Effect of Berberine on Sperm Profile in Varicocele-Induced Rats

Subject Areas : Journal of Animal Biology

Sogol Fami Tafreshi ¹ , Akram Eidi ^{2 *} , Pejman Mortazavi ³ , Ahmad Asghari ⁴

1 - Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
2 - Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
3 - Department of Pathology, Faculty of Specialized Veterinary Sciences, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
4 - Department of Veterinary Clinical Sciences, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran

Received: 2024-11-23 Accepted : 2025-05-31 Published : 2025-07-02

Keywords: Berberine, Varicocele, Sperm, Rat,

Abstract :

Berberine (C₂₀H₁₉NO) is an isoquinoline quaternary alkaloid that can be derived from various medicinal plants namely Berberis aquifolium (oregon grape), Berberis aristata (tree turmeric), Phellodendron amurense (Amur cork tree), Berberis vulgaris (barberry), and Hydrastis canadensis (Golden seal). It exhibits a wide range of biological properties, including antihypertensive, anxiolytic, antihyperglycemic, antidepressant, analgesic, anticancer, antioxidant, neuroprotective, anti-inflammatory, antiarrhythmic, and hypolipidemic effects. The current research aimed to explore the protective impacts of berberine on sperm profile in varicocele-induced rats. The animals were assigned randomly to nine groups: control, sham-operated, berberine alone (at doses of 25, 50, 100 mg/kg b.w./day), varicocele-induced control, and varicocele-induced rats treated with berberine. After thirty days of treatment, the animals were euthanized and sperm parameters were evaluated. Our results showed that varicocele induction notably reduced sperm motility, viability, and count in comparison to the normal controls. Additionally, sperm abnormalities markedly increased in the varicocele-induced rats. Berberine 50 and 100 mg/kg bw markedly enhanced across all semen quality parameters and mitigated the adverse impacts of varicocele induction. Notably, berberine led to no significant improvements in sperm features in the normal rats. Therefore, the findings suggested that berberine may have curative potential on the male reproductive system as an antioxidant, and it has potential clinical use for the treatment of varicocele disorders.

 

References:

1. Jensen CFS, Østergren P, Dupree JM, Ohl DA, Sønksen J, Fode M. Varicocele and male infertility. Nature Reviews Urology. 2017;14(9):523-33.
2. Jarow JP, Coburn M, Sigman M. Incidence of varicoceles in men with primary and secondary infertility. Urology. 1996;47(1):73-6.
3. Marmar JL. Varicocele and male infertility: part II: the pathophysiology of varicoceles in the light of current molecular and genetic information. Human Reproduction Update. 2001;7(5):461-72.
4. Saleh RA, HCLD AA. Oxidative stress and male infertility: from research bench to clinical practice. Journal of andrology. 2002;23(6):737-52.
5. Lorian K, Kadkhodaee M, Kianian F, Abdi A, Ranjbaran M, Ashabi G, Seifi B. Long‐term NaHS administration reduces oxidative stress and apoptosis in a rat model of left‐side varicocele. Andrologia. 2020;52(2):e13496.
6. Hassani‐Bafrani H, Najaran H, Razi M, Rashtbari H. Berberine ameliorates experimental varicocele‐induced damages at testis and sperm levels; evidences for oxidative stress and inflammation. Andrologia. 2019;51(2):e13179.
7. Turner T. The study of varicocele through the use of animal models. Human reproduction update. 2001;7(1):78-84.
8. Kuster C. Sperm concentration determination between hemacytometric and CASA systems: Why they can be different. Theriogenology. 2005;64(3):614-7.
9. Van der Horst G, Maree L. SpermBlue®: a new universal stain for human and animal sperm which is also amenable to automated sperm morphology analysis. Biotechnic & Histochemistry. 2010;84(6):299-308.
10. Russo GI, Saleh R, Finocchi F, Juma AR, Durairajanayagam D, Kahraman O, et al. Impact of Varicocele on Testicular Oxidative Stress and Sperm Parameters in Experimental Animals: A Systematic Review and Meta-Analysis. The World Journal of Men's Health. 2024;42(3):563.
11. Villanueva‐Diaz C, Vega‐Hernandez E, Diaz‐Perez M, Echavarria‐Sanchez M, Karchmer‐Krivitsky S. Sperm dysfunction in subfertile patients with varicocele and marginal semen analysis. Andrologia. 1999;31(5):263-7.
12. Missassi G, dos Santos Borges C, de Lima Rosa J, Villela e Silva P, da Cunha Martins Jr A, Barbosa Jr F, De Grava Kempinas W. Chrysin administration protects against oxidative damage in varicocele‐induced adult rats. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017;2017(1):2172981.
13. Vazquez-Levin MH, Friedmann P, Goldberg SI, Medley NE, Nagler HM. Response of routine semen analysis and critical assessment of sperm morphology by Kruger classification to therapeutic varicocelectomy. The Journal of urology. 1997;158(5):1804-7.
14. Walczak-Jedrzejowska R, Slowikowska-Hilczer J, Marchlewsk K, Oszukowska E, Kula K. During seminiferous tubule maturation testosterone and synergistic action of FSH with estradiol support germ cell survival while estradiol alone has pro-apoptotic effect. Folia Histochemica et Cytobiologica. 2007;45(I):59-64.
15. Hamada A, Sharma R, Du Plessis SS, Willard B, Yadav SP, Sabanegh E, Agarwal A. Two-dimensional differential in-gel electrophoresis–based proteomics of male gametes in relation to oxidative stress. Fertility and sterility. 2013;99(5):1216-26. e2.
16. Martínez P, Proverbio F, Camejo MI. Sperm lipid peroxidation and pro‐inflammatory cytokines. Asian Journal of Andrology. 2007;9(1):102-7.
17. Lampiao F, du Plessis SS. TNF-α and IL-6 affect human sperm function by elevating nitric oxide production. Reproductive biomedicine online. 2008;17(5):628-31.
18. Cicero AF, Baggioni A. Berberine and its role in chronic disease. Anti-inflammatory nutraceuticals and chronic diseases. 2016:27-45.
19. Song D, Hao J, Fan D. Biological properties and clinical applications of berberine. Frontiers of Medicine. 2020;14:564-82.
20. Mushtaq Z, Imran M, Saeed F, Imran A, Ali SW, Shahbaz M, et al. Berberine: A comprehensive Approach to combat human maladies. International Journal of Food Properties. 2023;26(1):787-807.
21. Najaran H, Rashtbari H, Mohammadi A, Soleimanifar F, Izadpanah F, Haddad Kashani H, Hassani Bafrani H. The protective effect of coenzyme Q10 and berberine on sperm parameters, with and without varicocelectomy in rats with surgically induced varicoceles. Comparative Clinical Pathology. 2019;28:479-85.

