تاثیر مستقیم داشته و باعث افزایش میزان لیپید و بیودیزل گردیده است.(شکل 14)

شکل 14 تاثیر مدت زمان نوردهی بر میزان بیودیزل تولیدی در شرایط ثابت شدت نوردهی 4000لوکس، دمای 25 درجه سلسیوس و pH8

درخصوص تاثیر شدت نور بر میزان بیودیزل تولیدی با توجه به شکل 15 می توان گفت که در شرایط ثابت (دمای 25 درجه سلسیوس،مدت زمان نوردهی 16 ساعت و اسیدیته 8 ) بیشترین میزان لیپید تولید شده مربوط به جلبک سندسموس با شدت لوکس 4000 می باشد. میزان تولید بیودیزل در کشت مخلوط بالاتر از تک کشت میکروجلبک دسمودسموس می باشد. با توجه به بالا بودن میزان بیودیزل در هرسه تیمار در شدت 4000 لوکس می توان نتیجه گرفت که بالا بودن شدت لوکس در افزایش میزان بیودیزل تاثیر مثبت داشته است. درخصوص تاثیر گذاری اسیدیته محیط کشت با توجه به نتایج بدست آمده ملاحظه می گردد که بیشترین میزان بیودیزل تولید شده در میزان اسیدیته 9 مربوط به میکروجلبک سندسموس می باشد. با توجه به شکل15 ملاحظه می گردد که میزان بیودیزل در کشت مخلوط نسبت به کشت تک دسمودسموس میزان بالاتری دارد.

شکل 15 تاثیر اسیدیته محیط و شدت نوردهی بر میزان بیودیزل در شرایط ثابت مدت زمان نوردهی 16 ساعت ، دمای 25 درجه سلسیوس و pH8

بحث:

جایگزین کردن منابع تولید بیودیزل از نسل اول و دوم به نسل سوم با توجه به اهمیت امنیت غذایی و بحران جمعیت از اهمیت بسیار بالایی برخوردار است . لذا تحقیقات گسترده ای در این زمینه انجام گرفته است. در این بین بهینه سازی شرایط تولید از اهمتی بالایی برخوردار است نجفی و همکاران ریزجلبک کلرلا ولگاریس را برای تولید بیودیزل معرفی نمودند و اذعان داشتند که استفاده از بیودیزل تأثیر محسوسی بر مصرف سوخت و کاهش تولید مونوکسید کربن دارد و علاوه بر بهره دهی مطلوب لیپید، اسید چرب مستخرج از نمونه های انتخاب شده دارای خواص فیزیکی و شیمیایی مورد نیاز برای تولید بیودیزل نیز می باشد (Najafi et al,.2012).

Malek ahmadi و همکاران(2019) در تحقیق خود بالاترین میزان رشد و تولید بیومس، کمترین زمان تقسیم و همچنین بیشترین میزان تولید لیپید در بین جلبکهای سبز را به میکروجلبک Scenedesmus sp نسبت داده و به دلیل تولید بالاترین و بهترین محتوای لیپیدی آن را به عنوان یک کاندید مناسب برای سوخت بیو دیزل معرفی کردند. به علاوه، آنالیز لیپیدها نشان داد که 80 درصد اسیدهای چرب از نوع اشباع و غیراشباع با یک پیوند دوگانه بودند. همچنین پالمیتیک اسید و اولئیک اسید مهم ترین اسیدهای چرب جداسازی شده می باشند.این نتیجه موید نتیجه تحقیق حاضر می باشد که با اختلاف معناداری کشت تک جلبک سندسموس را در میزان تولید لیپید و بیودیزل به عنوان کاندید اول معرفی میکند.

سلول های ریزجلبکی تمایل به عملکرد منظم در تک کشت دارند، تحقیقات زیادی در تک کشت انجام شده است. در حالی که در یک کشت مخلوط، عملکرد ریزجلبک ها به دلیل تعامل آنها پیچیده تر است. نتایج به‌دست‌آمده در این مطالعه نشان داد که در میزان تولید زیست توده، میکروجلبک سندسموس عملکرد بهتری داشته اما در مقایسه بین تک کشت جلبک دسمودمسوس و کشت مخلوط میزان زیست توده کشت مخلوط میزان بالاتری را نشان می دهد.

