The effect of drought stress on the efficiency of rhizobial bacteria (Rhizobium leguminosarum) symbiotic with faba bean (Phaseoulus vulgaris) Barkat variety
Subject Areas : Tension
1 - Soil Biology and Biotechnology (Ph.D.), Department of Soil and Water Research, Golestan Research Center of Agriculture and Natural Resources Gorgan, Iran,
Keywords: Bean, Rhizobium leminosarum, Nitrogen fixation efficiency, Drought stress,
Abstract :
In order to investigate the effect of drought stress on some growth parameters and nodulation index, the symbiotic efficiency of rhizobial isolates an experiment in controlled greenhouse conditions in the form of a completely randomized design with 21 rhizobial isolates, a negative control treatment (without rhizobial bacteria) and a control treatment Positive (no bacteria with nitrogen fertilizer at the rate of 70 mg/kg from urea source) and 3 repetitions were done in 2013. Different levels of drought stress including drought in two levels S0 (100% of field capacity (control or no drought stress)), S3 (55% of field capacity (severe stress)), which by adding different concentrations of zero and 310 grams per liter of polyethylene glycol 6000 (PEG) was applied to the nutrient solution after one week of seedling germination. The results of statistical analyzes showed that drought stress had a significant reduction effect on shoot dry weight, shoot water content, nitrogen content, symbiotic efficiency of rhizobial isolates and nodulation index.
Abdi, H., Bihamta, M., Azizof. E., and Chogan, R. (2013). Investigating the levels of drought stress caused by polyethylene glycol (PEG 6000) on the components of seed rejuvenation and its relationship with drought tolerance indices in promising varieties and lines of bread wheat (Triticum aestivum L.) Iranian Agricultural Research, 14(4): 582-596.
Alam, T., and Najam, L. (2022). Faba-Bean Antioxidant and Bioactive Composition: Biochemistry and Functionality. In Faba Bean: Chemistry, Properties and Functionality, (pp. 123-162). Springer, Cham.
Alikhani, H. A., Mohammadi, L. (2009). Investigating the salinity and drought tolerance of lentil symbiotic rhizobial isolates in rainfed conditions. Plant production technology, 10(1): 59-68.
Alizadegan, A., Hosseini Sarqin, S., and Jameei, R. (2014). investigating the effect of drought stress on antioxidant compounds in fava bean plant (Vicia faba), the second scientific research conference of biology and horticultural sciences of Iran, Tehran.
Ammar, M. H, F., Anwar, E. H., El-Harty, H. M., Migdadi, S. M., Abdel-Khalik, S. A., Al-Faifi, M., and Farooq and Alghamdi S. S. (2014). Physiological and yield responses of faba bean (Vicia faba L.) drought in a Mediterranean-type Environment. J Agro Crop Sci, 201: 280–287.
Beauchamp, C. J., Kloepper, J. W., Shaw, J. J. and Chalifour, F. P. (2001). “Root colonization of faba bean (Vicia faba L.) and pea (Pisum sativum L.) by Rhizobium leguminosarum bv. viciae in the presence of nitrate-nitrogen,” Canadian Journal of Microbiology, 47(12): 1068–1074. doi: 10.1139/cjm-47-12-1068.
Benmoussa, S., Nouairi, I., Rajhi, I., Rezgui, S., Manai, K., Taamali, W., Abbes, Z., Zribi, K., Brouquisse, R. and Mhadhbi, H. (2022). Growth Performance and Nitrogen Fixing Efficiency of Faba Bean (Vicia faba L.) Genotypes in Symbiosis with Rhizobia under Combined Salinity and Hypoxia Stresses. Agronomy, 12(3): p.606.
Bhattacharyya, P. N., and Jha, D. K. (2012). Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR): Emergence in Agriculture. World J Microbiol Biotechnol, 28(4): 1327-50.
Borucki, W., and Sujkowska, M. (2008). The effects of sodium chloride-salinity upon growth, nodulation, and root nodule structure of pea (Pisum sativum L.) plants. Acta Physiologiae Plantarum, 30(3): 293-301.
Burlyn, E., Michela and Merrill R. and Kaufmann (1973). The osmotic potential of polyethylene glycol 6000. Journal of Plant Physiology, 51: 914-916.
Chammakhi, C., Boscari, A., Pacoud, M., Aubert, G., Mhadhbi, H., and Brouquisse, R. (2022). Nitric Oxide Metabolic Pathway in Drought-Stressed Nodules of Faba Bean (Vicia faba L.). International Journal of Molecular Sciences, 23(21): p.13057.
Creus, C. M., Sueldo, R. J., and Barassi, C. A. (2004). Water relations and yield in Azospirillum-inoculated wheat exposed to drought in field.Can. Journal of Botany. 82: 273–281.
Creus, C. M., Sueldo, R. J., and Barassi, C. A. (1998). Water relations in Azospirillum -inoculated wheat seedlings under osmotic stress. Canadian Journal of Botany. 76: 238–244.
Elbagory, M., El-Nahrawy, S., and Omara, A. E. D. (2022). Synergistic Interaction between Symbiotic N2 Fixing Bacteria and Bacillus strains to Improve Growth, Physiological Parameters, Antioxidant Enzymes and Ni Accumulation in Faba Bean Plants (Vicia faba) under Nickel Stress. Plants, 11(14): p.1812.
Farnia, A., Noormohammadi, Q., and Naderi, A. (2007). Effect of drought stress on nodulation and nitrogen fixation of different races of Rhizobium japonicum in soybean. A new find in agriculture. second year, 2: 132-149.
Fesenko, A. N., Provorov, N. A., Orlova, I. F., Orlov, V. P., and Simarov, B.V. (1995). Selection of Rhizobium leguminosarum bv. viceae strains for inoculation of Pisum sativum L. cultivars: analysis of symbiotic efficiency and nodulation competitiveness. Plant Soil, 172: 189–198.
Gontia-Mishra, I, Sapre, S., Sharma, A., and Tiwari, S. (2015). Effect of plant growth-promoting Bacillus sp. on growth, antioxidant enzymes and DNA content of tomato seedlings under salt stress. Springerplus, 4:130
Guo, R., Silsbury, H., and Graham, R. D. (1992). Effect of four nitrogen compounds on nodulation and nitrogen fixation in faba bean, white lupine and medic plants. Australian Journal of plant physiology, 19: 501-508.
Hafeez, F. Y., Safdar, M. E., Chaudhury, A. U., and Malik, K. A. (2004). Rhizobial inoculation improves seedling emergence, nutrient uptake and growth of cotton. Australian Journal of Experimental Agriculture, 44: 617-622.
Hansen, A. P., and Choudhary, D. K. (2017). Rhizobium Biology and Biotechnology. doi: 10.1007/978-3-319-64982-5.
Joseph, B., Patra, R. R., and Lawrence, R. (2007). “Characterization of plant growth promoting rhizobacteria associated with chickpea (Cicer arietinum L.),” International Journal of Plant Production, 1(2): 141–151 ST–Characterization of plant growth pro.
Khosravi, H. (2014). Investigating some physiological characteristics of Rhizobium leguminosarum bv.viciae native to Iran. Journal of Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology), 28(4): 513-523.
Laguerre, G., Louvrier, P., Allard, M. R., and Amarger, N. (2003). Compatibility of rhizobial genotypes within natural populations of Rhizobium leguminosarum biovar viciae for nodulation of host legumes. Applied and Environmental Microbiology, 69: 2276–2283.
Lalande, R., Blowaneza, P. C., Antoun, H. (1990). Symbiotic effectiveness of strains of Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli from soils of Rawanda.Plant and Soil, 121: 41-46.
Lerki, S., and Akhgar, A. R. (2014). Effect of Sinorhizobium bacteria on growth, nodulation and nitrogen fixation in fenugreek plant. Journal of Soil Biology, 2(2): 137-148.
Nadeem, S. M., Ahmad, M., Zahir, Z. A., Javaid, A., and Ashraf, M. (2014). The role of mycorrhizae and plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) in improving crop productivity under stressful environments. Biotechnol Adv, 32(2): 429-48
Pii, Y., Mimmo, T., Tomasi, N., Terzano, R., Cesco, S., and Crecchio, C. (2015). Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils, 51(4): 403-415.
Prevost, D., and Antoun, H. (2008). Root nodule bacteria and symbiotic nitrogen fixation. In: Carter MR, Gregorich EG (eds), Soil sampling and methods of analysis (2nd edn). Boca Raton: CRC Press, 379–397.
Ramos, M. L. G., Gordon, A. G., Minchin, F. R., Sprent, J. I. and Parsons, R. (1999). Effects of water stress on nodule physiology and biochemistry of a drought tolerant cultivar of common bean (phaseolus vulgaris L.). Annals of Botany, 83(1): 57-63.
Ritchie, S. W., Nguyen, H. T., and Holaday, A. S. (1990). Leaf water content and gas exchange parameters of two wheat genotypes differing in drought resistance. Crop Sci, 30: 105-111.
Saghafi, D., Alikhani, H. A., and Motsharazadeh. (2013). Investigating plant growth stimulating properties of some rhizobial bacteria isolated from Iranian soils. Journal of Soil Management and Sustainable Production, 4(2): 131-150.
Serraj, R., Sinclair, T. R., Purcell, L. E. (1999). Symbiotic N2 fixation response to drought. Journal of Experimental Botany, 50:143-155.
Somasegaran, P., and Hoben, H. (1994). Handbook for rhizobia: methods in legume-Rhizobium technology. Springer Science & Business Media
Suarez, R.; Wong, A., Ramirez, M., Barraza, A., Orozco, M., Cevallos, M., Lara, M., Hernandez, G., and Iturriaga, G. (2008). Improvement of drought tolerance and grain yield in common bean by overexpressing trehalose-6- phosphate synthase in rhizobia. Molecular plant microb interactions. Published by APS PRESS in cooperation with the International Society for Molecular Plant-Microbe Interactions, 21(7): 958-966.
