Comparing the Effect of Galbanic Acid and Chitosan Gel on Pro-Inflammatory Factors in Intra-Abdominal Adhesions after Laparotomy in Rats
Subject Areas : Journal of Animal BiologyFiroozeh Saghaei 1 , melika montazeri 2 , Mahsa Rezvan 3
1 - Department of Veterinary Medicine, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran
2 - Department of Veterinary Medicine, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran
3 - Department of Veterinary Medicine, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran
Keywords: Laparotomy, Intra-abdominal adhesions, Inflammatory cytokines, Galbanic acid, Chitosan.,
Abstract :
Abdominal adhesions are a common complication after laparotomy (abdominal surgery) that can cause intestinal obstruction, pelvic pain and infertility. Since inflammation plays an effective role in induction of intra-abdominal adhesions and galbanic acid has anti-inflammatory and anti-cancer effects, in the present research, its effect on inhibiting of pro-inflammatory factors such as TNF-α and IL-1β, in abdominal adhesions after laparotomy was investigated. For this purpose, after anesthetizing and opening the abdomen, adhesion was induced in male wistar rats and, adhesion was induced in male wistar rats, and in one group, 2 cc of chitosan gel was injected in the adhesion induction site and the abdomen was closed, and in one group, galbanic acid (10mg/ kg) was injected intraperitoneally for 7 days. At the end of 7 days, the abdomen was opened again and the abdominal adhesion was observed and a sample was taken from the adhesion sites. RT-PCR method was used to determine the gene expression of pre-inflammatory factors TNF-α and IL-1β. The results of the study showed that intra-peritoneal injection of galbanic acid like chitosan gel effectively reduced the incidence of intra-abdominal adhesions after laparotomy. This effect was accompanied by a decrease in TNF-α and IL-1β gene expression in both groups, which indicates the anti-inflammatory effect of these two natural substances.
1. Awonuga A.O., Belotte J., Abuanzeh S., Fletcher N.M., Diamond M.P., Saed G.M., 2014. Advances in the pathogenesis of adhesion development: the role of oxidative stress. Reproductive Sciences, 21(7):823-836.
2. Bayhan Z., Zeren S., Kocak F.E., Kocak C., Akcılar R., Kargı E., Tiryaki C., Yaylak F., Akcılar A. 2016. Antiadhesive and anti-inflammatory effects of pirfenidone in postoperative intra-abdominal adhesion in an experimental rat model. Journal of Surgical Research, 201(2):348-355.
3. Bi J., Zhang S., Du Z., Zhang J., Deng Y., Liu C., Zhang J. 2017. Peripheral serotonin regulates postoperative intra-abdominal adhesion formation in mice. Scientific Reports, 7(1):1-12.
4. Chahardoli A., Mavaei M., Shokoohinia Y., Fattahi A. 2023. Galbanic acid, a sesquiterpene coumarin as a novel candidate for the biosynthesis of silver nanoparticles: In vitro hemocompatibility, antiproliferative, antibacterial, antioxidant, and anti-inflammatory properties. Advanced Powder Technology, 34(1):574-580.
5. Chen Q., Zhan Q., Li Y., Sun S., Zhao L., Zhang H., Zhang G. 2017. Schisandra lignan extract protects against carbon tetrachloride-induced liver injury in mice by inhibiting oxidative stress and regulating the NF-κB and JNK signaling pathways. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine, 2017:1-11.
6. Chung M.J., Park J.K., Park Y.I. 2012. Anti-inflammatory effects of low-molecular weight chitosan oligosaccharides in IgE–antigen complex-stimulated RBL-2H3 cells and asthma model mice. International Immunopharmacology, 12(2):453-459.
7. Dinarello C.A. 2018. Overview of the IL‐1 family in innate inflammation and acquired immunity. Immunological Reviews, 281(1):8-27.
8. Esmaeilzadeh M., Heidarian E., Shaghaghi M., Roshanmehr H., Najafi M., Moradi A., Nouri A. 2020. Gallic acid mitigates diclofenac-induced liver toxicity by modulating oxidative stress and suppressing IL-1β gene expression in male rats. Pharmaceutical Biology, 58(1):590-596.
9. Fatehi H.A., Zarzycki, A.N., Jeon, K., Deniset, J.F. and Fedak, P.W., 2021. Post-operative adhesions: a comprehensive review of mechanisms. Biomedicines, 9(8):867- 886.
10. Ghadiri M., Baradaran Rahimi V., Moradi E., Hasanpour M., Clark C.C., Iranshahi M., Rakhshandeh H., Askari V.R. 2021. Standardised pomegranate peel extract lavage prevents postoperative peritoneal adhesion by regulating TGF-β and VEGF levels. Inflammopharmacology, 29(3):855-868.
11. Ghasemi Z., Rezaee R., Aslani M.R., Boskabady M.H. 2021. Anti-inflammatory, anti-oxidant, and immunomodulatory activities of the genus Ferula and their constituents: A review. Iranian Journal of Basic Medical Sciences, 24(12):1613-1623.
12. Ghobrial S., Ott J., Parry J.P. 2023. An Overview of Postoperative Intraabdominal Adhesions and Their Role on Female Infertility: A Narrative Review. Journal of Clinical Medicine, 12(6):1-14.
13. Giusto G., Vercelli C., Iussich S., Audisio A., Morello E., Odore R., Gandini, M. 2016. A pectin-honey hydrogel prevents postoperative intraperitoneal adhesions in a rat model. BMC Veterinary Research, 13:1-5.
14. Jafari A., Teymouri M., Nik M.E., Abbasi A., Iranshahi M., Hanafi-Bojd M.Y., Jafari M.R. 2019. Interactive anticancer effect of nanomicellar curcumin and galbanic acid combination therapy with some common chemotherapeutics in colon carcinoma cells. Avicenna Journal of Phytomedicine, 9(3):237.
15. Jang D.I., Lee A.H., Shin H.Y., Song H.R., Park J.H., Kang T.B., Lee S.R., Yang S.H. 2021. The role of tumor necrosis factor alpha (TNF-α) in autoimmune disease and current TNF-α inhibitors in therapeutics. International Journal of Molecular Sciences, 22(5):1-16.
