The effectiveness of Micrococcus luteus bacteria on some blood and immune indices of common carp fry
Subject Areas : Journal of Animal Biology
Mehran Avakh Keysami
1
*
,
Alireza Akbari
2
,
Hamid Abdollahpour Biria
3
,
Maryam Avakh Keysami
4
1 - . Department of Fisheries and Aquatics, Mirzakochek Khan Fisheries Sciences and Industries Training Unit, Agricultural Research, Education and Extension Organization Rasht, Iran.
2 - . Department of Fisheries and Aquatics, Mirzakochek Khan Fisheries Sciences and Industries Training Unit, Agricultural Research, Education and Extension Organization Rasht, Iran.
3 - Department of Fisheries, Tal.C, Islamic Azad University, Talash, Iran
4 - Research Department of Experimental Sciences Education, General Directorate of Education, Gilan Province, Bint Al-Hoda Sadr Educational Campus, Rasht, Iran
Keywords: Common carp, Micrococcus luteus, Blood indices, Immune indices,
Abstract :
This research was conducted to investigate the effect of Micrococcus luteus bacteria on the blood indices, and immunology of common carp fry (Cyprinus carpio) in Mirzakochek Khan Training Center and Shahid Ansari Bony Fish Center in Gilan was carried out in 2023. Micrococcus luteus isolated from the digestive tract of common carp was fed to commercial pellet feed of 300 pieces of common carp juveniles (28.018 ± 2.87) for 8 weeks with 5 treatments and 3 replications (20 pieces of fish in each tank) used. Mixing fish feed in the suspension of Micrococcus luteus, 5 types of diets with different concentrations of Micrococcus in the pellet including 106, 107 cells/g were prepared as treatments 1, 2 and control without bacteria. After 56 days of feeding with these treatments, different levels of Micrococcus luteus bacteria in the diet of common carp fry increase the amount of The values of hematocrit, red blood cells, and hemoglobin, values of MCV and MCH MCHC, neutrophil and monocyte, sodium, lysozyme, and C3 in treatments 1 and 2 were significantly higher than the control treatment. In this regard, treatment 3 had the highest values, but the amounts of calcium, phosphorus, IGM, and C4 in the control treatments, treatments 1 and 2 did not have a statistically significant difference. There was a significant difference between the number of gram-positive and gram-negative bacteria in the digestive tract and water of the rearing tanks compared to the control treatment (P<0.05). Analysis of the results showed the benefits of using M. luteus probiotic in the diet of common carp fry in some cases. M. luteus is usually not pathogenic for fish. Therefore, the use of this probiotic in common carp farming to increase the ability deal with diseases is recommended.
1. Aattouri, N., Bouras, M., Tome, D., Marcos, A., Lemonnier, D. 2002. Oral ingestion of lactic-acid bacteria by rats increases lymphocyte proliferation and interferon-γ production. British Journal of Nutrition, 87(4): 367-373.
2. Abd El-Rhman, A. M., Khattab, Y. A., Shalaby, A. M. 2009. Micrococcus luteus and Pseudomonas species as probiotics for promoting the growth performance and health of Nile tilapia, Oreochromis niloticus. Fish & Shellfish Immunology, 27(2): 175-180.
3. Al‐Dohail, M. A., Hashim, R., Aliyu‐Paiko, M. 2009. Effects of the probiotic, Lactobacillus acidophilus, on the growth performance, haematology parameters and immunoglobulin concentration in African Catfish (Clarias gariepinus, Burchell 1822) fingerling. Aquaculture Research, 40(14): 1642-1652.
4. Ali, A. 2000. Probiotics in fish farming. Evaluation of a bacterial mixture. Rapport-Sveriges Lantbruksuniversitet, Vattenbruksinstitutionen (Sweden), (19).
5. Ali، F. H. M. 2010. Probiotics feed supplement" to improve quality of broiler chicken carcasses. World Journal of Dairy and Food Sciences, 5: 93-99.
6. Aly, S. M., Ahmed, Y. A. G., Ghareeb, A. A. A., Mohamed, M. F. 2008. Studies on Bacillus subtilis and Lactobacillus acidophilus, as potential probiotics, on the immune response and resistance of Tilapia nilotica (Oreochromis niloticus) to challenge infections. Fish & shellfish immunology, 25(1-2): 128-136.
7. Anderson, D. P., Roberson, B. S., Dixon, O. W. 1979. Plaque-forming cells and humoral antibody in rainbow trout (Salmo gairdneri) induced by immersion in a Yersinia ruckeri O-antigen preparation. Journal of the Fisheries Board of Canada, 36(6): 636-639.
8. Aubin، J. Gatesoupe، F. J. Labbé، L., Lebrun، L. 2005. Trial of probiotics to prevent the vertebral column compression syndrome in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum). Aquaculture Research، 36: 758-767.
9. Balcázar, J. L., De Blas, I., Ruiz-Zarzuela, I., Cunningham, D., Vendrell, D., Múzquiz, J. L. 2006. The role of probiotics in aquaculture. Veterinary microbiology, 114(3-4): 173-186.
10. Blaxhall, P. C., Daisley, K. W. 1973. Routine haematological methods for use with fish blood. Journal of fish biology, 5(6): 771-781.
11. Brunt, J., Austin, B. 2005. Use of a probiotic to control lactococcosis and streptococcosis in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). Journal of fish diseases, 28(12): 693-701.
12. Brunt, J., Newaj‐Fyzul, A., Austin, B. 2007. The development of probiotics for the control of multiple bacterial diseases of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). Journal of Fish Diseases, 30(10): 573-579.
13. Carnevali, O., de Vivo, L., Sulpizio, R., Gioacchini, G., Olivotto, I., Silvi, S., Cresci, A. 2006. Growth improvement by probiotic in European sea bass juveniles (Dicentrarchus labrax, L.), with particular attention to IGF-1, myostatin and cortisol gene expression. Aquaculture, 258(1-4): 430-438.
14. Dimitroglou, A., Merrifield, D. L., Moate, R., Davies, S. J., Spring, P., Sweetman, J., Bradley, G. 2009. Dietary mannan oligosaccharide supplementation modulates intestinal microbial ecology and improves gut morphology of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). Journal of animal science, 87(10): 3226-3234.
15. Drabkin, D. I. 1945. Crystallographic and optical properties of human hemoglobin. A proposal for the standarization of hemoglobin. American Journal of Medicine, 209: 268-270.
16. Ferguson, R. M., Merrifield, D. L., Harper, G. M., Rawling, M. D., Mustafa, S., Picchietti, S., Davies, S. J. 2010. The effect of Pediococcus acidilactici on the gut microbiota and immune status of on‐growing red tilapia (Oreochromis niloticus). Journal of applied microbiology, 109(3): 851-862.
17. Garibaldi, L. 2012. The FAO global capture production database: a six-decade effort to catch the trend. Marine Policy, 36(3): 760-768.
18. Hoseinifar, S. H., Khalili, M., Rostami, H. K., Esteban, M. Á. 2013. Dietary galactooligosaccharide affects intestinal microbiota, stress resistance, and performance of Caspian roach (Rutilus rutilus) fry. Fish & Shellfish Immunology, 35(5): 1416-1420.
19. Hoseinifar, S. H., Roosta, Z., Hajimoradloo, A., Vakili, F. 2015. The effects of Lactobacillus acidophilus as feed supplement on skin mucosal immune parameters, intestinal microbiota, stress resistance and growth performance of black swordtail (Xiphophorus helleri). Fish & shellfish immunology, 42(2): 533-538.
20. Irianto A., Austin B. 2002. Probiotics in aquaculture. Journal of fish diseases, 25(11): 633-642. doi.org/10.1046/j.1365-2761.2002.00422.x
21. Houston, A. H., Cyr, D. 1974. Thermoacclimatory variation in the haemoglobin systems of goldfish (Carassius auratus) and rainbow trout (Salmo gairdneri). Journal of Experimental Biology, 61(2): 455-461
22. Joborn، A., Olsson، J. C., Westerdahl، A., Conway، P. L., Kjelleberg، S. 1997. Colonization in the fish intestinal tract and production of inhibitory substances in intestinal mucus and faecal extracts by Carnobacterium sp. strain K1. Journal of Fish Diseases, 20: 383-392.
23. Kesarcodi-Watson, A., Kaspar, H., Lategan, M. J., Gibson, L. 2008. Probiotics in aquaculture: the need, principles and mechanisms of action and screening processes. Aquaculture, 274(1): 1-14.
24. Keysami M. A., Mohammadpour M., Saad C.R. 2012. Probiotic activity of Bacillus subtilis in juvenile fresh water prawn, Macrobrachium rosenbergii (de Man) at different methods of administration to the feed. Jounal of Aquaculture International, 20: 499-511. doi: 10.1007/s10499-011-9481-5
25. Keysami M.A., Mohammadpour M. 2013. Effect of Bacillus subtilis on Aeromonas hydrophila infection resistance in juvenile freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de Man). Aquaculture International, 21: 553-562. doi 10, 1007/s10499-012-9588-3.8.
26. Keysami, M. A., Shalmani, A. Z., Mojdehi, M. A. 2021. Effectiveness of Bacillus subtilis on growth and survival of common carp larva in non-earthen ponds. Journal of Animal Environment, 13(3): 261-268.