Tahir, M., Mirza, M. S., Zaheer, A., Dimitrov, M. R., Smidt, H., and Hameed, S. et al. (2017). Synergistic Effects of Biochar and Plant Growth-Promoting Rhizobacteria on the Growth and Physiology of Oryza sativa L. Front Plant Sci, 8:162.
Vacheron, J., Desbrosses, G., Bouffaud, M. L., Touraine, B., Moënne-Loccoz, Y., and Muller, D. et al. (2013). Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning. Front Plant Sci. 2013;4:356
Weir, B. (2006). Systematics, Specificity, and Ecology of New Zealand Rhizobia (Doctoral dissertation, The University of Auckland New Zealand).
The effect of drought stress on the efficiency of rhizobial bacteria (Rhizobium leguminosarum) symbiotic with faba bean (Phaseoulus vulgaris) Barkat variety
Mohammad Hossein Arzanesh1*
1 Soil Biology and Biotechnology (Ph.D.), Department of Soil and Water Research, Golestan Research Center of Agriculture and Natural Resources Gorgan, Iran, Email: mharzanesh@gmail.com
Article type: | Abstract | |
Research article
Article history Received: 18.03.2023 Revised: 14.06.2023 Accepted: 18.06.2023 Published:22.12.2023
Keywords Bean Rhizobium leminosarum Nitrogen fixation efficiency Drought stress | In order to investigate the effect of drought stress on some growth parameters and nodulation index, the symbiotic efficiency of rhizobial isolates an experiment in controlled greenhouse conditions in the form of a completely randomized design with 21 rhizobial isolates, a negative control treatment (without rhizobial bacteria) and a control treatment Positive (no bacteria with nitrogen fertilizer at the rate of 70 mg/kg from urea source) and 3 repetitions were done in 2013. Different levels of drought stress including drought in two levels S0 (100% of field capacity (control or no drought stress)), S3 (55% of field capacity (severe stress)), which by adding different concentrations of zero and 310 grams per liter of polyethylene glycol 6000 (PEG) was applied to the nutrient solution after one week of seedling germination. The results of statistical analyzes showed that drought stress had a significant reduction effect on shoot dry weight, shoot water content, nitrogen content, symbiotic efficiency of rhizobial isolates and nodulation index.
| |
Cite this article as: Arzanesh, M.H. (2023). The effect of drought stress on the efficiency of rhizobial bacteria (Rhizobium leguminosarum) symbiotic with faba bean (Phaseoulus vulgaris) Barkat variety. Journal of Plant Environmental Physiology, 18(4): 77-96.
| ||
| ©The author(s) Publisher: Islamic Azad University, Gorgan branch Doi: https://doi.org/10.71890/iper.2023.1105563 | |
اثرتنش خشکی روی کارایی باکتریهای ریزوبیومی (Rhizobium leguminosarum)
همزیست باقلا (Phaseoulus vulgaris) رقم برکت
محمدحسین ارزانش1*
1 بخش تحقیقات خاک وآب، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی استان گلستان، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، گرگان، ایران، رايانامه: mharzanesh@gmail.com
نوع مقاله: مقاله پژوهشی
تاریخ دریافت: 27/12/1401 تاریخ بازنگری: 24/03/1402 تاریخ پذیرش: 27/03/1402 تــاریخ چاپ:01/10/1402
واژههای کلیدی: باقلا ریزوبیوم لگمینوزارم کارآیی تثبیت نیتروژن تنش خشکی | چکيده | |||
به منظور بررسی اثر تنش خشکی روی برخی از پارامترهای رشدی و شاخص گرهزایی، کارایی همزیستی جدایههای ریزوبیومی آزمایشی در شرایط کنترل شده گلخانه در قالب طرح کامل تصادفی با 21 جدایه ریزوبیومی، یک تیمار شاهد منفی (بدون باکتری ریزوبیومی) و یک تیمار شاهد مثبت (بدون باکتری همراه با کود نیتروژنی به میزان 70 میلیگرم بر کیلوگرم از منبع اوره) و 3 تکرار در سال 1393 انجام شد. سطوح مختلف تنش خشکی شامل خشکی در دو سطح S0 (100 % ظرفیت مزرعهای (شاهد یا بدون تنش))، S3 (55% ظرفیت مزرعهای (تنش شدید)) که با افزودن غلظتهای مختلف صفر و 310 گرم در لیتر پلی اتیلن گلیکول 6000 (PEG) به محلول غذایی بعد از یک هفته از سبز شدن گیاهچهها اعمال شد. نتایج تجزیههای آماری نشان داد که تنش خشکی اثرکاهشی معنیداری روی وزن خشک اندام هوایی، محتوای آب اندام هوایی، مقدار نیتروژن، کارایی همزیستی جدایههای ریزوبیومی و شاخص گرهزایی داشت. گیاهان در شرایط تنش خشکی توانایی تشکیل گرههای جدید را از دست میدهند. گرهها نقش مهمی در رشد و توسعه گیاهان دارند و کاهش شاخص گرهزایی نشانگر کاهش توانایی گیاه در تولید گرههای جدید و رشد فعال است. بهطور کلی، نتایج نشان میدهد که تنش خشکی تأثیر منفی و قابل توجهی بر رشد و توسعه گیاهان، آبرسانی، تغذیه، همزیستی با باکتریهای ریزوبیومی و تشکیل گرههای جدید دارد. این نتایج میتوانند در درک بهتر اثرات تنش خشکی بر عملکرد گیاهان و ارائه راهکارهای مناسب برای مدیریت آب در کشاورزی مفید باشند.
| ||||
استناد: ارزانش، محمدحسین. (1402). اثرتنش خشکی روی کارایی باکتریهای ریزوبیومی (Rhizobium leguminosarum) همزیست باقلا (Phaseoulus vulgaris) رقم برکت. فیزیولوژی محیطی گیاهی، ۱۸ (۴)، 9۶-77.
| ||||
| ناشر: دانشگاه آزاد اسلامی، واحد گرگان © نویسندگان. | Doi: https://doi.org/10.71890/iper.2023.1105563 | ||
مقدمه
گياه باقلا نيز در همزيستي با گونه خاصي از ريزوبيوم R. leguminosarum bv Viciae (2002; Weir, 2006) ميتواند 78 - 39 درصد از نياز نيتروژني (192 –10 کيلوگرم نيتروژن در هکتار) خود را از اين طريق تامين نمايد (Alam and Najam, 2022). باقلا علاوه بر تامین مقدار زیادی از نیاز نیتروژنی خود باعث حاصلخیزی خاک میشود 0(Beauchamp et al., 2001). همچنین باقلا به علت داشتن دوره نمو طولانی و دارا بودن شاخ و برگ زیاد احتیاج زیادی به آب دارد. زیرا در موقع خشکی خاک رشد ریشههای فرعی کم شده و گیاه خیلی زود پژمرده میشود و بنابراین رطوبت کافی زمین از شرایط اولیه کشت موفقیت آمیز این گیاه است. استان گلستان یکی از استانهای مهم در زمینه کشت و تولید باقلا در سطح کشور است و اغلب باقلای کشت شده در استان به صورت دیم است، کمبود بارندگی و پراکنش نامناسب آن در برخی از سالها باعث میشود که گیاهان کشت شده تحت تنش خشکی قرار گرفته و عملکرد آنها کاهش یابد. یکی از مهمترین دلایل کاهش عملکرد اثر تنش خشکی روی سیستم همزیستی است (Zahran, 1999;Benmoussa et al., 2022). در واقع در اغلب موارد به دلیل تنشهای محیطی مانند خشکی، شوری و غرقاب فرایند تثبیت نیتروژن کارایی خوبی ندارد.
برخی تحقیقات نشان داده است که باکتریهای ریزوبیوم قادر به فعالسازی عناصر غذایی در خاک و تحریک جذب آنها توسط گیاهان میباشند. این اثر میتواند منجر به بهبود تغذیه گیاه و افزایش عملکرد آنها شود (Gontia-Mishra et al., 2015). برخی از باکتریهای ریزوبیوم قادر به تثبیت نیتروژن جو در ریزوسفر گیاهان میباشند. این فرایند به گیاهان اجازه میدهد تا از نیتروژن موجود در هوا استفاده کنند و این عنصر مورد نیاز را برای رشد و توسعه خود به دست آورند (Tahir et al., 2017). برخی از باکتریهای ریزوبیوم قادر به تولید هورمونهای گیاهی مانند اکسینها و سیتوکینینها هستند. این هورمونها میتوانند فرایندهای رشد و توسعه گیاهان را تنظیم کنند و بهبود عملکرد آنها را ایجاد کنند (Nadeem et al., 2014). ریزوبیوم میتواند به گیاهان در مقابل تنشهای محیطی مختلف مانند تنش خشکی، شوری و بیماریها کمک کند. این باکتریها میتوانند بهبود وضعیت آبی گیاهان را تسهیل کنند و به آنها کمک کنند تا با شرایط تنش مقابله کنند (Bhattacharyya and Jha, 2012).
بهطورمثال سطوح مختلف تنش خشکی (50، 100و 150 میلیمتر تبخیر از تشتک کلاس A)، شوری خاک (25 تا 75 میلیمول)، و نیترات خاک (5 تا 10 میلی مول نیتروژن) باعث کاهش تعداد گرهها و تثبیت نیتروژن توسط ریزوبیومها روی گیاهانی مانند نخود و باقلا گردید (Borucki & Sujkowska, 2008 Guo et al., 1992 ;Ammar et al., 2014) همچنین تنش خشکی باعث 26 درصد کاهش احیای استیلن گردید. راموس (1999) گزارش کرد که با کاهش آب خاک تعداد و وزن گرهها، فعالیت آنزیم نیتروژناز ، پتانسیل آب برگ، مقدار پروتئین ، نشاسته و مقدار لگ هموگلوبین و فعالیت سایر آنزیمهای مهم در ساخت کربن در گیاه لوبیا کاهش یافت. اما، وزن خشک گیاه تغییر نکرد. همچنینAlikhani و Mohammadi (2010) نشان دادند که کارایی جدایهها ریزوبیومی همزیست و نیز عملکرد گیاه عدس تحت تاثیر تنش شوری و خشکی کاهش می یابد.