Full-Text:



 

 

 

Effect of Berberine on Sperm Profile in Varicocele-Induced Rats

 

Sogol Fami Tafreshi1, Akram Eidi1*, Pejman Mortazavi2, Ahmad Asghari3

 

1- Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran

2- Department of Veterinary Pathology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran

3- Department of Veterinary Clinical Sciences, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran

* Corresponding author: [e-mail] 

Received: 23 November 2024                                 Accepted: 31 May 2025

DOI: 10.60833/ascij.2025.1191336

 

Abstract

Berberine (C20H19NO) is a quaternary isoquinoline extracted from a variety of medicinal plants including Berberis aquifolium, Berberis aristata, Phellodendron amurense, Berberis vulgaris and Hydrastis canadensis. This substance has many medicinal properties including antihypertensive, antianxiety, antihyperglycemic, antidepressant, analgesic, anticancer, antioxidant, neuroprotective, anti-inflammatory, antiarrhythmic and cholesterol-lowering. In the present study, the protective effects of berberine on sperm profile in varicocele-induced mice were evaluated. The animals were randomly divided into 9 groups: healthy control, sham, healthy experimental receiving berberine at doses of 25, 50 and 100 mg/kg body weight, varicocele control and experimental varicocele varicocele mice treated with berberine at doses of 25, 50 and 100 mg/kg body weight. After 30 days of treatment, the animals were anesthetized and sperm parameters were examined. The results showed that varicocele induction significantly reduced sperm motility, viability, and count compared to the healthy control group. In addition, sperm abnormalities were significantly increased in varicocele-induced mice. Berberine treatment at doses of 50 and 100 mg/kg body weight significantly increased all sperm quality parameters and reduced the adverse effects of varicocele induction. Berberine treatment did not significantly change sperm characteristics in healthy mice. Therefore, the findings indicate that berberine may have therapeutic potential on the male reproductive system as an antioxidant and has potential clinical application for the treatment of varicocele disorders.

 

Keywords: Berberine, Varicocele, Sperm, Infertility, Rat.

 

 

 

 

 

 

اثر بربرین بر پارامترهای اسپرم در ناباروری القا شده توسط واریکوسل در موش‌های صحرایی نر

سوگل فمی تفرشی1، اکرم عیدی1*، پژمان مرتضوی2، احمد اصغری3

1- گروه زیست­شناسی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

2- گروه پاتوبیولوژی دامپزشکی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

3- گروه علوم درمانگاهی دامپزشکی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

*مسئول مکاتبات: [e-mail]