16. Kihara T., Toriuchi K., Aoki H., Kakita H., Yamada Y., Aoyama M. 2021. Interleukin-1β enhances cell adhesion in human endothelial cells via microRNA-1914–5p suppression. Biochemistry and Biophysics Reports, 27:101-112.
17. Kim K.H., Lee H.J., Jeong S.J., Lee H.J., Lee E.O., Kim H.S., Zhang Y., Ryu S.Y., Lee M.H., Lü J., Kim S.H. 2011. Galbanic acid isolated from Ferula assafoetida exerts in vivo anti-tumor activity in association with anti-angiogenesis and anti-proliferation. Pharmaceutical Research, 28:597-609.
18. Kohno S., Murata T., Sugiura A., Ito C., Iranshahi M., Hikita K., Kaneda N. 2011. Methyl galbanate, a novel inhibitor of nitric oxide production in mouse macrophage RAW264. 7 cells. Journal of natural medicines, 65:353-359.
19. Lauder C.I., Garcea, G., Strickland, A. and Maddern, G.J. 2011. Use of a modified chitosan–dextran gel to prevent peritoneal adhesions in a rat model. Journal of Surgical Research, 171(2):877-882.
20. Lerche P., Aarnes T.K., Covey-Crump G., Taboada F.M., 2016. Handbook of small animal regional anesthesia and analgesia techniques. West Sussex, UK: Wiley Blackwell.
21. Najafian A., Alavi A., Amjadi-Golpayegani K., Dadipour S., Safarimoradabadi A., Fallahi S., Faramarzi A. 2013. Post-surgical adhesion prevention: Vitamin C or Satureja Khuzestanica. Veterinary Clinical Pathology the Quarterly Scientific Journal, 7(1):1786-1792.
22. Rahimi V.B., Shirazinia R., Fereydouni N., Zamani P., Darroudi S., Sahebkar A.H., Askari V.R. 2017. Comparison of honey and dextrose solution on post-operative peritoneal adhesion in rat model. Biomedicine and Pharmacotherapy, 92:849-855.
23. Roohbakhsh Y., Rahimi V.B., Silakhori, S., Rajabi H., Rahmanian-Devin P., Samzadeh-Kermani A., Rakhshandeh H., Hasanpour M., Iranshahi M., Mousavi S.H., Askari V.R. 2020. Evaluation of the effects of peritoneal lavage with Rosmarinus officinalis extract against the prevention of postsurgical-induced peritoneal adhesion. Planta Medica, 86(06):405-414.
24. Scotece M., Conde-Aranda J. 2022. Inflammation in Health and Disease: New Insights and Therapeutic Avenues. International Journal of Molecular Sciences, 23(15):83-92.
25. Shirani K., Behravan J., Mosaffa, F., Iranshahi, M., Mehmankhah, B., Razavi-Azarkhiavi K., Karimi G. 2014. Evaluating the effects of galbanic acid on hydrogen peroxide-induced oxidative DNA damage in human lymphocytes. Avicenna Journal of Phytomedicine, 4(5):337-342.
26. Sirizi M.A.G., Ghalenoei J.A., Allahtavakoli M., Forouzanfar H., Bagheri, S.M. 2023. Anticancer potential of Ferula assa-foetida and its constituents, a powerful plant for cancer therapy. World Journal of Biological Chemistry, 14(2):28-39.
27. Wei G., Wu Y., Gao Q., Shen C., Chen Z., Wang K., Yu J., Li X., Sun X. 2018. Gallic acid attenuates postoperative intra-abdominal adhesion by inhibiting inflammatory reaction in a rat model. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research, 24:827-838.
28. Wong K.K., Cheung S.O., Huang L., Niu J., Tao C., Ho C.M., Che C.M., Tam P.K. 2009. Further evidence of the anti‐inflammatory effects of silver nanoparticles. ChemMedChem: Chemistry Enabling Drug Discovery, 4(7):1129-1135.
29. Yang Y.L., Lee M.T.G., Lee C.C., Su P.I., Chi C.Y., Liu C.H., Wu M.C., Yen Z.S., Chen S.C. 2018. Pentoxifylline decreases post-operative intra-abdominal adhesion formation in an animal model. PeerJ, 6:1-18.
30. Yoon H.J., Moon M.E., Park H.S., Im S.Y., Kim Y.H. 2007. Chitosan oligosaccharide (COS) inhibits LPS-induced inflammatory effects in RAW 264.7 macrophage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 358(3):954-959.
31. Zhang Q., Qiao H., Wu D., Lu H., Liu L., Sang X., Li D., Zhou Y. 2019. Curcumin potentiates the galbanic acid-induced anti-tumor effect in non-small cell lung cancer cells through inhibiting Akt/mTOR signaling pathway. Life Sciences, 239:1-14.
مقایسه اثر گالبانیک اسید و ژل چیتوزان بر فاکتورهای پیش التهابی در چسبندگی داخل شکمی پس ازلاپاراتومی در رت
Comparing the effect of galbanic acid and chitosan gel on pro-inflammatory factors in intra-abdominal adhesions after laparotomy in rats.
چسبندگي هاي محوطه بطني عارضه اي شايع پس از لاپاروتومی ( جراحي شكم ) بوده كه مي تواند سبب انسداد روده، درد لگن يا نازايي شود. از آنجا که التهاب نقش موثری در القای چسبندگی داخل شکمی دارد و گالبانیک اسید واجد آثار ضد التهاب و ضد سرطان می باشد در تحقیق حاضر تاثیر آن بر مهار فاکتورهای پیش التهابی موثر در چسبندگی شکمی پس از لاپاروتومی مانند TNF-α , IL-1β مورد بررسی قرارگرفت. بدين منظور در رتهای نر نژاد ویستار پس از بیهوشی و باز کردن ناحیه شکم ، القای چسبندگی صورت گرفت ودر یک گروه 2 سی سی ژل چیتوزان در محلالقای چسبندگی تزریق و شکم بسته شد و در یک گروه به مدت 7 روز گالبانیک اسید با دوز mg/kg10بصورت داخل صفاقی تزریق شد. در پایان 7 روز، شکم مجددا بازو وضعیت ایجاد چسبندگی مشاهده و ازمحل چسبندگي نمونه برداری شد. جهت تعیین میزان بیان ژن فاکتور های پیش التهابی TNF-α و IL-1β از روش RT-PCR استفاده شد. نتايج مطالعه نشان داد كه تزریق داخل صفاقي گالبانیک اسید همانند ژل چیتوزان به طور مؤثري باعث كاهش بروز چسبندگي داخل شكمي بعد از لاپاروتومي شد. این اثر با کاهش بیان ژن TNF-α و IL-1β در هر دو گروه همراه بود که بیانگر اثر ضد التهاب این دو ماده طبیعی می باشد.