تلقیح گیاهان به ویژه گیاهان خانواده حبوبات با جدایههای ریزوبیوم مقاوم به تنش خشکی می تواند راهحل مناسبی برای کاهش اثرات تنش خشکی روی گیاهان باشند (et al., 2004 Hafeez). در اکثر مطالعات انجام شده غربالگری جدایههای ریزوبیومی برای مقایسه کارایی به ویژه آزمون گرهزایی در شرایط غیر تنشی بررسی میشود. هدف این مطالعه بررسی راهکاری کارامد جهت غربالگری بهتر جدایه و بررسی اثرات تنش خشکی روی شاخصهای کارایی جدایههای ریزوبیومی مانند توان گرهزایی و تثبیت نیتروژن روی یکی از ارقامهای معروف باقلا یعنی رقم برکت می باشد. برای این منظور ابتدا جدایههای ریزوبیومی از گرهها جداسازی ، خالص سازی و شناسایی مقدماتی شده و در ادامه توان گرهزایی و کارایی همزیستی آنها در شرایط تنشی با شرایط غیر تنشی مقایسه شده و از بین آنها جدایههایی که دارای شاخصهای بالاتری هستند انتخاب شدند.
مواد و روشها
نمونهبرداری گره از باقلا: در سال 1393 تعداد 58 نمونه گره از ریشه باقلا از سه استان گلستان، مازندران. خراسان رضوی در مرحله اواسط گلدهی (اسفند تا اوایل فروردین) از گیاهان شاداب برداشته شد. نمونهها بعد از برداشت و ثبت مختصات جغرافیایی (جدول 1) محل برداشت آنها در ظرفهای مخصوص قرار دادهشده و بلافاصله به آزمایشگاه بیولوژی خاک بخش تحقیقات خاک و آب مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی گلستان منتقل شدند.
جدول 1: محلهای جمعآوری گرههای باقلا
شماره نمونه | استان | آدرس محلهای نمونه بردای | مختصات جغرافيايی | |
|---|---|---|---|---|
1 | گلستان | امیر آباد- جنب زمین زندان – روبروی تابلوی ایستگاه گرگان – نام زارع احمد بزی | N3653334 | E5425130 |
2 | ایستگاه عراقی محله – نوار مرکزی – روبروی سوله ایستگاه | N3653203 | E5434518 | |
3 | سرخنکلاته- روستای کوماسی | N3652473 | E5426434 | |
4 | سرخنکلاته – نرسیده به روستای الوکلاته | N3653054 | E5428546 | |
5 | سرخنکلاته – سلطان آباد | N3653148 | E5430229 | |
6 | سرخنکلاته – نرسیده به روستای معصوم آباد | N3653186 | E5432216 | |
7 | جاده سرخنکلاته به جاده اصلی گرگان | N3652222 | E5434252 | |
8 | جاده گرگان به علی آباد- سر خط مرزن کلاته | N3651464 | E5435296 | |
9 | والش آباد- چاه حاج خلیل – نام زارع امید الوستانی | N3650599 | E5437044 | |
10 | والش آباد- اول روستا | N3652023 | E5437318 | |
11 | گرگان- نوده ملک، بعد از روستا | N3653261 | E5438523 | |
12 | گرگان- بعد نوده ملک به سمت عطا آباد -حسین آباد نوده ملک | N3655157 | E5438159 | |
13 | آق قلا- جنوب عطاآبادح کنار آنبار تپه | N3657265 | E5437337 | |
14 | آق قلا- روستای پیر واش | N3657514 | E5439514 | |
15 | علی آباد- غرب مزرعه کتول | N3657173 | E5451027 | |
16 | علی آباد- جنوب امیر آباد فندرسک | N3658469 | E5455103 | |
17 | علی آباد -جعفر آباد نامتلو (کیلوکتر 25 آزاد شهر) | N3658441 | E5458093 | |
18 | علی آباد- شهرک دارکلاته- علی آباد کتول | N3657548 | E5457128 | |
19 | گرگان- بین نوده ملک و قرق - شرق روستای جهان تیغ | N3652559 | E5440233 | |
20 | گرگان- روستای مرزنکلاته | N3652060 | E5436356 | |
21 | گرگان - جادههاشم آباد | N3651089 | E5421431 | |
22 | گرگان- بعد از جاده ورسن | N3650078 | E5419196 | |
23 | کردکوی- روستای چهارده | N3648403 | E5409504 | |
24 | کردکوی- غرب کردکوی | N3647094 | E5403469 | |
25 | بندرگز- ابتدای جاده روستای کوه صحرا | N3645330 | E5358370 | |
26 | بندرگز- روستای سوته ده – جاده قدیم کردکوی | N3644418 | E5401427 | |
27 | کردکوی- جاده قدیم- روستای سرکلاته خراب شهر – اول امام زاده قاسم | N3645224 | E5403068 | |
28 | کردکوی- سالیکنده | N3646508 | E5404458 | |
29 | کردکوی- جاده قدیم - روستای زارع محله | N3647034 | E5412068 | |
30 | گرگان- جاده قدیم کردکوی- روستای کفش گیری | N3648416 | E5416528 | |
1 | مازندران | ساری - گیلرد | N4052424 | E677596 |
2 | ساری به بابلسر- پنبه زار کتی | N4061816 | E684501 | |
3 | جویبار - گیلخواران | N4064024 | E672009 | |
4 | جویبار – کوهی خیل | N4062107 | E668656 | |
5 | بابلسر – نفت چال | N4063330 | E662594 | |
6 | بابلسر- عرب خیل | N40662391 | E656661 | |
7 | ساری – زردی جان | N4048008 | E677933 | |
8 | ساری- مشهدی کلا( کشتارگاه سابق) | N4077428 | E680191 | |
9 | ساری- شیخ کلا | N4047756 | E679266 | |
10 | ساری- المشیر | N4044336 | E674723 | |
11 | جاده ساری قائمشهر- پشت شرکت تخته فشرده | N4043472 | E673785 | |
12 | ساری | N4043964 | E671980 | |
13 | ساری - قائمشهر | N4041392 | E673321 | |
14 | بابل- استردی کلا - روبروی ترانس برق | N4042528 | E655021 | |
15 | ساری – شرف دار کلا | N4046005 | E678282 | |
16 | ساری – روستای اسپندان پایین | N4068611 | E688782 | |
17 | ساری – روستای اسپندان بالا | N4066858 | E689129 | |
18 | جویبار- بیکار آیش | N406404 | E666408 | |
19 | ساری- کشتارگاه جدید | N4049420 | E675717 | |
20 | جاده قائمشهر – پایین لموک | N4042044 | E673998 | |
21 | قائمشهر- روستای کاسگر | N4042069 | E670381 | |
1 | خراسان رضوی | نیشابور | N668376 | E4005877 |
2 | نیشابور | N668979 | E4005835 | |
3 | نیشابور | N667270 | E4004990 | |
4 | نیشابور | N669446 | E4006929 | |
5 | نیشابور | N669137 | E4006642 | |
6 | نیشابور | N668071 | E4006397 | |
7 | نیشابور | N668735 | E4004270 | |
جداسازی، خالص سازی و شناسایی مقدماتی: جداسازی باکتریهای ریزوبیومی از گره به روش Pii و همکاران (1994) انجام شد. آزمونهای شناسایی مانند آزمون گرم، کاتالاز، اکسیداز و آزمونهای مختلف قندی طبق روش ارائه شده در کتاب طبقه بندی سیستماتیک باکتری شناسی برجی
(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology) نسخه 2004 جلد دوم برای شناسایی باکتری تا حد جنس و گونه انجام شد. برای سهولت مطالعه جدایهها بر اساس تجزیه خوشه ای به روش بیشترین شباهت با استفاده از نرم افزار Minitab نسخه 16 گروه بندی شدند.
آزمون گرهزایی جدایههای ریزوبیومی(PIT1): برای تعیین توان گرهزایی جدایههای ریزوبیومی روی ریشههای باقلا طبق روش سوماسگران و هوبن (1994 ) با اندکی تغییرات انجام شد. برای این کار بذرهای باقلا رقم برکت از بخش اصلاح بذر و تهیه نهال مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی گلستان تهیه و پس از چند بار شستشو با آب شهر به مدت 30 ثانیه در الکل 96 درجه و 5 دقیقه در محلول هیپوکلریت 5/2 درصد غوطهور شدند. بعد از طی این مدت بذرها 5 بار با استفاده از آب مقطر استریل شستشو و روی تشتکهای پتری شیشه ای با قطر 10 سانتیمتری حاوی آب-آگار (نسبت 10 به 1) و داخل انکوباتور در دمای 20 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. برای کاشت از جارهای پلاستیکی (ظرف نوشابه 5/1 لیتری به ارتفاع 25 سانتیمتر و قطر دهانه 9 سانتیمتر) استفاده شد. این جارها با محلول 5/2 درصد هیپوکلریت سدیم ضدعفونی شدند. این جارهای پلاستیکی با مخلوط اتوکلاو شده از ماسه دو بار شسته شده و پرلیت (1 تا 2 میلیمتری) به نسبت 2 به 1 با ماسه پر شدند. در هر جار 5 عدد بذر جوانه زده در عمق 2 سانتیمتری کاشته شد. پس از کشت هر بذر با یک میلیلیتر از سوسپانسیون باکتری با جمعیت 108×2 ریزوبیوم در هر میلیلیتر تلقیح شدند. سپس روی آن با 5/1 سانتیمتر از مخلوط ماسه و پرلیت استریل پوشانده شد. جارها به اتاق رشد بخش تحقیقات خاک و آب و در دمای 5±23 درجه سلسیوس و تناوب نوری 14 ساعت روشنایی با لامپهای فلورسنت انتقال یافتند. کلیه جارها به مدت 5 روز با آب مقطر آبیاری شدند. پس از گذشت 5 روز گیاهچههای باقلا سر از بستر کشت بیرون آوردند. به منظور جلوگیری از آلودگی روی بستر و بین جوانههای باقلا با ماسه سفید شسته و استریل شده به ضخامت 5 میلی متر پوشانده شد. با ظهور برگ اصلی در بیش از 50 درصد جارهاها آبیاری گیاهان با محلول غذایی فاقد نیتروژن (Hansen and Choudhary, 2017) بهمدت 8 هفته محلول غذایی (هر دو هفته) داده شدند. در پایان 8 هفته اندام هوایی از بالای طوقه گیاه جدا و بعد از شستن ریشهها وجود و عدم وجود گرهها ، اندازه و رنگ درون گره برای تعیین شاحص گرهزایی (Prevost and Antoun, 2008) ثبت گردید. در نهایت تعداد 21 جدایه که از لحاظ مورفولوژی کلنی روی پلیت YMAمشابه ریزوبیوم و توانایی ایجاد گره روی باقلا را داشتند برای ادامه کار انتخاب شدند.