تاریخ دریافت:  03/09/1403       تاریخ پذیرش: 10/03/1404

DOI: 10.60833/ascij.2025.1191336

چکیده

بربرین (C20H19NO) یک ایزوکینولین چهارتایی است که از انواع گیاهان دارویی از جمله Berberis aquifolium، Berberis aristata، Phellodendron amurense، Berberis vulgaris و Hydrastis canadensis استخراج می‌شود. این ماده از خواص دارویی فراوانی از جمله ضد فشار خون بالا، ضداضطراب، ضد افزایش قند خون، ضدافسردگی، ضددرد، ضدسرطان، آنتی اکسیدان، محافظت از مغز و اعصاب، ضدالتهاب، ضد اریتمی و کاهش کلسترول برخوردار است. در تحقیق حاضر، اثرات حفاظتی بربرین بر پروفایل اسپرم در موش‌های با القا واریکوسل ارزیابی گردید. حیوانات به صورت تصادفی به 9 گروه تقسیم گردیدند: کنترل سالم، شم، تجربی سالم با دریافت بربرین در دوزهای 25، 50 و 100 میلی­گرم/کیلوگرم وزن بدن، کنترل واریکوسل و تجربی واریکوسل موش‌های واریکوسلی با تیمار بربرین در دوزهای 25، 50 و 100 میلی­گرم/کیلوگرم وزن بدن. پس از 30 روز تیمار، حیوانات بیهوش گردیده و پارامترهای اسپرم بررسی شد. نتایج نشان داد که القای واریکوسل به صورت معنی‌داری باعث کاهش تحرک، زنده‌مانی و تعداد اسپرم در مقایسه با گروه کنترل سالم شد. علاوه بر این، ناهنجاری­های اسپرم به صورت معنی‌داری در موش‌های القا شده با واریکوسل افزایش یافته است. تیمار بربرین در دوزهای 50 و 100 میلی‌گرم/کیلوگرم وزن بدن به صورت معنی‌داری در تمام پارامترهای کیفیت اسپرم موجب افزایش گردید و اثرات نامطلوب القای واریکوسل را کاهش داد. تیمار بربرین تغییر معنی‌داری در ویژگی‌های اسپرم در موش‌های سالم ایجاد نکرد. بنابراین، یافته‌ها نشان می‌دهد که بربرین احتمالا دارای پتانسیل درمانی بر سیستم تولیدمثلی مردان به ‌عنوان یک آنتی‌اکسیدان می باشد و کاربرد بالینی بالقوه‌ای برای درمان اختلالات واریکوسل دارد.

کلمات کلیدی: بربرین، واریکوسل، اسپرم، ناباروری، موش صحرایی.

مقدمه

 

واریکوسل مجموعه­‌ای از سیاهرگ­‌های پرپیچ ‌و خم شبکه پامپینی­‌فرم است که به ‌طور غیرطبیعی بزرگ شده‌اند. این شبکه از وریدها تخلیه بیضه­ها را فراهم می‌کند و با یک سیاهرگ اسپرماتیک داخلی ادغام می‌شود. واریکوسل در 15 درصد جمعیت عمومی اتفاق می­افتد و اولین بار در بزرگسالی پدیدار می‌شود (1). واریکوسل اغلب در مردان نابارور شناسایی می‌شود و در 44 درصد از مردان مبتلا به ناباروری اولیه وجود دارد. همچنین معمولاً در 81-45 درصد از مردان مبتلا به ناباروری ثانویه یافت می‌شود، زیرا تصور می‌شود که واریکوسل در طول زمان اثرات سویی بر عملکرد بیضه دارد (2). در حالی که رابطه دقیق بین واریکوسل و ناباروری هنوز به طور کامل مشخص نشده است، واریکوسل می‌تواند بر غلظت، تحرک و مورفولوژی اسپرم و همچنین یکپارچگی DNA اسپرم تأثیر منفی بگذارد. مکانیسم­های پاتوفیزیولوژی این بیماری بطور دقیق شناخته نشده است اما می‌توان به استرس اکسیداتیو، هیپوترمی اسکروتال، رفلاکس متابولیت­ها، آپوپتوزیس اشاره کرد (3). استرس اکسیداتیو عامل اختلال در تعادل بین گونه­های فعال اکسیژن (ROS) و ظرفیت بافری آنتی­اکسیدان­ها است (4). مطالعات متعدد نشان داده­اند که استرس اکسیداتیو می‌تواند باعث آسیب به غشای اسپرم و DNA شود، اسپرم­زایی را مختل کرده و تحرک اسپرم را کاهش دهد (4). روش­های درمانی متفاوتی مانند واریکوسلکتومی بطور معمول برای مردان واریکوسلی انجام می گردد که اگرچه پارامتر های اسپرمی و هورمونی را بهبود می بخشد به همین دلیل وجود عوارض بسیار دراثر واریکوسلکتومی استفاده از آنتی­اکسیدان­های معمولا می‌تواند پارامترهای اسپرمی را بهبود بخشد (5). بربرین آلکالوئیدی است که در گیاهانی از جمله زرشک (Berberis vulgaris)، عصاره ریشه قبطی چینی (Coptis chinensis) و خوک طلائی (Hydrastis canadensis) یافت می‌شود. بربرین دارای ویژگی­های دارویی متعددی از جمله خواص ضداضطراب، ضدالتهاب، ضدافسردگی، ضددرد و ضدفراموشی است. اثرات درمانی بربرین بر ایسکمی مغزی و سکته نشان داده شده است. علاوه بر این، اثرات آنتی اکسیدانی و ضد التهابی بربرین نیز قبلا گزارش شده است و نشان داده شده است که بربرین هیچ اثر مضری بر بافت­های مختلف انسان و همچنین بر روی مدل­های حیوانی ندارد (۶). در مطالعه حاضر اثرات بربرین بر پارامترهای اسپرم در موش‌های صحرائی مدل واریکوسل مورد بررسی قرار داده شد.