27. Khattab, Y. A., Shalaby, A. M., Abdel-Rhman, A. 2005. Use of probiotic bacteria as growth promoters, anti-bacterial and their effects on physiological parameters of Oreochromis niloticus. Aquaculture, 28: 74-81.
28. Kim, D. H., Austin, B. 2006. Innate immune responses in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) induced by probiotics. Fish & shellfish immunology, 21(5): 513-524.
29. Lara-Flores, M., Olvera-Novoa, M. A., Guzmán-Méndez, B. E., López-Madrid, W. 2003. Use of the bacteria Streptococcus faecium and Lactobacillus acidophilus, and the yeast Saccharomyces cerevisiae as growth promoters in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Aquaculture, 216(1-4): 193-201.
30. Lee، J. S.، Cheng، H.، Damte، D.، Lee، S. J.، Kim، J. C.، Rhee، M. H., Park، S. C. 2013. Effects of dietary supplementation of Lactobacillus pentosus PL11 on the growth performance، Immune and antioxidant systems of Japanese eel Anguilla japonica challenged with Edwardsiella tarda. Fish and Shellfish Immunology, 34: 756-761.
31. McLoughlin, I. J., Voss, A. L., Hale, J. D., Jain, R. 2024. Cosmetic efficacy of the topical probiotic Micrococcus luteus Q24 in healthy human adults. Cosmetics, 11(4): 122.
32. Mazurkiewicz, J., Przybył, A., Sip, A., Grajek, W. 2007. Effect of Carnobacterium divergens and Enterococcus hirae as probiotic bacteria in feed for common carp, Cyprinus carpio L. Fisheries & Aquatic Life, 15(2): 79-92.
33. Moriarty, D. J. W. 1990. Interactions of microorganisms and aquatic animals, particularly the nutritional role of the gut flora. Microbiology in poecilotherms, 217-222.
34. Mortazavian, A., Seyed Hadi, R., Mohammad Reza, E., Sara, S. 2007. Principles and methods of microencapsulation of Probiotic microorganisms. Iranian Journal of biotechnology, 5(1): 1-18.
35. Nwachukwu, U., George-Okafor, U., Ozoani, U., Ojiagu, N. 2019. Assessment of probiotic potentials of Lactobacillus plantarum CS and Micrococcus luteus CS from fermented milled corn-soybean waste-meal. Scientific African, 6: e00183.
36. Oyetayo, V. O. and Oyetayo, F. L. 2005. Potential of probiotics as biotherapeutic agents targeting the innate immune system. African Journal of biotechnology, 4(2): 123-127.
37. Panigrahi, A., Kiron, V., Kobayashi, T., Puangkaew, J., Satoh, S., Sugita, H. 2004. Immune responses in rainbow trout Oncorhynchus mykiss induced by a potential probiotic bacteria Lactobacillus rhamnosus JCM 1136. Veterinary immunology and immunopathology, 102(4): 379-388.
38. Reid, G., Sanders, M.E., Gaskins, H.R., Gibson, G.R., Mercenier, A., Rastall, R., Roberfroid, M., Rowland, I., Cherbut, C., Klaenhammer, T.R. 2003. New scientific paradigms for probiotics and prebiotics. Journal of clinical gastroenterology, 37(2): 105-118.
39. Rengpipat, S., Rukpratanporn, S., Piyatiratitivorakul, S., Menasaveta, P. 2000. Immunity enhancement in black tiger shrimp (Penaeus monodon) by a probiont bacterium (Bacillus S11). Aquaculture, 4: 271-288.
40. Rokka, S., Rantamaki, P. 2010. Protecting probiotic bacteria by microencapsulation. Challenges for Industerial applications. European food Research and Technology, 231(1): 1-12.
41. Sugita, H., Miyajima, C., Deguchi, Y. 1991. The vitamin B12-producing ability of the intestinal microflora of freshwater fish. Aquaculture, 92: 267-276.
42. Sun, Y. Z., Yang, H. L., Ma, R. L., Lin, W. Y. 2010. Probiotic applications of two dominant gut Bacillus strains with antagonistic activity improved the growth performance and immune responses of grouper Epinephelus coioides. Fish & Shellfish Immunology, 29(5): 803-809.
43. Ta'ati, R., Soltani, M., Bahmani, M., Zamini, A. A. 2011. Growth performance, carcass composition, and immunophysiological indices in juvenile great sturgeon (Huso huso) fed on commercial prebiotic, Immunoster. Iranian Journal of Fisheries Sciences, 10(2), 324-335.
44. Talas, Z. S., Gulhan, M. F. 2009. Effects of various propolis concentrations on biochemical and hematological parameters of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Ecotoxicology and Environmental Safety, 72: 1994-1998.
45. Tookmehchi A., Shamsi H., Meshkini S., Delshad R., Ghasemi Moghanjoei A. 2012. Dietary administration of vitamin C and Lactobacillus rhamnosus in combination enhanced the growth and innate immune response of the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Iranian Scientific Fisheries Journal, 21(3): 13-22. doi: 10.22092/ISFJ.2017.110067
46. Vazquez, J. A., González, M., Murado, M. A. 2005. Effects of lactic acid bacteria cultures on pathogenic microbiota from fish. Aquaculture, 4: 149-161.
47. Verschuere, L., Rombaut, G., Sorgeloos, P., Verstraete, W. 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture. Microbiology and molecular biology reviews, 64: 655-671.
48. VidyaLaxme B., Rovetto A., Grau R., Agrawal R. 2014. Synergistic effects of probiotic Leuconostoc mesenteroides and Bacillus subtilis in malted ragi (Eleucine corocana) food for antagonistic activity against V. cholerae and other beneficial properties. Journal of food science and technology, 51: 3072-3082. doi: 10.1007/s13197-012-0834-5.
49. Vine N.G., Leukes W.D., Kaiser H. 2006. Probiotics in marine larviculture. FEMS microbiology reviews, 30(3): 404-427. doi.org/10.1111/j.1574-6976.2006.00017.x
50. Wang Y. B. 2007. Effect of probiotics on growth performance and digestive enzyme activity of the shrimp Penaeus vannamei. Aquaculture, 1: 259-264.
51. Weston, D. P. 1996. Environmental considerations in the use of antibacterial drugs in aquaculture, 1996: 140-165.
52. Yahav D., Franceschini E., Koppel F., Turjeman A., Babich T., Bitterman R., Neuberger A., Ghanem-Zoubi N., Santoro A., Eliakim-Raz N., Pertzov B. 2019. Seven versus 14 days of antibiotic therapy for uncomplicated gram-negative bacteremia: a noninferiority randomized controlled trial. Clinical Infectious Diseases, 69(7): 1091-1098.050. doi: 10.1093/cid/ciy1054.
زیستشناسی جانوري، سال هفدهم، شماره چهارم، تابستان 1404، صفحات 128-115، آوخ کیسمی و همکاران
The Efectiveness of Micrococcus luteus Bacteria on Some Blood and Immune Indices of Common Carp Fry
Mehran Avakh Keysami1*, Alireza Akbari 1, Hamid Abdullahpour Biria2, Maryam Avakh Keysami3
1- Department of Fisheries and Aquatics, Mirzakochek Khan Fisheries Sciences and Industries Training Unit, Agricultural Research, Education and Extension Organization Rasht, Iran.
2- Department of Fisheries, Tal.C, Islamic Azad University, Talash, Iran
3- Research Department of Experimental Sciences Education, General Directorate of Education, Gilan Province, Bint Al-Hoda Sadr Educational Campus, Rasht, Iran
*Coresponding author: dr.keysami@gmail.com
Received: 10 April 2025 Accepted: 24 June 2025
DOI: 10.60833/ascij.2025.1206510
Abstract
This research was conducted to investigate the effect of Micrococcus luteus bacteria on the blood indices, and immunology of common carp fry (Cyprinus carpio) in Mirzakochek Khan Fisheries Science and Industry Training Center and Shahid Ansari Bony Fish Reserve Reproduction and Regeneration Center in Gilan was carried out during May to August 2023. In this experiment, Micrococcus luteus isolated from the digestive tract of common carp was fed to commercial pellet food of 300 pieces of common carp juveniles (28.018 ± 2.87) for 8 weeks in a completely randomized design with 5 treatments and 3 replications (20 pieces of fish in each tank) used. Mixing fish feed in the suspension of Micrococcus luteus, 5 types of diets with different concentrations of Micrococcus in the pellet including 106, 107 cells/g were prepared as treatments 1, 2 and control without bacteria. After 56 days of feeding with these treatments, different levels of Micrococcus luteus bacteria in the diet of common carp fry increase the amount of The values of hematocrit, red blood cells, and hemoglobin, values of MCV and MCH MCHC, neutrophil and monocyte, sodium, lysozyme, and C3 in treatments 1 and 2 were significantly higher than the control treatment. In this regard, treatment 3 had the highest values, but the amounts of calcium, phosphorus, IGM, and C4 in the control treatments, treatments 1 and 2 did not have a statistically significant difference. There was a significant difference between the number of gram-positive and gram-negative bacteria in the digestive tract and water of the rearing tanks compared to the control treatment (p < 0.05). Analysis of the results showed the benefits of using M. luteus probiotic in the diet of common carp fry in some cases. M. luteus is usually not pathogenic for fish. Therefore, the use of this probiotic in common carp farming to increase the ability deal with diseases is recommended.
Keywords: Common carp, Micrococcus luteus, Blood indices, Immune indices.