اثر تنش خشکی روی شاخص گره زایی، کارایی همزیستی جدایههای ریزوبیومی، وزن خشک اندام هوایی، محتوای آب اندام هوایی، مقدار نیتروژن اندام هوایی باقلا رقم برکت
برای بررسی اثر تنش خشکی روی برخی از پارامترهای رشدی و شاخص گره زایی، کارایی همزیستی جدایههای ریزوبیومی وزن خشک اندام هوایی، محتوای آب اندام هوایی، مقدار نیتروژن ، کارایی همزیستی جدایههای ریزوبیومی و شاخص گره زایی آزمایشی در قالب طرح بلوک کامل تصادفی به صورت فاکتوریل شامل، فاکتوراول کود ((مایه تلقیح باکتریایی با 21 جدایه ریزوبیومی و یک تیمار شاهد منفی (بدون باکتری ریزوبیومی) و یک تیمار شاهد مثبت (بدون باکتری همراه با کود نیتروژنی به میزان 70 میلیگرم بر کیلوگرم از منبع اوره)) و فاکتور دوم دو سطح تنش خشکی (بدون تنش و تنش شدید) در 3 تکرار در شرایط گلخانه ای در مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی گلستان در سال 1394 انجام شد. وزن خشک اندام هوایی، محتوای آب اندام هوایی، مقدار نیتروژن، کارایی همزیستی جدایههای ریزوبیومی و شاخص گره زایی برای مقایسه بین جدایهها اندازهگیری شدند.
شاخص گره زایی (NI) به روش پروست (2006) استفاده شد. برای این کار در پایان 8 هفته اندام هوایی از بالای طوقه گیاه جدا و بعد از شستن ریشهها وجود و عدم وجود گرهها ، اندازه و رنگ درون گره برای تعیین شاحص گره زایی استفاده شدند (Prevost and Antoun, 2008).
A×B×C≤18
A= Nodule size: small 1 medium 2 large 3
B= Nodule color: white 1 pink 2
C=Nodule number: few 1 several 2 many 3
برای بررسی کارایی تبیثت نیتروژن (SE) جدایهها از روش Somasegaran و Hoben (1994) استفاده شد. به منظور تهیه مایه تلقیح از محیط کشت YMB به مقدار کافی و با توجه به تعداد نمونهها تهیه و درون ارلنها توزیع و اتوکلاو شدند. تمام جدایههای ریزوبیومی خالص سازی شده به این ارلنهای استریل تلقیح و به مدت 72 ساعت روی شیکر دورانی با دوران 120 دور در دقیقه و دمای 28 درجه سلسیوس قرار داده شدند. تعداد پنج بذر جوانهزده در ظروف پلاستیکی (جار لئونارد) در عمق 2 سانتیمتری کاشته شد. هر بذر با یک میلی لیتر از سوسپانسیون باکتری با جمعیت 108×2/1 سلول در هر میلی لیتر تلقیح شد (Somasegaran and Hoben, 1994). روی جارها با درب پلیتهای استریل با قطر 10 سانتی متر برای جلوگیری از آلودگی پوشانده شد. بعد از یک هفته از سبز شدن گیاهچههای باقلا تعداد آنها به سه عدد کاهش یافت همزمان با تنک کرده گیاهچهها محلول زیرین جارهای پلاستیکی (200 میلی لیتر) محلول غذایی فاقد نیتروژن برای لگمهای دانه درشت (Pii et al., 2015) استفاده شد. تنش خشکی شدید (55 % ظرفیت مزرعهای) با استفاده از غلظت 310 گرم در لیتر پلی اتیلن گلیکول 6000 اعمال شد (Alizadegan et al., 2015; Abdi et al., 2014). سـطوح مختلـف خشـکی بـا پلـی اتـیلن گلیکـول (6000) اعمال گردید. غلظـت پلـی اتـیلن گلیکـول کـه بـراي تهیـه پتانسیل آب لازم بود از طریق رابطه زیر بدست آمد.
QS= (1018×10-2) C-(1018×10-4) C2 + (2067×10-4) CT+ (8039×10-7) C2T
QS: پتانسیل اسمزي بر حسب بار
C: غلظت پلی اتیلن گلیکول بر حسب گرم در لیتر
T: درجه حرارت بر حسب درجه سانتیگراد
برای این منظور محلولهای غذایی هر دو هفته با محلولهای غذایی جدید پر شدند. این جارهای حاوی گیاهچه در شرایط گلخانه ای مشابه با شرایط قبل (آزمون گره زایی) تا مرحله اولیه گلدهی (8 هفته) نگهداری شدند. در طول دوره رشد ازمحلول غذایی عناصر کم مصرف و پر مصرف (بدون نیتروژن) استفاده شد. تیمار نتیروژنی به مقدار 70 میلیگرم در کیلوگرم به فرم اوره و به صورت تقسیط در 4 مرحله و هر مرحله به میزان 5/17 میلی گرم در کیلوگرم به ترتیب در 1، 3،5 و 7 هفتگی استفاده شد.در انتهای 8 هفته اندام هوایی از محل طوقه جداسازی و در داخل پاکتهای کاغذی به مدت سه روز در دمای 68 درجه سلسیوس قرار داده شدند. پس از گذشت این مدت وزن خشک اندام هوایی اندازه گیری و کارای همزیستی با استفاده از فرمول زیر تعیین گردید
SE= (Ti-Tc)/ (Tn-Tc) ×100
که در این معادله SE کارایی همزیستی جدایه ریزوبیومی در شرایط تنش خشکی، Ti وزن خشک اندام هوایی گیاه تلقیح شده با جدایه ی ریزوبیومی، Tc وزن خشک اندام هوایی در تیمار شاهد منفی (تلقیح نشده و کود داده نشده) و Tn وزن خشک اندام هوایی در تیمار شاهد مثبت (تلقیح نشده و کود داده شده) بودند. در ضمن به منظور مقایسه میزان نیتروژن در تیمارهای آزمایشی مقدار نیتروژن موجود در اندام هوایی به وسیله دستگاه کجدال اندازه گیری شد. در ارزیابی کارایی همزیستی اکر 50 SE< بود جدایه در طبقه با کارایی ضعیف، SE-50-75 در طبقه با کارایی متوسط و SE- 75-100 در طبقه با کارایی خوب و SE>100 در طبقه با کارایی خیلی خوب گروه بندی شدند (1994 Somasegaran and Hoben,). براي اندازه گيري محتواي نسبي آب (RWC) در ساعت 10 صبح از آخرين برگ توسعه يافته (برگ سوم انتهایی) به طور تصادفي نمونهبرداري انجام شد. برگهاي جدا شده از هر بوته بهطور جداگانه در كيسههاي پلاستيكي قرار داده شد و براي جلوگيري از تلفات آب، نمونهها روي تكههاي يخ به سرعت به آزمايشگاه منتقل و وزن تر آنها اندازهگيري شد. سپس برگها در آب مقطر به مدت 24 ساعت در دماي اتاق و نور كم براي محاسبه وزن اشباع غوطهور شدند و پس از اين مدت نمونهها بسرعت و با دقت با دستمال كاغذي خشك و وزن اشباع آنها اندازه گيري شد. در نهايت براي اندازهگيري وزن خشك، نمونهها را بهمدت24 ساعت در دماي 70 درجه سانتيگراد در آون قرار داده شد، و RWC طبق معادله زیر تعیین گردید(Ritchie et al., 1990 ؛et al., 2004 Creus).
RWC= (وزن خشک – وزن اشباع /وزن خشک – وزن تر) × 100
نتایج
جداسازی ریزوبیومها از گره، شناسایی و دسته بندی و آزمون گرهزایی: تعداد 21 جدایه ریزوبیومی که 10 جدایه از گرههای باقلا در استانهای خراسان رضوی (40/16 درصد)، 8 جدایه از گرههای گلستان (11/12 در صد )و 3 جدایه (92/4 در صد) از مازندران جداسازی شدند. از 21 جدایه ریزوبیومی همزیست با باقلا، تعداد 16 جدایه قادر به استفاده از ساکارز به عنوان منبع کربنی بودند و 5 جدایه نیز توانایی مصرف ساکارز را نداشتند. تعداد 15 جدایه توانایی رشد در pH برابر 9 و همه جدایهها توانایی رشد در محیط با pH برابر با 8 را داشتند. همه جدایهها گرم منفی، میلهای، هوازی متحرک و کلنیهای آنها اغلب دایرهای،محدب، برآمده ،لعابی نیمه مات، فاقد توان جذب کنگورد با قطر کلنی دو تا 4 میلیمتر پس از پنج روز بودند. شناسایی مقدماتی بر اساس کتاب برجی (1994) نشان داد که همه جدایههای ریزوبیومی منسوب به گونه ریزوبیوم لگمینوزاروم بودند. گروه بندی جدایههای ریزوبیومی وجود 10 گروه فرعی را بر اساس تفاوت در صفات بیوشیمیایی و فیزویولوژیک نشان داد( شکل1). در گروه اول بیشترین تعداد جدایهها یعنی 7 جدایه قرار داشت. در گروه دوم سه جدایه و در 4 گروه بعدی هر کدام 2 جدایه ریزوبیومی داشتند. در نهایت نیز سه گروه وجود داشت که تنها یک جدایه در آن قرار داشتند (شکل1).