مواد و روش­ها

موش‌های صحرایي نر بالغ نژاد ویستار با وزن تقربی 250-200 گرم در يك محيط كنترل شده، در دماي 2 ± 23 درجه سانتيگراد و رطوبت 5 ± 50 درصد 12 ساعت روشنايي و 12 ساعت تاريکي قرار گرفته و دسترسی آزاد به آب و غذا داشتند. مطالعه حاضر با کد اخلاق IR.IAU.SRB.REC.1402.210 به ثبت رسیده است. حيوانات در این مطالعه ابتدا با تزريق کتامين (100 میلی‌گرم/کيلوگرم) و زايلازين (10 میلی‌گرم/کيلوگرم) بصورت تزریق داخل­صفاقی بیهوش شدند. القاء مدل واريکوسل به روش Turner انجام گردید که بر گرفته از پديده فندق­شکن (Nutcracker Phenomenon) است. حيوانات در حالت سوپاين قرار گرفتند و يک برش در خط وسط بصورت عمودی در شکم در حدود 4-3 سانتی­متر ايجاد شد. پس از باز کردن شکم، احشای شکمی با کمک یک گاز خیس به آرامی به طرف راست بدن انتقال یافتند. یافتن وريد کليوی چپ و محل ورود وريد اسپرماتيک داخلی به آن صورت گرفت و سپس اطراف وريد کليوی چپ باز گردید. به موازات وريد کليوی يک سرسوزن به قطر 85/0 ميلیمتر قرار داده شد و بوسيله نخ سيلک 4 صفر روی وريد کليوی چپ گره زده شد به طوريکه محل گره بعد از محل ورود اسپرماتيک داخلی به وريد کليوی باشد. بعد از ایجاد گره، سر سوزن خارج گردیده تا ورید به حالت اولیه خود برگردد. با این کار، قطر ورید کلیوی تا 50 درصد کاهش یافته و باعث می‌شود که فشار داخل وریدی افزایش یابد و به ورید اسپرماتیک چپ انتقال یابد و واریکوسل ایجاد گردد. احشای شکمی به آرامی به محل خود باز گردانده شدند و محل برش شکمی بوسیله نخ 4 صفر سیلک بخیه زده شد و آنتی­بیوتیک تتراسایکلین به محل بخیه زده شد (7). حیوانات در ۹ گروه به صورت تصادفی تقسیم بندی شدند، هر گروه شامل ۶ سر موش بودند . 1- گروه کنترل سالم که حیوانات هیچ گونه درمان و مداخله ای دریافت نکردند. 2- گروه شم، حیوانات در این گروه تحت عمل جراحی قرار گرفتند ولی القای واریکوسل در آنها صورت نگرفت. 3 تا 5- گروه­های تجربی سالم که بربرین در دوزهای 25، 50 و ۱۰۰ میلی‌گرم/کیلوگرم وزن بدن دریافت نمودند. ۶- گروه کنترل نابارور که القای واریکوسل در این گروه حیوانات صورت گرفت. ۷ تا ۹- گروه­های تجربی نابارور حیوانات با القای واریکوسل نابارور شده و بربرین در دوزهای 25، 50 و ۱۰۰ میلی‌گرم/کیلوگرم وزن بدن دریافت نمودند. مدت تیمار ۲۸ روز و بصورت گاواژ بود. پس از ۲۸ روز حیوانات بیهوش شدند و برای جمع­آوری نمونه‌های اسپرم، اپی دیدیم چپ در شرایط استریل جدا شد و درون فالکون حاوی ۱ میلی لیتر محلول + T6 حاوی ۱۰ درصد BSA  15 درصد که از قبل در دمای ۳۷ درجه سانتی­گراد قرار داده شد و اپی دیدیم به قطعاتی تقسیم شد. با مشاهده محلول همگن اطمینان از استخراج اسپرم‌ها حاصل شد. برای تخلیه کامل اسپرم‌ها درون محلول، نمونه­ها به مدت ۳۰ دقیقه در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی­گراد 5 درصد CO2 قرار داده شد. مایع کدر رنگی حاصل شد که برای مخلوط کردن چندبار پیپت شد. ۱۰ میکرولیتر از محلول حاصل بر روی لام گذاشته شد. برای بررسی تعداد اسپرم‌ها از لام هماسیتومتر استفاده شد. محلولی حاوی 5 میکرولیتر فرمالین (شامل NaHCO3 5 درصد و تریپان بلوی 25/0 درصد) با 95 میکرولیتر محلول اسپرم مخلوط شد. این مخلوط، در لام بارگذاری شد. ۴ مربع ۱۶ خانه­ای (متوسط) از لام هماسیتومتر با استفاده از میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی ۴۰۰ مورد شمارش قرار گرفت (8). از رنگ­آمیزی ائوزین-نکروزین برای بررسی میزان زنده­مانی اسپرم‌ها مورد استفاده قرار گرفت. از نسبت 50 میکرولیتر سوسپانسیون اسپرم به 100 میکرولیتر محلول استفاده شد. ائوزین 1 درصد به میکروتیوب وارد شد و به دنبال آن محلول فوق به مدت 30 ثانیه در مجاورت 150 میکرولیتر نکروزین 10 درصد قرار گرفت. پس از یکنواخت شدن رنگ و سوسپانسیون اسپرم، یک قطره از سوسپانسیون رنگ شده روی لام گذاشته شد و اسمیر ایجاد شد. اسمیر حاصل در هوا خشک شده و مستقیماً زیر میکروسکوپ (CKX41; Olympus, Tokyo, Japan) با بزرگنمایی 1000 مورد بررسی قرار گرفت و 200 اسپرم در یک زمان شمارش گردید. به این صورت که اسپرم‌های مرده به رنگ صورتی تا قرمز در می آیند و اسپرم‌های زنده بدون رنگ می­مانند (5). جهت بررسی تحرک اسپرم، 10 میکرولیتر از سوسپانسیون اسپرم بر روی لامی که از قبل گرم شده بود گذاشته شد. 10 میدان میکروسکوپی با استفاده از یک میکروسکوپ معمولی با بزرگنمایی 400 مورد بررسی قرار گرفت. سه نوع حرکت پیشرونده (Progressive Motility)، حرکت غیرپیشرونده (Non-progressive motility) و بدون­تحرک (Immotile) مورد بررسی قرار گرفت. درصد تحرک اسپرم با کمک میکروسکوپ کنتراست فاز معکوس ثبت گردید (5). برای بررسی مورفولوژی اسپرم یک قطره از سوسپانسیون اسپرم بر روی لام گذاشته شد و در هوا خشک شد. اسلاید با الکل 95 درصد تثبیت شد و سپس طبق پروتکل Sperm Blue رنگ­آمیزی انجام گرفت. 300 اسپرم در هر حیوان از نظر شکل با بزرگنمایی 100 بررسی شد و درصد اسپرم‌هاي غيرطبيعي ثبت شد (9). داده­ها به صورت Mean ± SEM گزارش شدند. مقايسه آماری جهت داده­های كمی به روش ANOVA دوطرفه انجام شد و از آزمون تعقیبی توکی استفاده گردید.