اثربخشی باکتریMicrococcus luteus بر روی برخی شاخصهای خونی و ایمنی بچهماهی کپور معمولی
مهران آوخ کیسمی1*، علیرضا اکبری1، حمید عبداللهپور بیریا2، مریم آوخ کیسمی3
1- بخش تحقیقات شیلات و آبزیان، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزي و منابع طبیعی استان گیلان، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزي، رشت، ایران
2- گروه شیلات، واحد تالش، دانشگاه آزاد اسلامی، تالش، ایران
3- بخش تحقیقات گروه آموزشی علوم تجربی، اداره کل آموزشوپرورش استان گیلان، پردیس آموزشی بنتالهدی صدر، رشت، ایران
*مسئول مکاتبات: dr.keysami@gmail.com
تاریخ دریافت: 21/01/1404 تاریخ پذیرش: 03/04/1404
DOI: 10.60833/ascij.2025.1206510
چکیده
این تحقیق بهمنظور بررسی تأثیر باکتریMicrococcus luteus بر شاخصهای خونی، ایمنی بچهماهی کپور معمولی (Cyprinus carpio) در مرکز آموزش علوم و صنایع شیلاتی میرزا کوچک خان و مرکز تکثیر و بازسازی ذخایر ماهیان استخوانی شهید انصاری گیلان در خلال ماههای اردیبهشت تا مرداد 1402 انجام شد. در اين آزمايشM. luteus جداشده از دستگاه گوارش ماهی کپور معمولی به غذاي تجاري پلت 300 قطعه بچهماهی کپور معمولی (87/2 ± 018/28) به مدت 8 هفته بهصورت یک طرح کاملا تصادفی در 3 تیمار و 3 تکرار (20 قطعه ماهی در هر تانک) استفاده شد. با مخلوط کردن غذاي ماهی در سوسپانسیون M. luteus ،3 نوع جيره با غلظتهای مختلف M. luteus در پلت شامل: 106، 107سلول در گرم بهعنوان تیمارهای 1، 2 و شاهد بدون باكتري تهيه شد. بعد از 56 روز غذادهی با سطوح مختلف باکتری M. luteus در جیره بچهماهیان کپور معمولی مقادیر هماتوکریت، گلبول قرمز خون و هموگلوبین، مقادیر MCV و MCH MCHC، نوتروفیل و مونوسیت، سدیم، لیزوزیم وC3 در تیمار 1 و 2 به شکل معنیداری بیشتر از تیمار شاهد بود. در این رابطه تیمار 1 بیشترین مقادیر را دارا بود. اما مقادیر کلسیم، فسفر، IGM و C4 در تیمار شاهد، تیمار 2 تفاوت معنیدار آماری نداشت. بین تعداد باکتریهای گرم مثبت و باکتریهای گرم منفی موجود در دستگاه گوارش و آب تانکهای پرورش نسبت به تیمار شاهد اختلاف معنیدار بود (05/0p < ). نتایج حاصل، فواید استفاده از پروبیوتیک M. luteus در جیره غذایی بچهماهیان کپور معمولی را در برخی موارد نشان داد. M. luteus معمولاً برای ماهی بیماریزا نیست. ازاینرو استفاده از این پروبیوتیک در پرورش ماهی کپور معمولی جهت افزایش توان مقابله با بیماریها قابل پیشنهاد است.
کلمات کلیدی: کپور معمولی، Micrococcus luteus، شاخصهای خونی، شاخصهای ایمنی.
بیماریهای ماهی، بهویژه عفونتهای باکتریایی، مشکل عمدهای است که صنعت پرورش ماهی با آن مواجه است که در حال حاضر با افزایش سالانه حدود 12 درصد بهسرعت در حال رشد است (1، 2). گروه متحرک Aeromonas، بهویژهAeromonas hydrophila، انواع گستردهای از گونههای ماهیهای آب شیرین و گاهی اوقات ماهیهای دریایی را تحت تأثیر قرار میدهد (3). ماهی کپور معمولی (Cyprinus carpio) یکگونه مهم برای آبزیپروری آب شیرین است و بهبود مدیریت پرورش با افزایش مقاومت این گونه در برابر بیماریها چالش بزرگی است که پرورشدهندگان ماهی با آن مواجه هستند. پیشگیری و درمان بیماری با آنتی بیوتیکها میتواند باعث ظهور میکروارگانیسمهای مقاوم به دارو شود و بقایای آنتیبیوتیکها را در ماهی و محیط بهجا بگذارد (4). علاوه بر این، شیمیدرمانی ممکن است میکرو فلور طبیعی در دستگاه گوارش را که برای ماهی مفید است، مهار کند (5، 6، 7). چندین استراتژی جایگزین برای استفاده از ضدمیکروبیها پیشنهادشده است، مانند استفاده از پروبیوتیک تا بهعنوان عوامل کنترل بیولوژیکی، پروبیوتیک بهعنوان میکروارگانیسمهای زنده شامل بسیاری از مخمرها و باکتریها تعریف میشوند که در صورت تجویز به مقدار کافی میتوانند رشد و سلامت میزبان را افزایش دهند (8، 9). افزودن پروبیوتیک باعث کاهش هزینههای پرورش کپور معمولی شده است (4). مخمر Saccharomyces cerevisiae و برخی سویههای میکروبی به عنوان پروبیوتیک در آبزیپروری استفاده میشوند. آنها بیماریزا نیستند، غیرسمیاند و می توانند در روده و احشا بقا داشته باشند و در شرایط انبار کردن به مدت طولانی زنده بمانند. امروزه استفاده از پروبیوتیکها به دلیل بهبود تعادل میکروبی روده، هضم و جذب بهتر مواد غذایی در دستگاه گوارش و بهرهوری بیشتر از مواد غذایی استفادهشده و کاهش هزینه و افزایش درآمد در دامپروریها، مرغداریها و مراکز آبزیپروری رو به افزایش است (49). از پروبیوتیکها بهعنوان محرک رشد و جهت تحریک سیستم ایمنی استفاده میشود (6). پروبیوتیکها یا میکروارگانیسمهای زنده بهعنوان راهحلی مطمئن و طبیعی برای کنترل اکوسیستمهای میکروبیولوژیکی محسوب میشوند (10). استفاده از باکتوسل برای پیشگیری از بیماریها بهترین جایگزین استفاده از آنتیبیوتیکهایی نظیر ارپترومایسین و فلورفنیکل هست (3). هدف همیشگی تولید آبزیان به حداکثر رساندن کارایی و بازده تولید برای حداکثر سوددهی است. جیره غذایی حاوی پروبیوتیکها نهتنها مواد مغذی ضروری را تأمین میکند، بلکه میتواند یکی از بهترین راهکارها برای حفظ سلامت آبزیان پرورشی و افزایش مقاومت آنها به استرس و عوامل بیماریزا باشد. همچنین عملکرد پروبیوتیکها در بهبود محیط آبی از طریق کاهش باکتریهای بیماریزا است. (11). تحقیقات زیادی در خصوص کاربرد باکتریهای پروبیوتیک در آبزیپروری صورت گرفته و برخی از عملکردهای اثباتشده در خصوص این باکتریها شامل دفع رقابتی برای سایر باکتریها و همینطور بازدارندههای پروبیوتیکی برای جلوگیری از کلنی شدن باکتریهای بیماریزا در لوله گوارشی میزبان از طریق ترشح ترکیبات بازدارنده، رشد دیگر باکتریها و یا رقابت برای غذا و مکان و تحریک سیستم ایمنی میزبان در جهت تحمل بهتر محرکهای محیطی و رشد را میتوان ذکر کرد (12). افزودن پروبیوتیکها به جيره غذايي ماهي باعث ايجاد تعادل ميكروبي روده، ساختن تركيبات مفيد ازجمله ویتامینها و برخي از آنزیمها، تحريك و افزايش کار آیی سيستم ايمني، افزايش فعالیتهای گوارشي و آنزيمي و به دنبال آن افزايش رشد و توسعه سطوح غذايي میشود (13، 14). پارامترهای هماتولوژی شاخص خوبی برای ارزیابی سلامت ماهی هستند. تجویز پروبیوتیک همراه با جیره غذایی میتواند موجب بهبود شاخصهای خونی و ایمنی در ماهی شود (7، 15، 16). مطالعات محدودي در ارتباط با تأثیر پروبیوتیکها بر شاخص تعداد گلبول سفید خون ماهیان انجامشده ولی مشخص شده است که تحریک ایمنی با افزایش سطح آنتیبادیها ارتباط دارد (16) چرا که برخی عوامل سلولی از قبیل عملکرد فاگوسیتوزي گلبولهای سفید و فعالیت لنفوسیتها نقش مهمی را در سیستم ایمنی ماهیها ایفا میکند. دراینارتباط گزارشی پیرامون تنظیم ایمنی گلبولهای سفید انسان توسط باکتریهای اسیدلاکتیک موجود است (17). برجستهترین اعضای باکتریهای پروبیوتیک لاکتوباسیلوس و بیفیدوباکتریا هستند که معمولاً با محصولات لبنی تخمیر شده مرتبط هستند. سایر باکتریهای پروبیوتیکی شامل M. luteus ،coli Escherichia، Lactococcus lactis ، Streptococcus thermophilus، Enterococcus durans و Bacillus Coagulans میباشند (3، 18). M. luteus جداشده از دستگاه گوارش Oreochromis niloticus ظاهراً سالم، برای O. Niloticus بیخطر بود و اثر آنتاگونیستی علیه باکتری بیماریزا Aeromonas hydrophila عامل سپتی سمی Aeromonas در ماهیان آب شیرین داشت (15). بهطورکلی، باکتری M. luteus به دلیل ویژگیهایی که دارد، بهطور متعدد برای تخمیرهای مختلف مواد غذایی مورد استفاده قرارگرفته است و حتی در پیشگیری از رشد باکتریهای مضر، کمک میکند (19، 20، 21). همچنین بسیاری از باکتریها (باسیلها، باکتریهای اسیدلاکتیک و سودومونادها) بهعنوان پروبیوتیک برای حیوانات آبزی ارزیابیشدهاند (22، 23، 24، 25، 26). اما جستجو برای میکروارگانیسمهای جدیدی که بهعنوان پروبیوتیک مورداستفاده قرار گیرند همچنان در اولویت است. بنابراین، مطالعه حاضر بهمنظور بررسی تأثیر باکتری M. luteus بر شاخصهای خونی، ایمنی بچهماهی کپور معمولی (Cyprinus carpio) در مرکز آموزش علوم و صنایع شیلاتی میرزا کوچک خان و مرکز تکثیر و بازسازی ذخایر ماهیان استخوانی شهید انصاری گیلان در خلال ماههای اردیبهشت تا مرداد 1402 انجام شد.