در تحقیق فلاح و همکاران نشان داده شده است که تنش رقابتی بین گونه‌های ریزجلبکی، سلول‌های جلبک را برای استفاده بیشتر از مواد مغذی محیط کشت تحریک می‌کند که در نتیجه نرخ تکثیر جلبک افزایش می‌یابد. دراین تحقیق ، محتوای کلروفیل و کاروتنوئید کل کشت مخلوط ریزجلبک در مقایسه با تک‌کشت گونه‌های جلبکی نیز افزایش داشته است در تحقیق حاضر نیز در میکروجلبک دسمودسموس همین نتیجه مشاهده میگردد. اما در مورد میکروجلبک سندسموس ملاحظه میگردد که کشت تک این جلبک نتایج بالاتری نسبت به کشت مخلوط داشته است(Fallah et al., 2020)

در مطالعه Mohan وهمکاران که در مورد پتانسیل ریزجلبک های مخلوط برای تولید بیودیزل با تصفیه همزمان انجام شده است نتایج نشان می دهد که رقابت بین سلول‌های جلبکی و همچنین محیط شور شرایط استرس‌زایی را برای کشت جلبکی مختلط فراهم می‌کند که در آن گونه‌های جلبکی می‌توانند مقادیر بیشتری از مواد مغذی مصرف کنند که این نتیجه با نتایج بدست آمده از این تحقیق سازگاری دارد به طوریکه میزان زیست توده تولیدی در کشت مخلوط اختلاف معناداری با کشت تک سویه دسمودسموس دارد(Mohan et al., 2011)

همچنین مشاهده شد که اگرچه در کشت مخلوط سویه ها تقریباً تمام مواد مغذی محیط کشت را مصرف کرد، اما در بسیاری از موارد آنها مواد مغذی را برای ذخیره رنگدانه‌های سلولی تخصیص ندادند ودر کشت مخلوط سلول‌های ریزجلبک، مواد مغذی را برای تکثیر سلولی جذب می‌کند و تاثیر کشت مخلوط تنها در متابولیت های اولیه مشاهده می گردد و بر میزان متابولیتهای ثانویه تاثیر چندانی ندارند که با نتایج این تحقیق سازگاری دارد(Gupta et al., 2016)

نیتروژن یکی از عناصر کلیدی برای تکثیر سلولی گونه های جلبکی است. در مطالعه Taskan به بررسی میزان جذب نیتروژن در کشتهای تک و مخلوط سه گونه میکروجلبک کلرلاولگاریس ، سندسموس و نانوکلورپسیس در محیط آب شور و شیرین پرداخته شد نتایج بدست آمده نشان می دهد که بازده زیست توده در کشت جلبکی مخلوط به طور معنی‌داری بیشتر از کشت تک‌کشت در میکروجلبکهای C.vulgaris و Scenedesmos obliquss بود که نشان داد کشت مخلوط دریایی و گونه های جلبک آب شیرین تمایل به تخصیص مقادیر نیتروژن برای تکثیر سلولی بالاتر داشتند. بنابراین، اختلاط گونه‌های مختلف جلبک می‌تواند یک استراتژی مناسب برای تحریک گونه‌های جلبکی به منظور بهبود راندمان حذف مواد مغذی در پسابها یا آبهای غیر متعارف باشد (Taskan E, 2016)

با توجه به تاثیر پارامترهای تنش زا از جمله عوامل محیطی و همچنین میزان مواد مغذی بر متابولیت های ثانویه در تحقیق انجام شده توسط حسن پور و همکاران نتایج نشان می دهد که محتوای لیپید کشت جلبک مخلوط در مقایسه با کشت تکی جلبک دریایی Nanochloropsis sp کمی کاهش یافته است.این نتیجه با نتیجه تحقیق حاضر همخوانی دارد. اگرچه کشت تک کشت جلبک برای تولید سوخت زیستی به طور گسترده در دهه های گذشته مورد مطالعه قرار گرفته است، اما نشان داده شده است که خطر آلودگی در تک کشت ها بالا است که ممکن است منجر به هزینه های بالای درمان شود و حتی می تواند منجر به توقف فرآیند شود(Hassanpour et l., 2015). در حالی که اگر سوخت زیستی هدف باشد، کشت مخلوط سناریوی امیدوارکننده‌ای است که در آن خطر آلودگی کم است و امکان فرآیند مستمر زیاد است که با نتایج این تحقیق سازگاری دارد (Kleerebezem et al., 2007)