کلید واژهها: "لاپاروتومی"،" چسبندگی داخل شکمی" ،" سایتوکینهای التهابی" ، "گالبانیک اسید"، "چیتوزان"
Abstract
Abdominal adhesions are a common complication after laparotomy (abdominal surgery) that can cause intestinal obstruction, pelvic pain and infertility. Since inflammation plays an effective role in induction of intra-abdominal adhesions and galbanic acid has anti-inflammatory and anti-cancer effects, in the present research, its effect on inhibiting of pro-inflammatory factors such as TNF-α and IL-1β, in abdominal adhesions after laparotomy was investigated. For this purpose, after anesthetizing and opening the abdomen, adhesion was induced in male Wistar rats and, adhesion was induced in male Wistar rats, and in one group, 2 cc of chitosan gel was injected in the adhesion induction site and the abdomen was closed, and in one group, galbanic acid (10mg/ kg) was injected intraperitoneally for 7 days. At the end of 7 days, the abdomen was opened again and the abdominal adhesion was observed and a sample was taken from the adhesion sites. RT-PCR method was used to determine the gene expression of pre-inflammatory factors TNF-α and IL-1β. The results of the study showed that intraperitoneal injection of galvanic acid like chitosan gel effectively reduced the incidence of intra-abdominal adhesions after laparotomy. This effect was accompanied by a decrease in TNF-α and IL-1β gene expression in both groups, which indicates the anti-inflammatory effect of these two natural substances.
Keyword: "Laparotomy", "intra-abdominal adhesions"," inflammatory cytokines"," galbanic acid", "chitosan"
مقدمه
چسبندگی به اتصالات فیبری بین بافتها و اندامهای مجاور اطلاق میشود که معمولاً پس از جراحی یا عفونت در هر قسمتی از بدن رخ میدهد. میزان بروز چسبندگی بعد از جراحی عمومی شکم بین 67 تا 93 درصد است. چسبندگی های داخل شکمی نه تنها باعث درد مزمن لگن و انسداد روده کوچک می شوند، بلکه یکی از دلایل اصلی ناباروری نیز هستند. چسبندگی علاوه بر اینکه برای بیماران مبتلا مشکل بزرگی است، برای سیستم مراقبت های بهداشتی نیز هزینه قابل توجهی دارد. در حالت ایده آل، با عمل جراحی دقیق و با استفاده از اصول میکروجراحی میتوان تا حدودی از چسبندگی جلوگیری کرد(12).علاوه بر این روشهای متنوعی برای پیشگیری از چسبندگی مانند موانع داخل شکمی و عوامل دارویی مورد تحقیق قرار گرفته اند. انواع مختلفی از موانع فیزیکی مانند غشاء های هیالورونیک اسید، کربوکسی متیل سلولز و ژل های هیالورونیک اسید – کربوکسی متیل سلولز که مکانیسم آن ها جلوگیری از تماس بین سطوح آسیب دیده می باشد، در دسترس هستند (13و 29).
تشکیل باندهای چیسندگی در روند ترمیم بافت پس از جراحی صورت میگیرد. مطالعات نشان داده است که پاسخهای التهابی و ترشح سایتوکاینها و هم چنین هایپوکسی و استرس اکسیداتیو در تشکیل بافت فیبروز سفت و در نتیجه باندهای چسبندگی نقش دارند(21و9). التهاب یک مکانیسم پیچیده برای مبارزه با عفونت ها و آسیب بافتی و عملکرد مناسب ارگانیسم های حیاتی است. التهاب امکان حرکت لکوسیت ها از گردش خون به بافت های آسیب دیده برای حذف عوامل بیماری زا، ترمیم بافت و بازگشت به هموستاز را فراهم میکند(24).
تعامل بین پاسخ های التهابی حاد، فیبرینولیز و فعالیت متالوپروتئینازهای ماتریکس و مهارکننده های بافتی آنها می تواند منجر به چسبندگی صفاقی شود. پس از آسیب صفاقی، واکنش های التهابی و تکثیر سلول های مزوتلیال آسیب دیده آغاز می شود و سپس سایتوکاین های التهابی مختلف و فاکتورهای رشد ترشح می شوند. سایتوکاین ها با مشارکت در مسیرهای فیبرینولیتیک و بازسازی ماتریکس خارج سلولی نقش مهمی در تحریک چسبندگی دارند. سطوح سرمی اینترلوکین 1 بتا( IL-1β ) و فاکتور نکروزدهنده تومور آلفا ( TNF-α ) نشانگرهای قابل اعتماد چسبندگی صفاقی پس از عمل لاپاراتومی هستند (22و12). TNF-α یک سایتوکاین است که به عنوان یک تنظیم کننده اصلی پاسخ های التهابی شناخته شده و در پاتوژنز برخی از بیماری های التهابی و خود ایمنی نقش دارد. TNF-α از نظر عملکردی موجب ایجاد یک سری مولکول های التهابی مختلف، از جمله سایر سایتوکاین ها و کموکاین ها می شود (15). IL-1β نیز یک واسطه کلیدی پاسخهای التهابی است و توسط چندین نوع سلول در پاسخ به محرکهای مختلف تولید میشود. بیان ژن IL-1β و رسپتور آن در بافتهای سرطانی منجر به رگزایی و رشد تومور میشود(16). به دلیل نقش IL-1β به عنوان میانجی بیماری های خود ایمنی، بیشترین اینترلوکین مطالعه شده از خانواده IL-1 است(7). در برخی مطالعات مشخص شده که کاهش فرایند التهاب میتواند از چسبندگی داخل شکمی جلوگیری کند مانند استفاده ازنانو ذرات نقره که موجب کاهش TNF-a در محل چسبندگی و به دنبال آن کاهش وقوع چسبندگی شده است(28) و همچنین تجویز پیرفنیدون در موش صحرایی موجب پیشگیری از وقوع چسبندگی پس از جراحی شده است که این امر همراه با کاهش التهاب ومیزان TNF-a بوده است (2). لذا انتخاب و برر سی اثر ترکیباتی که واجد اثر ضد التهاب می باشند میتواند راهگشای شناخت داروها و روشهای جدید برای پیشگیری از وقوع چسبندگی داخل شکمی باشد. در این راستا گالبانیک اسید که اصلی ترین سزکوئی ترپن کومارینی در گیاهان جنس آپیاسه است انتخاب شد.گالبانیک اسید واجد اثراتی مانند فعالیت پیش آپوپتیک در سلول های سرطانی، اثر ضد آنژیوژنزو ضد التهابی و ضد انعقادی می باشد(14) . همچنین ترکیب طبیعی چیتوزان که پیش از این در پیشگیری از چسبندگی داخل شکمی نیز استفاده شده است ، دارای خواص ضد التهاب با کاهش سایتوکینهای التهابی می باشد (6 و30). اما تا کنون تاثیر گالبانیک اسید و چیتوزان در مهار چسبندگی شکمی پس از جراحی با رویکرد کاهش فاکتورهای التهابی( TNF-α , IL-1β ) مورد بررسی قرار نگرفته است بنابر این در تحقیق حاضر تاثیر این دو ماده در پیشگیری از روند چسبندگی داخل شکمی پس از جراحی در رت بررسی و مقایسه شد.