در اين تحقیق M. luteus جداشده از دستگاه گوارش ماهی کپور معمولی به غذاي تجاري پلت 300 قطعه بچهماهی کپور معمولی (2.87±28.018) به مدت 8 هفته بهصورت یک طرح کاملاٌ تصادفی در3 تیمار و 3 تکرار (20 قطعه ماهی در هر تانک) استفاده شد. غذای تجاری مورداستفاده در اين آزمايش از شرکت آتا تهیه گردید. باکتری پروبیوتیک مورداستفاده در اين آزمايش از آزمایشگاه مرکز میرزا کوچک خان از محل پروژه تخصصی رشته کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی آبزیان که قبلاً بروسهای بیوشیمیایی و ملکولی شناسایی گردیده بود تهيه شد. اين فرآورده ميكروبي، M. luttius بود و کشتهای باكتريایی در محيط کشت (TSA) در 37 درجه سانتيگراد به مدت 24 ساعت انکوبه شد و پسازآن تعداد پرگنه های تشکیلشده در هر پلت شمارش و تعداد به ازاي هر میلیلیتر تعیین گردید (27). از هر يك از سوسپانسیونهای مای تهیهشده با سمپلر برداشته و پس از اضافه نمودن آب مقطر و 2 غلظت از باکتری تهیه شد (106 و 107 سلول/گرم). ریزپوشانی باکتریها با آلژینات سدیم در شرایط ا ستریل و به روش امولسیون انجام شد (28، 29). جیرههای تهیهشده بهخوبی با این غلظتها هم زدهشده و سپس در آون با دمای 40 درجه سانتیگراد در مدت 5 ساعت خشک گردیدو با 10 درصد رطوبت بر اساس برنامه زمانبندی غذایی در اختیار لاروها قرار گرفت (30). جیره بجه ماهیان کپور معمولی در تیمار شاهد با استفاده از فرآيند ذکرشده ساخته شد، ولي به آنها M. luteus پروبيوتيكي اضافه نگرديد. بچهماهیهای کپور معمولی بهمنظور سازگاري با شرايط آزمايش به مدت 3 روز 3 وعده در روز با غذاي پلت (كارخانه آتا) غذادهي شده و در شرايط آزمايش نگهداري شدند. طی دوره آزمایش، تلفات بهطور روزانه شمارش و ثبت میشد. كيفيت آب بهطور روزانه اندازهگیری شد. درجه حرارت و pH بهوسیله يك دستگاهpH متر و درجه حرارتسنجYSI اندازهگیری گردید. اكسيژن محلول نيز با اكسيژن مترYSI ، مدل V5 (USA) و آمونياك با استفاده از آمونياك سنج هانا، (,Taiwan 93715 HI) اندازهگیری گرديد. پس از اتمام دوره پرورش ماهیان موجود در هر تیمار شمارش و با استفاده از فرمول زیر درصد بازماندگی هر یک از تیمارها و تکرارها محاسبه شد.
100 × تعداد ماهی در ابتدای دوره/تعداد ماهی در پایان دوره= درصد بقاء ماهی (%)
تعیین تعداد کلنیهای باکتریایی: بهمنظور بررسی تغییرات در تشکیل کلنی باکتریایی در انتهای دوره نمونهبرداری انجام شد. ابتدا دو روز قبل از نمونهبرداری تغذیه ماهیان قطعشده و در ادامه از هر تکرار 3 عدد ماهی بهطور تصادفی گرفته شد. از هرکدام از آکواریومها نمونه آب و 3 عدد ماهی نمونهبرداری شده و از روده و معده آنها برای کشت و شمارش باکتریایی نمونهبرداری گردید. شمارش باکتریایی با تهیه رقتهای سریالی در محلول نرمال سالین (5/8 گرم در لیتر نمک طعام) در10 رقت و سپس در نوترینت آگار TSA پخش گردید. بعد از 24 تا 48 ساعت از پرورش کشت باکتریایی در دمای 32 درجه سانتیگراد پرگنههای رشدیافته شمارش و ثبت گردیدند (18). شمارش توسط دستگاه کلنیکانتر و شناسایی مجدد باکتری جداسازی شده به روشهای شیمیایی و مولکولی انجام گرفت (30).
سنجش شاخصهای خونشناسی: در پایان دوره، آزمایش، فاکتورهای خونشناسی شامل هماتوکریت (Hct)، میزان گلبولهای سفید (WBC)، میزان گلبولهای قرمز (RBC)، مقدار هموگلوبین (Hb)، میانگین حجم یک گلبول قرمز (MCV)، میانگین هموگلوبین یک گلبول قرمز (MCH)، میانگین درصد غلظت هموگلوبین در یک گلبول قرمز (MCHC) و پارامترهای بیوشیمیایی خون شامل سدیم، فسفر و کلسیم در تعداد 5 عدد ماهی از هر مخزن (صید تصادفی) اندازهگیری شد (31). پس از بیهوش نمودن ماهیها بهوسیله پودر گل میخک (۲۵۰ppm)، خونگیری از سیاهرگ وریدی انتهای باله انجام شد. ۵/۰ میلیلیتر خون در سرنگ ۲ میلیلیتری هپارینه جهت بررسیهای خونشناسی و با استفاده از سرنگ پلاستیکی ۲ میلیلیتری فاقد ماده ضدانعقاد، ۵/۱ میلیلیتر خون جهت شاخصهای بیوشیمیایی برداشت و در ظروف اپندورف نگهداری شد. برای جداسازی سرم، نمونههای خون به مدت ۱۰ دقیقه با سرعت ۱۶۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. سرم جداسازی شده تا زمان اندازهگیری پارامترهای بیوشیمیایی، در فریزر ۸۰- درجه سانتیگراد نگهداری شد.
تعیین هماتوکریت (Hct): از روش میکرو هماتوکریت استفاده شد (32).
تعیین مقدار هموگلوبین (Hb): از روش سیانومت هموگلوبین و دستگاه Sysmexlys استفاده شد (24). جذب نوری با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طولموج ۵۴۰ نانومتر خوانده شد. درنهایت، مقدار هموگلوبین نمونهی موردنظر با توجه به منحنی استاندارد و بر اساس رابطهی زیر برحسب گرم/دسیلیتر تعیین گردید.
Hb (g dL-۱) = نمونه)OD استاندارد/OD) × غلظت استاندارد
شمارش گلبول قرمز (RBC): از هماتوسیتومتر استفاده شد. عدسی میکروسکوپ با بزرگنمایی ۴۰ روی مربع ۲۵ تایی تنظیم گردید و گلبولهای موجود در ۴ مربع کوچک کناری و ۱ مربع کوچک وسطی از ۲۵ مربع کوچک شمارش شد (31).
تعیین شاخصهای گلبول قرمز: میانگین حجم یک گلبول قرمز (MCV)، میانگین هموگلوبین یک گلبول قرمز (MCH) و میانگین درصد غلظت هموگلوبین در یک گلبول قرمز (MCHC) بر اساس روابط زیر محاسبه شد (31).
[تعداد گلبولهای قرمز (۱۰۰۰۰۰۰ در میلیمتر مکعب)/ هماتوکریت (درصد)] ×۱۰ = (فمتولیتر) MCV
[تعداد گلبولهای قرمز (۱۰۰۰۰۰۰ در میلیمتر مکعب)/ هموگلوبین (گرم/دسیلیتر)] ×۱۰ = (پیکوگرم در سلول) MCH
[هماتوکریت (درصد)/ هموگلوبین (گرم/دسیلیتر)] ×۱۰۰ = (گرم/دسیلیتر) MCHC
شمارش گلبول سفید (WBC): شمارش تعداد گلبولهای سفید، با استفاده از پیپت حبابدار (ملانژور) سفید (مخصوص شمارش گلبولهای سفید) صورت گرفت.