[1] 1 PIT (plant-infection test)
شکل1: تجزیه خوشهای جدایههای ریزوبیوم لگومینوزاروم همزیست با باقلا
بررسی وضعیت گرهبندی (فراوانی، اندازه و رنگ داخل گرهها) جدایههای ریزوبیومی همزیست با باقلا نشان داد که بین جدایهها از این لحاظ تفاوت وجود داشت. در نتیجه شاخص گره زایی برای هر جدایه با جدایه دیگر تفاوت داشت. نتایج بررسی شاخص گره بندی جدایههای مختلف براساس نتایج آزمون آلودگی گیاه در جدول 1 آورده شده است.
از لحاظ دسته بندی بر اساس شاخص گره زایی این 21 جدایه به 5 دسته متفاوت تقسیم شدند (جدول 2) که از لحاظ تعداد بین دستهها تفاوت وجود داشت (جدول 2). جدایههای Rlu01،Rlu07 ، Rlu15وRlu20 دارای ضرایب گره زایی بالاتری از بقیه جدایهها بودند. جدایهها در شرایط بدون تنش دارای شاخص گره زایی از 4 تا 18 بودند.
همچنین از لحاظ کارایی تثبیت نیتروژن در شرایط بدون تنش خشکی این 21 جدایه به 4 دسته متفاوت تقسیم شدند که بین دستهها از لحاظ تعداد تفاوت وجود داشت (جدول3).
جدول 1: بررسی ضریب گره زایی در جدایههای ریزوبیومی همزیست با باقلا
جدایهها ریزوبیومی | محلهای جداسازی | تعداد گره | اندازه گرهها | رنگ داخل گره | شاخص گرهزایی (NI1) |
Rlu01 | گلستان | 3 | 3 | 2 | 18 |
Rlu02 | گلستان | 2 | 3 | 2 | 12 |
Rlu03 | گلستان | 1 | 2 | 2 | 4 |
Rlu04 | گلستان | 2 | 2 | 2 | 8 |
Rlu05 | گلستان | 1 | 2 | 2 | 4 |
Rlu06 | گلستان | 2 | 3 | 2 | 12 |
Rlu07 | گلستان | 3 | 3 | 2 | 18 |
Rlu08 | گلستان | 2 | 3 | 2 | 12 |
Rlu09 | خراسان رضوی | 2 | 2 | 2 | 8 |
Rlu10 | خراسان رضوی | 3 | 1 | 2 | 6 |
Rlu11 | خراسان رضوی | 2 | 1 | 2 | 4 |
Rlu12 | خراسان رضوی | 2 | 1 | 2 | 4 |
Rlu13 | خراسان رضوی | 2 | 3 | 2 | 12 |
Rlu14 | خراسان رضوی | 2 | 2 | 2 | 8 |
Rlu15 | خراسان رضوی | 3 | 3 | 2 | 18 |
Rlu16 | خراسان رضوی | 1 | 2 | 2 | 4 |
Rlu17 | خراسان رضوی | 2 | 2 | 2 | 8 |
Rlu18 | خراسان رضوی | 2 | 1 | 2 | 4 |
Rlu19 | مازندران | 1 | 2 | 2 | 4 |
Rlu20 | مازندران | 3 | 3 | 2 | 18 |
Rlu21 | مازندران | 1 | 2 | 2 | 4 |
جدول 2: دسته بندی جدایههای ریزوبیومی بر اساس شاخص گرهزایی
شاخص گره زایی | تعداد جدایهها | جدایههای ریزوبیومی |
4 | 8 | Rlu03 ، Rlu05 ، Rlu011 ، Rlu12، Rlu16 ، Rlu18، Rlu19 و Rlu21 |
6 | 1 | Rlu10 |
8 | 4 | Rlu04 ،Rlu09 ،Rlu14 ، Rlu17 |
12 | 4 | Rlu02 ،Rlu06 ، Rlu08 ، Rlu13 |
18 | 4 | Rlu01 ،Rlu07 ،Rlu15 ، Rlu20 |
جدول3: دستهبندی جدایههای ریزوبیومی براساس کارایی تثبیت نیتروژن در شرایط بدون تنش خشکی
شاخص گره زایی | تعداد جدایهها | جدایههای ریزوبیومی |
I | 1 | Rlu17 |
E | 13 | Rlu13، Rlu012، Rlu11، Rlu09، Rlu08 ،Rlu05، Rlu04 ،Rlu03، Rlu02 Rlu01 Rlu21 ، Rlu19 Rlu16 |
PE | 4 | Rlu06 ، Rlu10 ، Rlu14 ،Rlu18 ، Rlu07 |
VE | 3 | Rlu07 ، Rlu15 ، Rlu20 ، Rlu06 ، Rlu08 ، Rlu09 ، Rlu19 |
[1] 3Nodulartion Index (Prevost and Antoun,2006): A×B×C≤18 A(Nodule size: small 1 medium 2 large 3), B(Nodule color: white 1 pink 2) and C(nodule number : few 1 several 2 many 3)
اثر تنش خشکی روی شاخص گره زایی، کارایی همزیستی جدایههای ریزوبیومی، وزن خشک اندام هوایی، محتوای آب اندام هوایی، مقدار نیتروژن اندام هوایی باقلا رقم برکت: نتایج تجزیه واریانس ماده خشک کل، گرهبندي و صفات وابسته به آن، مقدار نیتروژن تثبیت شده در گره و عملکرد تثبیت نیتروژن، تحت تاثیر سطوح مختلف تنش خشکی و سطوح مختلف تلقیح با جدایههای ریزوبیوم لگومینوزاروم در جدول 4 نشان داده شده است. تاثیر تیمار خشکی و تیمار تلقیح جدایههای ریروبیومی واثر متقابل سطوح خشکی و جدایههای ریزوبیومی روی صفات اندازه گیری شده معنی دار بود (جدول 4).
جدول 4: نتایج تجزیه واریانس گره بندی و صفات وابسته به آن، مقدار نیتروژن، وزن خشک اندام هوایی و ریشه
شاخص گره زایی | محتوای نسبی آب | کارایی همزیستی | میزان نیتروژن اندام هوایی | وزن خشک اندام هوایی | درجه آزادی | منبع تغییرات |
**13/789 | **62/12530 | **93/33748 | **22/392898 | **15/121 | 1 | تنش خشکی |
**48/1763 | **77/485 | **20/77512 | **38/3111215 | **23/26 | 22 | تیمار تلقیح |
**87/692 | **55/206 | **97/6903 | **83/27826 | **63/7 | 22 | اثر متقابل |
01/24 | 67/92 | 61/6 | 83/5673 | 94/5 | 92 | خطا |
83/8 | 22/1 | 41/6 | 687/6 | 996/10 | - | ضریبتغییرات(%) |
** و ns بهترتیب معنیداری در سطح 1 درصد و عدم وجود اختلاف معنی دار
نتایج حاصل از این صفت کارایی همزیستی جدایههای ریزوبیومی نشان داد که در شرایط بدون تنش 3/14 درصد جدایه در گروه خیلی موثر، 62 درصد در گروه جدایههای موثر و 19 درصد در گره جدایههای نسبتاً موثر و 8/4 درصد در گروه جدایههای غیرموثر قرار داشتند (شکل6).
اثر تنش شدید خشکی روی وزن خشک اندام هوایی، مقدار نیتروژن و شاخص گره زایی در تیمارهای تلقیج شده با جدایههای ریزوبیومی تفاوت داشتند. نتایج حاصل از مقایسه میانگین دادهها نشان داد که مقدار نیتروژن گیاهچهها در تیمارهای تلقیح شده با جدایههای Rlu07 ،Rlu15 و Rlu20 تفاوت کمتری نسبت به تیمار شاهد مثبت (تیمار نیتروژنی) داشتند. یکی دیگر از اثرات تنش خشکی کاهش وزن خشک اندام هوایی یود. بیشترین وزن خشک اندام هوایی در شرایط تنش خشکی شدید مربوط به جدایه Rlu15 بود. همچنین مقدار نیتروژن، تعداد گره و مقدار تثبیت نیتروژن اندام هوایی در گیاهچههای تلقیح شده با این جدایه نسبت به شاهد بیشتر بود. در این آزمایش بیشترین میزان نیتروژن تثبیت شده مربوط به جدایههای ریزوبیومی Rlu07 ، Rlu15 و Rlu20 و کمترین مقدار مربوط به تیمار شاهد (C) بود (شکلهای 2 و 4). اعمال تنش خشکی باعث کاهش وزن خشک اندام هوایی، مقدار نیتروژن اندام هوایی، درصد نیتروژن تثبیت شده، درجه کارایی، درجه گره زایی و محتوای نسبی آب در برگ شد.