مواد و روش ها
مواد: زایلازین (شیمی دارو، ایران)، کتامین(شیمی دارو، ایران)، چیتوزان ( شرکت البرز نانوتجهیز رایان، ایران) ، گالبانیک اسید ( شرگت گل اکسیر پارس، ایران CAS Number 3566-55-0)، کیت BIOZOL (Bioer، چین)، کیت cDNA (شرکت یکتا تجهیز، ایران)
گروه بندی: تعداد 24 سر رت نر سالم نژاد ویستار در محدوده وزنی 200 تا 250 گرم و سن سه ماه از خانه ی حیوانات دانشگاه آزاد اسلامی شهرکرد خریداری و به مدت یک هفته در شرایط مناسب تغذیه، نور و دمای حدود 24 درجه سانتی گراد نگهداری و دسترسی آزاد به آب و غذا داشتند. لازم به ذکر است در کلیه مراحل قوانین و مقررات اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی مبتنی بر دستور العملهای بین المللی رعایت شده است. رت ها به 4 گروه 6 تایی تقسیم شدند.گروه اول (گروه کنترل) : جراحی شکمی و القاء چسبندگی و فقط دریافت روزانه 2/0سی سی آب مقطر به صورت داخل صفاقی به مدت یک هفته. گروه دوم (گروه چیتوزان): جراحی شکمی و القاء چسبندگی و تجویز دو سی سی ژل چیتوزان به عنوان عامل ضد چسبندگی در محل جراحی و دریافت روزانه 2/0سی سی آب مقطر به صورت داخل صفاقی به مدت یک هفته. گروه سوم(گروه توئین): جراحی شکمی و القاء چسبندگی و تزریق روزانه 2/0 سی سی توئین (حلال گالبانیک اسید) به صورت داخل صفاقی به هر موش به مدت یک هفته. گروه چهارم(گروه گالبانیک اسید) : جراحی شکمی و القاء چسبندگی و تزریق روزانه گالبانیک اسید با دوز mg/kg10 (حل شده در توئین) به صورت داخل صفاقی به هر موش به مدت یک هفته.
روش القای چسبندگی
یک روز قبل از عمل جراحی و القای چسبندگی غذا از دسترس حیوانات دور شد. ابتدا حیوان را مقید ساخته و به وسیله ی دو داروی کتامین 10% با دوز mg/kg 10 و زایلازین 2% با دوز mg/kg 2 به صورت داخل عضلانی بیهوشی انجام شد(20). سپس رت ها را به پشت خوابانده و بعد از ضد عفونی نمودن پوست شکم با بتادین 10% و تراشیدن موهای ناحیه با رعایت شرایط استریل با اسکالپل برشی به طول3 سانتی متر روی خط وسط شکمی داده شد و توسط گاز استریل خشک ناحیه سکوم و صفاق 30 الی 35 بار ساییده شد تا خونریزی بر روی دیواره سکوم ظاهر گردید(27). سپس در گروه چیتوزان تزریق 2 سی سی ژل چیتوزان در محوطه شکمی انجام شد. در انتهای جراحی ، لایه های عضلانی شکم با نخ ویکریل 0/4 و پوست با نخ نایلون 0/4 به صورت بخیه سرتاسری ساده بخیه شد و از اسپری اکسی تتراسایکلین برای جلوگیری از عفونت استفاده شد. تزریق روزانه گالبانیک اسید و توئین به مدت یک هفته در دو گروه مجزا انجام شد.
نمونه گیری
پس از تجویز آخرین دوز دارو، رتها به مدت 24 ساعت بدون دریافت غذا نگهداری شده سپس توسط کلروفرم بیهوش شده و بعد از آغشته نمودن پوست شکم با بتادین 10% و با رعایت شرایط استریل برشی به طول3 سانتی متر روی خط وسط شکمی داده و پس از مشاهده باندهای چسبندگی، از ناحیه ی سکوم و باند های ایجاد شده تکه برداری انجام شد.
مشاهدات ماکروسکوپیک
چسبندگی های داخل شکمی ایجاد شده توسط فرد ناآگاه به موضوع تحقیق مشاهده و ثبت شد و فراوانی آنها در مقیاس آماری مورد بررسی قرار گرفت .
روش Real Time PCR برای تعیین TNF-α و IL1-β
برای بررسی میزان بیان ژن های فاکتورهای پیش التهابی TNF-α و IL1-β در بافت ها از روش Real Time PCR استفاده شد.