تعیین درصد افتراقی گلبولهای سفید: یک قطره از نمونهی خون در یک سانتيمتري انتهاي لام قرار داده شد و لبهی لام ديگر با زاويهی ۳۰ تا ۴۵ درجه بر روی قطرهی خون قرار گرفت. وقتی خون در سراسر لبهی لام ۲ (فصل مشترک ۲ لام) انتشار یافت، با ۱ فشار ملايم و با سرعت يکنواخت، لام ۲ در سطح لام ۱ به سمت جلو حرکت داده و یک گسترش شعله مانند ایجاد شد. پس از خشک شدن کامل گسترش خوني در هواي آزمايشگاه، خونروی لام توسط الکل متانول خالص تثبیت شد. در پایان با محلول گیمسا رنگآمیزی شد. پسازآن لامها با آب شستشو و در دمای اتاق خشک شد. برای شمارش گلبولهای سفید از میکروسکوپ نوری با عدسی ۱۰۰ و روغن ایمرسیون استفاده شد. برای این کار قسمتی از گسترش که دارای ۱لایهی سلولی و رنگآمیزی بهتر بود زیر عدسی قرار گرفت و شمارش بهصورت مارپیچی تا رسیدن تعداد سلولها به عدد ۲۰۰ انجام شد. سرانجام درصد هر ۱ از گلبولهای سفید خون محاسبه شد (31، 33).
اندازهگیری پروتئین کل، آلبومین و گلوبولین: مقدار پروتئین کل و آلبومین با واحد گرم/دسیلیتر به روش رنگسنجی و با استفاده از کیت زیستشیمی (تهران، ایران) و دستگاه اسپکتروفتومتر به ترتیب با طولموج ۵۴۶ نانومتر و ۵۸۵ نانومتر موردسنجش قرار گرفت. مقدار گلوبولین با تفریق میزان آلبومین از پروتئین کل برای هر نمونه محاسبه شد (34).
اندازهگیری یونهای سدیم، کلسیم و فسفر: یون سدیم با واحد میلیمول بر لیتر به روش شعله سنجی با فلیم فتومتر اندازهگیری شد (5). سنجش مقدار کلسیم برحسب واحد میلیگرم/دسیلیتر به روش رنگسنجی و با استفاده از کیت مربوطه صورت گرفت و برای اندازهگیری میزان جذب نوری از دستگاه اسپکتروفتومتر با طولموج 500 نانومتر استفاده خواهد شد. مقدار فسفر با استفاده از کیت مربوطه به روش فتومتریک و با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر با طولموج 340 نانومتر و با واحد mg dl-1 اندازهگیری شد.
اندازهگیری کمپلمانهای C3 و C4: بر اساس همولیز گلبولهای قرمز گوسفند (SRBC) و با روش Al‐Dohail و همکاران (2009). اندازهگیری شد (5).
IgM: از روشايمونوتوربيدیمتریک استفاده شد.
میزان فعالیت لایزوزیم: از روش Clerton و همکاران (2001) استفاده شد. از لایزوزیم استخراجشده از سفيدهی تخممرغ برای تهیهی منحنی استاندارد استفاده شد. هر واحد از فعالیت لایزوزیم بر اساس کاهش جذب (001/0 در دقیقه) تعیین و نتايج برحسب u ml-1 min-1 محاسبه شد (31).
تجزیهوتحلیل آماری: از نرمافزار SPSS 21 و آزمون نرمال بودن الگوی پراکنش دادهها و نیز آنالیز واریانس یکطرفه (تست توکی)، کروسکال والیس و من ویتتنی (بررسی وجود تفاوت بین گروه شاهد و تیمارها) و آزمون نا پارامتریک مربع کای (بررسی تفاوت درصدها) استفاده شد.
نتایج شمارش باکتری در گروه های تیمار و شاهد در شرایط آزمایشگاهی در جداول 1 و 2 بیان گردیده است. بر اساس در بررسیهای انجامشده در مورد تعداد باکتریهای موجود در دستگاه گوارش بچهماهیان کپور مشاهده گردید که تعداد کل باکتریها در همه تیمارها ثابت بوده و تفاوت آنها در تعداد باکتریهای گرممثبت و گرممنفی هست در باکتریهای گرممثبت بیشترین تعداد باکتریها در تیمارهای 1 و 2 مشاهده گردید. کمترین تعداد باکتریهای گرممثبت و بیشترین تعداد باکتریهای گرممنفی در تیمار شاهد مشاهده گردید. کمترین تعداد باکتریهای گرممنفی در تیمارهای1 و 2مشاهده گردید. با توجه به آمارها و بررسیهای انجامشده افزایش مقدار باکتری M. luteus در جیره غذایی بچهماهیان کپور معمولی باعث افزایش تعداد باکتریهای گرممثبت در دستگاه گوارش گردید که این امر میتواند باعث افزایش مقاومت ماهیها در مقابل بیماریها و افزایش تولید ماهی کپور در مزارع گردد. با بررسیهای انجامشده از آب مخازن پرورش بچهکپور ماهیانی که با جیرههای حاوی باکتری M. luteus تغذیهشده بودند و گروه شاهد که فاقد باکتری M. luteus در جیره غذایی بود مشخص گردید آب مخازنی که بچهماهیان کپور معمولی با جیرههای حاوی این باکتری تغذیهشده بودند و یا جیره آنها فاقد باکتری M. luteus بود تعداد باکتریهای کل در مخازن تقریباً باهم برابر بود و اختلاف آنها در تعداد باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت بود. در مخازنی که در جیره غذایی آنها در صد باکتری M. luteus بالاتر بود تعداد باکتریهای گرممثبت بیشتر گردید. تیمار شاهد که جیره غذایی بچهماهیان کپور آنها فاقد باکتری M. luteus بود تعداد باکتریهای گرم منفی در آنها به حداکثر رسیده بود. با بررسیهای انجامشده به نظر میرسد که افزایش مقدار باکتری M. luteus در جیره غذایی باعث افزایش تعداد باکتریهای گرم مثبت در آب مخازن پرورش گردید که این غلبه و افزایش تراکم M. luteus بود که باعث رشد باکتریهای مفید و بهبود شرایط پرورش گردید. در آنالیز آماری نتايج بهدستآمده از بررسی متغيرهاي فيزيكو شيميايي آب بین تیمارها و تکرارها اختلاف معنیدار نبود. متغيرهاي فيزيكوشيميايي درجه حرارت، اكسيژن محلول، pH و آمونياك به ترتيب در محدوده 30-26 درجه سانتیگراد، 7/8-3/7 میلیگرم/ليتر، 27/7–2/7 و 02/0-011/0 میلیگرم/ليتر به دست آمد. نتايج بهدستآمده نرمال بوده و در محدوده كيفيت مناسب پرورش بچهماهي کپور معمولی بود (51). بين كيفيت آب گروههای تيمار شاهد اختلاف معنیدار مشاهده نگرديد و بین كيفيت آب تيمارهاي مختلف نيز اختلاف معنیدار آماري مشاهده نشد (05/0> p). بررسی فاکتورهای خونشناسی و بیوشیمیایی خون و درصد بقاء بچهماهی کپور معمولی تحتتغذیه با تیمار حاوی M. luteus و شاهد در مدت 8 هفته پرورش اختلاف معنیدار آماري در افزايش کیفیت این فاکتورها و درصد بقاء بچهماهیها نسبت به شاهد نشان داد (جدول 3، 05/0< p).