شکل 2: اثر تنش خشکی روی وزن خشک اندام هوایی باقلا رقم برکت
شکل 3 : اثر تنش خشکی روی مقدار نیتروژن اندام هوایی باقلا رقم برکت
یکی دیگر از اثرات تنش خشکی کاهش کارایی جدایهای ریزوبیومی بود. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که در صورت اعمال تنش خشکی شدید تعداد جدایههای با کارایی بالا و خوب کاهش یافته و غربالگری بهتر برای انتخاب جدایههای مقاوم و کارا صورت میگیرد. در کل کارایی جدایههای با توانایی موثر 46 درصد کاهش یافت. علاوه بر کارایی همزیستی جدایهها در اثر افزایش تنش خشکی گروه بندی جدایههای ریزوبیومی نیزتغییر کرد و جدایهها غیر موثر بیشتر شدند. به طوری که جدایههای با کارایی خیلی موثر به صفر درصد، گروه با کارایی موثر به 8/23 درصد، گروه با کارایی نسبتاً موثر به 3/33 درصد و گروه ریزوبیومی با کارایی غیر موثر به 9/43 درصد تغییر یافتند (شکل4). سه جدایه با کارایی بالا (Rlu07، Rlu15 و Rlu20) با اعمال تنش خشکی، یک درجه کاهش کارایی همزیستی در آنها مشاهده گردید. کلاس کارایی این سه جدایه از خیلی موثر به موثر کاهش یافت (شکل 4).
شکل4: اثر تنش خشکی روی کارایی همزیستی باقلا رقم برکت
شکل 5: اثر تنش خشکی روی محتوای نسبی آب اندام هوایی باقلا رقم برکت
بررسی محتوای نسبی آب در گیاهچههای تلقیح شده با جدایههای ریزوبیومی بیشتر از تیمار شاهد بود (شکل 5). یکی دیگر از اثرات تنش خشکی کاهش شاخص گره زایی در ریشههای تلقیح شده بود (شکل 6)، بهطوری که نیمی از جدایهها دارای شاخص گره زایی پایین تر از 4 شدند.
شکل6 : اثر تنش خشکی روی شاخص گره زایی باقلا رقم برکت
در شرایط تنش خشکی از لحاظ دستهبندی بر اساس شاخص گره زایی این 21 جدایه به 3 دسته متفاوت تقسیم شدندکه از لحاظ تعداد بین دستهها تفاوت وجود داشت(جدول5). جدایههای Rlu07 ،Rlu10 ،Rlu15 و Rlu20 دارای ضرایب گره زایی بالاتری از بقیه جدایهها بودند. جدایهها در شرایط بدون تنش دارای شاخص گره زایی از 2 تا 8 بودند.
جدول 5: دسته بندی جدایههای ریزوبیومی بر اساس شاخص گره زایی در شرایط تنش شدید
شاخص گروه زایی | تعداد جدایهها | جدایههای ریزوبیومی |
2 | 11 | Rlu01 ، Rlu02 ، Rlu03 ، Rlu06، Rlu11 ، Rlu12، Rlu13، Rlu14، Rlu16، Rlu17 و Rlu18 |
4 | 6 | Rlu21 ، Rlu19 ، Rlu09 ، Rlu08 ، Rlu05 ، Rlu04 |
8 | 4 | Rlu07 ، Rlu10 ، Rlu15 ، Rlu20 |
از لحاظ کارایی تثبیت نیتروژن در شرایط تنش خشکی این 21 جدایه به 3 دسته متفاوت تقسیم شدند که بین دستهها از لحاظ تعداد تفاوت وجود داشت (جدول 6).
جدول 6: دستهبندی جدایههای ریزوبیومی بر اساس کارایی تثبیت نیتروژن در شرایط تنش شدید
شاخص کارایی | تعداد جدایهها | جدایههای ریزوبیومی |
I | 9 | Rlu0 ،Rlu03 ، Rlu10، Rlu11 ، Rlu12، Rlu13، Rlu14، Rlu17 و Rlu18 |
E | 5 | Rlu21 ، Rlu20 ، Rlu16 ، Rlu15، Rlu07 |
PE | 7 | Rlu02 ، Rlu04 ، Rlu05 ، Rlu06 ، Rlu08 ، Rlu09 ، Rlu19 |
بین جذب نیتروژن و وزن خشک اندام هوایی گیاهان تلقیج شده با جدایههای ریزوبیوم همبستگی بیشتری در حالت تنش شدید نسبت به شرایط بدون تنش مشاهده شد( شکل7). Lerkiو Akhgar (2014) به وجود رابطه بین جذب نیتروژن و وزن خشک اندام هوایی تاکید داشتند. بر اساس میانگین دادهها بیشترین وزن خشک اندام هوایی با در گیاهان تلقیج شد با جدایههای Rlu07، Rlu15 وRlu20 (بالاترین غلظت نیتروژن) بدست آمد.
A
B
شکل7: رابطه بین مقدار نیتروژن در اندام هوایی و وزن خشک اندام هوایی
در شرایط بدون تنش (A) و در شرایط تنش خشکی شدید (B)
بحث
استفاده از جدایه مناسب باکتری ريزوبيومي و تلقيح آن ميتواند مقدار زيِادی از نياز نيتروژني باقلا را برطرف نمايد. لذا اولين مرحله از کار جداسازی و بررسي کارايي اين جدايهها و سپس انتخاب جدايهها با کارايي بالاست. نتايج حاصل از اين تحقيق نشان داد که 34 در صد از نمونههای گره، واجد ريزوبيوم وقابل جدا سازی با روش معمول بودند. از 58 نمونه گره ريشه ای باقلا 21جدایه توانايی ايجاد گره روی ريشههای باقلا را داشتند. گاهی اوقات طولانی شدن زمان نگهداری باکتری روی لولههای حاوی محيط کشت مورب (اسلنت) تا آزمون گره زايی ،کشتهای متوالی حين فرايند خالص سازی (واکشتها) ممکن است ، باعث از دست رفتن پلازميدهای حاوی ژن nod ، که نقش اصلی را در فرايند گره زايی دارند، شده باشد (Laguerre et al., 2003).
صفت کارایی همزیستی یک معیار مهم در انتخاب جدایههای ریزوبیومی است که بیانگر توانایی تثبیت نیتروژن در گیاهان گره دار شده می باشد (2004 Somasegaran and Hoben,). در اتیوپی از 38 جدایه تنها 13 درصد جدایهها (5 جدایه) در گروه با کارایی خیلی موثر و 71 درصد (27 جدایه) جدایهها در گروه با کارایی موثر (خوب) قرار داشتند. افزایش وزن خشک ساقه و ریشه در اثر تلقیح (یونجه و شبدر) با جدایههای ریزوبیومی همانند کارهای Lerki و Akhgar (2014) مطابقت داشت. البته میزان افزایش نیتروژن نسبت به شاهد در این آزمایش به دلیل اعمال تنش خشکی کمتر بود. در واقع گیاه در حالت تنشی انرژی زیادی را صرف بقای خود میکند.
همانند نتایج آین آزمایش Farnia و همکاران (2007) به نقل از Hafiz و همکاران (2000) گزارش کردند که جدایههاي باکتري ریزوبیوم لگومینوزارم اثر معنی داري بر وزن خشک گره عدس دارند و اعمال تنش رطوبتی تأثیر معنیداري روي این صفت میگذارد. همچنین دانشیان (1374) در مطالعه روي اثر متقابل جدایههاي باکتري ریزوبیوم (هلی نیترو، گلدکت و ریزوکینگ) و ارقام مختلف سویا (ویلیا مز، سنچوري وهارکور) به اثر معنیدار جدایه باکتري تحت تاثیر عوامل محیطی اشاره نمود که در این بین جدایه گلدکت از گره زایی بیشترينسبت به سایر جدایهها برخوردار بود. Farnia و همکاران (2007) نیز در بررسی اثر تنش خشکی بر گره بندی و تثبیت نیتروژن سه کود زیستی هلی نیترو، ریزوکنیک و نیتراژین روی سویا نشان داد که باکتری موجود در کود زیستی هلی نیترو در شرایط مطلوب آبیاری مقدار تثبیت نیتروژن، ماده خشک بالاتری نسبت به بقیه کودهای زیستی داشت. در حالی که با اعمال تنش خشکی کود زیستی ریزوکینگ از کارایی بیشتری برخوردار بود و تعداد گره فعال بیشتر ، تثبیت نیتروژن بیشتر و در نتیجه ماده خشک بالاتری را تولید نمود. در نتیجه آنها کود زیستی هلی نیترورا برای حالت بدون تنش خشکی و کود زیستی ریزوکینگ را برای شرایط تنش خشکی پیشنهاد دادند. با توجه به نتایج حاصل از این سه شاخص جدایههای با بیشترین مقدار یعنی جدایههای ریزوبیومی Rlu07، جدایه Rlu15 و جدایه Rlu20 انتخاب شدند.
مقايسه کارايي جدايهها میتواند براساس ميزان نيتروژن جذب شده توسط گياه و یا مقایسه وزن خشک اندام هوایی صورت گیرد. اندازه گيری میزان نیتروژن اندام هوایی مطابق نظر Fesenko و همکاران (1995) نسبت به اندازه گيری وزن خشک اندام هوايي مناسب تر است. برخی دیگر از محققین نیز اندازه گیری وزن خشک اندام هوایی را موثرتر از اندازه گیری نیتروژن در اندام هوایی میدانند (Khosravi, 2014; Lerki and Akhgar, 2014). در این آزمايش نیز اندازهگیری میزان نیتروژن اندام هوایی و وزن خشک اندام هوايي هردو انجام شد و نتایج حاصل نشان داد که 48 درصد جدایهها دارای کارایی غیر موثر، 33 درصد موثر و تنها 19 درصد خیلی موثر بودند.علل این کمی کارایی ممکن است به علت مصرف کودهای نیتروژنی، حضور جمعیت بومی ریزوبیومهای غیرکارا یا کم کارا وشرایط محیطی باشد. توان تثبیت نیتروژن و تولید ماده خشک گیاه، تحت تاثیر عوامل مختلفی از قبیل ژنوتیپ گیاه، جدایه باکتري، رطوبت خاك، نیتروژن طبق نظر Serraj و همکاران (1999)، در بین ریزوبیومها جدایههای تند رشد به از دست دادن رطوبت بیشتر از جدایههای کند رشد حساس هستند (Serraj et al., 1999). اما بقای ریزوبیومها در خاک تحت تنش خشکی مهم نیست. تکثیر و حرکت ریزوبیومهادر خاکهای خشک می تواند عامل محدود کننده خصوصاً در مراحل اولیه ایجاد رابطه همزیستی باشد که این امر می تواند باعث کاهش فرایند آلودهسازی شود. (Serraj et al., 1999).