ابتدا از mg 100بافت مورد نظر توتال RNA طبق دستورالعمل کیت تجاری به روش ترایزول شرکت سیگما استخراج شد. به منظور اطمینان از غلظت مناسب RNA استخراجشده، جذب نمونهها با استفاده از دستگاه نانودراپ 2000, Thermo) آمریکا)، خوانده شد. همچنین کیفیت RNA استخراج شده توسط الکتروفروز روی ژل آگارز بررسی شد. سنجش کمی برای تعیین غلظت RNA به روش اسپکتوفتومتری انجام شد. به منظور حذف حضور DNA احتمالی در نمونهی RNA استخراجشده از کیت DNase I ساخت شرکت سینا ژن استفاده شد. سپس با استفاده از کیت سنتز cDNA (شرکت یکتا تجهیز) توتال RNA به cDNA تبدیل گردید. تکثیر قطعات ژنی با کمک واکنش RT-q PCR و پرایمرهای اختصاصی برای هر ژن انجام شد. برای طراحی پرایمرها ازنرم افزار Beacon designer software استفاده شد تمام پرایمرها به صورت اتصال اگزون- اگزون طراحی شد و برای تکثیر DNA ژنومی از 25 نانوگرم cDNA در تیوبهای جداگانه شد. RT-q PCR در 45 سیکل انجام شد (شامل دناتوراسیون در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 15 ثانیه، اتصال پرایمر در دمای 60 درجه سانتیگراد برای مدت 20 ثانیه و گسترش در دمای 72 درجه سانتیگراد برای مدت 25 ثانیه). از ژن β-اکتین به عنوان یک ژن کنترل داخلی استفاده شد. که در جدول 1 در زیر توالی پرایمرهای TNF-α و IL1-β را قرار دارد. کارآیی تکثیر قطعات مورد نظر با استفاده از منحنی استاندارد مورد بررسی قرار گرفت و از فرمول2-ΔΔCT جهت براورد میزان بیان ژن استفاده شد.
جدول 1:پرایمرهای مورد استفاده در RT-qPCR
ژن | توالی زوج پرایمر |
TNF-α forward reverse |
5 ́-CTGGCGTGTTCATCCGTTC-3′ 5′-ggctctgaggagtagacgataa-3 |
IL-1β forward revers |
5 ́ - CAACAAAAATGCCTCGTGCTG-3′ 5 ́ -TCGTTGCTTGTCTCTCCTTGTA-3′ |
β-actin forward revers |
5-CGCAAATTACCCACTCCCGAC-3′ 5′- GTAACCTCCCGTTCAGACCAC-3′ |
تجزیه و تحلیل داده ها
نتایج ماکروسکوپیک: درگروه اول (کنترل) که جراحی شکمی و القاء چسبندگی داشتند در5 مورد چسبندگی وجود داشت و 1رت فاقد چسبندگی بود. درگروه دوم ( چیتوزان ) در2 رت چسبندگی دیده شد و 4 رت فاقد چسبندگی بودند. درگروه سوم (توئین) در 4 مورد چسبندگی وجود داشت و 2رت فاقد چسبندگی بود. درگروه چهارم ( گالبانیک اسید ) در 1رت چسبندگی وجود داشت و 5 رت فاقد چسبندگی بودند. از آنجا که سطح معناداری فیشر 001/0بدست آمده که کمتر از 05/0است با اطمینان 95 درصد میتوان نتیجه گرفت شدت چسبندگی در گروههای مختلف یکسان نیست. مقایسه فراوانی وقوع چسبندگی در بین گروههای مختلف نشان دهنده کاهش معنا دار چسبندگی در گروه دریافت کننده گالبانیک اسید نسبت به گروه کنترل و گروه توئین می باشد. از طرفی کاهش وقوع چسبندگی داخل شکمی در دو گروه چیتوزان و گالبانیک اسید هم ارز است (نمودار 1).
نمودار 1: فراوانی وقوع چسبندگی در گروههای مختلف
حروف مشابه نشان دهنده عدم اختلاف معنا دار در بروز چسبندگی می باشد
نتایج آنالیز بیان ژنی : نتایج حاصل از بیان ژن IL1-β در گروه های مورد نظر نشان دهنده کاهش معنادار بیان این ژن در گروه های دریافت کننده گالبانیک اسید و چیتوزان نسبت به گروه کنترل می باشد. در گروه توئین گرچه کاهش بیان ژن IL-1β مشاهده میشود اما در مقایسه با دو گروه تیمار یعنی چیتوزان و گالبانیک اسید به لحاظ آماری معنا دار نمی باشد (نمودار 2).
نمودار2: مقایسه بیان ژن IL-1β در بین گروه ها(گروه کنترل : فاقد درمان، گروه چیتوزان: دریافت 2 سی سی چیتوزان، گروه توئیین: دریافت حلال گالبانیک اسید، گروه گالبانیک اسید: دریافت 10mg/kg گالبانیک اسید). داده ها به عنوان میانگین ± انحراف معیار (n = 6) ارائه شده است. کاهش معنیداری در بیان ژن IL-1β در گروههای چیتوزان و گالبانیک اسید نسبت به گروه کنترل مشاهده شد. (p<0.05)
نتایج بیان ژن TNF-α در نمودار 3 مشاهده میشود. با تجویز گالبانیک اسید و چیتوزان بیان ژن TNF-α به طور معناداری نسبت گروه کنترل کاهش دارد. تغییرات در گروه توئین نسبت به سایر گروهها معنادار نبوده و نشان دهنده این است که توئین اثر خاصی بر القای چسبندگی ندارد. 