نتایج 

پژوهش حاضر نشان داد که تیمار حیوانات سالم با بربرین در دوزهای 25، 50 و 100 میلی­گرم/کیلوگرم وزن بدن، تغییر معنی‌داری در تعداد، حرکت پیشرونده، اسپرم‌های بدون حرکت، زنده‌مانی و مورفولوژی اسپرم در مقایسه با حیوانات گروه کنترل سالم ایجاد نکرد. نتایج گویای آن است که تعداد، حرکت پیشرونده، حرکت غیر پیشرونده و زنده­مانی و مورفولوژی اسپرم در حیوانات گروه کنترل واریکوسل در مقایسه با گروه کنترل سالم کاهش معنی­داری نشان داد. درصد اسپرم‌های غیر پیشرونده و بدون حرکت در حیوانات گروه کنترل واریکوسل در مقایسه با گروه کنترل سالم افزایش معنی‌داری در سطح 001/0 p < ایجاد نمود. از طرفی، تیمار با بربرین در دوزهای 50 و 100 میلی‌گرم/کیلوگرم وزن بدن موجب بهبود در پارامترهای فوق گردید. نمودارهای 1 تا 6 اثر تیمارها بر پارامترهای مختلف را نشان می­دهند.

 

 

 

 

نمودار 1- اثر تیمار خوراکی بربرین در دوزهای 25، 50 و ۱۰۰ میلی‌گرم/ کیلوگرم وزن بدن بر تعداد اسپرم در رت­های نر سالم و نابارور القا شده توسط واریکوسل. نتایج به صورت میانگین ± خطای معیار میانگین برای 6 سر رت در هر گروه ارائه شده است. 001/0 ***p < اختلاف از گروه کنترل سالم را نشان می‌دهد. 001/0 +++p < اختلاف از گروه کنترل واریکوسل را نشان می‌دهد.

Fig. 1. Effect of oral barbering treatment at doses of 25, 50 and 100 mg/kg body weight on sperm count in healthy and infertile male rats induced by varicocele. Results are presented as Mean ± SEM for 6 rats in each group. ***p < 0.001 indicates difference from healthy control group. +++p < 0.001 indicates difference from varicocele control group.

 

نمودار 2- اثر تیمار خوراکی بربرین در دوزهای 25، 50 و ۱۰۰ میلی‌گرم/کیلوگرم وزن بدن بر حرکت پیشرونده اسپرم در رت­های نر سالم و نابارور القا شده توسط واریکوسل. نتایج به صورت میانگین ± خطای معیار میانگین برای 6 سر رت در هر گروه ارائه شده است. 001/0 *** p < اختلاف از گروه کنترل سالم را نشان می‌دهد. 001/0 +++ p < اختلاف از گروه کنترل واریکوسل را نشان می‌دهد.

Fig. 2. Effect of oral barbering treatment at doses of 25, 50 and 100 mg/kg body weight on sperm motility in healthy and infertile male rats induced by varicocele. Results are presented as Mean ± SEM for 6 rats in each group. ***p < 0.001 indicates difference from healthy control group. +++p < 0.001 indicates difference from varicocele control group.

 

 

 

نمودار 3- اثر تیمار خوراکی بربرین در دوزهای 25، 50 و ۱۰۰ میلی‌گرم/کیلوگرم وزن بدن بر حرکت غیرپیشرونده اسپرم در رت­های نر سالم و نابارور القا شده توسط واریکوسل. نتایج به صورت میانگین ± خطای معیار میانگین برای 6 سر رت در هر گروه ارائه شده است. 001/0 *** p < اختلاف از گروه کنترل سالم را نشان می‌دهد. 001/0 +++ p < اختلاف از گروه کنترل واریکوسل را نشان می‌دهد.