همچنین تنش خشکی نیز یکی دیگر از عوامل مهم درفرایند تثبیت نیتروژن است (Chammakhi, 2022). کافی نبودن آب از دو طریق فعالیت گرهها را کاهش و یا متوقف می کند، یکی اثر غیرمستقیم تنش خشکی است که در مراحل اولیه باعث کاهش فتوسنتز گیاه میشود، زیرا روزنهها بسته شده و کاهش ورود دي اکسیدکربن به برگ باعث کاهش فعالیت فتوسنتزي گیاه میگردد، چنانچه این شرایط به مدت طولانی ادامه یابد انتقال کربوهیدراتها به گرهها کاهش مییابد، که دلیل آن کاهش میزان تولید مواد فتوسنتزي و همچنین مصرف مواد فتوسنتزي جهت رشد و توسعه ریشه به منظور دستیابی به منابع جدید آب، میباشد. این عامل باعث کاهش تثبیت نیتروژن شده و با کاهش نیتروژن مورد نیاز گیاه، فرایند تولید و توسعه برگها و اندامهاي رویشی کند می شود که خود منجر به کاهش فتوسنتز گیاه میگردد و در تنش سخت این عامل تشدید میگردد. همچنین اثر مستقیم تنش خشکی بر تثبیت نیتروژن، از طریق کاهش انتشار اکسیژن به گره و در نتیجه کاهش تنفس گره است (Elbagory, 2022). با توجه به این که تثبیت نیتروژن واکنشی انرژي خواه می باشد، محدودیت تولید انرژي در گرههاي موجود بر روي ریشه، تثبیت نیتروژن را کاهش می دهد. نتایج آزمون کارایی 21 جدایههای ریزوبیومی تثبیت کننده بیولوژیکی نیتروژن در تنش خشکی شدید نشان داد که ضریبت گره زایی در جدایهها از 56 تا 89 درصد و کارایی تثبیت نیتروژن از 10 تا 50 درصد کاسته می شود. در واقع ضریب گره زایی نسبت به کارایی حساسیت بیشتری به تنش خشکی دارد. Serraj و همکاران (1999) کاهش تعداد گره و وزن خشک را بعد از اعمال تنش شدید خشکی گزارش کردند (Serraj et al., 1999).
خشکی باعث کاهش تجمع نیتروژن و کاهش عملکرد در لگمها میشود. این کاهش به دلیل کاهش فعالیت نیتروژناز است که خود به دلایلی مانند محدودیت یا کاهش منایع کربن، کاهش اکسیژن و بازخورد خود تنظیمی حاصل از تجمع نیتروژن در اندامهای هوایی باشد. تغییر در جریان آب در آوند آبکش باعث تغییر در فشار تورژسانس در برگها شده که این امر خود باعث تغیر شدید در فعالیت گرهها میشود. از طرفی اثر تنش خشکی جریان سیگنال نیتروژن همراه با تجمع نیتروژن در ساقه و گرهها را باعث میشود که خود میتواند باعث ممانعت از تثبیت نیتروژن در مراحل اولیه در خاکهای خشک شود. وجود تفاوتهای ژنتیکی رقمها امکان افزایش تثبیت نیتروژن و مقاومت به شرایط خشکی را فراهم میکند.بر اساس نتایج بهدست آمده، مقدار نیتروژن اندام هوایی و ماده خشک اندام هوایی میتواند بهعنوان معیار مناسب برای مقایسه کارایی جدایهها مورد استفاده قرار گیرد. هم چنین معیار تعداد و وزن خشک گره همبستگی مثبت و معنیدار با میزان نیتروژن اندام هوایی دارند، در صورتی که وزن تر و خشک ریشه معیار مناسبی به شمار نمیآید و از این فاکتور نمیتواند جهت تعیین کارآیی جدایه باکتري برتر استفاده نمود (جدول7).
جدول7: ضریب همبستگی بین صفات اندازه گیری شده
صفات اندازه گیری شده | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
محتوانی نسبی آب(1) | 000/1 |
|
|
|
|
|
|
|
وزن تر اندام هوایی(2) | *556/0 | 000/1 |
|
|
|
|
|
|
وزن خشک اندام هوایی(3) | 0727/0** | 890/0** | 000/1 |
|
|
|
|
|
وزن تر ریشه(4) | 789/0** | 672/0** | 796/0** | 000/1 |
|
|
|
|
وزن خشک ریشه(5) | 316/0* | 609/0* | 606/0** | 497/0** | 000/1 |
|
|
|
میزان نیتروژن اندام هوایی(6) | 495/0** | 931/0** | 880/0** | 652/0** | 664/0** | 000/1 |
|
|
تعداد گره در بوته(7) | 380/0** | 891/0** | 780/0* | 560/0** | 659/0** | 956/0** | 000/1 |
|
وزن خشک گره دربوته(8) | 386/0**0 | 881/0** | 790./0* | 594/0** | 686/0** | 960/0* | 940/0** | 000/1 |
**. Correlation is significant at the 0.01 level
*. Correlation is significant at the 0.05 level
Farnia و همکاران (2007) نیز تعداد گره و نه اندازه گره را معیار مناسبی برای توان تثبیت جدایههای ریزوبیومی بیان کردند. همچنین در آزمایش گلخانهای روی یونجه تحت شرایط کم آبی مشاهده کردند که وزن گیاه و مقدار نیتروژن در گیاهان تلقیح شده با جدایههای ریزوبیوم میلیلوتی در شرایط خشک بیشتر بود (Serraj et al., 1999). افزایش مقدار نیتروژن تثبیت شده تقریبا بهطور خطی مقدار ماده خشک تولید شده را افزایش داد که خود بهدلیل تولید سطح فتوسنتزکننده بیشتر و تولید و انتقال مواد فتوسنتزي بیشتر به ریشه می باشد و این خود میتواند بر تثبیت نیتروژن اثر تشدید کننده داشته باشد (Farnia et al., 2007; Khosravi, 2014; Lerki and Akhgar, 2014).
با اعمال تنش خشکی مقدار تثبیت نیتروژن و ماده خشک در گیاهانی از قبیل سویا، باقلا، نخود و نخود فرنگی کاهش می یابد(Farnia et al., 2007). کاهش تثبیت نیتروژن در جدایههاي مختلف باکتري تحت تاثیر سطوح تنش خشکی و به خصوص در تنش شدید میتواند عمدتاً مربوط به آنزیم موجود در برگ باشد که مسئول تجزیه محصولات تثبیت نیتروژن انتقال یافته از گرهها به برگها میباشد این آنزیم داراي حساسیت زیادي نسبت به کمبود آب است و فعالیت آن دچار اختلال می گردد، با کاهش فعالیت این آنزیم، اثر بازخوردي منفی روي فعالیت تثبیت نیتروژن دارد، در نتیجه تثبیت نیتروژن کاهش مییابد، اما مکانیسم آن بهطور کامل مشخص نشده است. دلیل دیگري که می توان علت کاهش تثبیت نیتروژن با کاهش رطوبت خاك را توجیه نمود، کاهش تنفس سلولهاي ریشه و مخصوصا تنفس گرههاي موجود روي ریشه میباشد، با کاهش تنفس گره، انرژي مورد نیاز تثبیت نیتروژن کاهش می یابد و سبب کاهش تثبیت نیتروژن میگردد. کاهش بیش از 20 درصد رطوبت گره، سبب توقف تثبیت نیتروژن میگردد و تنفس گره را به شدت کاهش می دهد، هم چنین تغییرات روزانه قابل توجهی در میزان تثبیت نیتروژن به وسیله گره سویا در رابطه با تغییرات مقدار رطوبت گزارش شده است (Farnia et al., 2007). بهنظر میرسد که کاهش تثبیت نیتروژن در اثر خشکی گره، مربوط به کاهش تنفس گره به دلیل کمبود اکسیژن در باکتريها میباشد، چنین کمبودي در اثر ایجاد یک مانع فیزیکی در ورود اکسیژن به گره به وجود می آید که در اثر بیمیلی لگ هموگلوبین گره خشک نسبت به اکسیژن پدید میآید. این نظریه با توجه به این که اثرات منفی کمبود ر طوبت بر تثبیت نیتروژن و تنفس گره با افزایش غلظت اکسیژن در اطراف گره برطرف میشود مطرح میگردد (Farnia et al., 2007). تنش خشکی ملایم باعت کاهش تثبیت نیتروژن گردید، اما در تنشهاي متوسط و شدید، تثبیت نیتروژن کاهش شدیدي را نشان داد. بهنظر میرسد کمبود رطوبت در حد متوسط سبب تغییرات ساختمانی از قبیل پارگی پلاسمودسماتا در بخش خارجی سلولهاي کورتکس گرههاي سویا می شود، این خسارت نه تنها در اثر تعرق بیش از حد گره به دلیل خشکی هواي خاك، بلکه در اثر جذب مواد مضر مانند نمکهاي در تماس با ریشه ایجاد می گردد (Farnia et al., 2007).