نمودار3: مقایسه بیان ژن TNF-α در بین گروه ها(گروه کنترل : فاقد درمان، گروه چیتوزان: دریافت 2 سی سی چیتوزان، گروه توئیین: دریافت حلال گالبانیک اسید، گروه گالبانیک اسید: دریافت 10mg/kg گالبانیک اسید). داده ها به عنوان میانگین ± انحراف معیار (n = 6) ارائه شده است. کاهش معنیداری در بیان ژن TNF-α در گروههای چیتوزان و گالبانیک اسید نسبت به گروه کنترل مشاهده شد. (p<0.05)
بحث
سه فرآیند در ایجاد چسبندگی پس از جراحی دخیل است: الف) مهار سیستم های فیبرینولیتیک و تخریب ماتریکس خارج سلولی ، ب) القای پاسخ التهابی با تولید سایتوکین ها.ج) بروز هیپوکسی بافتی، همراه با افزایش بیان فاکتور رشد اندوتلیال عروقی (VEGF) می باشد (9و 23). التهاب در مقیاس بزرگ زمانی رخ می دهد که صفاق زخمی شود. سلول های التهابی مانند سلول های غول پیکر، لنفوسیت ها و سلول های پلاسما و همچنین فیبروبلاست ها به ناحیه آسیب دیده وارد می شوند. علاوه بر این، سایتوکاین های التهابی به طور قابل توجهی آزاد می شوند. این فرآیندها منجر به ایجاد چسبندگی فیبری می شود. استرس اکسیداتیو نیز نقش مهمی در تشکیل چسبندگی دارد(1). تحقیقات نشان داده است که IL-1β نقش مهمی در شروع و توسعه التهاب و تحریک سایتوکاین ها دارد(8). فاکتور نکروز دهنده تومور (TNF-α)، که یک سایتوکاین پیش التهابی است، در بافت های ملتهب تولید میشود(5). در تحقیقی نشان داده شده است وجود سروتونین در محل جراحی در رت باعث تشکیل باندهای چسبندگی میگردد که این ناشی از افزایش فاکتورهای التهابی در محل جراحی می باشد(3). مطالعات مختلف نشان می دهد که با مهار التهاب می توان از ایجاد چسبندگی جلوگیری کرد. قدیری و همکاران نشان دادند که عصاره هسته انار می تواند از ایجاد چسبندگی صفاقی جلوگیری کند. آنها این اثر را به اثر ضد التهابی و آنتی اکسیدانی دانه های انار نسبت دادند. زیرا کاهش چسبندگی با کاهش بیان ژنهای IL-1β TNF-α, و تحریک فاکتورهای آنتی اکسیدانی در محل چسبندگی همراه بود (10). مطالعه بر روی عصاره گیاه رزماری بر مهار چسبندگی پس از جراحی در رت توسط روحبخش و همکاران نیز با رویکرد بررسی فاکتورهای التهابی نشان داد که در گروههای دریافت کننده عصاره گیاه، کاهش قابل توجهی در سایتوکاینهای پیش التهابی مانند IL-1β و TNF-α و فاکتورهای اکسیداتیو مشاهده شد(23). عسل به صورت معنا داری موجب کاهش وقوع چسبندگی داخل صفاقی و نمره چسبندگی شده است . در این راستا عسل علاوه بر کاهش فاکتورهای اکسیداتیو، موجب کاهش چشمگیر سایتوکاینهای التهابی مانند IL-1β, IL-6 TNF-α, در محل چسبندگی شده است(22).
Ferula یک سرده از خانواده Apiaceae است و شامل حدود 170 گونه از گیاهان گلدار است که عمدتا بومی منطقه مدیترانه و شرق تا آسیای مرکزی هستند. در ایران، Ferula spp. به طور گسترده در طب سنتی استفاده می شود. گیاهان فرولا و مشتقات آنها سطح واسطه های التهابی را کاهش می دهند و اثرات ضد آپوپتوزی دارند. در شرایط تنش اکسیداتیو، این گیاهان و ترکیبات آنها نشانگرهای اکسیداتیو مانند مالون دی آلدئید، گونههای فعال اکسیژن و اکسید نیتریک را کاهش میدهند اما سوپراکسید دیسموتاز، گلوتاتیون پراکسیداز را افزایش میدهند. گیاهان فرولا و ترکیبات آنها نیز با تأثیر بر سیتوکین های مختلف، اثرات تعدیل کننده ایمنی را نشان دادند. علاوه بر این، مطالعات in vivo و in vitro اثرات کاهنده فشار خون، محافظت کننده عصبی، تقویت کننده حافظه، آنتی اکسیدانی، محافظت از کبد، ضد میکروبی، ضد سرطان، ضد سیتوتوکسیک، ضد چاقی و ضد کرم را برای گونه های مختلف Ferula و ترکیبات آنها نشان داد. تمام این اثرات مفید می تواند ناشی از اثرات ضد التهابی، آنتی اکسیدانی و تعدیل کننده ایمنی این گیاهان و ترکیبات آنها باشد. بر این اساس ، اعضای جنس Ferula را می توان به عنوان درمان بالقوه در برابر شرایط التهابی، استرس اکسیداتیو و اختلالات ایمنی در نظر گرفت(11).
گالبانیک اسید یک سزکوئی ترپن کومارینی است که از گیاه Ferula assa-foetida استخراج میشود.این ترکیب نیز آثار فارماکولوژیک متنوعی دارد از جمله اثرات ضد رگزایی، القای آپوپتوز، ضد سرطان، انتی اکسیدان و ضد التهاب (31و 4). یکی از مشتقات گالبانیک اسید به نام متیل گالبانات با مهار تولید نیتریک اکساید و کاهش خونرسانی به بافت موجب کاهش قابل توجه التهاب شده است (18). همچنین گالبانیک اسید نقش موثری در جذب رادیکالهای آزاد دارد(25). معمولا پس از ایسکمی بافتی تولید رادیکالهای آزاد افزایش یافته و فر ایند التهاب تحریک میشود . گالبانیک اسید با کاهش رادیکالهای آزاد منجر به مهار تولید سایتوکاینها و TNF-α میگردد (26و 17) و بنابر این به نظر میرسد میتواند از بروز چسبندگی داخل شکمی پیشگیری نماید. نتایج تحقیق حاضرنیز نشان داد بیان ژنهای فاکتورهای پیش التهابی از جمله TNF-α و IL-1β در گروه کنترل همراه با وقوع چسبندگی در 5 مورد بود. پس از استفاده از گالبانیک اسید، مشاهدات حاکی از کاهش وقوع چسبندگی بود. همچنین بیان ژنهای TNF-α و IL-1β به طور معنا داری نسبت به گروه کنترل کاهش داشت که این نتیجه نشان دهنده اثر ضد التهاب گالبانیک اسید می باشد و احتمالا مکانیسم پیشگیری از چسبندگی داخل شکمی توسط این ترکیب بر پایه اثرات ضد التهاب و ضد سایتوکاین آن می باشد و با سایر تحقیقات انجام شده در این زمینه همخوانی دارد.