با توجه به تاثیر پارامتر های محیطی بر میزان متابولیت های اولیه و ثانویه میکروجلبکها بیشترین میزان زیست توده تولیدی جلبک دسمودسموس در شدت تابش نور ۳۰۰۰ لوکس،‌مدت تابش برابر با ۱۸ ساعت، شوری برابر با ۵ و pH برابر با ۹ به دست آمد. بالاترین میزان تولید لیپید و بیودیزل در دمای ۲۶ درجه سانتی گراد، شدت تابش نور برابر با ۴۲۰۰ لوکس، مدت تابش برابر با ۱۶ ساعت و pH برابر با ۹ بود..این نتایج در مقایسه با شرایط محیطی تحقیق حاضر همخوانی دارد( Niazkhani et al., 2022). به عبارت دیگر اعمال شرایط استرس مانند افزایش شدت نور،باعث افزایش میزان لیپیدگردیده است که با نتایج تحقیق حاضر همخوانی دارد. نتایج این تحقیق می توان نشان می دهد که ترکیب تغییرات شدت و مدت زمان نوردهی در شرایط یکسان اسیدیته محیط توانسته است در دمای پایین تر نیز لیپید را تولید نماید. از سوی دیگربالاترين بيوديزل توليد شده در دماي ۲۶ درجه سانتي گراد، شدت تابش نور ۴۲۰۰ لوکس، مدت تابش نور برابر با ۱۶ ساعت، شوري برابر با ppm11 و اسيديته برابر با ۹ است که با نتایج تحقیق نیازخانی و همکاران سازگاری دارد.

Wang و همکاران(2019) در مطالعه اي که بر روي کشت دسمودسموس داشتند اعلام کردند که دماي بهينه براي رشد جلبک دماي۲۷ درجه سانتي گراد، شدت نور ۱۰۸ ميکرومول بر متر مربع در ثانيه، pH برابر با ۷ و جريان هواي نيم ليتر در دقيقه است که از نظر دما و pH نزديک به نتايج به دست آمده است. Nzayisenga و همکاران (2020)اثر شدت نور بر رشد و توليد چربي در ميکروجلبک‌هاي رويش يافته در پساب را بررسي کردند. نتايج مطالعه ايشان نشان داد که افزايش شدت نور باعث افزايش توليد زيست توده در جلبک دسمودسموس مي‌شود. در اين مطالعه نيز از شدت تابش 3000 لوکس تا 4500 لوکس بر توليد جلبک افزوده شد درحالی که نقطه اشباع تابش یا بازدارندگی نوری را 4500لوکس معرفی نمودند. نتیجه اعلام شده در مقایسه با نتیجه این تحقیق با توجه به اینکه شدت نور بهینه 4200لوکس بدست آمده سازگاری دارد. Chaudhary و همکاران(2017) در مطالعه اي که بر روي توليد چربي و رشد جلبک دسمودسموس انجام دادند بيشترين رشد جلبک را در pH برابر با 4/6 مشاهده نمودند درحالیکه در تحقیق حاضر شرایط بهینه برای اسیدیته محیط جهت رشد میکورجلبک دسمودسموس

نتيجه‌گيري نهایی:

نتایج بدست آمده نشان داد که شرایط بهینه برای تولید متابولیت های اولیه( میزان تراکم سلولی، میزان زیست توده) و متابولیت های ثانویه( درصد تولید لیپید و بیودیزل) از نظر انتخاب روش کشت( کشت تکی و یا کشت مخلوط) میکروجلبک سندسموس و دسمودسموسس و همچنین پارامترهای محیطی(دما، مدت و شدت نوردهی و اسیدیته محیط) متفاوت می باشد. درخصوص متابولیت های اولیه در برخی موارد مشاهده شده که علیرغم افزایش میزان تراکم سلولی میزان زیست توده افزایش چندانی نداشته است و بواسطه تنش های محیطی اندازه سلولها رشد چندانی نداشته است. اما در این تحقیق مشاهده گردید که میزان زیست توده با افزایش میزان تراکم سلولی افزایش یافته است. در مورد متابولیت های ثانویه نیز ممکن است شرایط بهینه تولید زیست توده برای تولید متابولیت های ثانویه مناسب نبوده و بایستی در شرایط متفاوتی به دنبال بالاترین میزان تولید این متابولیتها بگردیم. از سوی دیگر با توجه به تاثیر کشت مخلوط در مقاومت به آلودگی ها در صورتی که شرایط برای کنترل کشت های خالص وجود نداشته باشد بهتر است از گونه هایی با شرایط یکسان استفاده گردد تا در مجموع تاثیر مثبت در عملکرد تولید داشته باشد. با توجه به اینکه این کشت در شرایط کاملا کنترل شده انجام گرفته است تفاوت معناداری در مقایسه کشت خالص با کشت مخلوط در جلبک سندموس مشاهد نگردید اما در ریزجلبک دسمودسموس که به نسبت حساس تر می باشد توانسته عملکرد بهتری نسبت به کشت خالص داشته باشد. همچنین در مورد تاثیر پارامترهای موثر محیطی نتایج نشان داد که شرایط بهینه برای تولید متابولیت های اولیه و ثانویه با هم متفاوت می باشد. اما می توان بهینه ترین شرایط را برای تولید زیست توده و متابولیتهای ثانویه بدست آورد که در این تحقیق بهترین شرایط دمای 25، اسیدیته 8 ، مدت زمان نوردهی 16 ساعت با لوکس 4000 بدست آمد. میتوان با انتخاب گونه های متفاوت تاثیرات سویه ها را بطور مشخص بررسی کرد. به طور کلی، نتایج متمایز تری را می توان با بررسی برهمکنش و همچنین رقابت بین سایر سویه های ریزجلبکی در یک کشت مخلوط به دست آورد.

منابع:

Andersen, R.A. (2005). Algal culturing techniques. Elsevier, Amsterdam, 578 pp.

Afsharbakhsh M., Mohammadi, A., Mashadi, H. and Mahmoudnia, F. (2020). Effect of culture medium temperature and pH on performance of micro algae of Spirolinaplatensis in vertical photobioreactor. System Researches and Agriculture Mechanisation, 21(76): 99-116. (in Persian)

Bharti, R.K.; Singh, A.; Dhar, D.W.; Kaushik, A. Biological Carbon Dioxide Sequestration by Microalgae for Biofuel and Biomaterials Production. In Biomass, Biofuels, Biochemicals; Elsevier: Amsterdam, The Netherlands, 2022; pp. 137–153

Chaudhary R., Khattar J. I. S.Singh D.P. (2017). Growth and lipid production by Desmodesmus armatus subspicatus and potential of lipids for biodiesel production. Journal of Energy and Environmental Sustainability,26(3): 58-63.

Dai C., Tao J., Xie F., Dai, Y.J. and Zhao M. (2007). Biodiesel generation oleaginous yeast Rhodotorula glutinis with xylose assimilating capacity. African Journal of Biotechnology, 6(18):2130-2134.

Deniz I. (2020). Determination of growth conditions for Chlorella vulgaris. Mar.sci. Tech. Bull. 9(2): 114-117.

El-Fadaly H., El-Ahmady N. Marvan E.M. (2009). Single cell oil production by an oleaginous yeast strain in a low cost cultivation medium. Research Journal of Microbiology, 4(8):301-313.

Fabregas J., Domingue A., Regueiro M., Maseda A., Otero A.(2000). Optimazation of culture medium for the continuous cultivation of the microalgae Haematococcus pluvialis. Journal of Microbiology and Biotechnology, 53 (5): 530- 5.

Fallahi A, Hajinajaf N, Tavakoli O, Sarrafzadeh MH. Cultivation of Mixed Microalgae Using Municipal Wastewater: Biomass Productivity, Nutrient Removal, and Biochemical Content. Iran J Biotechnol. 2020 Oct 1;18(4):e2586. doi: 10.30498/IJB.2020.2586. PMID: 34056025; PMCID: PMC8148641

Farsani M.N., Meshkiny S., Manaffar R., Asal Pishe Z. Response of growth, protein and fatty acid content of Desmodesmus armatus cuneatus to the repletion and depletion of nitrogen. Biological Journal of Microorganism 2015; 3 (12): 59- 68.

Georgianna DR, Mayfield SP. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels. Nature. 2012;488(7411):329–335. doi: 10.1038/nature11479. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Gupta PL, Choi HJ, Lee SM. Enhanced nutrient removal from municipal wastewater assisted by mixotrophic microalgal cultivation using glycerol. Environ Sci Pollut Res Int. 2016;23(10):114–123. doi: 10.1007/s11356-016-6224-1.