Fig. 3. Effect of oral barbering treatment at doses of 25, 50 and 100 mg/kg body weight on non-progressive sperm motility in healthy and infertile male rats induced by varicocele. Results are presented as Mean ± SEM for 6 rats in each group. ***p < 0.001 indicates difference from healthy control group. +++p < 0.001 indicates difference from varicocele control group.

 

 

 

نمودار 4- بررسی اثر تیمار خوراکی بربرین در دوزهای 25، 50 و ۱۰۰ میلی‌گرم /کیلوگرم وزن بدن بر تعداد اسپرم‌های بدون حرکت در رت­های نر سالم و نابارور القا شده توسط واریکوسل. نتایج به صورت میانگین ± خطای معیار میانگین برای 6 سر رت در هر گروه ارائه شده است. 001/0 *** p < اختلاف از گروه کنترل سالم را نشان می‌دهد. 001/0 +++ p < اختلاف از گروه کنترل واریکوسل را نشان می‌دهد.

Fig 4. Study of the effect of oral barbering treatment at doses of 25, 50 and 100 mg/kg body weight on the number of non-motile sperm in healthy and infertile male rats induced by varicocele. Results are presented as Mean ± SEM for 6 rats in each group. *** p < 0.001 indicates difference from the healthy control group. +++ p < 0.001 indicates difference from the varicocele control group.

 

 

 

نمودار 5- اثر تیمار خوراکی بربرین در دوزهای 25، 50 و ۱۰۰ میلی‌گرم/کیلوگرم وزن بدن بر زنده‌مانی اسپرم در رت­های نر سالم و نابارور القا شده توسط واریکوسل. نتایج به صورت میانگین ± خطای معیار میانگین برای 6 سر رت در هر گروه ارائه شده است. 001/0 *** p <، 01/0 ** p < اختلاف از گروه کنترل سالم را نشان می‌دهد. 001/0 +++ p < اختلاف از گروه کنترل واریکوسل را نشان می‌دهد.

Fig. 5. Effect of oral barbering treatment at doses of 25, 50 and 100 mg/kg body weight on sperm viability in healthy and infertile male rats induced by varicocele. Results are presented as Mean ± SEM for 6 rats in each group. ***p < 0.001, **p < 0.01 indicates difference from healthy control group. +++p < 0.001 indicates difference from varicocele control group.

 

 

 نمودار 6- اثر تیمار خوراکی بربرین در دوزهای 25، 50 و ۱۰۰ میلی‌گرم/کیلوگرم وزن بدن بر مرفولوژی اسپرم در رت­های نر سالم و نابارورالقا شده توسط واریکوسل. نتایج به صورت میانگین ± خطای معیار میانگین  برای 6 سر رت در هر گروه ارائه شده است. 001/0 *** p < اختلاف از گروه کنترل سالم را نشان می‌دهد. 001/0 +++ p <، 01/0 ++ p < اختلاف از گروه کنترل واریکوسل را نشان می‌دهد.

Fig. 6. Effect of oral berberine treatment at doses of 25, 50 and 100 mg/kg body weight on sperm morphology in healthy male rats and infertile male rats induced by varicocele. Results are presented as Mean ± SEM for 6 rats in each group. *** p < 0.001 indicates difference from the healthy control group. +++ p < 0.01 indicates difference from the varicocele control group.

 

بحث

 