چیتوزان یک پلی ساکارید طبیعی است که از جنس کیتین می باشد و در سیستمهای دارورسانی استفاده میشود زیرا قابلیت نفوذ پذیری بالایی دارد. چیتوزان کاربردهای پزشکی متنوعی دارد و از آن به عنوان یک محصول پیشگیری از چسبندگی داخل شکمی استفاده می شود. مکانیسمی که توسط آن ژل چیتوزان از چسبندگی جلوگیری می کند مهار تکثیر فیبروبلاست ها است و موجب جداسازی فیزیکی سطوح صفاقی آسیب دیده شده و همچنین دارای خواص هموستاتیک و ضد باکتریایی می باشد. اثر هموستاتیک آن میتواند از خونریزی پس از جراحی که محرک چسبندگی است جلوگیری کند (19) . مطالعات متعددی خواص ضد التهابی چیتوزان را گزارش کرده اند. در مطالعه ای که توسط یون و همکاران انجام شده اثرچیتوزان بر سلولهای RAW 264.7 تحریک شده با لیپو پلی ساکاریدها همراه با کاهش وابسته به دوز بیان ژنهای سایتوکاینهای TNF-α و IL-6شده است (30). تجویز روزانه الیگوساکارید چیتوزان در مدل موشهای مبتلا به آسم موجب کاهش سایتوکاینهای التهابی و پیش التهابی در بافت ریه گردیده است (6). در تحقیق حاضر اثر چیتوزان در کاهش التهاب و بیان ژنهای TNF-α و IL-1β هم ارز با گالبانیک اسید بوده که موید اثر ضد چسبندگی آن می باشد. مقایسه نسبت فراوانی وقوع چسبندگی در گروه چیتوزان با گالبانیک اسید نیز اثر آن را تایید میکند. بنابر این مقایسه اثر دو ترکیب گالبانیک اسید و ژل چیتوزان در پیشگیری از بروز چسبندگی نشان میدهد هر دو ماده دارای اثر مشابهی در کاهش وقوع چسبندگی از دیدگاه ماکروسکوپیک و ضد التهابی می باشند .
نتیجه گیری
نتایج این پژوهش نشان داد گالبانیک اسید می تواند از بروز چسبندگی داخل شکمی به طور معنا داری پیش گیری کند . این اثر همراه با کاهش بیان ژن فاکتورهای پیش التهابی بوده که بیانگر اثر ضد التهاب آن می باشد هم چنین ژل چیتوزان به شکل موضعی نیز موجب کاهش وقوع چسبندگی و التهاب گردیده است بنابراین میتوان به این دو ترکیب به عنوان عوامل ضد چسبندگی داخل شکمی پس از جراحی اندیشید. گرچه نیاز به تحقیقات گسترده تر نیز احساس میشود.
منابع
1-Awonuga, A.O., Belotte, J., Abuanzeh, S., Fletcher, N.M., Diamond, M.P. and Saed, G.M., 2014. Advances in the pathogenesis of adhesion development: the role of oxidative stress. Reproductive sciences, 21(7), pp.823-836.
2-Bayhan, Z., Zeren, S., Kocak, F.E., Kocak, C., Akcılar, R., Kargı, E., Tiryaki, C., Yaylak, F. and Akcılar, A., 2016. Antiadhesive and anti-inflammatory effects of pirfenidone in postoperative intra-abdominal adhesion in an experimental rat model. journal of surgical research, 201(2), pp.348-355.
3-Bi, J., Zhang, S., Du, Z., Zhang, J., Deng, Y., Liu, C. and Zhang, J., 2017. Peripheral serotonin regulates postoperative intra-abdominal adhesion formation in mice. Scientific Reports, 7(1), p.10001.
4- Chahardoli, A., Mavaei, M., Shokoohinia, Y. and Fattahi, A., 2023. Galbanic acid, a sesquiterpene coumarin as a novel candidate for the biosynthesis of silver nanoparticles: In vitro hemocompatibility, antiproliferative, antibacterial, antioxidant, and anti-inflammatory properties. Advanced Powder Technology, 34(1), p.103928.
5-Chen, Q., Zhan, Q., Li, Y., Sun, S., Zhao, L., Zhang, H. and Zhang, G., 2017. Schisandra lignan extract protects against carbon tetrachloride-induced liver injury in mice by inhibiting oxidative stress and regulating the NF-κB and JNK signaling pathways. Evidence-based complementary and alternative medicine, 2017.
6-Chung, M.J., Park, J.K. and Park, Y.I., 2012. Anti-inflammatory effects of low-molecular weight chitosan oligosaccharides in IgE–antigen complex-stimulated RBL-2H3 cells and asthma model mice. International immunopharmacology, 12(2), pp.453-459.
7-Dinarello, C.A., 2018. Overview of the IL‐1 family in innate inflammation and acquired immunity. Immunological reviews, 281(1), pp.8-27.
8-Esmaeilzadeh, M., Heidarian, E., Shaghaghi, M., Roshanmehr, H., Najafi, M., Moradi, A. and Nouri, A., 2020. Gallic acid mitigates diclofenac-induced liver toxicity by modulating oxidative stress and suppressing IL-1β gene expression in male rats. Pharmaceutical biology, 58(1), pp.590-596.
9-Fatehi Hassanabad, A., Zarzycki, A.N., Jeon, K., Deniset, J.F. and Fedak, P.W., 2021. Post-operative adhesions: a comprehensive review of mechanisms. Biomedicines, 9(8), p.867.
10-Ghadiri, M., Baradaran Rahimi, V., Moradi, E., Hasanpour, M., Clark, C.C., Iranshahi, M., Rakhshandeh, H. and Askari, V.R., 2021. Standardised pomegranate peel extract lavage prevents postoperative peritoneal adhesion by regulating TGF-β and VEGF levels. Inflammopharmacology, 29(3), pp.855-868.
11-Ghasemi, Z., Rezaee, R., Aslani, M.R. and Boskabady, M.H., 2021. Anti-inflammatory, anti-oxidant, and immunomodulatory activities of the genus Ferula and their constituents: A review. Iranian Journal of Basic Medical Sciences, 24(12), p.1613.
12-Ghobrial, S., Ott, J. and Parry, J.P., 2023. An Overview of Postoperative Intraabdominal Adhesions and Their Role on Female Infertility: A Narrative Review. Journal of Clinical Medicine, 12(6), p.2263.