González-González, L.M.; Correa, D.F.; Ryan, S.; Jensen, P.D.; Pratt, S.; Schenk, P.M. Integrated Biodiesel and Biogas Production from Microalgae: Towards a Sustainable Closed Loop through Nutrient Recycling. Renew. Sustain. Energy Rev. 2018, 82, 1137–1148.

Hall CAS, Benemann JR. Oil from Algae? BioScience. 2011;61(10):741–742. [Google Scholar]

Hassanpour M, Abbasabadi M, Ebrahimi S, Hosseini M, Sheikhbaglou A. Gravimetric enrichment of high lipid and starch accumulating microalgae. Bioresour Technol. 2015;196:17–21. doi: 10.1016/j.biortech.2015.07.046

Hegewald E. (1997). Taxonomy and phylogeny of Scenedesmaceae Algae. 12:235-246.

Imamogul E., Sukan F.V. and Dalay M.C. (2007). Effect of different culture media and light intensities on growth of Haematococcus pluvialis. Natural Enginrring Science, 3 (1): 05- 09.

Karlsson, H.; Ahlgren, S.; Sandgren, M.; Passoth, V.;Wallberg, O.; Hansson, P.-A. Greenhouse Gas Performance of Biochemical Biodiesel Production from Straw: Soil Organic Carbon Changes and Time-Dependent Climate Impact. Biotechnol. Biofuels 2017,10, 217. [CrossRef]

Kiaei, E., Soltani, N., Mazaheri Assadi, M., Khavarinegad, R., Dezfulian, M. (2013). Study of optimal conditions in order to the use of the cyanobacteria Synechococcus sp. ISC106 as a candidate for biodiesel production. Journal of Aquatic Ecology. 2(4): 40-51.

Kleerebezem R, van Loosdrecht MC. Mixed culture biotechnology for bioenergy production. Curr Opin Biotechnol. 2007;18(3):207–212. doi: 10.1016/j.copbio.2007.05.001.

Malek Ahmadi, F., and Khavari Nejad, R., and Soltani, N., and Najafi, F., and Nejad atari,T.(2019). Investigation of physiological properties of green algae in order to use them as biodiesel fuel. Plant Environmental Physiology, 14 (1): 30-46.

Matusiak-Mikulin K., Tukaj C. and Tukaj Z. (2007). Relatinships between growth, development and photosynthetic activity during the cell cycle of Desmodesmus armatus armatus (Chlorophyta) in synchronous cultures. European Journal of Phycology, 41(1):38-49

Moreno-Garrido I. (2008). Microalgae immobilization: Current techniques and uses. Bio resource Technology, 99: 3949-3964.

Mohan SV, Devi MP, Mohanakrishna G, Amarnath N, Babu ML, Sarma PN. Potential of mixed microalgae to harness biodiesel from ecological water-bodies with simultaneous treatment. Bioresour Technol. 2011;102(2):109–117. doi: 10.1016/j.biortech.2010.08.103.

Meireles L.C., Catarina A., Guedes A.C. and Malcata F.X.(2003). Lipid class composition of the microalgae Pavlova lutheri: Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic acids. Agriculture Food Chemistry,. 51: 2237-2241.

Naderi Farsani M., Meshkini S. and Manaffar R. (2013). Investigation of optimal growth and nutritional value of two micro algae Hematococcus and Desmodesmus armatus in different culture media. Journal of microorganism biology, 14: 49-60 (In Persian).

Naderi Farsani, M. Meshkini S., Manaffar R. and Banayi M. (2015). Effects of different level of nitrogen on growth and lipid contents of two species of freshwater micro algae (Desmodesmus armatus cunaetus and Haematococcus sp). Utilization and culture of water organism, 4(1): 15-27.

Najafi, B., Torkian, M., Hejazi M.A., Zamzamian, A.A.( 2012). Effect of Microalgae Biodiesel on Performance Parameters and Exhaust Emissions from IDI Diesel Engine. Fuel and Combustion. 4(2): 29-42.