جدول1- لگاريتم تعداد باکتریهای شمارششده از دستگاه گوارش کپور معمولی تغذیهشده با غلظتهای مختلف M. luteus در گروهها
Table 1. Logarithm of bacteria counted from the digestive tract of common carp fed with different concentrations of M. luteus bacteria in groups
Treatment2 | Treatment1 | Control | Variable |
7.9a | 7.9 a | 7.8 a | Logarithm of total bacterial counted (CFU/g) |
7.5b | 7.5b | 1 a | Logarithm of Gram-positive bacteria counted (CFU/g) |
2.01 b | 2.01 b | 5.9 a | Logarithm of Gram-negative bacteria counted (CFU/g) |
حروف غير همسان لاتین در هر رديف نشانه اختلاف معنیدار است (05 /0 < p)، کنترل (تغذیهشده با غلظت صفر سلول M. luteus در گرم غذا)، تیمار 1 (تغذیهشده با غلظت 106 سلول M. luteus در گرم غذا)، تیمار 2 (تغذیهشده با غلظت 107 سلول M. luteus در گرم غذا)
Non-identical Latin letters in each row indicate significant differences (p < 0.05). Control (fed with zero concentration of M. luteus cells per gram of food), treatment 1 (fed with a concentration of 106 M. luteus cells/g of food), treatment 2 (fed with a concentration of 107 M. luteus cells per gram of food)
جدول 2- لگاريتم تعداد باکتریهای شمارششده از مخزن آب کپور معمولی تغذیهشده با غلظتهای مختلف M. luteus در گروهها
Table 2. Logarithm of bacteria counted from the water tank of common carp fed with different concentrations of M. luteus bacteria in groups
Treatment2 | Treatment1 | Control | Variables |
5.9 a | 5.9 a | 5.9 a | Logarithm of total bacterial counted (CFU/ml) |
4.09 b | 5.01 b | 1 a | Logarithm of Gram-positive bacteria counted (CFU/ml) |
2.3 b | 2.3 b | 5.3 a | Logarithm of Gram-negative bacteria counted (CFU/ml) |
جدول 3- فاکتورهای خونشناسی، پارامترهای بیوشیمیایی خون و درصد بقاء بچهماهی کپور معمولی (میانگین ± انحراف معیار)
Table 3. Hematological factors, blood biochemical parameters and survival rate of common carp fry (Mean ± SD)
Treatment1 | Control | Variables | |
15423 ± 3516 b | 16071 ± 6052 a | 15016 ± 6251 b | RBC (Number in microliters x 106) |
225 a ± 731 | 251 a ± 732 | 156 b ± 521 | WBC(Number in microliters x 103) |
8 ± 0.1b | 8.6 ± 0.1a | 7.6 ± 0.2b | Hb(g/dl) |
37.1±0.92 a | 39.4±0.5 a | 35.2±0.77 b | Hct(%) |
269 ± 0.5b | 273 ± 0.9a | 267 ± 3.2b | MCV(fl) |
54.4 ± 0.5b | 55 ± 0.1a | 51 ± 0.5b | MCH(pg) |
20.4 ± 0.1a | 20.5 ± 0.1a | 20.4 ± 0.1a | MCHC(g/dl; %) |
24.8 ± 1.2a | 24.8 ± 0.9a | 18 ± 0.9b | Neutrophil(%) |
78.4 ± 0.5a | 78.6 ± 0.5a | 71 ± 0.6b | lymphocyte(%) |
4.1± 0.5 a | 4 ± 0.0 a | 3.4 ± 0.5 b | Monocyte(%) |
136 ± 1.7 b | 140 ± 1.2 a | 134 ± 0.38 b | Na (mg/dl) |
15.8 ± 1 a | 15.4 ± 0.5 a | 12.4 ± 0.5 b | C3(mg/dl) |
12.08 ± 1 a | 12 ± 0.0 a | 8 ± 0.0 b | C4(mg/dl) |
16.4 ± 1 a | 16.6 ± 1.2 a | 13.6 ± 1 b | Lysozyme(u/ml/min) |
12 ± 0.5 a | 12 ± 1 a | 11 ± 0.0 b | Ca(mg/dl) |
15 ± 0.0 a | 15 ± 0.5 a | 13.6 ± 1 b | P (mg/dl) |
24 ± 1.8 a | 23 ± 1.3 a | 19.6 ± 0.5 b | IGM(mg/dl) |
83.3 ± 0.97 b | 97.5 ± 1.19 a | 85.3 ± 0.17 b | Survival percentage (%) |
حروف غير همسان لاتین در هر رديف نشانه اختلاف معنیدار است (05 /0 < p). هماتوکریت (Hct)، میزان گلبولهای سفید (WBC)، میزان گلبولهای قرمز (RBC)، مقدار هموگلوبین (Hb)، میانگین حجم یک گلبول قرمز (MCV)، میانگین هموگلوبین یک گلبول قرمز (MCH)، میانگین درصد غلظت هموگلوبین در یک گلبول قرمز (MCHC)
Non-identical Latin letters in each row indicate significant differences (p < 0.05). Hematocrit (Hct), White Blood Cell Count (WBC), Red Blood Cell Count (RBC), Hemoglobin (Hb), Mean Red Blood Cell Volume (MCV), Mean Cell Hemoglobin (MCH), Mean Cell Hemoglobin Concentration percentage (MCHC)
بحث
نتايج 56 روز غذادهی با غذاي حاوي M. luteus تأثیر معنیداری بر تعداد زیادی از فاکتورهای خونشناسی بچهماهی کپور معمولی داشت. M. luteus در تجزیه مواد آلی در سیستم های آبی نقش دارد که ممکن است به چرخه مواد مغذی کمک کند. این می تواند کیفیت آب را افزایش داده و محیط سالم تری را برای کپور معمولی ایجاد کند. گونههای خاصی از میکروکوکوس میتوانند مواد محرک رشد تولید کنند یا باکتریهای بیماریزا را مهار کنند و به طور بالقوه برای ماهیها در اکوسیستم آنها مفید باشند. M. luteus معمولاً برای ماهی بیماری زا نیست و برایند این خواص در کاهش استرس آبزی پرورشی موثر است (9، 32). M. luteus انواع مختلفي از پروتئاز و ساير انواع آنزيمها را توليد ميكند كه میتواند انواع مواد آلي و مواد غذايي را تجزيه نموده و به مواد مغذي قابلجذب تبديل كند. از طرف ديگر M. luteus با توليد مواد آنت باكتريال و رقابت در جذب املاح غذايي و حتي با ازدياد و تجمع باکتریهای پاتوژن در دستگاه گوارش لارو جلوگيري مي كند(35). در اين تحقيق جيره با سطح 106 سلول در گرم غذا بهطور معنیداري از ساير سطوح M. luteus در تیمارها و شاهد اثربخشتر بود. اثربخشي پروبيوتيك در سطح 106 توسط مطالعات متعددي تائيد گرديد (36، 37، 38). تاثیر کمتر در سطح بالاتر M. luteus در تیمار 2، قبلاً در تحقيق Panigrahi و همکاران (2004) تائيد گرديده بود (39) كه در آن اثربخشی پروبيوتيكي لاکتوباسيلوس، وقتیکه غلظت باکتری بالاتر رفت كاهش پيدا كرد. در اينكه چرا غلظت پائين تر باكتري اثربخشي بالاتري نشان داد شاید تاثیر كمتر در غلظت بالاتر به جنبههای محيط زيستي آبزي مربوط باشد، زيرا افزايش غلظت باكتري در آب استرسزا بوده و ميزان تغذيه لارو را كاهش میدهد. اين مطالعه نشان داد كه غلظت پروبيوتيك بهمنظور جلوگيري از مصرف ميزان بالا و درنتیجه كاهش اثربخشی و افزايش هزينه توليد بايد بهخوبی و با دقت بكار برود (30). نتايج شمارش باکتریها در لاشه بچهماهیهای کپور معمولی و آب مخازن پرورش اختلاف معنیداري را بين باکتریهای تيمارها و شاهد نشان داد (05/0< p). تراكم باکتریهای گرم منفي در گروه شاهد از گروههای تيمار بالاتر بود، اين شايد بدين دليل باشد كه M. luteus به مقدار زيادي مواد آنت باكتريال و تركيبات آنتیبیوتیکی در محيط پرورش خود رهاسازی ميكند (18، 32، 40). M. luteus توليد آنتیبیوتیکهایی ميكند كه میتواند طيف وسيعي از باکتریهای هوازي و بیهوازی را از بين ببرد (32). همچنين M. luteusتوليد بسياري از آنتیبیوتیکهای معمول همچون باكتريوسين میکند (41). بنابراين به نظر میرسد كه باکتریهای گرم منفي در تيمارها بهوسیله باکتریهای M. luteus کشتهشده و با M. luteus جايگزين شده باشد (42). افزايش تراكم M. luteus در لاشه بچهماهیها و آب مخازن پرورش تیمار در اين تحقيق میتواند نشاندهنده تجمع و جاگيري M. luteus در بدن بچهماهیها و آب مخازن باشد. به نظر میرسد باکتریهایی كه بتوانند در دستگاه گوارش بچهماهیها غالب شوند و تجمع يابند شايد گزينه خوبي براي حذف باکتریهای بیماریزا از دستگاه گوارش آبزي و شروع فعاليت پروبيوتيكي باشند (36 ،42 ،43). نتایج حاصل از آنالیز آماری دادههای این تحقیق نشان داد که استفاده از پروبیوتیک M. luteus تأثیر معنیداری بر تعداد زیادی از فاکتورهای خونی و ایمنی بچهماهی کپور معمولی داشت. در مطالعه حاضر گروههای تیمار تغذیهشده با پروبیوتیک نسبت به گروه شاهد افزایش معنیدار در تعداد گلبول قرمز خون، هموگلوبین و هماتوکریت نسبت به گروه شاهد یافته است که با بررسی اثر Carnobacterium بر پارامترهای خونی ماهی قزلآلای رنگینکمان، Khattab و همکاران (2006)، بررسی اثر پروبیوتیک Micrococcus luteus و Psuedomonas بر پارامترهای خونی ماهی تیلاپیا Oreochromis niloticus شباهت دارد (21). Ferguson و همکاران (2010) نشان دادند که کاهش معنیداری در حجم هماتوکریت در ماهیان تغذیهشده با پروبیوتیک Pediococcus acidilactici مشاهده میشود ولی در مورد تعداد گلبول