نتایج این مطالعه نشان داد که القا واریکوسل باعث کاهش تعداد اسپرم، حرکت پیشرونده، افزایش اسپرم‌های غیرپیشرونده یا بدون حرکت شده است. از طرفی القا واریکوسل سبب کاهش تعداد اسپرم با مورفولوژی طبیعی گردید. تیمار بربرین در دوزهای 50 و 100 میلی‌گرم/ کیلوگرم باعث بهبود پارامترهای اسپرمی می‌شود. القا واریکوسل با ایجاد تغییرات در پارامتر های اسپرم توسط مکانیسم­های زمینه­ای مختلف از جمله استرس اکسیداتیو، التهاب و آپوپتوز منجر به ناباروری می­گردد (10). در مطالعه­ای توسط Russo در سال 2024 صورت گرفته است نقش بالقوه استرس اکسیداتیو در پاتوژنز بیضه با آسیب واریکوسل تایید گردیده است (10). القا واریکوسل مرتبط با افزایش استرس اکسیداتیو است که با افزایش سطوح MDA در بافت بیضه می­باشد. MDA محصول جانبی پراکسیداسیون لیپیدی ناشی از عدم تعادل ROS است و به عنوان نشانگر استرس اکسیداتیو عمل می‌کند. در مراحل اولیه استفاده از آنتی­اکسیدان­ها می‌تواند تا حدی کیفیت پارامترهای اسپرمی را بهبود ببخشد (10). تحرک اسپرم در بسیاری از مردان نابارور مبتلا به واریکوسل به تنهایی یا همراه با سایر پارامترهای اسپرمی تحت تاثیر قرار می گیرد (11). Gabriela و همکاران نشان دادند که واریکوسل باعث کاهش تحرک اسپرم می‌شود و تعداد اسپرم‌های با شکل غیرطبیعی در گروه واریکوسل بیشتر است (12، 13). واریکوسل با افزایش سطح پروستاگلاندین­ها سبب کاهش تعداد سلول‌های لیدیگ و کاهش سطح هورمون تستوسترون می­گردد. تستوسترون برای بلوغ لوله­های منی ساز لازم است و ترشح آن سبب گسترش و رشد لوله­های منی­ساز می‌شود (14). به نظر می­رسد که هیپوکسی و استرس اکسیداتیو ناشی از واریکوسل ممکن است باعث کاهش حرکت پیشرونده اسپرم‌ها شوند. تحرک اسپرم یکی از عوامل اصلی تعیین کننده در ظرفیت اسپرم برای عبور از لوله­های فالوپ به منظور لقاح است. آنتی­اکسیدان­ها با تنظیم عملکردهای مختلف بر روی حرکت اسپرم موثر واقع می‌شوند (15). رسپتورهایی جهت بیان آنزیم سیکلواکسیژناز و پروستاگلاندین E2 در سلول‌های اسپرماتوژنیک وجود دارد که تولید پروستاگلاندین­ها به­خصوص پروستاگلندین 2E در سلول‌های اسپرم­ساز بر مورفولوژی اسپرم تاثیر می­گذارند و میزان باروری را کاهش می‌دهند. اینترفرون گاما، اینترلوکین-10 و اینترلوکین-8 باعث لیپید پراکسیداسیون در غشا اسپرم شده و میزان MDA را افزایش می‌دهند که در نهایت سبب کاهش ظرفیت اسپرم و ناباروری می­گردند (16). همچنین شاخص­های التهابی دخیل در بیماری واریکوسل سبب افزایش میزان تولید نیتریک اکساید می‌شوند که تحرک اسپرم را کاهش می‌دهند (17). خواص آنتی­اکسیدانی و ضد التهابی ناشی از بربرین و همچنین اثر غیرسمی آن بر بافت­های انسانی، آن را به عنوان یک عامل درمانی تازه کشف شده تبدیل کرده است. مسیرهای سیگنالینگ که از طریق آن بربرین اثرات خود را اعمال می‌کند حائز اهمیت می­باشد. بربرین استرس اکسیداتیو را از طریق القای مسیر فاکتور هسته‌ای فاکتور 2 (Nrf2) مرتبط با اریتروئید 2 سرکوب می‌کند. Nrf2 یک فاکتور رونویسی است که منجر به رونویسی آنزیم­های فاز II و ژن­های پروتئین­های محافظ سلولی مانند NAD(P)H کینون اکسیدوردوکتاز-1 (NQO-1) و هم اکسیژناز-1 می‌شود. (HO-1) با طیف گسترده­­ای از فعالیت­ها در تنظیم حالت ردوکس و متابولیسم انرژی در سلول‌ها نقش دارد. Nrf2 به­عنوان یک واسطه مهم بربرین در کاهش استرس اکسیداتیو شناخته شده است، زیرا مسدود کردن Nrf2 فعالیت آنتی­اکسیدانی بربرین را از بین می برد. بربرین از طریق مکانیسم­های پیچیده التهاب را سرکوب می‌کند. علاوه بر فعالیت آنتی­اکسیدانی، مسیر AMPK نیز برای اثر ضدالتهابی بربرین مهم است. مسدود کردن AMPK می‌تواند اثر مهاری بربرین را بر تولید سایتوکاین­های پیش­التهابی مانند نیتریک­اکسیدسنتاز القایی (iNOS) و COX2 در ماکروفاژها از بین ببرد (18). از بربرین به علت داشتن خواص آنتی­اکسیدان، ضد آپوپتوز و ضد ایسکمی می‌توان برای درمان بسیاری از بیماری­ها مانند سرطان و بیماری­های گوارشی، متابولیک، قلبی عروقی و عصبی استفاده کرد (19). این گیاه در سیستم تولیدمثلی بویژه در مردان موثر واقع شده است. بربرین در ترکیب با کوآنزیم Co Q10 و/یا به تنهایی، پارامترهای اسپرم را افزایش داده و آسیب DNA اسپرم را در موش‌های مبتلا به واریکوسل کاهش می‌دهد. بربرین افزایش سطح تستوسترون و اینهیبین خون، توانایی غدد درون ریز بیضه را افزایش می‌دهد و از سلول‌های لیدیگ در برابر آسیب­های التهابی و استرس اکسیداتیو ناشی از واریکوسل محافظت می‌کند. علاوه­براین، بربرین سطح هورمون­های جنسی سرم را در واریکوسل تجربی افزایش می‌دهد و با کاهش فعالیت GnRH، FSH، LH و آلکالین فسفاتاز، پاسخ­های التهابی ناشی از واریکوسل را کاهش می‌دهد (20). حسنی بافرانی و همکاران نشان دادند که تیمار با بربرین زنده‌مانی، تعداد و حرکت اسپرم‌ها را افزایش داد كه به علت کاهش پارامترهای التهابی IL-6 و TNF-α و کاهش MDA و افزایش ظرفیت آنتی­­اکسیدانی SOD بود (6). همچنین نجاران و همکاران گزارش کردند که تیمار با بربرین تعداد، حرکت، مورفولوژی و زنده‌مانی اسپرم‌ها را بهبود بخشیده است (21). تحقیق حاضر نشان داد که واریکوسل تعداد، درصد اسپرم‌ها با حرکت پیشرونده و بدون حرکت، مورفولوژی طبیعی اسپرم‌ها را دستخوش تغییر می‌کند. تمامی پارامترهای اسپرمی از جمله تراکم، تحرک و مورفولوژی در افراد مبتلا به واریکوسل نسبت به افراد سالم غیرطبیعی می­باشند.