Niazkhani, A, Mohammadi, A, Mashhadhi, H, and Mahmoudnia, F. (1401). The effect of different environmental factors on the optimal level of cell density, biomass production, lipid and biodiesel production in Desmodesmos microalgae. Plant environmental physiology. doi: 10.30495/iper.2022.1946872.1754

Novoveská L, Franks DT, Wulfers TA, Henley WJ. Stabilizing continuous mixed cultures of microalgae. Algal Research. 2016;13:126–133. doi: 10.1016/j.algal.2015.11.021. [CrossRef] [Google Scholar]

Nzayisenga J., Farge X., Groll S.L. and Sellstedt, A. (2020). Effects of light intensity on growth and lipid production in microalgae grown in wastewater. Biotechnology for Biofuels, 13(4):135-147

Ratledge C. and Cohen Z. (2008). Microbial and algal oils: Do they have a future for biodiesel or as commodity oils? Technology, 20(7): 155-160

Rostami, S., Ghobadian, B., Savadkouhi, L., Ebrahimi, R. (2010). Experimental Investigation of Effect of Injection Pressure on Performance of a Diesel Engine Using Blends of Biodiesel and Diesel. The Journal of Engine Research. 21: 73-83.

Salama el S, Kim HC, Abou-Shanab RA, Ji MK, Oh YK, Kim SH, et al. Biomass, lipid content, and fatty acid composition of freshwater Chlamydomonas mexicana and Scenedesmus obliquus grown under salt stress. Bioprocess Biosyst Eng.2013;36(6):827-833. doi.org/10.1007/s00449-013-0919-1 http://ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23411874

Sanchez S., Martinez E. and Espinola F.(2000). Biomass production and biochemicalvariability of the marine microalgae Isochrysis galbana in relation to culturemedium. Biochemistry Enginering, 6(1): 13- 18.

Soeder, C. J. (1986). A historical outline of applied algology. In Handbook of Microalgal Mass Culture; Richmond, A., Ed.; CRC Press: Boca Raton, FL. pp. 25-41

Taskan E. Performance of mixed algae for treatment of slaughterhouse wastewater and microbial community analysis. Environ Sci Pollut Res Int. 2016;23(20):474–482. doi: 10.1007/s11356-016-7241-9

Unpaprom, Y., Tipnee, S. & Ramaraj, R. (2015). Biodiesel from green alga Scenedesmus acuminatus. International Journal of Sustainable and Green Energy. Special Issue: Renewable Energy Applications in the Agricultural Field and Natural Resource Technology, 4(1), 1-6

Wang S., Cao M., Wand B., Deng R., Gao Y. and Liu P. (2019). Optimization of growth requirement and scale-up cultivation of freshwater algae Desmodesmus armatus armatus using response surface methodology. Aquaculture Research, 50(11): 3313-3325.

Xin L., Hong-Ying H., Jia Y. and Yin-Hu W. (2010). Enhancement effect of ethyl-2-methyl acetoacetate on triacylglycerols production by a freshwater microalga, Scenedesmus sp. LX1. Bioresource Technology, 101(24):9819-21.

Investigating the productivity of biomass, lipid content, and biodiesel fuel in the mixed culture of Scenedesmus sp and Desmodesmus armatus microalgae.

Abstract:

The results showed that the highest amount of cell density and biomass in the conditions of a temperature of 25 degrees Celsius, the light intensity of 3000 lux, 16 hours of exposure, and acidity of 8 is related to the pure culture of Scenedesmus sp and then the mixed culture of Scenedesmus sp and Desmodesmus armatus . The highest amount of lipid production in constant temperature conditions of 30oC, 18 hours of exposure, the light intensity of 4000 lux, and acidity of 9 were related to Scenedesmus sp and then Desmodesmus armatus . Regarding the amount of biodiesel produced, the highest amount was related to Scenedesmus sp microalgae and then Desmodesmos in the conditions of 16 hours of exposure, 4000 lux radiation, a temperature of 25 degrees Celsius, and a ph of 8.

The results showed that the mixed microalgae culture compared to the pure culture had a positive effect on the production of biomass and cell density and a negative effect on the production of secondary metabolites such as lipids. Of course, regarding the percentage of extracted biodiesel, it was observed that the biodiesel in the mixed culture was higher than in the pure culture of Desmodesmus armatus algae.

Keywords: mixed culture, microalgae, primary metabolite, secondary metabolite, pure culture

[1] Desmodesmus armatus e

[2] Scenedesmus sp

[3] Merck

[4] Bold basal medium(BBM)

Share To

Article Url

Investigating the productivity of biomass, lipid content, and biodiesel fuel in the mixed culture of Scenedesmus sp. and Desmodesmus armatus microalgae.