قرمز و حجم هموگلوبین، تفاوت معنیداری وجود نداشت (25). افزایش تعداد گلبول قرمز و درنتیجه کاهش اندازه آن، نشاندهنده کاهش مسیر انتشار اکسیژن به بافتهاست، بهعبارتدیگر، با افزایش غلظت گلبول قرمز، قابلیت جذب بیشتر اکسیژن از آبشش و انتشار اکسیژن در بافتها بالاتر میرود (44). میزان کمتر هموگلوبین و بهتبع آن کاهش ظرفیت حمل اکسیژن، ممکن است منجر به کاهش سطح اکسیژن خون در ماهیان گروه شاهد، شده که بهتبع آن، ماهیانی که تنها از جیره پایه بدون افزودن پروبیوتیک تغذیه میشدند، ممکن است توانایی محدودتری در تأمین اکسیژن در شرایط غیر بهینه که نیاز به اکسیژن افزایش مییابد ازجمله دمای بالا، تراکم بستر و غیره (داشته باشند. میزان فعالیت ماهی، تغییرات فصلی، دمای آب، درجه شوری، آلودگی آب، سن و تغذیه ماهی بر غلظت هموگلوبین خون مؤثرند (45). گروههای تغذیهشده با پروبیوتیک مقدار گلبول قرمز و هموگلوبین بالاتری نسبت به گروه شاهد داشتند و تقریباً تمامی اکسیژن خون بهوسیله هموگلوبین گلبولهای قرمز انتقال مییابد. هموگلوبین 95 درصد از کل پروتئین داخل سلولی گلبول قرمز را شامل میشود. ازاینرو شباهت الگوی تغییرات میزان گلبولهای قرمز و هموگلوبین خون توجیهپذیر است. تلقیح باکتریهای اسیدلاکتیک موجب افزایش لنفوسیتها میشود که آثار مفید این عمل منجر به افزایش مقاومت آبزی در برابر بیماریها است (46). دیواره سلولی گلیکوپپتیدی باسیلوسها ممکن است از طریق فعالسازی لنفوسیتها به افزایش پاسخ ایمنی موجود آبزی منجر شود (47). تحریک سلولی (افزایش لنفوسیتها، گلبول سفید و کل تعداد ماکروفاژها و افزایش بیگانهخواری) بیش تر از ایمنی همورال دارای اهمیت است (16). همچنین ماکروفاژهای تیمار پروبیوتیکی نسبت به گروه شاهد توانایی بیشتری برای بیگانهخواری دارند (15). افزودن پروبیوتیک به خوراک آبزیان موجب کاهش تعداد گلبولهای قرمز میشود کاهش تعداد گلبولهای قرمز و هماتوکریت تیلاپیای آلودهشده به پاتوژن Mycobacterium marinum میتواند به گسترش هیپوکرومیک و آنمی میکروسیتیک منجر شود (17). بر اساس نتایج این تحقیق، استفاده از پروبیوتیک M. luteus تأثیر معنیداری بر افزایش مقادیر هموگلوبین خون بچهماهیان کپور معمولی داشت. در تحقیق، Al‐Dohail و همکاران (2009) بر روی گربهماهی آفریقایی نیز این نتیجه حاصل شد (5). افزایش سطح فاکتورهاي خونشناسی موردسنجش در این آزمایش میتواند بهعنوان شاخصی جهت بهبود سیستم ایمنی ماهی کپور معمولی به دنبال تغذیه با جیره حاوي پروبیوتیک لاکتوباسیلوس باشد (48). کامپلمنتها از اصلیترین اجزای پاسخ همورال هستند که در بروز خطر در سیستم ایمنی نقشی مهم دارند. لایزوزیم یک آنزیم کاتیونی است که توانایی تجزیه انواع باکتریهای گرم مثبت را دارد. همچنین نقشی مهم در ترکیب با کامپلمنت برخی باکتریهای گرم منفی دارد (49). بر اساس نتایج تحقیق Abd El-Rhman و همکاران (2009) از انواع عملکردهای پروبیوتیکها، تحریک پاسخ ایمنی خونی و سلولی است (1). نتایج حاصل از بررسی فعالیت آلترناتیو کمپلمان C3و C4 نشان داد که میزانC3 در گروه تغذیهشده با پروبيوتيك M. luteus بیشترین مقدار را داشت درحالیکه در گروه شاهد و تیمار 2 مقادیر کمتر بود. این نتیجه بیانگر تأثیر نسبی و مثبت پروبیوتیک M. luteus بر فعالیت کامپلمنتهای همورال کپور معمولی است. همچنین نتایج تحقیق حاضر نشاندهنده تأثیر مثبت پروبیوتیک مورداستفاده بر افزایش مقادیر لایزوزیم همورال بود. درعینحال مقدار این متغیر در تیمار تغذیهشده با پروبیوتیک M. luteus به شکل معنیداری بیشتر از تیمار شاهد و تغذیهشده با تیمار2 بود. لایزوزیم در گلبولهای سفید تولید میشود و کمتر تولید شدن این عامل دفاعی در تیمار مورد تغذیه با جیره شاهد میتواند به دلیل تأثیر تحریکی این پروبیوتیک بر سیستم ایمنی بچهماهیان کپور معمولی باشد (1). مقادیر IgM (شاخص ارزیابی واکنش ایمنیشناختی خون) در گروه تیمار 1 و 2 بیشتر از گروه شاهد بود. درعینحال که تفاوت مشاهدهشده معنیدار نبود، اما ایمونوژن با توجه به اینکه باکتریهای پروبیوتیکی تولید آنتیبادی را در بدن تحریک میکنند، بنابراین افزایش سطح IgM در تیمارهای پروبیوتیکی قابلانتظار است (9، 25). لذا استفاده پروبیوتیک موردبررسی در تحقیق حاضر با تحریک سیستم ایمنی بدن، مقاومت در برابر بیماریها را افزایش میدهد (27). نتایج نشان داد که در تیمار 2 (با استفاده از M. luteus با غلظت بیشتر)، عامل سدیم خون به شکل معنیداری بیشتر از تیمار 1 و شاهد است. همسویی با یافتههای این تحقیق، نتایج ارائهشده توسط Taati و همکاران (2011) نشان داد که پریبیوتیک مانان الیگوساکارید بهعنوان محرک ایمنی و رشد، دارای اثرات قابل توجهی در افزایش اسمولاریته و Ca2+، + K، + Na و Mg2+در سرم خون فیلماهیان جوان تغذیهشده با این پریبیوتیک میباشند (50). لذا استفاده از پروبیوتیک موردبررسی در تحقیق حاضر موجب افزایش یون سدیم و درنهایت بهعنوان محرک ایمنی و افزایش درصد بقاء عمل میکند. عملکرد پروبیوتیکها در بهبود محیط آبی از طریق کاهش باکتریهای بیماریزا است (51). اثرات مثبت پروبیوتیکها در آبزیان پرورشی، با دیدگاه متفاوتی نظیر بهینهسازی پارامترهای فیزیکی و شیمیایی محیط پرورشی آنها، پیشگیری از ابتلا و مبارزه با عوامل بیماریزا و همچنین ارتقاء پارامترهای خونی و ایمنی و در نتیجه درصد بقاء آبزیان پرورشی در تحقیقات بیشماری توسط محققین شیلاتی تائید شده است (22، 23، 24، 25، 42).
نتیجهگیری
جیره غذایی حاوی پروبیوتیکها نهتنها مواد مغذی ضروری را تأمین میکند، بلکه میتواند یکی از بهترین راهکارها برای حفظ سلامت آبزیان پرورشی و افزایش مقاومت آنها به استرس و عوامل بیماریزا باشد. باكتري Micrococcus luteus میتواند بهعنوان پروبيوتيك در بچهماهی کپور معمولی بكار رود. میتوان اين باکتریها را با غلظت 106 سلول در گرم غذا، به غذاي بچهماهی کپور معمولی وارد نموده و فاکتورهای خونی و ایمنی در نتیجه عملکرد رشد و درصد بقاء بچهماهی کپور معمولی را بهبود بخشيد.
منابع
1. Abd El-Rhman AM, Khattab YA, Shalaby AM. Micrococcus luteus and Pseudomonas species as probiotics for promoting the growth performance and health of Nile tilapia, Oreochromis niloticus. Fish Shellfish Immunol. 2009; 27(2):175-180.
2. Garibaldi L. The FAO global capture production database: a six-decade effort to catch the trend. Mar. Policy. 2012; 36(3):760-768.
3. Aubin J, Gatesoupe FJ, Labbé L, Lebrun L. Trial of probiotics to prevent the vertebral column compression syndrome in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum). Aquac. Res.2005; 36(8):758-767.
4. Yahav D, Franceschini E, Koppel F, Turjeman A, Babich T, Bitterman R, Neuberger A, Ghanem-Zoubi N, Santoro A, Eliakim-Raz N, Pertzov B. Seven versus 14 days of antibiotic therapy for uncomplicated gram-negative bacteremia: a noninferiority randomized controlled trial. Clin. Infect. Dis.2019; 69(7):1091-1098.
5. Al‐Dohail MA, Hashim R, Aliyu‐Paiko M. Effects of the probiotic, Lactobacillus acidophilus, on the growth performance, haematology parameters and immunoglobulin concentration in African Catfish (Clarias gariepinus, Burchell 1822) fingerling. Aquac. Res. 2009; 40(14):1642-1652.
6. Ali A. Probiotics in fish farming. Evaluation of a bacterial mixture. Rapport-Sveriges Lantbruksuniversitet, Vattenbruksinstitutionen (Sweden). 2000.
7. Ali FH. “Probiotics feed supplement" to improve quality of broiler chicken carcasses. WJDFS. 2010; 5(1): 93-99
8. Anderson DP, Roberson BS, Dixon OW. Plaque-forming cells and humoral antibody in rainbow trout (Salmo gairdneri) induced by immersion in a Yersinia ruckeri O-antigen preparation. J. Fish. Res. Board Can. 1979; 36(6):636-9.
9. Balcázar JL, De Blas I, Ruiz-Zarzuela I, Cunningham D, Vendrell D, Múzquiz JL. The role of probiotics in aquaculture. Vet. Microbiol. 2006; 114(3-4):173-186.