13- Giusto, G., Vercelli, C., Iussich, S., Audisio, A., Morello, E., Odore, R. and Gandini, M., 2016. A pectin-honey hydrogel prevents postoperative intraperitoneal adhesions in a rat model. BMC veterinary research, 13, pp.1-5.
14-Jafari, A., Teymouri, M., Nik, M.E., Abbasi, A., Iranshahi, M., Hanafi-Bojd, M.Y. and Jafari, M.R., 2019. Interactive anticancer effect of nanomicellar curcumin and galbanic acid combination therapy with some common chemotherapeutics in colon carcinoma cells. Avicenna journal of phytomedicine, 9(3), p.237.
15-Jang, D.I., Lee, A.H., Shin, H.Y., Song, H.R., Park, J.H., Kang, T.B., Lee, S.R. and Yang, S.H., 2021. The role of tumor necrosis factor alpha (TNF-α) in autoimmune disease and current TNF-α inhibitors in therapeutics. International journal of molecular sciences, 22(5), p.2719.
16-Kihara, T., Toriuchi, K., Aoki, H., Kakita, H., Yamada, Y. and Aoyama, M., 2021. Interleukin-1β enhances cell adhesion in human endothelial cells via microRNA-1914–5p suppression. Biochemistry and Biophysics Reports, 27, p.101046.
17- Kim, K.H., Lee, H.J., Jeong, S.J., Lee, H.J., Lee, E.O., Kim, H.S., Zhang, Y., Ryu, S.Y., Lee, M.H., Lü, J. and Kim, S.H., 2011. Galbanic acid isolated from Ferula assafoetida exerts in vivo anti-tumor activity in association with anti-angiogenesis and anti-proliferation. Pharmaceutical research, 28, pp.597-609.
18-Kohno, S., Murata, T., Sugiura, A., Ito, C., Iranshahi, M., Hikita, K. and Kaneda, N., 2011. Methyl galbanate, a novel inhibitor of nitric oxide production in mouse macrophage RAW264. 7 cells. Journal of natural medicines, 65, pp.353-359.
19-Lauder, C.I., Garcea, G., Strickland, A. and Maddern, G.J., 2011. Use of a modified chitosan–dextran gel to prevent peritoneal adhesions in a rat model. Journal of Surgical Research, 171(2), pp.877-882.
20-Lerche, P., Aarnes, T.K., Covey-Crump, G. and Taboada, F.M., 2016. Handbook of small animal regional anesthesia and analgesia techniques. West Sussex, UK: Wiley Blackwell.
21-Najafian, A., Alavi, A., Amjadigolpayegani, K., Dadipour, S., Safarimoradabadi, A., Fallahi, S. and Faramarzi, A., 2013. Post surgical adhesion prevention: Vitamin C or Satureja Khuzestanica. Veterinary Clinical Pathology the Quarterly Scientific Journal, 7(1 (25) Spring), pp.1786-1792.
22-Rahimi, V.B., Shirazinia, R., Fereydouni, N., Zamani, P., Darroudi, S., Sahebkar, A.H. and Askari, V.R., 2017. Comparison of honey and dextrose solution on post-operative peritoneal adhesion in rat model. Biomedicine & Pharmacotherapy, 92, pp.849-855.
23-Roohbakhsh, Y., Rahimi, V.B., Silakhori, S., Rajabi, H., Rahmanian-Devin, P., Samzadeh-Kermani, A., Rakhshandeh, H., Hasanpour, M., Iranshahi, M., Mousavi, S.H. and Askari, V.R., 2020. Evaluation of the effects of peritoneal lavage with Rosmarinus officinalis extract against the prevention of postsurgical-induced peritoneal adhesion. Planta Medica, 86(06), pp.405-414.
24- Scotece, M. and Conde-Aranda, J., 2022. Inflammation in Health and Disease: New Insights and Therapeutic Avenues. International Journal of Molecular Sciences, 23(15), p.8392.
25-Shirani, K., Behravan, J., Mosaffa, F., Iranshahi, M., Mehmankhah, B., Razavi-Azarkhiavi, K. and Karimi, G., 2014. Evaluating the effects of galbanic acid on hydrogen peroxide-induced oxidative DNA damage in human lymphocytes. Avicenna Journal of Phytomedicine, 4(5), p.337.
26-Sirizi, M.A.G., Ghalenoei, J.A., Allahtavakoli, M., Forouzanfar, H. and Bagheri, S.M., 2023. Anticancer potential of Ferula assa-foetida and its constituents, a powerful plant for cancer therapy. World Journal of Biological Chemistry, 14(2), pp.28-39.
27-Wei, G., Wu, Y., Gao, Q., Shen, C., Chen, Z., Wang, K., Yu, J., Li, X. and Sun, X., 2018. Gallic acid attenuates postoperative intra-abdominal adhesion by inhibiting inflammatory reaction in a rat model. Medical science monitor: international medical journal of experimental and clinical research, 24, p.827.
28-Wong, K.K., Cheung, S.O., Huang, L., Niu, J., Tao, C., Ho, C.M., Che, C.M. and Tam, P.K., 2009. Further evidence of the anti‐inflammatory effects of silver nanoparticles. ChemMedChem: Chemistry enabling drug discovery, 4(7), pp.1129-1135.
29-Yang, Y.L., Lee, M.T.G., Lee, C.C., Su, P.I., Chi, C.Y., Liu, C.H., Wu, M.C., Yen, Z.S. and Chen, S.C., 2018. Pentoxifylline decreases post-operative intra-abdominal adhesion formation in an animal model. PeerJ, 6, p.e5434.
30-Yoon, H.J., Moon, M.E., Park, H.S., Im, S.Y. and Kim, Y.H., 2007. Chitosan oligosaccharide (COS) inhibits LPS-induced inflammatory effects in RAW 264.7 macrophage cells. Biochemical and biophysical research communications, 358(3), pp.954-959.
31-Zhang, Q., Qiao, H., Wu, D., Lu, H., Liu, L., Sang, X., Li, D. and Zhou, Y., 2019. Curcumin potentiates the galbanic acid-induced anti-tumor effect in non-small cell lung cancer cells through inhibiting Akt/mTOR signaling pathway. Life sciences, 239, p.117044.