نتیجهگیری کلی
با کاهش میزان آب در برگ (محتوای نسبی آب) در اثر تنش خشکی مقدار نیتروژن اندام هوایی و وزن خشک اندام هوایی کاهش یافت. بهطوری که با کاهش هر یک درصد میزان آب در اندام هوایی مقدار نیتروژن 5/1 درصد و مقدار عملکرد (وزن خشک اندام هوایی) به میزان 6/1 درصد کاهش مییابد. لذا در هنگام استفاده از مایه تلقیحهای ریزوبیومی باید از جدایههای مقاوم به تنش خشکی استفاده نمود. در این تحقیق نیز اثر سطح تنش خشکی شدید روی برخی از اجزای اصلی سیستم همزیستی بررسی شد و در نهایت از بین 21 جدایه، سه جدایه Rlu07، Rlu15 و Rlu20 از گونه Rhizobium leguminosarun دارای مقدار بیشتری نیتروژن و وزن خشک اندام هوایی بودند بهعنوان جدایههای مقاوم گزارش شدند.
Abdi, H., Bihamta, M., Azizof. E., and Chogan, R. (2013). Investigating the levels of drought stress caused by polyethylene glycol (PEG 6000) on the components of seed rejuvenation and its relationship with drought tolerance indices in promising varieties and lines of bread wheat (Triticum aestivum L.) Iranian Agricultural Research, 14(4): 582-596.
Alam, T., and Najam, L. (2022). Faba-Bean Antioxidant and Bioactive Composition: Biochemistry and Functionality. In Faba Bean: Chemistry, Properties and Functionality, (pp. 123-162). Springer, Cham.
Alikhani, H. A., Mohammadi, L. (2009). Investigating the salinity and drought tolerance of lentil symbiotic rhizobial isolates in rainfed conditions. Plant production technology, 10(1): 59-68.
Alizadegan, A., Hosseini Sarqin, S., and Jameei, R. (2014). investigating the effect of drought stress on antioxidant compounds in fava bean plant (Vicia faba), the second scientific research conference of biology and horticultural sciences of Iran, Tehran.
Ammar, M. H, F., Anwar, E. H., El-Harty, H. M., Migdadi, S. M., Abdel-Khalik, S. A., Al-Faifi, M., and Farooq and Alghamdi S. S. (2014). Physiological and yield responses of faba bean (Vicia faba L.) drought in a Mediterranean-type Environment. J Agro Crop Sci, 201: 280–287.
Beauchamp, C. J., Kloepper, J. W., Shaw, J. J. and Chalifour, F. P. (2001). “Root colonization of faba bean (Vicia faba L.) and pea (Pisum sativum L.) by Rhizobium leguminosarum bv. viciae in the presence of nitrate-nitrogen,” Canadian Journal of Microbiology, 47(12): 1068–1074. doi: 10.1139/cjm-47-12-1068.
Benmoussa, S., Nouairi, I., Rajhi, I., Rezgui, S., Manai, K., Taamali, W., Abbes, Z., Zribi, K., Brouquisse, R. and Mhadhbi, H. (2022). Growth Performance and Nitrogen Fixing Efficiency of Faba Bean (Vicia faba L.) Genotypes in Symbiosis with Rhizobia under Combined Salinity and Hypoxia Stresses. Agronomy, 12(3): p.606.
Bhattacharyya, P. N., and Jha, D. K. (2012). Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR): Emergence in Agriculture. World J Microbiol Biotechnol, 28(4): 1327-50.
Borucki, W., and Sujkowska, M. (2008). The effects of sodium chloride-salinity upon growth, nodulation, and root nodule structure of pea (Pisum sativum L.) plants. Acta Physiologiae Plantarum, 30(3): 293-301.
Burlyn, E., Michela and Merrill R. and Kaufmann (1973). The osmotic potential of polyethylene glycol 6000. Journal of Plant Physiology, 51: 914-916.
Chammakhi, C., Boscari, A., Pacoud, M., Aubert, G., Mhadhbi, H., and Brouquisse, R. (2022). Nitric Oxide Metabolic Pathway in Drought-Stressed Nodules of Faba Bean (Vicia faba L.). International Journal of Molecular Sciences, 23(21): p.13057.
Creus, C. M., Sueldo, R. J., and Barassi, C. A. (2004). Water relations and yield in Azospirillum-inoculated wheat exposed to drought in field.Can. Journal of Botany. 82: 273–281.
Creus, C. M., Sueldo, R. J., and Barassi, C. A. (1998). Water relations in Azospirillum -inoculated wheat seedlings under osmotic stress. Canadian Journal of Botany. 76: 238–244.
Elbagory, M., El-Nahrawy, S., and Omara, A. E. D. (2022). Synergistic Interaction between Symbiotic N2 Fixing Bacteria and Bacillus strains to Improve Growth, Physiological Parameters, Antioxidant Enzymes and Ni Accumulation in Faba Bean Plants (Vicia faba) under Nickel Stress. Plants, 11(14): p.1812.
Farnia, A., Noormohammadi, Q., and Naderi, A. (2007). Effect of drought stress on nodulation and nitrogen fixation of different races of Rhizobium japonicum in soybean. A new find in agriculture. second year, 2: 132-149.
Fesenko, A. N., Provorov, N. A., Orlova, I. F., Orlov, V. P., and Simarov, B.V. (1995). Selection of Rhizobium leguminosarum bv. viceae strains for inoculation of Pisum sativum L. cultivars: analysis of symbiotic efficiency and nodulation competitiveness. Plant Soil, 172: 189–198.
Gontia-Mishra, I, Sapre, S., Sharma, A., and Tiwari, S. (2015). Effect of plant growth-promoting Bacillus sp. on growth, antioxidant enzymes and DNA content of tomato seedlings under salt stress. Springerplus, 4:130
Guo, R., Silsbury, H., and Graham, R. D. (1992). Effect of four nitrogen compounds on nodulation and nitrogen fixation in faba bean, white lupine and medic plants. Australian Journal of plant physiology, 19: 501-508.
Hafeez, F. Y., Safdar, M. E., Chaudhury, A. U., and Malik, K. A. (2004). Rhizobial inoculation improves seedling emergence, nutrient uptake and growth of cotton. Australian Journal of Experimental Agriculture, 44: 617-622.
Hansen, A. P., and Choudhary, D. K. (2017). Rhizobium Biology and Biotechnology. doi: 10.1007/978-3-319-64982-5.
Joseph, B., Patra, R. R., and Lawrence, R. (2007). “Characterization of plant growth promoting rhizobacteria associated with chickpea (Cicer arietinum L.),” International Journal of Plant Production, 1(2): 141–151 ST–Characterization of plant growth pro.
Khosravi, H. (2014). Investigating some physiological characteristics of Rhizobium leguminosarum bv.viciae native to Iran. Journal of Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology), 28(4): 513-523.
Laguerre, G., Louvrier, P., Allard, M. R., and Amarger, N. (2003). Compatibility of rhizobial genotypes within natural populations of Rhizobium leguminosarum biovar viciae for nodulation of host legumes. Applied and Environmental Microbiology, 69: 2276–2283.
Lalande, R., Blowaneza, P. C., Antoun, H. (1990). Symbiotic effectiveness of strains of Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli from soils of Rawanda.Plant and Soil, 121: 41-46.
Lerki, S., and Akhgar, A. R. (2014). Effect of Sinorhizobium bacteria on growth, nodulation and nitrogen fixation in fenugreek plant. Journal of Soil Biology, 2(2): 137-148.
Nadeem, S. M., Ahmad, M., Zahir, Z. A., Javaid, A., and Ashraf, M. (2014). The role of mycorrhizae and plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) in improving crop productivity under stressful environments. Biotechnol Adv, 32(2): 429-48
Pii, Y., Mimmo, T., Tomasi, N., Terzano, R., Cesco, S., and Crecchio, C. (2015). Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils, 51(4): 403-415.
Prevost, D., and Antoun, H. (2008). Root nodule bacteria and symbiotic nitrogen fixation. In: Carter MR, Gregorich EG (eds), Soil sampling and methods of analysis (2nd edn). Boca Raton: CRC Press, 379–397.
Ramos, M. L. G., Gordon, A. G., Minchin, F. R., Sprent, J. I. and Parsons, R. (1999). Effects of water stress on nodule physiology and biochemistry of a drought tolerant cultivar of common bean (phaseolus vulgaris L.). Annals of Botany, 83(1): 57-63.
Ritchie, S. W., Nguyen, H. T., and Holaday, A. S. (1990). Leaf water content and gas exchange parameters of two wheat genotypes differing in drought resistance. Crop Sci, 30: 105-111.
Saghafi, D., Alikhani, H. A., and Motsharazadeh. (2013). Investigating plant growth stimulating properties of some rhizobial bacteria isolated from Iranian soils. Journal of Soil Management and Sustainable Production, 4(2): 131-150.
Serraj, R., Sinclair, T. R., Purcell, L. E. (1999). Symbiotic N2 fixation response to drought. Journal of Experimental Botany, 50:143-155.
Somasegaran, P., and Hoben, H. (1994). Handbook for rhizobia: methods in legume-Rhizobium technology. Springer Science & Business Media
Suarez, R.; Wong, A., Ramirez, M., Barraza, A., Orozco, M., Cevallos, M., Lara, M., Hernandez, G., and Iturriaga, G. (2008). Improvement of drought tolerance and grain yield in common bean by overexpressing trehalose-6- phosphate synthase in rhizobia. Molecular plant microb interactions. Published by APS PRESS in cooperation with the International Society for Molecular Plant-Microbe Interactions, 21(7): 958-966.
Tahir, M., Mirza, M. S., Zaheer, A., Dimitrov, M. R., Smidt, H., and Hameed, S. et al. (2017). Synergistic Effects of Biochar and Plant Growth-Promoting Rhizobacteria on the Growth and Physiology of Oryza sativa L. Front Plant Sci, 8:162.
Vacheron, J., Desbrosses, G., Bouffaud, M. L., Touraine, B., Moënne-Loccoz, Y., and Muller, D. et al. (2013). Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning. Front Plant Sci. 2013;4:356
Weir, B. (2006). Systematics, Specificity, and Ecology of New Zealand Rhizobia (Doctoral dissertation, The University of Auckland New Zealand).