نتیجه­گیری

بربرین با خواص آنتی­اکسیدانی خود باعث بهبود پارامترهای اسپرمی از طریق کاهش مکانیسم­های زمینه­ای از جمله استرس اکسیداتیو در موش‌های صحرایی واریکوسلی گردیده است.

منابع

1. Jensen CFS, Østergren P, Dupree JM, Ohl DA, Sønksen J, Fode M. Varicocele and male infertility. Nat Rev Urol. 2017;14(9):523-533.

2. Jarow JP, Coburn M, Sigman M. Incidence of varicoceles in men with primary and secondary infertility. Urology. 1996;47(1):73-76.

3. Marmar JL. Varicocele and male infertility: part II: the pathophysiology of varicoceles in the light of current molecular and genetic information. Hum Reprod Update. 2001; 7(5):461-472.

4. Saleh RA, HCLD AA. Oxidative stress and male infertility: from research bench to clinical practice. J Androl. 2002;23(6):737-752.

5. Lorian K, Kadkhodaee M, Kianian F, Abdi A, Ranjbaran M, Ashabi G, Seifi B. Long‐term NaHS administration reduces oxidative stress and apoptosis in a rat model of left‐side varicocele. Andrologia. 2020; 52(2):e13496.

6. Hassani‐Bafrani H, Najaran H, Razi M, Rashtbari H. Berberine ameliorates experimental varicocele‐induced damages at testis and sperm levels; evidences for oxidative stress and inflammation. Andrologia. 2019;51(2):e13179.

7. Turner T. The study of varicocele through the use of animal models. Hum Reprod Update. 2001;7(1):78-84.

8. Kuster C. Sperm concentration determination between hemacytometric and CASA systems: Why they can be different. Theriogenology. 2005;64(3):614-617.

9. Van der Horst G, Maree L. SpermBlue®: a new universal stain for human and animal sperm which is also amenable to automated sperm morphology analysis. Biotech Histochem. 2010;84(6):299-308.

10. Russo GI, Saleh R, Finocchi F, Juma AR, Durairajanayagam D, Kahraman O, et al. Impact of Varicocele on Testicular Oxidative Stress and Sperm Parameters in Experimental Animals: A Systematic Review and Meta-Analysis. World J Mens Health. 2024;42(3):563.

11. Villanueva‐Diaz C, Vega‐Hernandez E, Diaz‐Perez M, Echavarria‐Sanchez M, Karchmer‐Krivitsky S. Sperm dysfunction in subfertile patients with varicocele and marginal semen analysis. Andrologia. 1999; 31(5):263-267.

12. Missassi G, dos Santos Borges C, de Lima Rosa J, Villela e Silva P, da Cunha Martins Jr A, Barbosa Jr F, De Grava Kempinas W. Chrysin administration protects against oxidative damage in varicocele‐induced adult rats. Oxid Med Cell Longev. 2017; 1:2172981.

13. Vazquez-Levin MH, Friedmann P, Goldberg SI, Medley NE, Nagler HM. Response of routine semen analysis and critical assessment of sperm morphology by Kruger classification to therapeutic varicocelectomy. J Urol. 1997;158(5):1804-1807.

14.Walczak-Jedrzejowska R, Slowikowska-Hilczer J, Marchlewsk K, Oszukowska E, Kula K. During seminiferous tubule maturation testosterone and synergistic action of FSH with estradiol support germ cell survival while estradiol alone has pro-apoptotic effect. Folia Histochem Cytobiol. 2007;45(I):59-64.

15. Hamada A, Sharma R, Du Plessis SS, Willard B, Yadav SP, Sabanegh E, Agarwal A. Two-dimensional differential in-gel electrophoresis–based proteomics of male gametes in relation to oxidative stress. Fertil Steril. 2013;99(5):1216-1226.

16. Martínez P, Proverbio F, Camejo MI. Sperm lipid peroxidation and pro‐inflammatory cytokines. Asian J Androl. 2007; 9(1):102-107.

17. Lampiao F, du Plessis SS. TNF-α and IL-6 affect human sperm function by elevating nitric oxide production. Reprod Biomed Online. 2008;17(5):628-31.

18. Cicero AF, Baggioni A. Berberine and Its Role in Chronic Disease. Adv Exp Med Biol. 2016;928:27-45.

19. Song D, Hao J, Fan D. Biologicalproperties and clinical applications of berberine. Front Med. 2020; 14:564-582.

20. Mushtaq Z, Imran M, Saeed F, Imran A, Ali SW, Shahbaz M, et al. Berberine: A comprehensive Approach to combat human maladies. Int J Food Prop. 2023;26(1):787-807.

21. Najaran H, Rashtbari H, Mohammadi A, Soleimanifar F, Izadpanah F, Haddad Kashani H, Hassani Bafrani H. The protective effect of coenzyme Q10 and berberine on sperm parameters, with and without varicocelectomy in rats with surgically induced varicoceles. Comp Clin Pathol. 2019;28:479-485.