10. Weston DP. Environmental considerations in the use of antibacterial drugs in aquaculture.1996: 140-165.
11. Vine NG, Leukes WD, Kaiser H. Probiotics in marine larviculture. FEMS Microbiol. Rev.2006; 30(3):404-427.
12. VidyaLaxme B, Rovetto A, Grau R, Agrawal R. Synergistic effects of probiotic Leuconostoc mesenteroides and Bacillus subtilis in malted ragi (Eleucine corocana) food for antagonistic activity against V. cholerae and other beneficial properties. J. Food Sci. Technol. 2014; 51:3072-3082.
13. Kim DH, Austin B. Innate immune responses in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) induced by probiotics. Fish Shellfish Immunol. 2006 Nov 1; 21(5):513-524.
14. Verschuere L, Rombaut G, Sorgeloos P, Verstraete W. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture. Microbiol Mol Biol Rev. 2000; 64(4):655-671.
15. Brunt J, Austin B. Use of a probiotic to control lactococcosis and streptococcosis in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). J. Fish Dis. 2005; 28(12):693-701.
16. Irianto A, Austin B. Probiotics in aquaculture. J. Fish Dis. 2002; 25(11):633-642.
17. Oyetayo VO, Oyetayo FL. Potential of probiotics as biotherapeutic agents targeting the innate immune system. Afr. J. Biotechnol. 2005; 4(2):123-127.
18. Hoseinifar SH, Roosta Z, Hajimoradloo A, Vakili F. The effects of Lactobacillus acidophilus as feed supplement on skin mucosal immune parameters, intestinal microbiota, stress resistance and growth performance of black swordtail (Xiphophorus helleri). Fish Shellfish Immunol. 2015; 42(2):533-538.
19. Aly SM, Ahmed YA, Ghareeb AA, Mohamed MF. Studies on Bacillus subtilis and Lactobacillus acidophilus, as potential probiotics, on the immune response and resistance of Tilapia nilotica (Oreochromis niloticus) to challenge infections. Fish Shellfish Immunol. 2008; 25(1-2):128-136.
20. Kesarcodi-Watson A, Kaspar H, Lategan MJ, Gibson L. Probiotics in aquaculture: the need, principles and mechanisms of action and screening processes. Aquac. J. 2008; 274(1):1-4.
21. Khattab YA, Shalaby AM, Abdel-Rhman A. Use of probiotic bacteria as growth promoters, anti-bacterial and their effects on physiological parameters of Oreochromis niloticus. InProceedings of international symposium on Nile Tilapia in Aquac. J. 2005;7:156-165.
22. Brunt J, Newaj‐Fyzul A, Austin B. The development of probiotics for the control of multiple bacterial diseases of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). J. Fish Dis. 2007;30(10):573-579.
23. Dimitroglou A, Merrifield DL, Moate R, Davies SJ, Spring P, Sweetman J, Bradley G. Dietary mannan oligosaccharide supplementation modulates intestinal microbial ecology and improves gut morphology of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). J. Anim. Sci. 2009; 87(10):3226-3234.
24. Drabkin DI. Crystallographic and optical properties of human hemoglobin. A proposal for the standarization of hemoglobin. Am. J. Med. 1945;209:268-270.
25. Ferguson RM, Merrifield DL, Harper GM, Rawling MD, Mustafa S, Picchietti S, Balcàzar JL, Davies SJ. The effect of Pediococcus acidilactici on the gut microbiota and immune status of on‐growing red tilapia (Oreochromis niloticus). J. Appl. Microbiol. 2010;109(3):851-862.
26. Hoseinifar SH, Khalili M, Rostami HK, Esteban MÁ. Dietary galactooligosaccharide affects intestinal microbiota, stress resistance, and performance of Caspian roach (Rutilus rutilus) fry. Fish Shellfish Immunol. 2013; 35(5):1416-1420.
27. Rengpipat S, Rukpratanporn S, Piyatiratitivorakul S, Menasaveta P. Immunity enhancement in black tiger shrimp (Penaeus monodon) by a probiont bacterium (Bacillus S11). Aquac. J. 2000; 191(4):271-288.
28. Mortazavian A, Razavi SH, Ehsani MR, Sohrabvandi S. Principles and methods of microencapsulation of probiotic microorganisms. Iran. J. Biotechnol. 2007; 5(1):1-18.
29. Rokka S, Rantamäki P. Protecting probiotic bacteria by microencapsulation: challenges for industrial applications. Eur. Food Res. Technol. 2010;231(1):1-2.
30. Keysami MA, Mohammadpour M, Saad CR. Probiotic activity of Bacillus subtilis in juvenile freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de Man) at different methods of administration to the feed. Aquac. Int. 2012 Jun; 20:499-511.
31. Blaxhall PC, Daisley KW. Routine haematological methods for use with fish blood. J. Fish Biol. 1973;5(6):771-781.
32. Nwachukwu U, George-Okafor U, Ozoani U, Ojiagu N. Assessment of probiotic potentials of Lactobacillus plantarum CS and Micrococcus luteus CS from fermented milled corn-soybean waste-meal. Sci. Afr. 2019;6:e00183.
33. Carnevali O, de Vivo L, Sulpizio R, Gioacchini G, Olivotto I, Silvi S, Cresci A. Growth improvement by probiotic in European sea bass juveniles (Dicentrarchus labrax, L.), with particular attention to IGF-1, myostatin and cortisol gene expression. Aquac. J. 2006; 258(1-4):430-438.
34. Lee JS, Cheng H, Damte D, Lee SJ, Kim JC, Rhee MH, Suh JW, Park SC. Effects of dietary supplementation of Lactobacillus pentosus PL11 on the growth performance, immune and antioxidant systems of Japanese eel Anguilla japonica challenged with Edwardsiella tarda. Fish Shellfish Immunol. 2013; 34(3):756-761.
35. Wang YB. Effect of probiotics on growth performance and digestive enzyme activity of the shrimp Penaeus vannamei. Aquac. J. 2007; 269(1-4):259-264.
36. Keysami MA, Shalmani AZ, Mojdehi MA. Effectiveness of Bacillus subtilis on growth and survival of common carp larva in non-earthen ponds. Anim. Environ. J. 2021;13(3):261-268 [In Persian].
37. Reid G, Sanders ME, Gaskins HR, Gibson GR, Mercenier A, Rastall R, Roberfroid M, Rowland I, Cherbut C, Klaenhammer TR. New scientific paradigms for probiotics and prebiotics. J Clin Gastroenterol. 2003;37(2):105-118.
38. Tookmehchi A, Shamsi H, Meshkini S, Delshad R, Ghasemi Moghanjoei A. Dietary administration of vitamin C and Lactobacillus rhamnosus in combination enhanced the growth and innate immune response of the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. ISFJ. 2012; 21(3):13-22.
39. Panigrahi A, Kiron V, Kobayashi T, Puangkaew J, Satoh S, Sugita H. Immune responses in rainbow trout Oncorhynchus mykiss induced by a potential probiotic bacteria Lactobacillus rhamnosus JCM 1136. Vet. Immunol. Immunopathol. 2004; 102(4):379-388.
40. Keysami MA, Mohammadpour M. Effect of Bacillus subtilis on Aeromonas hydrophila infection resistance in juvenile freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de Man). Aquac Int. 2013; 21:553-562.
41. Sugita H, Miyajima C, Deguchi Y. The vitamin B12-producing ability of the intestinal microflora of freshwater fish. Aquac. J. 1991; 92:267-276.
42. Moriarty DJ. Interactions of microorganisms and aquatic animals, particularly the nutritional role of the gut flora. Microbiology in poecilotherms. 1990:217-222.
43. Mazurkiewicz J, Przybył A, Sip A, Grajek W. Effect of Carnobacterium divergens and Enterococcus hirae as probiotic bacteria in feed for common carp, Cyprinus carpio L. Fish Aquat Sci. 2007; 15(2):79-92.
45. Houston AH, Cyr D. Thermoacclimatory variation in the haemoglobin systems of goldfish (Carassius
auratus) and rainbow trout (Salmo gairdneri). J. Exp. Biol. 1974 Oct 1; 61(2):455-461.
46. McLoughlin IJ, Voss AL, Hale JD, Jain R. Cosmetic efficacy of the topical probiotic Micrococcus luteus Q24 in healthy human adults. Cosmet. 2024; 11(4):122.
47. Vázquez JA, González M, Murado MA. Effects of lactic acid bacteria cultures on pathogenic microbiota from fish. Aquac. J. 2005; 245(1-4):149-161.
48. Talas ZS, Gulhan MF. Effects of various propolis concentrations on biochemical and hematological parameters of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Ecotoxicol. Environ. Saf. 2009; 72(7): 1994-1998.
49. Sun YZ, Yang HL, Ma RL, Lin WY. Probiotic applications of two dominant gut Bacillus strains with antagonistic activity improved the growth performance and immune responses of grouper Epinephelus coioides. Fish Shellfish Immunol. 2010; 29(5):803-809.
50. Taati R, Soltani M, Bahmani M, Zamini AA. Growth performance, carcass composition, and immunophysiological indices in juvenile great sturgeon (Huso huso) fed on commercial prebiotic, Immunoster. Iran J Fish Sci. 2011;10(2):324-335.
51. Jöborn A, Olsson JC, Westerdahl A, Conway PL, Kjelleberg S. Colonization in the fish intestinal tract and production of inhibitory substances in intestinal mucus and faecal extracts by Carnobacterium sp. strain K1. J. Fish Dis. 1997; 20(5):383-392.